CON ACTIVIDAD PROBIÓTICA A PARTIR DE HECES DE LACTANTES

ALIMENTADOS EXCLUSIVAMENTE CON LECHE MATERNA

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

El objetivo general de este estudio es aislar microorganismos probióticos para un posterior uso en Ia industria alimenticia o farmacéutica, especialmente para utilizarlos en fórmulas lácteas para Ia infancia. Dichos microorganismos presentan valores elevados de resistencia a pH, sales biliares y adhesión a células intestinales, por Io que son especialmente indicados para ser empleados en las industrias anteriormente mencionadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La nutrición ha tenido un desarrollo muy importante en estas últimas décadas, Io cual ha hecho cambiar su concepto. Antes se consideraba que Ia dieta tenía el papel de aportar los nutrientes necesarios para mantener el estado de salud, mientras que hoy en día este concepto ha evolucionado a Ia idea de que Ia dieta puede contener alimentos que además de nutrir, promueven Ia salud. Razón por Ia cual, Ia industria alimentaria ha comenzado a desarrollar una gran cantidad de productos que promueven Ia salud y el bienestar. En esta área Ia línea de alimentos funcionales ha tenido un desarrollo muy importante, donde el consumo de probióticos por parte de Ia población aumenta día a día. El reto actual es ampliar el conocimiento de estos alimentos, entre ellos los que contienen probióticos poseen un especial interés.

Existen antecedentes muy antiguos donde se relacionan efectos beneficiosos derivados del consumo de alimentos con alto contenido de bacterias. Como en Ia versión del viejo testamento donde se dice que Abraham atribuye su longevidad al consumo de leche, o el historiador romano Plinius que en el año 76 A.C. recomendó el uso de productos de fermentados de leche para el tratamiento de gastroenteritis (Senmier y De Vrese 2001).

A comienzos del siglo pasado, el microbiólogo Ruso ENe Metchnikoff (1845-1916) sugirió que el consumo de leche fermentada modulaba Ia microbiota intestinal produciendo un efecto positivo en Ia salud humana (Metchnikoff 1908). Fijó su atención en el hecho de que en Bulgaria existía un increíble número de personas centenarias, a pesar de ser uno de los países europeos más pobres. Observó que los búlgaros consumían grandes cantidades de yogur. Metchnikoff logró aislar Ia bacteria responsable de Ia producción del yogur y Ia utilizó en sus investigaciones. Era el inicio del estudio de los probióticos. Metchnikoff se volvió un firme defensor del concepto que Ia dieta puede proteger el cuerpo de Ia invasión de patógenos y en consecuencia mejorar y prolongar Ia calidad de vida. Fue además Ia primera persona en desarrollar un preparado utilizando lactobacilos en forma de cápsula para ingerir oralmente, denominado Lactobacillin.

En Ia misma época, el microbiólogo francés Tissier observó que Ia microbiota fecal de recién nacidos amamantados al pecho _/ presentaban más bacterias del género Bifidobacterium que Ia microbiota fecal de niños que habían recibido leche artificial y reconoció el papel benéfico de este microorganismo.

Mas tarde, en 1940, apareció Ia Leche Bifidus, para paliar las deficiencias nutritivas de los niños durante Ia 1 ^a Guerra Mundial. En 1950, Ia fabrica Degusta, elabora el Biogur y el Bio-garde. En 1989, en Suiza aumenta el consumo y Ia producción de leches fermentadas. En 1993, dos investigadores, Modler y Vila-García, desarrollan el primer yogur bio, de baja acidez.

En 1965 Lilly y Stillwell utilizaron por primera vez el término "probiótico", para nombrar a los productos de Ia fermentación gástrica. Pero Ia definición de probiótico más válida y usada será Ia enunciada más tarde por Fuller (Fuller 1992, Fuller 1989). Los define como: "suplementos de microorganismos vivos que añadidos a los alimentos, ejercen efectos beneficiosos en Ia salud del receptor como consecuencia de condicionar una mejora en su balance microbiano intestinal". Para el ser humano adulto incluye tanto productos derivados de leches fermentadas como preparados liofilizados con estas bacterias.

