НЕГО ВасШиs sιιbtilis И ВасШиs liсhепifоrтis'

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и касается создания новых пробиотических препаратов на основе бактерий рода ВасШиs, которые могут быть использованы для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии человека, сельскохозяйственных животных и птицы.

Предшествующий уровень техники

Биопрепараты на основе бактерий рода ВасШиs хорошо известны. В состав биопрепаратов - пробиотиков на основе бактерий рода Васillus входят штаммы, обладающие разным спектром антибактериальной и антимикозной активности. Эффективность препаратов определяется широтой спектра и силой антибактериальной активности входящих в препарат штаммов.

Широкое распространение в медицинской практике в странах Западной Европы получил пробиотик бакгисубтил (фирма "Маriоп Merrell» /Франция/) и его аналог флонивин БС (фирма "Gаlепikа" /Югославия/), содержащие культуру штамма В.сеrеиs IP 5832 (коллекция Института Пастера (Париж). Известен вьетнамский препарат биосубтил, который в качестве активного компонента содержит штамм В.sиbtilis. Основой энтерогермина (фирма "Sапоfi Wiпthгор", Италия) является культура В. сlаиsii. Известен также биопрепарат цереобиоген ("Хiпg Лап", Китай), действующим началом которого является штамм В.сеrеиs DM-423 (B.B. Смирнов, CP. Резник, И.Б. Сорокулова, B.A. Вьюницкая. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. Журн., 1992, т. 54, N->6, c.82-93).

Недостатком данных пробиотиков является ограниченность спектра действия, так как они направлены против узкой группы возбудителей заболеваний.

Известен лечебно-профилактический биопрепарат Бакrиспорин для лечения широкого круга заболеваний, содержащий лиофильно высушенную биомассу штамма ВасШиs sиbtilis ЗН и защитную среду на основе сахарозо-желатиновой смеси или лактозы (Патент RU N°2130316, A61K 35/66, опубл.20.05.1999).

Однако биопрепарат Бактиспорин не эффективен против ряда возбудителей острых кишечных инфекций, например, вызываемых бактериями рода Рsеudоmопаs sрр. , Strерtососсus sрр., Епtеrососсus sрр..

Известен также биофармацевтический препарат «Дeпpeкaн -A», содержащий рекомби- нантный штамм Васйlиs sиbtϊlis, продуцирующий альфа -2-интepфepoн человека, штамм Васпlиs lidгепifоrтis и наполнитель. В составе препарата может быть использован рекомбинантный штамм Васпlиs sиbtпis ВКПМ NsB-7289. Препарат обладает антибактериальной, антивирусной и иммуномодулирующей активностью и может быть использован при лечении различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы (Патент RU N° 2158134, A61K 35/74, опубл. 20.09.2000).

Однако в состав препарата «Дeпpeкaн-A» входит рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду, детерминируюпгую устойчивость к антибиотику (канамицину), что не удовлетворяет требованиям ВОЗ.

Известен препарат Биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живые клетки штаммов Васпlиs sиbtilis 3 (ВКПМ NsB-2335) и Васil- lиs, lidгепifоrтis 31 (ВКПМ JNb B-2336) и наполнитель (Патент RU JN° 1722502, A61K 35/74, опубл. 30.03.1992).

Биоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Сорокулова И,Б., 1997).

Недостатком Биоспорина является то, что входящие в его состав штаммы чувствительны к антибиотикам, поэтому препарат не рекомендуется применять при лечении совместно с антибиотиками.

Наиболее близким аналогом является препарат против вирусных и бактериальных инфекций, содержащий смесь биомассы штаммов Васйlиs sиbtilis ВКПМ N°B-7092, Васillиs sиbtilis ВКПМ NsB-7048, Васillиs, liсhепifоrтis ВКПМ MB-7038 в споровой форме с титром не менее ЗхlО ¹⁰ спор/г, и стабилизатор - крахмал и сахар.. (Патент RU N° 2142287, A61K 35/74, опубл. 10.12.1999).

Недостатком известного препарата является использование рекомбинантного штамма, содержащего плазмиду, детерминирующую устойчивость к антибиотикам.

