CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção descreve um processo e sistema fermentativo integrado para produção e extração de etanol de segunda geração a partir de pentoses. É objeto adicional o etanol produzido a partir do processo integrado.

[2] A tecnologia possui aplicação em usinas de etanol de segunda geração, a partir de biomassa lignocelulósica, composta de xilose e outros açúcares, como uma fonte de combustível renovável.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[3] A ineficiénte conversão dos açúcares, hexoses e pentoses, em etanol é um dos maiores obstáculos para as indústrias que dependem do desenvolvimento dè processos viáveis. Além disso, Scheffersomyces stipitis (também' conhecida como Pichia stipitis) é fortemente inibida por elevadas concentrações de substrato no meio, bem como pelo etanol acumulado. Assim, existe uma forte necessidade para o desenvolvimento de novas tecnologias para aperfeiçoar processos fermentativos visando à produção de etanol de segunda géraçáo. As tecnologias propostas atualmente na literatura têm a desvantagem de serem relativamente lentas e/ou reportarem rendimentos relativamente baixos, o que inviabiliza a aplicação das mesmas para ampliação de escala e aplicação industrial. É imprescindível para aplicações industriais; que o processo de fermentação de pentoses em etanol seja rápido e gere altos rendimentos, para não encarecer e inviabilizar a transferência de tecnologia. Também é desejável a minimização da perda do substrato para promover o crescimento celular bem como promover o reciclo de células, possibilitando operar com altas densidades celulares, e, consequentemente, possibilitar a utilização mais eficiente do substrato no processo. A otimização da produção de etanol a partir de S. stipitis pode ser atingida através da manipulação das condições de cultura bem como definição de estratégias operacionais que minimizem os efeitos inibitórios promovidos pelas altas concentrações de açúcares administradas e pela concentração de etanol acumulado.

[4] Uma eficiente produção de etanol de segunda geração (2G) a partir da fração de pehtoses da matéria-prima lignoceiulósica, a qual resulta em elevados rendimentos, produtividades e concentrações de etanol ainda não foi descrita.

[5] Uma alternativa para produção de álcool a partir de pentoses está descrita no documento WO2014060678. A tecnologia refere-se ao desenvolvimento de uma nova linhagem de Saccharomyces cerevisiae pela inserção de genes de S. stipitis para metabolizar frações de açúcares C5, tornando a linhagem capaz de crescer nessas frações. A aplicação da tecnologia está relacionada a áreas de panificação, produção de aromas e produção de cerveja, etc. Mas o foco não é a produção de álcool 2G, diferentemente da presente invenção que trata de sistema e processo integrado para produção de biocombustível.

[6] A levedura S. stipitis da classe ascomicetos têm demonstrado grande potenciar como catalisador biológico para produção de etanol lignocelulósico devido à sua habilidade de fermentar uma ampla variedade de açúcares presentes nos hidrolisados lignocelulósicos, incluindo celobiose, hexoses e pentoses. Essa matriz lignocelulósica é composta por uma mistura complexa de açúcares, a qual contém em média 40 % de açúcar xilose, que é a fração mais problemática para a fermentação da matriz (Slininger et al., 2014). A xilose é um açúcar de cinco carbonos: (denominado C5) que não é diretamente fermentado pela levedura Saccharomyces cerevisiae, linhagem amplamente utilizada para produção de etanol 1G. Por outro lado, S. stipitis (anteriormente Pichia stipitis) (Kurtzman and Suzuki, 2010) é um biocatalizador potencial para a produção de etanol 2G a partir de derivados lignocelulósicos, pois esta levedura é capaz de fermentar naturalmente os açúcares C5 a um nível comercialmente promissor (Slininger et al., 2014; Farias et al., 2014; Unrean et al., 2013; Abgogo et al., 2008).

[7] No entanto, o desempenho de S. stipitis em processos fermentativos é fortemente dependente das condições operacionais e/ou de cultivo.

[8] O documento CN102787143 refere-se a um método de fermentação para produção de etanol por imobilização celular da levedura S. stipitis. A levedura é utilizada como cultura starter e, posteriormente, é imobilizada em alginato de manganês, prolongando a viabilidade da linhagem. A tecnologia não prevê a eliminação dos efeitos tóxicos promovidas pela elevada concentração de álcool. A presente invenção, diferente do documento citado, retém totalmente as células da linhagem de S. stipitis por meio de microfiltração tangencial em membrana, processo denominado retentostato. Ainda, opera-se o sistema em velocidades de crescimento próximas de zero, situação que a levedura maximiza a produção de álcool, e há a extração de álcool concomitantemente à sua produção, evitando efeitos tóxicos para S. stipitis. Desta forma, proporciona aumento de rendimentos e produtividades no processo de fermentação.

[9] O documento CN102660589 consiste na produção de celulases, a partir de Aspergillus niger ou Trichoderma koningii, gerando um hidrolisado com açúcares fermentescíveis para produção de etanol por Cândida shehatae ou S. stipitis. O processo fermentativo é realizado por 3-7 dias e ocorre filtração e destilação por baixa pressão de toda solução contendo o etanol. Por outro lado, a presente invenção se trata de um processo que retira constantemente o álcool produzido por um sistema de vácuo a baixa pressão, sem a necessidade de filtragem anterior. Além disso, trata-se de um processo integrado de produção e extração de etanol, e que ocorre constantemente em modo retentostato e não no modo convencional denominado batelada, como será explicada mais adiante.