En 1998 el International Life Science lnstitute (ILSI) en Bruselas definió a los probióticos como microorganismos vivos, que cuando son ingeridos en cantidades suficientes, tienen efectos beneficiosos sobre Ia salud, Io que va más allá de los efectos nutricionales convencionales. Afectan beneficiosamente a una o varias funciones del organismo. Proporcionan un mejor estado de salud y bienestar y/o reducen el riesgo de enfermedad. Pueden ser funcionales para Ia población en general o para grupos particulares de Ia misma. Actualmente existen criterios para Ia definición de microorganismos probióticos:

1. Ser de origen humano.

2. Ser de naturaleza no patogénica.

3. Ser resistente a Ia destrucción por procesos técnicos.

4. Ser resistente a Ia destrucción por el ácido gástrico y bilis.

5. Adherirse al epitelio intestinal.

6. Ser capaz de colonizar el tracto gastrointestinal.

7. Producir sustancias antimicrobianas.

8. Modular Ia respuesta inmune.

9. Influenciar las actividades metabólicas humanas (asimilación de colesterol, producción de vitaminas, etc).

Las bacterias probióticas pueden influenciar a todas las células del intestino y los mecanismos de acción de estas incluyen efectos sobre Ia microbiota (Backhed y Ley

2005), Ia modulación de Ia función inmune (Picard et al. 2004; Kalliomaki 2004) y el aumento de Ia función de Ia barrera epitelial (Madsen et al. 2001 ; Isolauri & Salminen

2005).

Dentro de las bacterias con actividad probiótica, las del género Bifidobacterium son las más abundantes en el intestino, con el 25% de bacterias en el colon adulto y 95% en el recién nacido con lactancia materna. Actualmente, se pueden encontrar muchos productos alimenticios (yogur y leches) que son suplementados con este tipo de bacterias. Otras cepas que también tiene actividad probiótica son las del género Lactobacillus, que según estudios "in vitro" inhiben Ia adhesión de otras bacterias anaeróbicas como Clostridium, Bacteroides, Bifidobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus y Enterobacteriaceas (Silva et al.1987).

El uso de probióticos como herramienta médica en algunas patologías esta muy aceptado y Ia evidencia de su eficacia es fuerte, principalmente como resultado de los estudios clínicos y meta-análisis, para malabsorción de lactosa, (Adolfsson et al. 2004; Piaia et al. 2003) infecciones gastrointestinales (Brownlee et al. 2003) y diarrea asociada al uso de antibióticos (D'Souza et al. 2002). Además, el uso de bacterias probióticas ya sean Bifidobacterias, Lactobacilos y/o una mezcla de ellas han mostrado efectos beneficiosos sobre algunas enfermedades digestivas. La evidencia en Ia literatura sobre los efectos beneficiosos es muy amplia.

La comprensión de Ia relación existente entre los componentes de Ia microbiota intestinal es muy compleja, así como Ia interacción con el huésped. La genómica facilita el análisis de Ia respuesta de bacterias aisladas a las condiciones intestinales, revelando en parte Ia capacidad metabólica de las cepas, sin embargo, las condiciones en las cuales se pueden expresar estas capacidades, así como las condiciones para poder aislar Ia mayor parte de las cepas que componen Ia microbiota intestinal, es aún poco conocido, pudiendo ser solo identificadas mediante herramientas moleculares que identifican parte o totalmente su genoma. Es por esta razón el desarrollo en el área de los probióticos y de alimentos funcionales está en pleno desarrollo.

Así, teniendo en cuenta que existen diferentes efectos entre las cepas de probióticos y que variedades de bacterias pertenecientes a Ia misma especie pueden presentar características fisiológicas diferentes, que les otorguen propiedades probióticas diferentes o mejoradas frente a otras bacterias, Ia identificación y caracterización de los efectos de nuevas cepas prebióticas, es de alta importancia a Ia vista de su interés en Ia salud e industrial.