Среди препаратов ветеринарного назначения известен штамм Васillиs sиbtilis X- 15, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров (Патент RU N° 2180575, C12N 1/20, опубл. 20.03.2002).

Недостатком препарата на основе штамма Васillиs sиbtilis X- 15 является ограниченность спектра действия, так как он активен только против узкой группы микроорганизмов, вызывающих эндометриты у коров.

Известен также пробиотический препарат «Cyбтилиc» на основе жидкой или лио- фильно высушенной культуры штамма Васillиs sиЪtϊlis BKM Ns B-2250 Д. Препарат предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы, способствует увеличению усвояемости кормов, повышению продуктивности и привесов (Патент RU JЧs 2184774, C12N 1/20, опубл. 10.07.2002).

Недостатком препарата «Cyбтилиc» является ограниченный спектр антагонистической активности.

Наиболее близким аналогом является пробиотический препарат комплексного действия, содержащий следующие компоненты, oб.%: смесь биомассы Васillиs sиbtilis BKQM - 4759 с титром IxIO ⁷ -1OxIO ⁹ живых микробных клеток и биомассы Васillиs. Ысhепifоrтis 2336/105 с титром IxIO ⁸ -10x10 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора — 92 — 98 %, и стабилизатор на основе сыворотки крови крупного рогатого скота, или молока, или их смеси, сахарозы и желатина - 2 - 8 %.. Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способен к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма (Патент RU JYo 2159625, A61K 35/66, опубл. 27.11.2000).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является получение новых штаммов Васillиs sиbtilis и Васillиs, liсhепifоrtпis и создание на их основе пробиотического биопрепарата, характеризующегося более выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой лизоцимной, протеолитической и амилазной активностей входящих в биопрепарат штаммов, удобного в применении и имеющего разные рецептурные формы.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности профилактики и лечения инфекционных болезней различной этиологии и дисбиоза за счет расширения спектра антагонистической активности входящих в биопрепарат Ирилис штаммов бактерий, повышении устойчивости биопрепарата к действию ферментов желудочно-кишечного тракта, и удобстве применения.

Сущность изобретения заключается в следующем:

Входящие в состав биопрепарата Ирилис новые штаммы В.sиbtilis 07 (ВКПМ Ns В - 8611) и В.liсhепifоrtпis 09 (ВКПМ N° В - 8610) характеризуются широким спектром антагонистической активности, высокой протеолитической и амилазной активностью (В.sиbtilis 07) и выраженной способностью к продукции лизоцима (В. liсhепifоrтis 09), не конкурируют друг с дру-

гом, а вступают в синергидные отношения, что проявляется в повышении антагонистического действия биопрепарата.

Штаммы В.sиbήlis 07 (BKTM JNb В - 8611.) и В.liсhепifоrтis 09 (ВКПМ N° В - 8610) выделены из здорового растения пшеницы, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и характеризуются следующими свойствами:

Васϊllиs sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2,7-0,6 х 0,8-0,7 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют в аэробных условиях споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются.

На среде Гаузе N°2 , сусло-агаре, среде Громыко штамм растет обильно, образует матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимаются петлей с агара.

В протоплазме штамма после роста на глюкозном агаре не обнаруживаются включения поли-р-оксимасляной кислоты. На МПБ культура образует пленку.

Не растет в анаэробных условиях, не гидролизует мочевину, не образует газ из нитратов в анаэробных условиях, не продуцирует аргининдигидролазу. Культура образует каталазу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7 % NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обесцвечивает метиленовую синьку. Не обладает коагу- лазной и лецитиназной активностью, обладает высокой протеолитической и амилазной активностью.

Основные физико-биохимические свойства В.sиbήlis ВКПМ N° B - 8611 представлены в табл. 1 и табл.2.

Васϊllиs liсhепifоrтis ВКПМ Ns В - 8610 - грамположительные спорообразующие палочки, размером 2,6-0,7 х 0,5-06 мкм. Клетки подвижные, перитрихи, располагаются в основном в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-р-оксимасляной кислоты.

На МПА образует колонии с тусклой грубой поверхностью, непрозрачные, плотно прикрепленные к агару: нередко на поверхности обнаруживается слизь. На МПБ образуется морщинистая пленка, иногда с кремовым оттенком.

