Le milieu marin, en fonction du biotope local, de la température et de l'ensoleillement, peut etre sujet, de façon épisodique et saisonnière, à des efflorescences de microorganismes planctoniques qui affectent l'environnement et qui sont parfois toxiques pour la faune marine locale et pour l'homme, consommateur final de poissons, mollusques et crustacés filtreurs de plancton.

On connaît par exemple les efflorescences de Phaeocystis, dont les métabolites soufrés corrompent 1'eau, la rendent malodorante et la colorent, faisant fuir les bancs de poissons, ou encore les efflorescences d'Alexanclyiun2 minutum, dinoflagellé producteur de toxines paralysantes qui se concentrent dans les moules et les huîtres, et de Dinophysis, à l'origine de toxines diarrhéiques.

Le contrôle planctonique des eaux de mer s'impose donc pour des raisons de santé publique.

Actuellement, la détection de tels microorganismes fait appel à des techniques d'observation microscopique à partir d'échantillons d'eau, analyses qui sont fastidieuses et souvent approximatives, ou à l'utilisation de sondes moléculaires spécifiques de l'espèce à détecter, méthode trop coûteuse pour pouvoir être utilisée industriellement et de façon routinière.

D'autre part, aucun procédé satisfaisant pour le contrôle des efflorescences de microorganismes planctoniques n'a été décrit. En effet, une méthode chimique consistant à déverser dans l'eau des particules floculantes d'argile ou de limon, de façon à faire précipiter le plancton toxique, est utilisée au Japon et en Corée, mais cette teclmique n'est pas sélective et a un impact néfaste sur l'écosystème.

Le but de l'invention est donc de pourvoir à des moyens de détection de microorganismes planctoniques présents dans de l'eau, tels que des microalgues, et à un procédé d'élimination sélective de ces microorganismes, qui soient utilisables aussi bien à l'échelle du laboratoire qu'à l'échelle industrielle, ainsi qu'au niveau de l'écosystème naturel, en milieu marin notamment.

A cette fin, les Inventeurs ont eu l'idée de rechercher si des copolymères du type de ceux décrits dans l'article de M. JOZEFOWICZ et J. JOZEFONVICZ, paru dans Biomaterials, 1997, 18, 1633-1644, pouvaient être

utilisés en tant que matériau présentant une affinité envers certains microorganismes planctoniques, cette affinité étant suffisamment importante et spécifique pour permettre la capture de ces microorganismes, que ce soit en vue de leur détection, de leur isolement ou de leur élimination.

La présente invention a pour objet un copolymère statistique insoluble comprenant un polymère synthétique dont les unités monomériques de base sont substituées par au moins un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'etre obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles par substitution statistique d'un polymère synthétique à l'aide d'acides aminés ou de leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste, et e) synthèse d'un copolymère identifié à l'issue de l'étape d).

L'étape e) de synthèse d'un copolymère peut être effectuée en utilisant les techniques de chimie organique connues de l'Homme de l'art.

Le polymère synthétique mentionné ci-dessus est par exemple sélectionné dans le groupe constitué par les polymères vinyliques (tels que les acrylates ou le polystyrène), les polymères diéthyléniques, les polyuréthannes et les silicones.

On entend par « protiste » un microorganisme eucaryote unicellulaire autotrophe ou hétérotrophe. A titre d'exemples de protistes, on peut citer les microorganismes zooplanctoniques ou phytoplanctoniques, tels que les microalgues, ou encore les protozoaires.

Le copolymère défini ci-dessus peut être utilisé pour éliminer ledit protiste, dans le cas où il présente un risque pour l'environnement ou pour la santé. On peut citer par exemple les entités taxonomiques nuisibles suivantes : genres Dinophysis, Alexandrium, Gonyaulax, Protogonyaaclax, Gambierdiscus, Ostreopsis, Ceratizxm, Prorocentrzlm, Gymnodiniuna, Gyrodinizrn2, Heterosignaa, Chcztonella et Phaeocystis. Le copolymère peut également être utilisé pour isoler ou capturer ledit protiste, par exemple dans le but de récupérer des substances produites par ce dernier : certains protistes produisent en effet des métabolites d'intérêt industriel, par exemple en pharmacologie, ou dans les domaines alimentaire et technologique. A titre

d'exemples, on peut citer les microalgues productrices d'acides gras polyinsaturés et les diatomées productrices de silice biominérale (Bacillariophycées).