[10] A otimização dos ganhos em rendimento e produtividade é um dos pré-requisitos para o desenvolvimento de um processo economicamente rentável a partir da matriz lignocelulósica. Por outro lado, atualmente as pesquisas desenvolvidas para investigar a produção de etanol 2G por leveduras são conduzidos principalmente no modo de operação batelada simples. A operação de fermentadores no modo batelada apresenta algumas limitações que impedem o seu uso para obtenção de alta eficiência na produção de etanol. Isto ocorre porque geralmente todos os nutrientes estão presentes em excesso no início dos cultivos em batelada, e nesta situação normalmente são evidenciados efeitos tóxicos para o metabolismo dà levedura, efeitos estes provocados principalmente pelas elevadas concentrações de açúcar e etanol no meio.

[11] Além disso, como consequência, a velocidade específica de crescimento (μ) da levedura durante a fase inicial de fermentação em batelada é próxima à velocidade específica máxima de crescimento celular (pma ), Ό que muitas vezes não é condição otimizada para produção de etanol (Riesenberg et a!., 1991 ; Anderson et al., 1999; Boender et al., 2009; Cho et al., 201 1 ; Farias et al., 2014). Na prática, o crescimento microbiano em ambientes naturais é geralmente limitado pela disponibilidade de nutrientes e a velocidade específica de crescimento é susceptível de ser definida por um ou mais nutrientes limitantes do crescimento no ^• meio, resultando em taxas específicas de crescimento muito baixas (Brock, 1971 ; Koch, 1997).

[12] Cultivos de S. stipitis em modo quimiostato tem um forte efeito da velocidade específica de crescimento sobre o acúmulo de células e formação de produto (Farias et al., 2014). A velocidade específica de crescimento no estado estacionário está na faixa de 0.008-0.150 h ^~1 . Embora esta faixa já seja relevante para a produção industrial de etanol combustível, há o interesse no crescimento desta levedura em velocidades específicas menores. Além disso, durante cultivos em que a velocidade específica de crescimento é praticamente nula, a idade individual de cada célula de levedura torna-se muito maior do que a que pode ser obtida durante os cultivos convencionais operados no modo batelada e/ou quimiostato e, nesta situação (crescimento limitante em baixas velocidades específicas de crescimento) uma fração relativamente grande de energia, proveniente do substrato, tende a ser dissimilada para processos associados à manutenção celular (Pirt, 1965; Boender, 2009).

[13] Para manter a fisiologia microbiana a uma velocidade específica de crescimento próxima de zero, foram desenvolvidos cultivos operados no modo retentostato por Hebert (1961). Um retentostato nada mais é do que um quimiostato modificado: a energia limitante de crescimento é alimentada a uma velocidade constante e as células são mantidas no reator através de um filtro externo conectado à linha de efluente. Desta forma, durante ^' cultivos em retentostato prolongados a velocidade específica de crescimento deve, em teoria, se tornar nula e a velocidade específica de consumo de substrato deverá ser igual à energia de manutenção requerida. De acordo com Boender et al. (2011), em um típico experimento em retentostato, a taxa de fornecimento do nutriente limitante ao crescimento é mantida constante ao longo do tempo. Assim, a concentração celular irá aumentar devido à retenção de células no interior do reator. Consequentemente, a disponibilidade de substrato para cada célula individual diminui ao longo do tempo. Neste processo, o consumo de substrato é Utilizado por dois processos essenciais à levedura: manutenção e crescimento. Teoricamente, durante a cultura em crescimento nulo, a levedura cataboliza o nutriente limitante exclusivamente pára fornecer a energia necessária para o processo de manutenção, sendo que o micro-organismo permanece metabolicamente ativo evitando ou ao menos retardando a deterioração de sua atividade metabólica.

[14] Outro problema no estado da técnica é o fato de que a relação de equilíbrio entre o crescimento celular e a produção de etanol por S. stipitis é fortemente inibida na presença de elevadas concentrações de açúcar e etanol acumulado no meio, e este comportamento apresenta uma limitação na obtenção de elevados rendimentos e produtividades. Estudos realizados por Farias et al. (2014) evidenciaram que a levedura S. stipitis é fortemente inibida por altas concentrações de etanol e de substrato, não promovendo altas conversões e altos rendimentos simultaneamente em processos em batelada simples e batelada alimentada.

[15] As elevadas concentrações de etanol no final de cada ciclo de fermentação (nas etapas batelada simples e batelada alimentada) é um dos principais fatores de estresse que atuam sobre o metabolismo da levedura (Basso et al., 2011). Devido a isso, a manutenção de concentrações baixas de etanol no meio de fermentação é extremamente importante, a fim de minimizar estes fatores inibitórios. O papel inibitório de etanol sobre o metabolismo de S. stipitis ainda não foi completamente compreendido. Somando-se a isso, concentrações elevadas de etanol atacam a membrana citoplasmática das células de levedura (Thomas et al., 1978; Alexandre et al., 2001 ). Como resultado, a fluidez da membrana é profundamente alterada na presença de elevadas concentrações de etanol e, consequentemente, a permeabilidade da membrana para alguns íons (especialmente os íons H+) é significativamente afetada. Nesta condição, como os íons podem entrar no interior das células, ocorre uma dissipação do gradiente electroquímico através da membrana citoplasmática,: afetando assim a formação e a manutenção da força próton motriz, que por sua vez diminui o pH intracelular até provocar a morte celular. Além de afetar a composição da membrana celular, existem vários outros efeitos tóxicos do etanol sobre a fisiologia da levedura durante o processo fermentativo, incluindo a inibição do crescimento, e inativação enzimática, o que leva a uma diminuição da viabilidade celular (Basso et al., 201 1 ).