El objetivo general de este estudio es aislar microorganismos probióticos con mejores propiedades probióticas resistencia a pH ácido, resistencia a sales biliares y de adhesión a células intestinales, para un posterior uso en Ia industria alimenticia o farmacéutica, especialmente para utilizarlos en fórmulas lácteas para Ia infancia.

La presente invención proporciona y caracteriza microorganismos probióticos, aislados de heces de niños alimentados exclusivamente con leche materna.

Así, Ia mayor resistencia al pH y a las sales biliares, de las cepas objeto de Ia invención, confiere a los microorganimos probióticos una mayor capacidad de supervivencia a su paso por el estómago e intestino y de esta forma aumenta su efecto colonizador y, por consiguiente, sus efectos antagónicos frente a otras bacterias potencialmente patogénicas. Por otra parte, Ia mayor adherencia a las células intestinales humanas de las cepas de probióticos, que constituyen el objeto de Ia invención, les posibilita una mayor acción sobre todo de modulación del sistema inmunológico. OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona microorganismos probióticos aislados de heces de niños alimentados exclusivamente con leche materna. Dichos microorganismos, dadas sus mejores propiedades probióticas que confieren efectos beneficiosos en Ia salud de quienes los ingieren, son de aplicación en Ia industria alimenticia o farmacéutica, especialmente para su uso en fórmulas lácteas para Ia infancia.

Para el aislamiento de dichos microorganismos probióticos, Ia presente invención se plantea los siguientes objetivos específicos: a) aislar cepas bacterianas ácido lácticas, obtenidas a partir de heces de niños alimentados exclusivamente al pecho; b) evaluar Ia resistencia al pH y a sales biliares; y c) evaluar Ia adherencia a células epiteliales intestinales.

Es habitual buscar bacterias probióticas en las heces de los bebés. Además, hay cierta tradición de recomendar que los probióticos deben ser de origen humano, supuestamente porque se implantarían mejor en muestro intestino. Sin embargo, muchas de las cepas aisladas no cumplen con Ia condición de probiótico ya que su resistencia a los jugos digestivos es escasa o nula y muchas de ellas no se adhieren al epitelio intestinal. En Ia presente invención seleccionamos lactantes alimentados con leche materna exclusivamente para asegurar que no son bacterias comerciales las que se aislan. Además, se ha visto que Ia microbiota intestinal de los bebés alimentados con leche materna es muy rica en bifidobacterias y lactobacilos.

En relación a los probióticos, un probiótico efectivo debe caracterizarse por:

1. Su capacidad para ejercer un efecto beneficioso sobre el hospedador Ej. Resistencia a enfermedades.

2. No provocar patogenicidad o toxicidad.

3. Capacidad de sobrevivir al paso por el tracto intestinal. Ej. Resistencia al ácido gástrico y a ácidos biliares.

4. Capacidad para mantener Ia adherencia a las células de Ia pared intestinal.

5. Tiempo de generación breve, estable y capaz de mantenerse viable durante largos periodos bajo condiciones de almacenamiento.

6. Ser de origen humano. 7. Producción de sustancias antimicrobianas ante patógenos, propiedades antineoplásicas.

8. Tener Ia habilidad de influir en Ia actividad metabólica.

Entre las ventajas para Ia salud que se asocian a Ia ingesta de probióticos, se encuentran:

1. Alivio de los síntomas derivados de Ia mala absorción de lactosa.

2. Incremento de Ia resistencia natural a enfermedades infecciosas del tracto intestinal.

3. Reducción de Ia concentración sérica de colesterol.

4. Mejora de Ia digestión.

5. Estimulación de Ia inmunidad gastrointestinal.

6. Desarrollo de inmunotolerancia a los antígenos alimentarios y disminución del riesgo de alergias

Así, Ia presente invención se refiere a nuevos microorganismos probióticos aislados de heces de bebés. Específicamente Ia invención se - refiere a los microorganismos Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036), Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034) y Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035). Dichos microorganismos presentan mejores propiedades probióticas frente a microorganismos de Ia misma especie.

Formulación se refiere a las composiciones o conjunto de uno o varios ingredientes, esto es, clase y número de los elementos presentes en una sustancia compleja (producto alimenticio o forma farmacéutica, entre otros) y proporción en que se encuentren.