Au cours de l'étape c) décrite ci-dessus, une association se forme entre ledit protiste et les copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ce protiste. Les copolymères conformes à l'invention, sélectionnés par le procédé défini ci-dessus, présentent donc une affinité spécifique envers un protiste donné. Ce caractère biospécifique est dû à la fonctiomalisation statistique du copolymère, et provient également du procédé par lequel le copolymère est sélectionné.

De par sa fonctionnalisation statistique, le copolymère conforme à l'invention mime la structure d'un ligand naturel des récepteurs membranaires (tels que des facteurs de croissance, des glycopeptides, des lipopeptides) du protiste envers lequel il présente une affinité spécifique. Ainsi, le copolymère conforme à l'invention consiste avantageusement en un mimétique d'un peptide ou d'un dérivé de peptide.

Selon un mode de réalisation avantageux du copolymère conforme à l'invention, lesdites unités monomériques de base du polymère synthétique sont substituées, de façon statistique, par des groupements sulfonates et par de l'acide aspartique ou l'un de ses dérivés, de préférence un ester de l'acide aspartique (par exemple 1'ester diméthylique).

Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ledit acide aminé ou dérivé d'acide aminé est relié aux unités monomériques de base du polymère synthétique par une liaison chimique appropriée, par exemple une liaison sulfamide.

Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ce dernier comprend, en pourcentages molaires : . entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, de préférence entre 25 et 3 1%, . entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, de préférence entre 21 et 25%, et . entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, reliées auxdites unités styrène par une liaison sulfamide.

Un tel copolymère présente une affinité spécifique envers l'espèce Slexandrizl77 ? mimltzlm.

Le copolymère conforme à l'invention peut par exemple comprendre, en pourcentages molaires, environ 29% d'unités styrène non substituées, environ 24% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et environ 47% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique.

L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère défini ci-dessus pour la capture sélective d'un protiste donné, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce.

Une telle utilisation est particulièrement utile pour capturer des protistes nuisibles.

A titre d'exemples, on peut citer des espèces produisant des toxines endocellulaires qui se concentrent dans les produits de la mer au cours de la chaîne alimentaire et qui causent chez le consommateur humain divers désordres et intoxications de type gastrointestinal ou neurologique tels que : . des intoxications de type paralytique (PSP : « Paralytic Shellfish Poisoning ») agissant sur le système nerveux central, occasionnées par des dinoflagellés comme Alexandrium catenella, Alexandrium minzctum, Alexandrium acatenella, Alexandrium cohorticula, Alexandrium fundyense, Alexandrium fraterculus, Alexandrium ostenfeldii, Alexandrium tamarense, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium bahamense var. compressum, . des intoxications de type diarrhéique (DSP : « Diarrhetic Shellfish Poisoning »), occasionnées par des espèces comme Dinophysis acta, Dinophysis acuminata, Dinophysis norvegica, Dinophysis mitra, Dinophysis rotundata, Prorocentrum lima, Prorocentrum mexicanum, . des intoxications de type amnésique (ASP : « Amnesic Shellfish Poisoning »), occasionnées par des espèces de diatomées comme Pseudo-nitzschia mzcltiseries, Pseudo-nitzschia psezdodelicatissima, Pseudo-nitzschia australis, ou de dinoflagellé comme Pfiesteria piscicida, . des intoxications de type ciguaterique (CFP : « Ciguatera Fish Poisoning »), occasionnées par des espèces comme Gambierdiscus toxicus, Ostreopsis spp., Prorocentrum spp., . des intoxications de type neurotoxique (NSP : « Neurotoxic Shellfish Poisoning »), occasionnées par des espèces comme Gymnodinium breve et Gymnodinium cf. breve, On peut également citer les protozoaires dont une partie du cycle de vie comporte une ou plusieurs phases aquatiques (amibes, paramécies, trypanosomes, plasmodium,...), dont l'ingestion entraîne une intoxication ou une parasitose.