[16] O documento US2013337527 refere-se à produção de butanol, acetona e etanol por processo fermentativo continuo pela linhagem de Clostridium imobilizada em suporte presente em biorreator ou em múltiplos biorreatores, com alimentação continua de matriz lignocelulósica que é continuamente hidrolisada em etapa anterior a alimentação dos biorreatores. Diferentemente, a presente invenção é um sistema e processo integrados em que a fermentação e a extração do álcool ocorrem concomitantemente e o micro-organismo fermentativo é o S. stipitis. Além disso, a presente invenção permite aumentar a produtividade e rendimento de etanol por meio do controle da extração do álcool, do controle da velocidade de alimentação de substrato e da retenção total das células de levedura.

[17] O documento KR2014018757 propõe um processo de produção de etanol, compreendendo o processo "green laver" com catalisador do processo de hidrólise e a aplicação de hidrolases para a realização do processo de sacarificação, promovendo a obtenção de monossacarídeos, e, posteriormente ocorre a fermentação destes monossacarídeos por Saccharomyces cerevisiae e Pichia stipitis. O processo não elimina os efeitos tóxicos promovidos pelo acúmulo de elevadas concentrações de etanol durante o processo fermentativo, bem como não efetua estratégias operacionais de processo visando o aumento de produtividade. Enquanto que na presente invenção, há a eliminação dos efeitos tóxicos (altas concentrações de etanol e substrato) através de estratégias de extração e velocidade de alimentação de substrato, proporcionando aumento de produtividade na produção de etanol.

[18] Frente ao exposto, a presente tecnologia é um sistema integrado de produção e extração simultânea do etanol, denominado retentostato extrativo, no qual o comportamento cinético da levedura Scheffersomyces stipitis em condições de crescimento próximas de zero maximizam o consumo de pentoses e aumentam a produção de etanol. A estratégia de fermentação no ^! modo retentostato permite o controle da velocidade específica de crescimento da levedura através do reciclo total da mesma e controle da taxa de alimentação de substrato no sistema, e pode ser aplicada para evitar a inibição pelo substrato e acúmulo de sub-produtos indesejáveis. Somando-se a isso, o etanol é continuamente extraído pelo vácuo promovido no tanque flash, evitando assim que elevadas concentrações de etanol se acumulem no meio fermentativo. As estratégias em conjunto maximizam o desempenho da produção de etanol por S. stipitis, possibilitando obter altos rendimentos e produtividades.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [19] Á presente invenção descreve um processo e sistema fermentativo integrado para produção e extração de etanol de segunda geração a partir de pentoses, sua fermentação pelo micro-organismo Scheffersomyces stipitis e compreende pelo menos um reator, um sistema de separação de células, o qual pode ser realizado por microfiltros ou centrífugas; tanque flash a vácuo; bombas; meios para produção de vácuo, sistema de condensação e etapas e subetapas.

[20] É objeto ¹ adicional da presente invenção os produtos obtidos a

i

partir do sistema fermentativo integrado, preferencialmente, o etanol.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 . Modalidade experimental retentostato extrativo a vácuo, com extração de etanol no modo intermintente. Legenda: 1 - Reator; 2 - Meio de alimentação; ₍ 3 - Bomba peristáltica de alimentação; 4 - Sistema de filtração; 5 - Bomba peristáltica de circulação; 6 - Líquido permeado; 7 - Bomba peristáltica de permeado; 8 - Tanque flash; 9 - Válvula solenóide entrada flash; 10 - Sistema de condensação; 1 1 - Válvula solenóide descarga atmosférica; 12 - Primeira coluna de destilação; 13 - Segunda coluna de destilação; A - Sistema de vácuo.

Figura 2. Modalidade experimental do 'retentostato extrativo a vácuo', com extração de etanol no modo continuo.

Figura 3. Modalidade experimental do 'retentostato extrativo a vácuo', com extração de etanol no modo contínuo, múltiplos estágios.

Figura 4. Perfis de concentrações de célula, substrato e etanol em função do tempo de fermentação durante cultivos com S. stipitis operados no modo retentostato extrativo a vácuo, realizados com diferentes concentrações de substrato no meio de alimentação a) Sa = 100 g.L-1 ; b) Sa = 150 g.L-1 ; c) Sa = 200 g.L-1 . Símbolos: X (·); S (■) and P ( A).

Figura 5. Influência da velocidade específica de crescimento na produtividade em etanol para S. stipitis em diferentes concentrações de xilose no meio de alimentação, a) Sa = 100 g.L-1 ; b) Sa = 150 g.L-1 ; c) Sa = 200 g.L-1. Os experimentos foram realizando utilizando a tecnologia REV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[21] A presente invenção descreve um processo e sistema fermentativo integrado para produção e extração de etanol de segunda geração a partir de pentoses e sua fermentação pelo micro-organismo Scheffersomyces stipitis.

[22] O sistema integrado para produção de etanol de segunda geração a partir de pentoses (Figura 1 ) compreende:

- pelo menos um reator (1);

- bombas (3, 5, 7):

- meios dè retenção e/ou separação de células, o qual pode ser realizado por microfiltros ou centrífugas (4);

- tanque flash a vácuo (8);

- meios para produção de vácuo (A), o qual pode ser realizado por bomba de vácuo ou sistemas de geração de vácuo segundo o princípio "venturi";

- sistema de condensação (10);