Por "carrier" se entiende cualquier tipo de sustancia que permite el crecimiento, transporte y/o administración de las cepas de Ia presente invención. En función del destino y/o uso al que se vayan a destinar dichas cepas, los "carriers" podrán ser de distinta naturaleza. La presente invención se refiere a "carriers" farmacéuticamente aceptables como aquellos habitualmente asociados a cápsulas, tabletas o polvo, así como a "carriers" constituidos por ingredientes o productos alimenticios. Los productos alimenticios destinados a una alimentación especial son productos alimenticios que, por su composición particular o por el particular proceso de su fabricación, se distinguen claramente de los productos alimenticios de consumo corriente, que son apropiados para el objetivo nutritivo indicado y que se comercializan indicando que responden a dicho objetivo. (DIRECTIVA 89/398/CEE del Consejo, de 3 de mayo de 1989, relativa a Ia aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros sobre los productos alimenticios destinados a una alimentación especial (DO serie L núm. 186 de 30 de junio)).

Por alimentación especial se entiende aquella que debe satisfacer las necesidades nutritivas particulares de:

i) determinadas clases de personas que tienen el proceso de asimilación o de metabolismo trastornado, o

ii) determinadas clases de personas que se encuentran en condiciones fisiológicas particulares y que, por ello, obtienen beneficios especiales de una ingestión controlada de determinadas sustancias de los alimentos, o

iii) los lactantes o los niños de corta edad, con buena salud.

Complemento alimenticio se refiere a aquellos productos alimenticios cuyo fin sea complementar Ia dieta normal y consistentes en fuentes concentradas de nutrientes o de otras sustancias que tengan un efecto nutricional o fisiológico, en forma simple o combinada, comercializados en forma dosificada, es decir cápsulas, pastillas, tabletas, pildoras y otras formas similares, bolsitas de polvos, ampollas de líquido, botellas con cuentagotas y otras formas similares de líquidos y polvos que deben tomarse en pequeñas cantidades unitarias; (DIRECTIVA 2002/46/CE DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 10 de junio de 2002 relativa a Ia aproximación de las legislaciones de los Estados miembros en materia de complementos alimenticios).

Probiótico se refiere a aquellos preparados celulares microbianos o células microbianas o componentes de células microbianas con un efecto beneficioso sobre Ia salud y el bienestar del huésped.

Por prebiótico se entiende "un ingrediente de Ia dieta que no es digerible y el cual beneficia y estimula el crecimiento de bacterias intestinales que mejoran el balance intestinal del huésped". Dentro de los prebióticos utilizados están: inulina, oligofructosacáridos, galactooligosacáridos, oligosacáridos procedentes de Ia hidrólisis de pectinas y otras gomas y mucílagos, y almidones y maltodextrinas resistentes, así como nucleótidos.

Un objeto de Ia presente invención se refiere a Ia cepa de microorganismo probiótico aislada de heces de niños alimentados exclusivamente de leche materna caracterizada por consistir en Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036) o

Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034) o Bifidobacterium breve HERO 15B

(CNCM I-4035).

En una realización particular, dicha cepa es Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM I-4036).

En otra realización particular, dicha cepa es Lactobacillus paracasei HERO 7

(CNCM 1-4034).

En otra realización particular, dicha cepa es Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035).

En una realización, Ia cepa descrita anteriormente se presenta en forma de cultivo biológico puro. En otra realización Ia cepa es aislada.

En una realización Ia cepa de microorganismo anteriormente descrita se presenta en forma de células viables; en otra realización Ia cepa se presenta en forma de células no viables.

Otro objeto de invención se refiere a Ia formulación que comprende una cepa de microorganismo según se ha descrito anteriormente. En una realización particular, dicha formulación comprende otro material probiótico, en otra realización, adicionalmente comprende material prebiótico.

En otra realización particular Ia formulación descrita comprende un carrier apto para su ingesta. Dicho carrier es farmacéuticamente aceptable, como aquellos habitualmente asociados a cápsulas, tabletas o polvo.