On peut également citer des espèces qui ne sont pas toxiques pour le consommateur humain, mais qui occasionnent des pertes de cheptel aquacole importantes et induisent des perturbations considérables des écosystèmes côtiers, telles que la diatomée Chaetoceros convultus, les haptophycées comme <BR> <BR> <BR> Chrysochromulina polylepis, Phaeocystis pouchetSi, Phaeocystis antartica,

Prymnesium parvurz et Prymhesium patelliferum, les dinoflagellés comme Gymnodinium mikimotoi et Gymnodinium corsicum, ainsi que les raphydophytes comme Heterosigma carterae, Chattonella antiqua, Chattonella marina et Chattonella verruculosa.

L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère décrit ci-dessus qui comprend, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, pour la capture sélective de l'espèce Alexandriztm mimltum, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce.

L'invention a également pour objet un dispositif de filtration d'eau pour en éliminer sélectivement au moins un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère tel que décrit précédemment, ledit copolymère comprenant de préférence, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, tel que décrit ci-dessus, lorsque ledit protiste est l'espèce Alexandrium minutum.

Grâce à ce dispositif, la concentration dudit protiste donné est diminuée de manière significative dans 1'eau filtrée (eau douce ou eau de mer par exemple).

Un tel dispositif de filtration d'eau peut par exemple se présenter sous la forme d'un filet ou d'une membrane filtrante. De manière générale, il est bien entendu que tout matériau d'une porosité donnée, dont la surface est revêtue du copolymère selon l'invention, pourrait être utilisée dans ce dispositif.

On pourrait également envisager l'utilisation des copolymères décrits ci-dessus en tant que phase stationnaire en chromatographie d'affinité sur colonne, toujours dans le but d'éliminer un protiste donné d'une source d'eau.

La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de copolymères présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles, mimétiques de peptides ou de dérivés de peptides, par substitution statistique d'un polymère synthétique par des acides aminés ou leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), et

d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste.

Ledit protiste est tel que décrit précédemment. Il consiste par exemple en l'espèce Alexandrium minutes.

Le procédé selon l'invention peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape de marquage radioactif dudit protiste. Auquel cas, l'étape d) est effectuée par la détection des associations copolymère/protiste qui donnent lieu à une émission de radioactivité.

Le procédé selon l'invention peut également comprendre, entre les étapes c) et d), une étape d'élimination des cellules qui ne se sont pas associées aux copolymères, réalisée par tamisage.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de procédés de synthèse et de sélection de copolymères conformes à l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d'Xlexandrium minzltum en fonction de la composition de copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé en un rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe-+-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe-| -la figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d'Heterocapsa triquetra en fonction de la composition de ces mêmes copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que dans la figure 1.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Synthèse d'une librairie de copolymères mimétiques de dérivés de peptides.

1) Polymère synthétique utilisé.

On utilise des microsphères de polystyrène réticulées avec 3% de divinylbenzène, commercialisées par Bio-Rad Laboratories (Richmond, Californie,

USA) sous la dénomination BioBeads SX3.

Afin d'en éliminer toute impureté résiduelle,, es microsphères de polystyrène sont lavées successivement à l'aide de soude 1M, d'eau déminéralisée, d'acide chlorhydrique 1M et de nouveau à l'aide d'eau déminéralisée, chaque lavage étant effectué pendant 3 heures. A l'issue du dernier lavage, les microsphères de polystyrène sont filtrées, puis séchées sous vide à 50°C.

2) Protocole de substitution statistique du polystyrène.

Les substitutions choisies consistent en des sulfamides de 1'ester méthylique de l'acide aspartique de l'alanine, de la leucine, ou de la phénylalanine. Le protocole qui suit est répété, pour ces quatre familles de substituants, de façon à obtenir huit degrés de substitution différents.

. Chlorosulfonation.