Культура образует каталазу, характеризуется способностью расти на агаре в анаэробных условиях. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет при 7% NaCl. Гидролизует крахмал, казеин, не гидролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюко-

зу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных условиях из нитратов образует газ. Продуцирует аргининдигидролазу, лизоцим. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

Основные свойства штамма В.liсhеήifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 представлены в табл. 1 и табл. 2 .

Штаммы В. sиbtϊlis ВКПМ JVb В - 8611 и В.liсhепifоrпιis ВКПМ JVb в -8610 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно - патогенных микроорганизмов и устойчивостью к ряду антибиотиков

В составе предлагаемого биопрепарата Ирилис указанные штаммы могут быть использованы в различных сочетаниях, например, в равных соотношениях (по титру клеток): биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре IxIO ⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO ⁹ КОЕ/мл или в любых соотношениях в пределах (1- 100 ): (100 - 1), например, биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре 5xlO ⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма В. liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO ⁹ КОЕ/мл, или биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ Jfe В - 8611 в титре IxIO ¹⁰ КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсliепifоrтis ВКПМ JNb В - 8610 в титре 5xlO ⁹ КОЕ/мл, или биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре IxIO ⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO ⁷ КОЕ/мл и т.д.

Биопрепарат Ирилис содержит также защитную среду для обеспечения сохранности бактерий в процессе технологической переработки, получения конечной рецептурной формы и последующего хранения. В качестве защитной среды, он может содержать, например, сахарозо- желатиновую среду, сухое молоко, желатозу, лактозу, сахарозу и т.п.

Биопрепарат Ирилис может дополнительно содержать растворитель. В качестве растворителя может быть использована, например, дистиллированная или кипяченая вода, физиологический раствор и т.п.

Биопрепарат Ирилис может дополнительно также содержать наполнитель, обычно применяемый при изготовлении различных рецептурных форм. При формовании таблеток он может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, сахарозу, лактозу, стеарат кальция, глюкозу, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п. При получении суппозиторий или свечей в качестве наполнителя он содержит, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

Биопрепарат может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметил- целлюлозе, щцроксиэтилцеллюлозе, хитозане и т.п.

Биопрепарат может также быть лиофилгоирован.

Биопрепарат «Иpилиc» может быть использован для перорального или вагинального или ректального или наружного применения в виде водной суспензии. Механизм действия биопрепарата Ирилис основан на адгезивной и антагонистической активности бактерий- пробиотиков, продуцирующих различные физиологически активные вещества и вытесняющих патогенные и условно-патогенные микроорганизмы из пищеварительного тракта макроорганизма, и оказывающих стимулирующее действие на специфические и неспецифические защитные реакции макроорганизма.

Лучшие варианты осуществления изобретения

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1 . Получение жидкого препарата.

Штаммы культивируют по отдельности или на плотных или на жидких питательных средах.

При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38 °C в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончанию инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, стабилизатором - защитной средой, содержащей 5 % - ный раствор лактозы, сводят вместе в соотношении 10:1, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В. sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 в титре IxIO ¹ КОЕ/мл и биомассы штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ Ш В - 8610 - IxIO ⁹ КОЕ/мл.

При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35- 38 °C в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончанию инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 1:1 и добавляют сахарозе- желатиновую защитную среду, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре 5xlO ⁹ КОЕ/мл и биомассы штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 - 5xlO ⁹ КОЕ/мл.

П р и м е р 2 . Получение препарата в форме лиофилизата.

При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 3 8 ° С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончанию инкубации

смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, защитной средой, содержащей 10 %- ный раствор глицерина, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум - сушильной установке или высушивают распылительным способом.

При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38 °C в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4- 5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончанию инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 2: 1 и добавляют стабилизатор, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум - сушильной установке или высушивают распылительным способом.

П р и м е р 3 . Получение препарата в таблетированной форме.

Выращенные культуры штаммов В. sиbtilis ВКПМ JYe В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум - сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами (крахмалом или стеаратом кальция) и прессуют на ротационных прессах.