En otra realización particular dicho carrier es un producto alimenticio. Dicho producto alimenticio se selecciona entre el grupo de leches y productos lácteos derivados, especialmente leches fermentadas y quesos; cereales y derivados, incluidas masas panarias; sopas y otros productos similares en forma deshidratada; productos cárnicos fermentados; derivados de frutas, zumos y bebidas refrescantes; alimentos para usos nutricionales específicos. Otro objeto de invención se refiere a Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas para su uso en alimentación. En una realización, dicha alimentación se refiere a alimentación infantil y/o adulta y/o especial.

En otra realización Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas son usadas para Ia elaboración de fórmulas lácteas para Ia infancia. En una realización particular, dichas fórmulas consisten en leches infantiles y/o cereales infantiles, y/o alimentos infantiles listos para comer.

En otra realización, Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas son empleadas para Ia elaboración de complementos alimenticios.

En otra realización, Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas son empleadas para Ia elaboración de fórmulas especiales para nutrición oral y/o enteral.

En otra realización Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas son empleadas para Ia elaboración para aplicación farmacéutica/ aplicable como medicamento/ para su uso en Ia elaboración de un producto farmacéutico.

En otra realización Ia cepa de microorganismo probiótico o formulación anteriormente descritas son aplicables en Ia estimulación del sistema inmune y/o en Ia prevención/tratamiento del asma y/o en Ia prevención/tratamiento de los transtornos gastrointestinales, y/o en Ia eliminación/modulación de los principales patógenos digestivos, y/o en Ia prevención/tratamiento de Ia obesidad y de sus comorbilidades incluido el síndrome metabólico y Ia diabetes y/o en las enfermedades propias asociadas al envejecimiento.

Dichos transtornos gastrointestinales comprenden alteraciones del tránsito intestinal, como estreñimiento y alteraciones de Ia biodisponibilidad de minerales, infecciones y síndromes malabsortivos.

Dichos síndromes malabsortivos comprenden transtornos que afectan a Ia anatomía del intestino, como el síndrome del intestino corto, y transtornos que afectan a

Ia fisiología del intestino como fibrosis quística del páncreas, malabsorción de azúcares, especialmente lactosa, alteraciones de Ia absorción de lípidos, alergias alimentarias, y enfermedades inflamatorias intestinales como enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: A través de una tabla, dicha figura muestra Ia influencia del pH sobre Ia supervivencia de las cepas Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 y Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. En concreto, dicha tabla muestra los valores de viabilidad (en unidades formadoras de coloniaso en % de los estudios de resistencia a pH de las cepas aisladas Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) y sus respectivos controles comerciales. Dichos valores son mostrados como % de supervivencia por comparación del número de bacterias presentes en el control frente al número de bacterias presentes a los distintos pH ensayados. Los resultados son expresados en unidades de porcentaje en Ia columna %. Puede observarse que a pH 3 las cepas 7 y 22 A presentan una resistencia similar o ligeramente superior a las cepas comerciales ensayadas. No obstante, a pH 2 Ia cepa 22A presenta una viabilidad muy elevada comparada con el resto de las cepas que no sobreviven a este pH.

Figura 2. A través de una tabla, dicha figura muestra Ia influencia de las sales biliares (Oxgall) sobre Ia supervivencia de las cepas Lactobacillus rhamnosus CNCM I- 4036 y Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. Así, dicha tabla muestra los valores de viabilidad de los estudios de resistencia frente a sales biliares de las cepas aisladas Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM 1-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM 1-4034) y sus respectivos controles comerciales. Dichos valores son mostrados como % de supervivencia por comparación del número de bacterias presentes en el control frente al número de bacterias presentes a las distintas concentraciones de sales biliares ensayadas. Los resultados son expresados en unidades de porcentaje en Ia columna %. Según se desprende de los resultados, ambas cepas 7 y 22A muestran un porcentaje de supervivencia muy superior a las cepas comerciales ensayadas, alrededor del doble, tanto a concentraciones de 0.3% y 0.7% de sales biliares. Ambas cepas tienen una supervivencia superior al 100% Io que indica que incluso pueden reproducirse en presencia de estas sales. Esto indica un elevado potencial colonizador de las cepas, unido a su elevada resistencia al pH.