2,5 g de microsphères de polystyrène sèches sont gonflées dans 75 ml de dichlorométhane, pendant une nuit. On procède ensuite à une réaction de chlorosulfonation : les microsphères de polystyrène sont mises en contact avec un excès d'acide chlorosulfonique (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), pendant 60 minutes, à 40°C, sous agitation et sous reflux. Les microsphères de polystyrène chlorosulfonées sont lavées sous vide à l'aide, successivement, de dichlorométhane distillé, d'acétone distillé et de nouveau de dichlorométhane distillé, puis dispersées dans 100 ml de dichlorométhane.

Sulfamidation.

Pour obtenir environ 10% de substitution du polystyrène, 0,11 moles d'acide aminé, sous forme de chlorhydrate d'ester monométhylique (dans le cas de la leucine et de la phénylalanine) ou diméthylique (dans le cas de l'acide aspartique), sont introduits par mole de polystyrène sec. La réaction est initiée par l'ajout de 2 équivalents molaires de triéthylamine, suivie d'une agitation douce du mélange pendant 48 heures, puis de nouveau par l'ajout d'1 équivalent de triéthylamine, le milieu réactionnel étant maintenu sous agitation pendant 12 heures. Une fois la réaction de sulfamidation effectuée, les copolymères sont filtrés et lavés trois heures dans de l'éthanol pour éliminer les traces de dichlorométhane.

A ce stade, on obtient donc quatre familles de copolymères : . famille I : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, . famille II : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la phénylalanine, . famille III : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la leucine,

. famille IV : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de l'alanine, les copolymères de ces trois familles présentant chacun des degrés variables en acides aminés sous forme d'esters, ainsi que des unités styrène non substituées et des unités styrène substituées par des groupements chlosulfonates.

Dans le tableau I ci-après sont rassemblées, pour les familles de copolymères I à IV, les quantités d'acide aminé sous forme d'ester utilisées lors de la réaction de sulfamidation (quantités exprimées en grammes pour 2,5 grammes de polystyrène sous forme sèche, et en pourcentage molaire pour 100 moles de polystyrène), ainsi que les quantités de triéthylamine utilisées (en millilitres) lors du premier ajout (2 équivalents) et du second ajout (1 équivalent).

* Hydrolyse.

Pour les familles de copolymères I et IV, on procède ensuite à une réaction d'hydrolyse faible, au moyen de six lavages par de la soude 10-2 M, suivis de lavages à 1'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH des bains de lavage reste constant.

L'hydrolyse faible permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, ou des esters méthyliques de l'alanine.

Pour les familles de copolymères II et III, on procède à une réaction d'hydrolyse forte à l'aide de soude 2M. Afin de minimiser le choc osmotique et de ne pas endommager les microsphères de polystyrène, on utilise m gradient croissant, puis décroissant pour la concentration de la soude (dans l'ordre : 10-2, 10-1, 1, 2,1, 10-l, puis 10-2M). L'hydrolyse forte permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par le sel sodé de la phénylalanine ou de la leucine.

3) Caractérisation chimique des copolymères synthétisés.

Le tableau II résume les taux de substitution des quatre familles de copolymères, à savoir les taux en unités styrène non substituées (colonne « styrène » dans le tableau II), en unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium (colonne « sulfonate » dans le tableau II), et en unités styrène substituées par des acides aminés, sous forme d'ester méthylique dans le cas des copolymères de la famille I et de la famille IV, et sous forme de sel sodé dans le cas des copolymères des familles II et III (colonne « acide aminé » dans le tableau II).