На стабильность изучено 10 экспериментально - производственных серий табле- тированного препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В. sиbtilis ВКПМ N° В -8611 и В.liсhепifоппis BKПMN° В - 8610 в таблетках составляет не менее 10 ^9"7 - 10 ^8~б КОЕ/дозе (соответственно). После хранения таблеток на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже! О ^9"7 - 10 ^8"6 КОЕ/дозе.

П р и м е р 4 . Получение препарата в форме суппозиториев.

Выращенные культуры штаммов В. sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ Na B - 8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум - сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями (кондитерским жиром или парафином) и отливают на специальной установке суппозитории.

На стабильность изучено 10 экспериментально - производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В. sиbtilis ВКПМ Ne В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ N° В - 8610 в суппозито-

риях составляет не менее 10 ^9"7 - 10 ^8~6 КОЕ/ суппозиторий (соответственно). После хранения суппозиториев на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10 ^9"7 - 10 ^8"6 КОЕ/суппозиторий.

П р и м е р 5 . Все полученные по примерам 1 или 2 или 3 или 4 варианты и формы биопрепарата Ирилис проверяют на безвредность на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест - культур - представителей различных групп патогенных и условно - патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.

Биопрепарат Ирилис характеризуется безвредностью.

Для определения безвредности содержимое флакона разводят в 0,5 мл физиологического раствора и вводят эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта используют не меньше 10 мышей массой 15 - 16г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Биопрепарат Ирилис характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест - штаммов культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В таблице 3 представлена характеристика антагонистической активности препарата в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных при различных инфекционных заболеваниях и дисбиоза различной этиологии. Для определения специфической активности исследуют антагонистическую активность вариантов препарата в отношении клинических тест -культур. Исследование осуществляют методом отсроченного антагонизма Для этого содержимое флакона растворяют в 1 мл физиологического раствора Полученную .взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованнй средой Гаузе N° 2. Посевы инкубируют в термостате при 37 °C в течении 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевают штрихом тест -микроорганизмы (500 - миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе) Учет результатов проводят через 18 часов инкубирования при 37 С по величине зон отсутствия роста тест - культур.

Контролем роста тест - культур служит параллельное выращивание их на чашках с агаризован- ной средой Гаузе N° 2 без исследуемой культуры

Из данных табл.3 следует, что оптимальным количеством живых клеток в одной дозе препарата является 1 - 5 х 10 ⁹ . Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препаратав отношении тест - культур микроорганизмов.

Пример 6. Для определения лечебной эффективности полученного по примеру 1 или 2 или 3 пробиотика Ирилис, в сравнении с применением препарата пектосорбин, в хо-

зяйстве, длительно неблагополучном по желудочно-кишечным болезням поросят с симпто- мокомплексом диареи, формируют три группы из 81 поросят 1-2 дневного возраста с клиническими признаками диспепсии (диарея, кал разжижен, каловые массы имели кислый запах, содержали пузырьки газа, аппетит отсутствовал, сухость и бледность окраски видимых слизистых, пульс учащен, тоны сердца глухие, дыхание учащено).

После клинического обследования было установлено, что у 69 поросят -простая диспепсия, у 12 - токсическая.

При бактериологических исследованиях проб фекалий у всех больных поросят выделяют в больших количествах патогенные эшерихий (10 ⁸ -10 ¹¹ бактерий в 1 г), в то время как штаммы эшерихий - нормальных представителей толстого отдела кишечника выделяют только у 8 поросят (10 ³ - 10 ⁴ бактерий в 1 г).

Патогенные эшерихий, в отличие от нормальных представителей кишечника, как правило, не ферментируют лактозу, вызывают гибель белых мышей при внутрибрюшин- ном введении. При серотипировании выделенных от поросят штаммов - 11 штаммов относят к энтеропатогенной серогруппе 0141, остальные 40 штаммов не агглютинировались типос- пецифическими сыворотками. Результаты исследований свидетельствуют о нарушении микрофлоры толстого отдела кишечника больных диспепсией поросят (дисбактериозе), что является причиной их заболеваемости.