Figura 3. A través de una tabla, dicha figura muestra Ia adhesión a células intestinales humanas HT-29 de las cepas Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 y Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. Dicha capacidad es mostrada a través de los valores de viabilidad de los estudios de adhesión a células epiteliales intestinales de las cepas aisladas Lactobacillus rhamnosus 22A(CNCM 1-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM 1-4034) y sus respectivos controles comerciales. Dichos valores son mostrados como % de bacterias adheridas por comparación con el número de bacterias presentes en el control. Ambas cepas presentan unos porcentajes de adhesión a las células intestinales humanas HT-29 muy superiores a los de las cepas comerciales ensayadas, Io que indica su potencial acción en Ia modulación de actividades celulares del intestino incluida Ia inmunomodulación.

Figura 4. A través de una tabla, dicha figura muestra Ia influencia del pH sobre Ia supervivencia de Ia cepa Bifidobacterium breve CNCM 1-4035, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. Dicha influencia es mostrada a través de los valores de viabilidad de los estudios de resistencia a pH, de dicha cepa frente a sus respectivos controles comerciales. Dichos valores son mostrados como % de supervivencia por comparación del número de bacterias presentes en el control frente al número de bacterias presentes a los distintos pH ensayados. Los resultados son expresados en unidades de porcentaje en Ia columna %. Puede observarse que a pH 3 Ia cepa 15B muestra una resistencia significativamente muy superior a Ia de las otras dos bifidobacterias ensayadas, siendo su viabilidad superior al 100% Io que indica que incluso Ia bacteria puede reproducirse a ese pH.

Figura 5. A través de una tabla, dicha figura muestra Ia influencia de las sales biliares (Oxgall) sobre Ia supervivencia de Ia cepa Bifidobacterium breve CNCM I-4035, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. Esta influencia es mostrada mediante estudios de resistencia a sales biliares de Ia cepa aislada

Bifidobacterium breve 15B (CNCM I-4035) y sus respectivos controles comerciales.

Dichos valores son mostrados como % de supervivencia por comparación del número de bacterias presentes en el control frente al número de bacterias presentes a las distintas concentraciones de sales biliares ensayadas. Los resultados son expresados en unidades de porcentaje en Ia columna %. Los valores de supervivencia en presencia de sales biliares a concentraciones bajas es similar a las de las otras dos bifidobacterias. Sin embargo, Ia cepa 15B muestra una mayor supervivencia a concentraciones más elevadas.

Figura 6. A través de una tabla, dicha figura muestra Ia adhesión a células intestinales humanas de Ia cepa Bifidobacterium breve CNCM I-4035, objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas. Dicha capacidad es mostrada a través de los valores de viabilidad de los estudios de adhesión a células epiteliales intestinales de Ia cepa aisladas Bifidobacterium breve 15B (CNCM I-4035) y sus respectivos controles comerciales. Dichos valores son mostrados como % de bacterias adheridas por comparación con el número de bacterias presentes en el control. La cepa objeto de Ia invención presenta un porcentaje de adhesión a las células intestinales humanas HT-29 muy superior a Ia de las cepas comerciales ensayadas, Io que indica su potencial acción en Ia modulación de actividades celulares del intestino incluida Ia inmunomodulación.

Figura 7 Dicha figura muestra las actividades enzimáticas (en unidades de: Unidades/ml de medio de cultivo) de Ia cepa Bifidobacterium breve CNCM I-4035 (Bifidobacterium breve 15B), objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas (sus controles). Los resultados están expresados como se describe en el ejemplo 11. Los resultados obtenidos permiten concluir que Ia actividad fermentativa de CNCM I-4035 coincide con Ia de una especie del género Bifidobacterium, permitiendo clasificar a CNCM I-4035 dentro de dicho género

Figura 8. Dicha figura muestra las actividades enzimáticas de las cepas

Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4036 (Lactobacillus rhamnosus HERO 22A) y Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034 (Lactobacillus paracasei HERO 7), objeto de Ia invención, comparado con dos cepas comercializadas (controles).