Ces taux de substitution sont déduits de l'analyse élémentaire des copolymères en azote (analyseur Perkin-Elmer 2400 CHN), en soufre (analyseur Tableau I Famille des Quantité d'acide amine Quantite de tril ttiylamine (mi) copolymeres % molaire premier ajout second ajout Famille I la 0, 521 11 0, 73 0, 36 lb 1, 043 22 1, 47 0, 73 Ic 1, 564 33 2, 20 1, 10 Id 2, 086 44 2, 94 1, 47 le 2, 608 55 3, 68 1, 84 If 3, 129 66 4, 41 2, 20 Ig 3, 651 77 5, 15 2, 57 Ih 4, 173 88 5, 88 2, 94 Famille If IIa 0,569 11 0,73 0, 36 IIb 1,138 22 1,47 0, 73 IIc 1,708 33 2,20 1, 10 IId 2,277 44 2,94 1, 47 IIe 2,847 55 3,68 1, 84 IIf 3, 416 66 4, 41 2, 20 IIg 3,986 77 5,15 2, 57 lih 4, 555 88 5, 88 2, 94 Famille III Illa 0, 479 11 0, 73 0, 36 Illb 0, 959 22 1, 47 0, 73 IIIc 1,438 33 2,20 1, 10 Ilid 1, 918 44 2, 94 1, 47 IIIe 2, 397 55 3, 68 1, 84 Illf 2, 877 66 4, 41 2, 20 Illg 3, 357 77 5, 15 2, 57 IIIh 3,836 88 5,88 2, 94 Famille IV IVa 0, 368 11 0, 73 0, 36 IVb 0,373 22 1,47 0, 73 IVc 1, 105 33 2, 20 1, 10 IVd 1, 474 44 2, 94 1, 47 IVe 1, 842 55 3, 68 1, 84 IVf 2, 211 66 4,41 2,20 IVg 2, 579 77 5, 15 2, 57 IVh 2, 948 88 5, 88 2, 94 IVi 3,316 99 6, 60 3,30 Tableau II Famille de Taux (%) en unités Analyse elémentaire (% pondéral) Acide copolymères styrene sulfonate gonflement N S CI aminé FamilleI ) a27M91500. 6712, 31 traces (<0,01%) lb 27 54 17 142 1,17 11,76 " Ic 28 47 25 121 1,68 11,12 " Id 40 28 32 100 2, 19 9, 44" le 31 25 44 100 2, 69 9, 69 If 29 24 47 100 2, 84 9, 70 Ig 25 21 54 100 3,08 9,73 " Ih 16 16 68 100 3, 49 9, 91 Famille 11 Ila 21 73 6 210 0, 43 13, 09 traces (< 0, 01%) lib 21 65 14 187 0, 48 12, 29 IIc 27 53 20 175 1,36 11,19 " Ild 37 30 33 150 2, 11 9, 28 Ile 27 37 36 150 2, 18 10, 07" IIf 26 21 53 150 2,88 9,22 " jig 21 19 60 150 3, 07 9,29 ' IIh 18 15 67 150 3,27 9,18 " Famille III IIIa 26 66 8 150 0,57 12, 54 traces (< 0, 01%) IIIb 21 60 19 150 1,29 12,23 " Illc 22 51 27 145 1, 77 11, 68" IIId 20 44 36 124 2,23 11,29 " Ille 18 30 52 110 2, 94 10, 65 IIIf 20 18 62 100 3,37 10,04 " IIIg 20 9 71 100 3,75 9,62 " Ilih 13 4 83 100 4, 06 9, 72 Famille IV IVa 32 60 8 215 0, 61 12, 34 0, 2 IVb 24 59 16 183 1, 16 12, 79 0,2 IVc 23 50 26 167 1,85 12, 46 0,2 IVd 25 41 35 155 2,34 11, 99 0,2 IVe 56 31 42 137 2,9 11, 51 0,2 IVf 15 25 59 115 3,66 11, 91 0, 2 IVg 17 19 63 106 3, 89 11, 65 0,2 IVh 23 . 2 74 100 4, 55 12, 24 0,2 IVi 21 2 77 100 4, 61 11, 39 0,2 IVj 15 7 78 100 4,56 11, 58 0,2

coulométrique Tacussel de type Coulomatic S-Cl) et en chlore (analyseur Titrator DL 55 de Mettler Toledo), mesurée après passage des copolymères dans un four à 50°C, pendant un temps suffisant pour rester à poids constant. Dans le tableau I, l'analyse élémentaire en azote (N), en soufre (S) et en chlore (CI) est donnée en pourcentage pondéral (c'est-à-dire en grammes pour 100 grammes de polystyrène sous forme sèche).

Le tableau II mentionne également le taux de gonflement des copolymères, mesuré par la différence entre le volume occupé par une quantité donnée de copolymère à l'état sec (sous forme de poudre) et le volume occupé par cette même quantité de copolymère placé dans du milieu Guillard f/2 tel que décrit par R. R. L.