- sistema de destilação (12, 13). [23] Num outro aspecto, o processo integrado fermentativo para produção de etanol de segunda geração a partir de pentoses compreende as seguintes etapas e subetapas:

a. Cultura da levedura S. stipitis e fermentação de meio de cultivo em reator (1 ), no modo de operação batelada simples até o esgotamento da concentração substrato;

b. Alimentação de meio de cultivo (2) para o reator (1 ) através de uma bomba dosadora (3), caracterizando a passagem do modo batelada simples para o modo de operação batelada alimentada, até o volume máximo do sistema ser preenchido;

c. Após o volume máximo do sistema ser atingido conforme (b), ocorre a etapa de retenção celular (retentostato), operada de dois modos distintos (referência Figura 1 ):

c.i. Sem reciclo de células, com alimentação contínua de mèio de cultivo (2) para o reator (1), sendo que a retenção celular ocorre devido ao volume de etanol extraído no condensador (10);

c.ij. Com reciclo de células, com alimentação contínua de méio de cultivo (2) para o reator (1 ), e ocorre no caso de que na etapa (c.i) a vazão de alimentação seja superior a vazão de; etanol extraído no condensador (10). Neste caso, para manter o volume e a taxa de diluição do sistema constantes pode-se operar conforme as seguintes sub-etapas: c.ii.1) Passagem do líquido fermentado contido no reator (1) pelo microfiltro (4) através do acionamento da bomba de circulação (5);

c.ii.2) Remoção de líquido permeado (6) (livre de células) através do acionamento da bomba (7);

c.ii.3) Retorno do líquido que passou pelo microfiltro (4) (concentrado em células) para o reator (1), devido a operação da bomba de circulação (5);

c. ii.4) Envio do líquido permeado (6) descrito em (c.ii.2) para a primeira coluna de destilação (12);

d. Extração do etanol produzido na etapa (c), através de dois modos alternativos:

d.i. Extração no modo intermitente (Figura 1), a qual compreende:

d. i.1) Envio do meio fermentado contido no reator (1) para o tanque flash (8);

d.i.2) Acionamento dos meios para produção de vácuo (A);

d.i.3) Abertura da válvula (9) de sucção posicionada na entrada do tanque flash (8);

d.i.4) Transferência de meto fermentado do reator (1) para o tanque flash (8) devido a diferença de pressão do sistema;

d.i.5) Fechamento da válvula (9); d.i.6) Extração do etanol devido ao vácuo formado em d.i.2);

d.i.7) Condensação do etanol extraído em d.i.6) no condensador (10);

d.i.8) Desligamento dos meios para produção de vácuo (A);

d.i.9) Acionamento da válvula de descarga atmosférica (11) posicionada na saída do tanque flash (8) para promover a quebra de vácuo do sistema; d.i.10) Retorno do meio fermentativo ao reator (1 ), através da abertura da válvula (9) posicionada na entrada do tanque flash (8);

d. i. 1) Fechamento das válvulas posicionadas na entrada (9) e na saída (11) do tanque flash (8);

d.i.12) Retomada do processo de fermentação no reator (1 ) até o próximo ciclo de extração.

d.ii. Extração no modo contínuo, a qual compreende

(referência Figura 2):

d.ii.1) Acionamento dos meios de produção de vácuo (A);

d.ii.2) Envio do meio fermentativo do reator (1) para o tanque flash (8) através do acionamento da bomba (5);

d.ii.3) Retomo do meio fermentativo do tanque flash (8) para o reator (1) pelo acionamento da bomba (9); d.ii.4) A circulação de meio fermentativo entre o reator (1) e o tanque flash (8) conformes as etapas d.ii.2) e d.ii.3) é feita continuamente, caracterizando a extração do etanol no modo contínuo;

d.ii.5) A extração de etanol no modo contínuo pode ser operada em um único estágio (Figura 2) ou múltiplos estágios de fermentação (Figura 3).

e. Envio do etanol extraído conforme (d.i) e/ou (d.ii) é enviado para a segunda coluna de destilação (13);

[24] Sendo que:

-Na etapa (a), a concentração da xilose é entre 20 g.L- e 50 g.L ^-1 ' preferencialmente de 50g.L ^~1 .

-Na etapa (a), ocorre a fermentação completa após aproximadamente 40h.

-Durante a etapa (a), amostragens do líquido fermentado podem ser retiradas periodicamente para quantificar a concentração de substrato no reator (1) e determinar corretamente o momento da exaustão de substrato. Esta quantificação é feita através de metodologias analíticas, como é o caso de quantificação por cromatografia líquida de alta performance (HPLC).

-Na etapa (b), a concentração de xilose é entre 80 g.L ¹ e 120 g.L ^"1 , preferencialmente de 100 g.L ¹ .

-Na etapa (c), a velocidade específica de crescimento do microorganismo para produção de etanol pode variar entre 0.025 (velocidade ótima) até 0.001 , aonde ocorre a máxima concentração celular. -Na etapa (c.i) e (c.ii), a vazão do meio de alimentação é feita de acordo com a concentração da xilose no meio de alimentação, e esta pode variar de 80 até 200 g.L , preferencialmente de 100 g.L ^"1 , sendo que a alimentação nestas condições corresponde a 2 g.h ^" ,L ¹ de volume de meio no reator (1).

-Na etapa (c.i) a retenção celular ocorre devido ao fato de que, no momento da extração no tanque flash (8) a fase mais volátil (etanol e água) evapora devido a pressão de vácuo e condensa no condensador (10). Como este líquido condensado é livre de células, o líquido que retorna para o reator (1) terá maior concentração celular.

-Na etapa (c.j), a vazão alimentação deve equivaler à vazão da solução etanol extraída no condensador (10), de maneira a manter o volume do sistema constante.

-Caso na etapa (c.i), a vazão de etanol extraído supere a vazão de meio alimentado, o sistema é operado conforme a etapa (c.ii).

- Na etapa (c.ii), a vazão alimentação equivale à vazão de permeado (6) mais a vazão da solução etanol extraída no condensador (10), de maneira a manter o volume do sistema constante.

- Na etapa (c.ii), o controle do volume de líquido no reator (1 ) pode ser realizado com p auxílio de uma boia de nível ou controle por peso, responsável por acionar as bombas de alimentação (3) e permeado do sistema (7), através de um software supervisório.