Поросятам первой и второй групп первый раз после 3-4 часовой водо-голодной диеты за 20-30 минут до кормления выпаивают Ирилис в количестве 2 и 4 доз соответственно 2 раза в день с интервалом 12 часов до клинического выздоровления. Поросятам третьей группы три раза в день до клинического выздоровления с молозивом применяют препарат Пектосорбин в дозе 0,26 г на кг живой массы в соответствии с инструкцией по применению. За поросятами ведут клинические наблюдения, учитывают количество выздоровевших животных, длительность лечения. О выздоровлении судят по исчезновению признаков диареи, патологических примесей в фекалиях, метеоризма, спазмов, улучшению общего состояния, появлению аппетита. Результаты представлены в табл.4.

Как видно из табл. 4, пробиотик Ирилис обеспечивал высокую эффективность при применении его в количестве 4 доз 2 раза в день. Выздоровление наступает после 4-6- кратного применения Ирилиса при соблюдении диетического режима. Нормализация кишечной микрофлоры устраняет обезвоживание, что исключает необходимость проведения регидратационных мероприятий. После отмены препарата заболевание не регистрируют.

Пример 7. Для определения эффективности препарата Ирилис при лечении телят с симптомокомплексом диареи и оценки профилактического действия на животных до

достижения ими 2-х месячного возраста было сформировано три группы из 100 здоровых новорожденных телят 1-2 дневного возраста, весом при рождении 28-30 кг.

Телят всех групп кормят в соответствии с рекомендациями по технологи! выращивания: по 1,5-2 л молозива (молока) на каждое кормление три раза ] сутки. Первый раз молозиво выпаивают не позднее 1,5 ч после рождения Телятам первых двух групп (по 40 гол. каждая) за 20-30 мин. до второго кормления в течение пяти дней двумя курсами с перерывом 3-4 дня между ним: дают внутрь препарат Ирилис по 1 и 2 дозы соответственно. Перед введение препарата содержимое одной ампулы (флакона) растворяют в 100 мл кипячено и остуженной до температуры 38-39 °C воды. Телятам первой опытной группы выпаивают по 50 мл, телятам второй опытной группы - по 100 мл препарата. Третья группа - контрольная (20 гол), препарат Ирилис не получает.

Телят взвешивают при рождении и в 2-х месячном возрасте. Ежедневно учитывают физическое состояние, аппетит и функционирование пищеварительной системы (характер стула, метеоризм), поведение животного. В конце опыта от пяти телят каждой группы берут пробы крови для гематологических исследований. В крови определяют содержание гемоглобина с помощью гемометра Сали, форменных элементов крови в счетной камере Горяева, лейкоцитарную формулу общепринятым методом, концентрацию общего белка в сыворотке крови рефрактометрически, содержание иммуноглобулинов с помощью цинксульфатного теста, содержание лизопима по Э.В.Ермолаевой, бактерицидную активность по С.В.Смирновой и T.A.Kyзьминoй. Результаты исследований представлены в табл.5.

Как видно из табл. 5, применение пробиотика Ирилис не оказывает существенного влияния на концентрацию в крови гемоглобина, количество форменных элементов крови и лейкоцитарную формулу. Вместе с тем в крови у телят, получавших препарат, существенно возрастает уровень общего белка в сыворотке крови, иммуноглобулинов, лизопима и бактерицидной активности сыворотки крови

Было установлено, что Ирилис не оказывает отрицательного влияния на здоровье животных, а существенно повышает их резистентность к желудочно-кишечным болезням улучшает качество жизни телят, они не теряют в весе. (Табл.6).

Как видно из табл. 6, в контрольной группе, не получавшей Ирилис, заболело 15 из 20 телят, что составляет. 75 % от числа животных в группе, а в первой опытной группе (1 доза Ирилиса 1 раз в день) - 11 из 40 телят (27,5 %), во второй опытной группе (2 дозы Ирилиса 1 раз в день) - 7 из 40 телят (17,5 %). Профилактическая эффективность пробно-

тика Ирилис составляет 72,5 % и 82,5 % соответственно. При этом телята контрольной группы заболевают уже на 2 и 9 дни, и болезнь протекает в основном в тяжелой форме, в результате отход составляет 30 % , а сохранность - 70 %. Применение препарата Ирилис в количестве не менее 2 доз нецелесообразно, что подтверждается высокими процентами сохранности телят и среднесуточного привеса массы тела, соответственно равных 95 % и 9 %.