Guillard (1983) dans l'ouvrage Culture of Marine Invertebrates, Selected Readings, C. J. Berg Jr. Editor, pages 108-132. Ce milieu consiste en de 1'eau de mer dans laquelle sont additionnés les sels nutritifs nécessaires à la croissance des microalgues Slexandriglm minutum, Heterocapsa triquetra et Scrippsiella trochoidea. On constate que le taux de gonflement est d'autant plus important que le copolymère comprend un taux de substitution en groupements sulfonates de sodium élevé (groupements de nature hydrophile).

EXEMPLE 2 : Culture de microalgues et marquage radioactif de ces dernières.

1) Culture des microalgues.

Des souches d'alexandrium minutum (souche AM89BM fournie par 1'IFREMER) et d'Heterocapsa triquetra (souche CCMP 449 fournie par la société CCMP, West Boothbay Harbour, USA) sont cultivées dans des conditions similaires à celles décrites par S. La Barre et al. dans Journal of Biotechnology, 1999,70, 207-212 : le milieu de culture consiste en 80 ml d'eau de mer (qui a été filtrée de façon à en éliminer les bactéries) enrichie de 3 ml de solution de Guillard f/2 exempte de silicium. Ce milieu est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes, puis enrichi par des vitamines du groupe B à l'état de traces. Une solution antibactérienne commerciale (Life Teclmologies, Eragny, France) comprenant un mélange de pénicilline (5000 unités/ml) et de streptomycine (5000 unités/ml) est ajoutée à ce milieu, à raison de 1% en volume, avant son inoculation avec 105 cellules d'Alexandrium minutum ou d'Heterocapsa triquera. Le milieu est complété à 100 ml par du milieu f/2 stérilisé, puis il est incubé à 17°C sous une alternance de lumière (85 pE. s~l. m~2) et d'obscurité avec des cycles 12 heures/12 heures, une agitation douce étant effectuée deux fois par jour.

La courbe de prolifération (représentation du nombre de cellules par ml en fonction du temps) de la souche Alexandrium minutum révèle une période de latence de 2 jours, suivie d'une phase de multiplication exponentielle de 21 jours, puis

d'une période stationnaire (plateau) au jour 23. La vitesse de division cellulaire à la moitié de la phase exponentielle de croissance (jour 14 après l'inoculation) est de 3, 4 jours, en accord avec ce qui a été décrit dans l'article de S. LA BARRE et al.

(ibis).

Scrippsiella troclzoiclea possède un temps de génération de 4, 35 jours à la moitié de la phase exponentielle de croissance (jour 9 après l'inoculation), le début de la phase stationnaire (plateau) étant observé au jour 14.

Heterocapsa triquetra présente un cycle de croissance plus rapide qu'Alexandrium minutes : la phase de latence est de 1,5 jours et celle de multiplication exponentielle est de 7 jours, le plateau étant atteint au jour 8,5. La vitesse de division cellulaire est de 1,7 jours, c'est-à-dire deux fois plus rapide que celle d'Alexandrium minutes.

2) Marquage radioactif des microalgues.

Le marquage des cellules d'Alexandrium minutum, d'Heterocapsa triquetra ou de Scrippsiella trochoidea est également effectué conformément à S. LA BARRE et al. (ibid) : 100 ml de la culture d'Alexandrium minutum (âgée de 14 jours) de Scrippsiella trochoidea (âgée de 9 à 10 jours) ou la culture d'Heterocapsa triquetra (âgée de 5 jours) est incubée avec 250 IlCi d'orthophosphate 33P dans 25 Ll d'acide chlorhydrique 10-2 M, commercialisé par la société Amersham (France), pendant 96 heures pour Sllexandrizlm minutum, pendant 67 heures pour Scrippsiella trochoidea ou pendant 41 heures pour Heterocapsa triquera.

Le milieu est ensuite réduit à un volume de 20 ml par filtration sur une membrane de porosité égale à 5 micromètres (membrane Durapore' commercialisée par Millipore), puis complété à 100ml par ajout d'im nouveau volume de milieu f/2, ces opérations étant répétées 7 à 8 fois jusqu'à ce que l'on ne détecte plus qu'une radioactivité négligeable dans le filtrat, mesurée comme indiqué dans l'article de S. LA BARRE et al. (ibid).