-Na etapa (d) os meios para produção de vácuo (A) podem funcionar na faixa de pressão entre de 100 a 200 mmHg, preferencialmente de 150 mmHg. -Na etapa (d), a condição de vácuo descrita é capaz de gerar uma solução de etanol concentrada no condensador (10), com aproximadamente 40°GL, podendo variar entre 35 e 50°GL, dependendo da operação d sistema, com meio retornando para o reator (1 ) com concentração de etanol próximo de 0°GL (mantendo 25-35 g.L ¹ de etanol no reator, minimizando a toxidez)

- Na etapa (d), o condensador é resfriado à temperatura adequada (10 °C a 25 °C) para promover a condensação da solução alcoólica.

-A etapa (d.ii), ou seja, extração intermitente pode ser realizada a cada 12h ou com uma frequência maior caso a concentração de etanol no reator (1 ) esteja acima de 35 g.L ¹

É objeto adicional o etanol produzido a partir do processo integrado.

Micro-organismo e meio de cultivo

[25] A linhagem Scheffersomyces stipitis NRRL-Y7124 utilizada na presente tecnologia é proveniente da coleção de levedura ARS Culture Collection (National Center of Agricultural Utilization Research, Peoria, IL). As culturas devem ser mantidas regularmente em tubos inclinados contendo meio GYMP (composição em g.L-1 ): ágar-ágar, 20; glicose, 10; extrato de levedura, 5; extrato de malte, 20; e fosfato de sódio monobásico, 2. As cepas foram mantidas a 4 ^o C no Laboratório de Engenharia de Bioprocessos / Faculdade de Engenharia de Alimentos / Unicamp, Campinas, Brasil.

[26] A ativação foi realizada em dois passos. Inicialmente, a pré-cultura foi ativada por inoculação de uma cultura estoque em frascos agitados de 250 mL, com 100 ^' mL de meio GYMP (sem ágar) a pH 5,0 durante 24 h 1 / 4 em agitador rotativo a 28 ° C e 150 rpm. No segundo passo, este inoculo foi aclimatizado em meio mineral com a mesma composição do biorreator durante um período de 24 h usando agitador rotativo nas mesmas condições utilizadas no primeiro passo. O extrato de levedura e o extrato de malte foram utilizados como um suplemento de aminoácidos e vitaminas necessários para suportar o crescimento das células. O meio mineral utilizado para a ativação e para os cultivos no modo retentostato está descrito em detalhes em Farias et al. (2014).

Etapa de Esterilização

[27] A esterilização do meio de cultivo foi realizada em autoclave a 121 ° C durante 5 min. O meio de alimentação e o aparato foram esterilizados a 121 ° C durante 30 min. Para minimizar a variação na composição do meio (mais especificamente na concentração de xilose) as soluções contendo xilosé foram esterilizadas separadamente a frio usando um sistema de membrana estéril de éster-celulose com 0,2 μητ» de diâmetro de poro (modelo do filtro inikap HF MK2M-512-V6S, Sprectrum Laboratories, Inc., Fl, EUA) e assepticamente adicionada ao sistema de acordo com cada uma das concentrações definidas.

Sistema e processo integrados

[28] A tecnologia proposta neste estudo foi denominada 'retentostato extrativo a vácuo' (REV). O esquema do sistema e processo integrados utilizado para realização dos ensaios experimentais é mostrado na Figura 1 a 3.

[29] A construção do sistema permite controlar quantitativa e qualitativamente o comportamento cinético do micro-organismo S. stipitis em condições de crescimento próximas de zero permitindo, assim, o uso eficiente das xiloses, a fim de otimizar a produção de etanol por este micro-organismo. Crescimento nulo é aqui definido como uma situação na qual não ocorre nenhum crescimento aparente; por outro lado, o microorganismo permanece metabolicamente ativo, minimizando o consumo de substrato para crescimento celular e maximizando consequentemente a conversão em etanol. Desta forma, o sistema e processo integrado é a fermentação extrativa com reciclo total de células (retentostato).

[30] Para atingir esse objetivo, o meio fermentado é enviado ao tanque flash a vácuo (na forma intermitente ou contínua), efetuando a extração do etanol, e retornado ao reator (etapas (e) e (i)). No caso da extração intermitente, a vazão de alimentação é equivalente à vazão do condensado. Caso a vazão do condensado seja menor que a da alimentação, o processo é acoplado com um sistema de microfiitração tangencial conectado à linha de saída do reator, possibilitando assim manter o volume do reator constante e a retenção completa das células no sistema.

[31] O sistema de fermentação extrativa compreende pelo menos os seguintes equipamentos:

-pelos menos um reator (1);

-bombas centrífugas ou de deslocamento positivo (3, 5, 7);

-sistema de filtração (4);

-tanque flash (8);

-meios pará produção de vácuo (A);

-sistema de condensação (10); _{nn m}

20/34

- sistema de destilação (12, 13).

[32] O sistema é automatizado e controlado online através da aplicação de um sistema supervisório de controle construído utilizando, por exemplo, o software LabVIEW 10.1 , o qual permite o controle, monitoramento te tomada de decisões em tempo real de acordo com os parâmetros do sistema;

Etapas fermentativas

Etapa batelada simples

[33] O modo ; batelada simples é realizado em um fermentador tipo reator de mistura. A temperatura é mantida a 28 °C, pH 5,0 com a adição de soluções previamente esterilizadas de NaOH 2 N e HCI 2 N, aeração a 0,05 wm e velocidade de agitação de 200 rpm. A taxa de aeração e velocidade de agitação foram definidas com base nas condições operacionais adòtadas em trabalho anterior (Farias et al., 2014).