Пример 8. Эффективность применения препарата Ирилис для профилактики желудочно-кишечных болезней с симптомокомплексом диарей определяют в условиях хозяйства, длительно неблагополучного по этим заболеваниям, в сравнении с препаратами пектосорбин и иммуноглобулином. Из 105 новорожденных телят формируют три группы по 35 гол. в каждой. Все животные здоровы, нормально развиты, а разница между группами по средней живой массе не превышает 2 %.

Телятам первой группы за 20-30 мин. до второй выпойки молозива дают препарат Ирилис (2 дозы), телятам второй группы - пектосорбин в соответствии с наставлением по его применению, телятам третьей группы вводят неспецифический иммуноглобулин внутримышечно согласно наставлению по его применению.

Курс профилактики по группам составляет: в первой группе - 10 дней, во второй - 10 дней, в третьей - 50 дней. Период наблюдения - 60 дней. Телят взвешивают при рождении, через один месяц и в конце периода наблюдения. Ежедневно учитывают клиническое состояние, обращая внимание на количество заболевших животных, течение и исход болезни. Результаты исследований представлены в табл. 7

Как видно из табл. 7, эффективность пробиотика Ирилис в сравнении с известными препаратами пектосорбином и иммуноглобулином, значительно выше, что подтверждается показателями сохранности и среднесуточного роста массы тела

Пример 9. Проводят испытания по включению в традиционную схему кормления пробиотического препарата Ирилис в птицеводстве при выращивании цыплят-бройлеров. Формируют 4 группы цыплят, которые получают:

1 гр. - препарат «Beтoм» производства НПФ-ИЦ «Koльцoвe»,

2 гр. - препарат Ирилис

3 гр. - препарат СТФ производства ООО «Биoaвтoмaтикa»,

4 гр. - препарат «Энтepocпopин»

Экспериментальная профилактическая схема по дням выращивания следующая: 1 сутки - пробиотики с кормом

1-3 сутки - фторхинолон

4-13 сутки - пробиотаки с кормом.

Далее - по действующей в хозяйствах профилактической схеме.

Учет результатов проводят по основным технологическим показателям: вес цыплят на 1,7,14,28,35 и 42-е сутки и при сдаче на убой; учет падежа каждую неделю и общий - при сдаче на убой. Результаты представлены в тaбл.8.

Данные, приведенные в табл.8 , свидетельствуют, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания цыплят позволяет получить высокий результат по сохранности поголовья, препарат Ирилис оказывает положительное действие на организм цыплят, обеспечивая больший прирост живой массы по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенные испытания препарата Ирилис показали возможность и высокую эффективность его применения при выращивании животных и птицы. Он обеспечивает ингибирование патогенных эшерихий, поддержание оптимального микробного баланса в пищеварительном тракте, повышение неспецифической резистентности животных, их сохранность и прирост массы тела, оказывает профилактический лечебный эффект при заболеваниях сопровождающихся диареей и обеспечивает профилактику дисбактериоза. Преимуществом препарата Ирилис является хромосомная резистентность к антибиотикам составляющих его штаммов, что делает возможным его применение в комплексе противомикроб- ной терапии.

Таблица 1

Культурально-морфологические и биохимические свойства

Таблица 2

Антибиотикочvвсτвiггельность штаммов рода Ваάllиs

Таблица 3

Антагонистическая активность вариантов биопрепарата Ирилис в отношении клинических штаммов патогенных и условно патогенных микроорганизмов

Таблица 4

Сравнительная эффективность применения Ирилиса и Пектосорбина для лечения желудочно-кишечных болезней поросят, вызванных патогенной микрофлорой

Таблица 5

Исследования основных показателей крови 2-месячных телят, после проведения профилактических мероприятий

Таблица 6 Профилактическая эффективность Ирилиса при выращивании телят-молочников

Таблица 7

Сравнительная эффективность применения Ирилиса и известных препаратов для профилактики желудочно-кишечных болезней, вызываемых <жлeвнoй» микрофлорой у новорожденных телят

Таблица 8

Результаты испытания препаратов-пробиотиков на цыплятах-бройлерах.

СО