EXEMPLE 3 : Sélection des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers Alexandrium minutum, Scrippsiella trochoidea ou Heterocapsa triquetra.

1) Cinétique d'adhésion cellulaire.

La mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire permet d'évaluer le temps de contact optimal pour l'adhésion des cellules aux copolymères. Pour cette mesure, on utilise un copolymère test, par exemple un copolymère à base de polystyrène substitué à hauteur de 81% par des groupements sulfonates de sodium. Ce copolymère est préparé conformément au protocole décrit dans 1'exemple 1, par une étape de chlorosulfonation suivie d'une réaction d'hydrolyse.

20 mg (poids sec) de ce copolymère test sont mis en suspension dans

200 ptl de milieu f/2. On y ajoute une quantité donnée (environ 105 cellules) de cellules d'Alexandrium minutum marquées au 33P conformément à 1'exemple 2, le mélange étant ensuite complété jusqu'à 7ml par du milieu f/2. On prépare 7 échantillons de ce mélange.

Les sept échantillons sont placés sous agitation, à la vitesse de 10 rpm, pour des durées respectives de 4,8,24,30,50, 56 et 72 heures et à la température de 17°C. A l'issue de chacun de ces sept temps respectifs d'incubation, l'échantillon correspondant est filtré sur un tamis de nylon de trame égale à 60 u. m, de façon à retenir le copolymère et à éliminer les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère. La filtration est suivie de trois lavages par 1 ml de milieu f/2.

Les mesures de radioactivité sur chaque échantillon sont réalisées comme suit : le filtre de nylon, avec le résidu de filtration, est placé dans une fiole de scintillation, auquel on ajoute 1 ml de soude 2M afin de lyser les cellules, puis 10 ml de fluide de scintillation (commercialisé par la société Fisher Chemicals sous la dénomination Wallac Optiphase Hisafe 2). Par ailleurs, pour contrôle, 200 Ll du filtrat contenant les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère sont placés dans une fiole de scintillation contenant 1 ml de soude 2M et 2 ml de fluide de scintillation. Le contenu des fioles est homogénéisé au vortex et l'émission de rayons P est mesurée sur un appareil Wallac LKB 1214 de la société Rackbeta.

Le même protocole est suivi avec les cellules d'Heterocapsa triquetra et de Scrippsiella trochoidea, le temps d'incubation des cellules avec le copolymère porteur de groupements sulfonate de sodium étant respectivement de 25, 32,54,68 et 72 heures.

Pour chaque type de cellules, on obtient la cinétique d'adhésion cellulaire au copolymère testé : en fonction du temps, le nombre de cellules qui adhèrent au copolymère est d'abord croissant, puis atteint un plateau. Ce plateau est atteint à partir de 55 heures pour alexandrium minutum et à partir de 32 heures pour Heterocapsa triquetra. Dans les expériences d'adhésion cellulaire qui suivent, dans le but de conserver une marge de sécurité, les temps d'incubation des différents copolymères avec les cellules d'Alexandrium mimltunt ou d'Heterocapsa triquera seront respectivement de 72 heures et de 48 heures.

2) Adhésion cellulaire en fonction de la composition du copolymère.

20 mg (poids sec) de chacun des huit copolymères des familles I, II, III et IV, préparés conformément au protocole décrit dans l'exemple 1 et mis en suspension dans du milieu f/2, sont mis en présence d'une quantité donnée (environ 105 cellules) de cellules d'Alexandrium minutuna marquées au 33P conformément à l'exemple 2 (14250 cellules/ml, marquées à 15 cpm par cellule). A l'issue de

72heures d'incubation à 17°C, on sépare le copolymère (auquel ont adhéré des cellules) des cellules libres en solution au moyen de l'étape de filtration décrite précédemment en rapport avec la mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire. On mesure ensuite la radioactivité du copolymère, comme indiqué ci-dessus.