[34] A concentração inicial de xilose na etapa batelada é de 50 g.L ¹ e as células são inoculadas no reator a fim de proporcionar uma DO inicial a 600 nm de cercai de 0,2. Amostras foram coletadas periodicamente para a medição da concentração de células, açúcar e etanol. A cultura foi inicialmente operada em modo batelada simples até à completa exaustão do açúcar, em seguida, o modo de fermentação em batelada alimentada foi iniciado.

Etapa batelada alimentada

[35] Cultivos em batelada alimentada são realizados nas mesmas condições operacionais descritas para as culturas em batelada simples. Meio de cultivo previamente esterilizado (em autoclave a 121 °C por 30 min) e com composição mineral idêntica aos cultivos em batelada, sendo que o meio contendo xilose é periodicamente alimentado para o reator.

[36] A solução de alimentação é bombeada com auxílio de uma bomba alimentadora a uma taxa de alimentação otimizada (de acordo com a concentração de xilose no meio de alimentação, a qual pode variar de 50 a 200 g.L-1), levando também em consideração a taxa de consumo de substrato investigada em trabalho prévio (Farias et al., 2014). A alimentação é realizada até que o volume de trabalho máximo do reator seja alcançado, o qual era de aproximadamente 3,0 L.

[37] O nível de líquido no reator é controlado e monitorado automaticamente pelo sistema supervisório desenvolvido no software LabVIEW 10.1 . Este controle é feito por um detector de nível tipo boia, produzido por Madíson Co., USA, modelo M5000. A taxa de alimentação de substrato é baseada na concentração de xilose no meio de alimentação e na velocidade específica de consumo de substrato (obtida com base em estudos anteriores), levando em conta as características cinéticas e fisiológicas da levedura.

[38] Quando b reator atinge o nível máximo, o contato da boia de nível é fechado, fornecendo uma corrente de cerca de 1 mA observado pelo sistema supervisório de controle. Em seguida, a alimentação pela bomba é interrompida, mantendo assim o nível do reator máximo e constante, até a completa exaustão do açúcar.

Etapa retentostato

[39] O retentostato equipado com um módulo de filtração externo ligado à linha de efluente, resulta na garantia de total retenção celular dentro do tanque de fermentação. A fermentação é iniciada no modo batelada alimentada, até que o reator atinja seu nível máximo e, após a completa utilização do substrato, o processo no modo retentostato inicia-se pela passagem do meio fermentado pelo tanque flash para evaporação do etanol. A medida que o condensado obtido é retirado ocorre a alimentação de ^' meio novo, como descrito em (c). Caso necessário, há retirada de efluente na saída do filtro, efluente este livre de células. [40] A técnica de microfiltração (e/ou centrifugação) é aplicada quando se deseja separar partículas em suspensão do meio de cultivo (nesse caso, a massa celular) com base no tamanho do poro da unidade filtrante. Assim, a característica de retenção de uma membrana é uma função direta do seu diâmetro de poros.

[41] O elemento filtrante é constituído por um filtro inorgânico tubular feito de alumina de elevada pureza com diâmetro médio de poros de 0,22 μητι.

[42] O reciclo de células tem por objetivo promover alta densidade celular, visando maiores produtividades. Para isso, o efluente líquido (sem massa celular) é constantemente removido na forma de condensado e/ou

_^

com auxílio de unia bomba acoplada na saída do sistema de filtração (ver Figura. 1 e 2). A retirada de efluente opera em sincronia com a bomba de alimentação, sendo responsável por manter a taxa de diluição do sistema. Etapa Extrativa ^'■

[43] A extração e promovida continuamente ou em períodos de tempo pré-determinados ípelo operador do sistema (intermitente), a fim de manter uma concentração constante e suficientemente baixa de etanol no meio fermentativo (na faixa de aproximadamente 30 g.L ¹ ). No modo contínuo, uma bomba injeta o meio fermentado no tanque flash e outra bomba aspira o líquido e o devolve ao reator. No modo intermitente, a extração se inicia quando vácuo é acionado e o meio de fermentação é transferido por sucção para o tanque flash, após a abertura de uma válvula solenóide (normalmente fechada) posicionada na entrada do reservatório. Já na extração contínua, o sistema de vácuo (ou meios para produção de vácuo) permanece acionado até atingir a faixa de vácuo desejada. Assim que o sistema atinge o vácuo necessário para promover a extração, a bomba é desligada. Sempre que o vácuo cair abaixo do valor adequado para a extração, o sistema de vácuo (ou meios para produção de vácuo) é acionado automaticamente até atingir o set-point desejado, através do auxílio do sistema supervisório. A fração de vapor com alta concentração de etanol é condensada em condensador a baixa temperatura e o ondensado é enviado a um reservatório coletor e deste é então destinado para a segunda coluna de destilação.

Avaliação do desempenho da etapa fermentativa

[44] O desempenho de cada etapa fermentativa é baseado nos cálculos dos fatores de conversão de substrato em etanol (Yp/s) e conversão de substrato em células (Yx/ _S ), assim como na avaliação da produtividade volumétrica de etanol (Q ) para cada etapa fermentativa. As equações utilizadas para estes cálculos são apresentadas a seguir:

(1) batelada simples: Y _N

p (2) batelada alimentada

AS ' ^ϊ/ AS ^, " V _R {l ₂ -t,

(3) retentostato extrativo: 7

AS ^{Λ' ν} AS ^p V _si {t ₂ -t, ) [45] Sendo: ,

AX = {X ₂ -X ) V _R ^S - {S ₂ -S, ) V _R + F _a S _a {t ₂ -t ) Legenda:

F _a vazão de alimentação do sistema (L.h ^"1 );

P, concentração inicial de etanol no início da etapa batelada (g.L ¹ )

Pf concentração de etanol no final da etapa batelada (g.L ¹ ),

S, concentração inicial de substrato (g.L ^"1 )

Pext concentração de etanol extraída (g)