Los resultados están expresados como se describe en el ejemplo 11 Los resultados obtenidos permiten concluir que Ia actividad fermentativa de HERO 7 y HERO

22A coincide con Ia de las especies del género Lactobacillus paracasei y rhamnosus, permitiendo clasificar a CNCM I-4036 y CNCM I-4034 dentro de dichos géneros y especies respectivas.

Figura 9. Las figuras 9A y 9B muestran los resultados de actividades fementativas de hidratos de carbono y de otros sustratos (API 50 CHL) de las cepas

CNCM I-4034 (Lactobacillus paracasei HERO 7) y CNCM I-4036 (Lactobacillus rhamnosus HERO 22A) seleccionadas y sus controles. Los resultados están expresados como se describe en el ejemplo 11. Los resultados obtenidos permiten concluir que Ia actividad fermentativa de HERO 7 (CNCM I-4034) y HERO 22A (CNCM I-4036), coincide con Ia de las especies del género Lactobacillus paracasei y rhamnosus, permitiendo clasificar a CNCM I-4036 y CNCM I-4034 dentro de dichos géneros.

Figura 10. Las figuras 1OA, 1OB y 1OC muestran los resultados del efecto ejercido sobre L. monocytogenes CECT 4031 y S. sonnei CECT 457 de las bacterias probióticas de Ia presente invención. (A) efecto ejercido sobre L. monocytogenes CECT 4031 a partir de sobrenadante concentrado 10x obtenido tras 17h de crecimiento de L. paracasei CNCM I-4034. (B) efecto ejercido sobre L. monocytogenes CECT 4031 a partir de sobrenadante concentrado 10x obtenido tras 24h de crecimiento de B. breve CNCM I- 4035. (C) efecto ejercido sobre S. sonnei CECT 457 a partir de sobrenadante concentrado 10x obtenido tras 24 h de crecimiento, de L. rhamnosus CNCM I-4036.

Figura 11. La figura 11 muestra los resultados de los efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, a 17 y 24h de tiempo de cultivo, neutralizado y sin neutralizar, al 1 % y 4% para las bacterias Salmonella typhi CECT 725, Salmonella typhimurium CECT 443 y Salmonella typhimurium CECT 4594. (A) efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034, a 17h de tiempo de cultivo sin neutralizar para las bacterias Salmonella typhimurium CECT 443. (B) efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, a 24h de tiempo de cultivo sin neutralizar para las bacterias Salmonella typhimurium CECT 4594. (C) efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034, a 24h de tiempo de cultivo sin neutralizar para las bacterias Salmonella typhi CECT 725. (D) efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CNCM I- 4034, a 24h de tiempo de cultivo neutralizado para las bacterias Salmonella typhi CECT 725. (E) efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034, a 17h de tiempo de cultivo sin neutralizar para las bacterias Salmonella typhi CECT 725

Figura 12. La figura 12 muestra los efectos inhibitorios del sobrenadante

Bifidobacterium breve CNCM I-4035, a 17 y 24h de tiempo de cultivo, neutralizado y sin neutralizar, al 1 % y 4% para Ia bacteria Salmonella typhi CECT 725. (A) efectos inhibitorios del sobrenadante Bifidobacterium breve CNCM I-4035, a 17h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para Ia bacteria Salmonella typhi CECT 725. (B) efectos inhibitorios del sobrenadante Bifidobacterium breve CNCM I-4035, a 17h de tiempo de cultivo, neutralizado, al 1% y 4% para Ia bacteria Salmonella typhi CECT 725.

(C) efectos inhibitorios del sobrenadante Bifidobacterium breve CNCM I-4035, a 24h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para Ia bacteria Salmonella typhi CECT 725.

(D) efectos inhibitorios del sobrenadante Bifidobacterium breve CNCM I-4035, a 24h de tiempo de cultivo, neutralizado, al 1% y 4% para Ia bacteria Salmonella typhi CECT 725.