On procède de la même façon à partir de cellules ScriRpsiella troclzoidea et d'Heterocapsa triquera, mises en présence respectivement des huit copolymères de la famille I pendant 48 heures, et des neuf copolymères de la famille IV pendant 24 heures.

La figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d'Alexandrium minutum en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères de la famille I en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé par le rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe-+-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe--).

On observe une zone d'adhésion non spécifique jusqu'à un taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique d'environ 30%, la surface disponible pour l'adhésion des cellules étant plus importante pour les copolymères qui présentent un taux de substitution en acide aminé faible (copolymères qui présentent le taux de gonflement le plus important).

Au-delà de 30% de substitution, le gonflement des copolymères reste stable, permettant des comparaisons entre les taux d'adhésion des cellules. Le pic marqué sur le graphique est significatif d'une adhésion cellulaire spécifique, qui a lieu pour les copolymères qui comprennent entre 44 et 55% d'ester diméthylique de l'acide aspartique.

D'autre part, les profils d'adhésion réalisés à partir des copolymères des familles II et III, en présence des cellules d'Xlexandrum mnutum, n'ont révélé aucune affinité spécifique entre ces copolymères et ces cellules. La spécificité des copolymères envers les cellules d'Alexandrium nzitzutzem apparaît donc dépendante de la composition du copolymère. Cette spécificité pourrait s'expliquer par le fait que les copolymères, de par l'arrangement statistique des différentes unités styrène, sulfonates et ester diméthylique de l'acide aspartique, présentent des sites de liaison spécifiques envers un ou plusieurs composants de la membrane plasmique des cellules.

La figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d'Heterocapsa triquera en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que

ceux de la figure 1.

En présence des cellules d'Heterocapsa triquetra, contrairement à ce qui est observe avec Alexandrium minutum, les copolymères de la famille I ne donnent pas lieu à une interaction spécifique, bien que Heterocapsa triquetra soit également un dinoflagellé autotrophe, qui appartient à une famille taxonomique (Peridiniaceae) proche de celle d'Alexandru7n mnutum (Gonyaulacaceae). Ces résultats montrent que l'affinité des copolymères de la famille I envers les cellules testées est spécifique de l'espèce Alexandrium minutum.

La figure 3 représente le profil d'adhésion des cellules d'Alexandrziuz7Z mnutum en fonction de la composition des copolymères de la famille IV. Les abscisses représentent le taux de subsitution des copolymères de la famille IV en ester méthylique de l'alanine. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé par le rapport signal/bruit de fond (courbe-+-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe--).

Le profil d'adhésion correspond : -d'une part à l'augmentation de l'adhésion des cellules, de caractère non spécifique de la composition des copolymères, dès que cette dernière est inférieure à 30% en ester méthylique de l'alanine. Cette augmentation du bruit de fond est monotone et n'excède pas 0,5% des cellules adhérées pour la composition la plus faible en ester méthylique de l'alanine (8%), -d'autre part à la présence d'un pic significatif d'une adhésion cellulaire spécifique des copolymères comprenant au moins 8% d'ester méthylique de l'alanine, et au plus 30%.

Au delà de 30% de substitution, le gonflement des copolymères reste stable et le profil d'adhésion est monotone, ne présentant aucune indication d'adhésion cellulaire excédant le bruit de fond de manière significative.

La figure 4 représente le profil d'adhésion des cellules de Scrippsiella trochoiclecz en fonction de la composition des copolymères de la famille IV. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes signification que ceux de la figure 3.

Le profil d'adhésion des cellules de Scrippsiella trochoidea sur les copolymères de la famille IV est comparable à celui observé pour Alexandrizenm mihzatum sur la figure 3.

Ces résultats montrent que les copolymères de la famille IV, possédant au moins 8% et au plus 30% d'ester méthylique de l'alanine présentent des sites de liaison envers un ou plusieurs composants de la membrane plasmique d'Alexandrium minutum et de Scrippsiella trochoidea qui appartiennent à des familles taxonomiques proches, respectivement Peridiniaceae et Gonyaulacaceae, mais ne possèdent pas d'affinité spécifique de genre vis-à-vis de Scrippsiella trochoidea et Alexandrium minutum.