Pma concentração de produto quando o crescimento celular cessa (g.L ^"1 ) S _a concentração de substrato no meio de alimentação (g.L ^"1 ) S, concentração inicial de substrato na etapa batelada (g.L ¹ ) Sf concentração final de substrato na etapa batelada (g.L ¹ ) Xi concentração Inicial de células na etapa batelada (g.L ¹ ) Xt concentração final de células na etapa batelada ff tempo fina! de fermentação da etapa batelada ti tempo de fermentação antes da extração de etanol ser promovida (h) Í2 tempo de fermentação após a extração de etanol ser promovida (h) Si, Xi e Pi concentrações de substrato, células e etanol (g), respectivamente, no tempo de fermentação U S2, X2 e P2 são as concentrações de substrato, células e etanol (g), respectivamente no tempo de fermentação 2

í ^■

Yp/s rendimento de produto baseado no consumo de substrato (g.g ¹ )

Yx/s rendimento de células baseado no consumo de substrato (g.g ¹ )

Q _p produtividade volumétrica de etanol (g.L ^"1 .lr ¹ )

D taxa de diluição do sistema (Ir ¹ ) μ _χ velocidade específica de crescimento celular (Ir ¹ )

Exemplos

(2014).

[47] Inicialmente, S. stipitis foi submetida a um processo em batelada

I

alimentada, com intuito de promover: acúmulo de células e preencher o volume do sistema. Após a completa exaustão do açúcar e o volume

Ir ^{■ ■ ■}

máximo de trabalho do sistema ter sido atingido deu-se início ao

^■ I ^' i

retentostato extrativo. A concentração de xilose no meio de alimentação variou de acordo com as condições de estudo. [48] As concentrações de substrato, células e etanol acumulado para cada concentração de xilose avaliada são apresentadas na Figura 4. Em um retentostato ideal, o aumento da concentração de biomassa deve estabilizar após o cultivo prolongado. Este comportamento foi aproximadamente observado em toda a faixa de açúcares testada. Durante o cultivo com 100 g.L-1 de xilose no meio de alimentação, a velocidade específica de crescimento variou de 0,005 h-1 a 0,025 h- , e, em seguida, o, acúmulo de células atingiu uma condição de estado pseudo-estacionário. A concentração máxima de células obtida nesta condição foi de;22,1 g.L-1. Por outro lado, observou-se uma diminuição da velocidade específica de crescimento de 0,007 h-1 para 0,003 h-1 (a 150 g.L-1) e de 0,005 h-1 para 0,002 h-1 (a 200 g.L -1). A concentração máxima celular obtida no interior do reator variou segundo as concentrações de xilose na alimentação, sendo respectivamente 22,1 g.L- 1 , 15,4 g.L-1 e 14,0 g.L-1 para as condições de 100 g.L-1 , 150 g.L-1 e 200 g.L-1 , respectivamente. No entanto, em todas as concentrações de xilose avaliadas no modo retentostato extrativo ficou claramente evidenciado o aumento do acúmulo de células até atingir um máximo, com tendência a; se estabilizar, fator observado apenas durante cultivos prolongados (emi torno de 20 dias de cultivo). Uma das características peculiares dos cultivos em retentostato em comparação a um quimiostato sem retenção de células é que altas densidades celulares com baixas velocidades específicas de crescimento podem ser atingidas.

[49] O perfil de consumo de substrato variou de acordo com a vazão de alimentação bem ¹ como com a concentração de xilose no meio de alimentação. O melhor comportamento foi observado para a condição de 100 g.L-1 de xilose na alimentação, experimento no qual foi possível manter uma baixa concentração de substrato no meio fermentativo em torno de 10 g.L-1 no decorrer de todo o processo. Maiores oscilações na concentração de substrato foram observadas quando a vazão de alimentação aumentou para 1 mL.min-1 , correspondente a uma velocidade específica de crescimento de 0,025 h ^' -1. Nesta nova vazão avaliada, o micro-organismo necessitou de aproximadamente 150 h (Figura 4a) para se readaptar à nova condição, sendo capaz então de manter novamente baixas concentrações de substrato no meio. Para maiores concentrações de substrato no meio de alimentação, de 150 g.L- 1 e 200 g.L-1 , a manutenção de baixas concentrações de substrato só foi possível quando foram aplicadas baixas vazões de alimentação, na ordem de 0,10 mL.min-1 (Figura. 4b e Figura. 4c). Isso ocorreu provavelmente em virtude da inibição do metabolismo celular pelas elevadas concentrações de xilose administradas no meio de alimentação, concomitantemente com a operação de condições para a vazão de alimentação não otimizadas.

A presença de glicerol não foi detectada em nenhuma etapa fermentativa.

[50] Ácido acético e xilitol foram detectados apenas durante os cultivos em retentostato prolongados, e foi observado um aumento na concentração de ¹ xilitol de acordo com a concentração de xilose no meio de alimentação (Xy = 12,73 g.L-1 a 200 g.L-1 de xilose; 4,6 a 150 g.L-1 e

2,3 a 100 g.L-1). Como consequência, ocorreu uma diminuição no

í

rendimento em etanol durante prolongados períodos de fermentação (após aproximadamente 20 dias na etapa retentostato). Este comportamento está de acordo com observações prévias (Farias et al., 2014), na qual foi evidenciado que altas concentrações de xilose resultam em maiores quantidades de xilitol acumulado no meio, promovendo simultaneamente uma redução na produção de etanol, o que não é interessante do ponto de vista industrial.

[51] Assim, comprova-se que o desempenho do sistema de produção do etanol em baixas concentrações de açúcar operado em condições ótimas é cruciai para a obtenção de elevados rendimentos e produtividades.

I

Extração a vácuo

[52] A concentração de etanol aumentou continuamente durante a fase batelada alimentada para todas as concentrações de xilose analisadas (ver Figura. 4). Após o início do modo de operação restentostato extrativo a vácuo (REV), o etanol produzido foi então extraído intermitentemente pela aplicação de vácuo no tanque flash. A etapa extrativa foi realizada com o intuito de manter a concentração de etanol dentro do reato r em níveis suficientemente baixos para minimizar a inibição (abaixo de 30 g.L-

[53] Os perfis de concentração de etanol para cada concentração de xilose individual analisada estão apresentados na Figura 4. De acordo com essa figura, verifica-se que através da aplicação da etapa extrativa no tanque flash foi possível manter a concentração de etanol no reator entre 20 e 35 g.Lyi , faixa de concentração de etanol que não causa efeitos tóxicos ao metabolismo das leveduras. Determinação dos parâmetros cinéticos de cultivo

[54] A Tabela 1 resume os dados de conversão e produção do processo, possibilitando comparar o comportamento de S. stipitis durante o crescimento e acúmulo de etanol durante diferentes fases do processo de fermentativo (batelada simples, batelada alimentada e retentostato extrativo a vácuo).

Tabela 1. Comparação dos parâmetros cinéticos para S. stipitis NRRL- Y7124 durante fermentações no modo batelada, batelada alimentada e retentostato extrativo a vácuo ^* .

Parâmetros 50 g.L- ¹ 100 g.L ¹ 150 g.L ¹ 200 g.L- ¹

Batelada Batelada Batelada

Bateíad

alimentada/ alimentada/ alimentada/ a

Retentostato Retentostato Retentostato x (g i-- ¹ ) .4.70 11.45/22.15 11.80/15.40 7.13/14.00

P (g-L- ¹ ) 21.00 38.70/20-35 39.40/20-35 46.50/20-35

Q _P . (g.L- ¹ .h- ¹ ) 0.26 0.30/1.00 0.47/0.45 0.58/0.37 y*. (g-g- ) Ò.39 0.43/0.47 0.44/0.43 0.43/0.42 s íg g-1) 0.07 0.12/0.06 0.11/0.04 0.06/0.03

Pmax no Cond.

— /167 — /195 — /240

(g.L- ¹ )

^* As células foram inicialmente crescidas em cultivos em batelada simples com 50 g.L-1 de xilose pura antes de transferir para o modo de operação batelada alimentada, com suplementação de xilose no meio de alimentação com concentração variando na faixa de estudo de 100 g.L-1 a 200 g.L-1.

[55] Estes resultados sugerem a eficiência na produção de etanol

i

durante o processo ;REV desenvolvido neste estudo. A concentração de ι etanol recolhido no condensador oscilou entre 167 e 240 g.L-1 , de acordo com a concentração de açúcar no meio de alimentação, ou seja, quanto maior a concentração de xilose aplicada maior foi a concentração de etanol no condensado.

[56] Quando a concentração de xilose em meio de alimentação aumentou de 100 g.L-1 a 200 g.L-1 houve um aumento considerável na concentração de etanol no condensador (Tabela 1). Por outro lado, houve uma diminuição na concentração de etanol no condensador durante cultivos prolongados operados no modo retentostato. Esta redução se deve provavelmente a uma falta de melhor ajuste entre taxa de conversão e taxa de alimentação do substrato, ocasionando acúmulo de xilose e por consequência inibindo o micro-organísmo (Figura 4).

[57] No entanto, a concentração de etanol no reator permaneceu substancialmente constante, mesmo com distúrbios causados pela alimentação de meio no sistema, o que indica a robustez do sistema.

[58] O rendimento em células no modo retentostato extrativo apresentou valores superiores em relação às etapas batelada e batelada alimentada, sendo que este comportamento foi observado para todas as concentrações iniciais de xilose avaliadas no meio de alimentação. O desempenho do rendimento em células durante os cultivos no modo retentostato extrativo foi consistente com o acúmulo celular, ou seja, o maior rendimento de células (Yx/s = 0,06 g.g-1 ) foi obtido na condição de Sa = 100 g.L-1 , concentração de xilose na qual também foi atingida a máxima concentração de células (X = 22 g.L-1 ). [59] A variação na produtividade é mostrada na Figura 5, para cada perfil de concentração de xilose avaliada durante os cultivos com a tecnologia REV. Verifica-se que a produtividade volumétrica em etanol aumentou de forma linear com o aumento da velocidade específica de crescimento. Os resultados revelaram que a velocidade específica de crescimento ótima foi de 0.025 h-1 obtidos com 100 g.L-1 de xilose no meio de alimentação, sendo esta condição capaz de promover a maximização da produção de etanol.

[60] Nesta condição foi obtido o melhor desempenho para os

i

parâmetros cinéticos de processo, o que resultou em um rendimento em etanol de 0,43 g.g-1 e a produtividade em etanol de 1 g.L-1.h-1. Estes valores foram 2,0 e 4,35 vezes superior ao rendimento e produtividade em etanol, respectivamente, em comparação com os cultivos operados na etapa batelada. Quando a concentração de xilose em meio de alimentação aumentou de 100 g.L-1 para 150 g.L-1 e 200 g.L-1 , houve uma ligeira diminuição na produtividade em etanol em comparação com os cultivos em batelada alimentada (ver Tabela 1 ). Mais uma vez, isso ocorreu devido à conversão ineficiente de substrato. Por outro lado, a produtividade em etanol observada no modo retentostato a 100 g.L-1 foi muito superior à produtividade observada durantes os cultivos em batelada e batelada alimentada, o que sugere que o controle da vazão de alimentação em , condições otimizadas foi capaz de promover uma produção eficiente de etanol. A concentração do etanol extraído no condensador é da ordem de 40 °GL.

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