Figura 13. La figura muestra los efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 17 y 24h de tiempo de cultivo, neutralizado y sin neutralizar, al 1 % y 4% para las bacterias Salmonella typhi CECT 725, Salmonella typhimurium CECT 4594, Escherichia coli ETEC CECT 501 , Escherichia coli ETEC CECT 515, Escherichia coli EPEC CECT 729 y Escherichia coli EPEC CECT 742. (A) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 17h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para las bacterias Salmonella typhi CECT 725. (B) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 24h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para las bacterias Salmonella typhi CECT 725. (C) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 24h de tiempo de cultivo, neutralizado, al 1% y 4% para las bacterias Salmonella typhimurium CECT 4594. (D) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 17h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para las bacterias Escherichia coli ETEC CECT 501. (E) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 24h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para las bacterias Escherichia coli ETEC CECT 501. (F) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 17h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1% y 4% para las bacterias Escherichia coli ETEC CECT 515. (G) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4036, a 17h de tiempo de cultivo, sin neutralizar, al 1 % y 4% para las bacterias Escherichia coli EPEC CECT 729. (H) efectos inhibitorios del sobrenadante Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, a 24h de tiempo de cultivo, neutralizado, al 1% y 4% para las bacterias Escherichia coli EPEC CECT 742.

Figura 14. La figura 14 muestra Ia reducción de focos de infección obtenidos en los virus Ito, Wa y VA70 sobre Ia línea HT-29 a partir de sobrenadantes concentrados 1x de las cepas de Ia presente invención tras (A) 17h de crecimiento y (B) 24h de crecimiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona microorganismos probióticos con mejores propiedades probióticas de resistencia a pH, sales biliares y adhesión. En concreto, Ia presente invención aisla y caracteriza las bacterias Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034) y Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035), aisladas de heces de lactantes.

Se sabe que las superficies de las mucosas están colonizadas por una gran cantidad y diversidad de microorganismos. En el adulto numéricamente existen más células procarióticas que eucarióticas, de hecho se estima que el 90% de nuestras células son microbianas, mientras que solo el 10% corresponden a eucarióticas (Savage 1977). La influencia de esta comunidad microbiana sobre nuestra fisiología probablemente es más pronunciada en el intestino, debido a que este órgano contiene Ia mayoría de estos organismos. La densidad en el intestino delgado proximal y medio es relativamente baja, pero existe un aumento considerable en el intestino delgado distal, Ia cual puede alcanzar 10 ⁸ cfu/ml del contenido luminal, y en el colon llega a 10 ¹¹ -10 ¹² /g.

Durante los primeros días de vida, existe el mayor cambio en Ia composición de Ia microbíota intestinal. En el nacimiento el intestino se encuentra estéril y dentro de las primeras horas de vida las bacterias comienzan a aparecer en las deposiciones. El tracto gastrointestinal es colonizado primero por Ia flora bacteriana vaginal y fecal de Ia madre. Los primeros en colonizar el intestino son los que tienen un alto potencial reductor, que incluye especies como enterobacterias, estreptococos y estafilococos. Gradualmente el consumo de oxigeno por parte de estas bacterias cambia el medioambiente intestinal, permitiendo el crecimiento de anaerobios incluyendo lactobacilos y bifidobacterias. Estas bacterias que colonizan al recién nacido son principalmente de Ia madre y del medioambiente, siendo el tipo de parto uno de los principales determinantes de Ia microbiota intestinal (Bezirtzoglou 1997).

El ecosistema intestinal esta formado por Ia interacción entre Ia microbiota, el epitelio intestinal, sistema inmune mucoso, y sistema nervioso entérico (Gordon et al. 1997). La comparación de ratas normales y ratas con intestino libre de gérmenes ha revelado una serie de diferencias anatómicas, bioquímicas y fisiológicas. Por ejemplo, Ia presencia de Ia microbiota aumenta el intercambio epitelial, también conjuga y deshidroxila los ácidos biliares, metaboliza Ia bilirrubina y reduce el colesterol a coprostanol.

Por Io cual, Ia relación entre intestino y microbiota es muy estrecha y puede ser vista como una relación simbiótica, ya que por ejemplo, Ia microbiota puede degradar carbohidratos que el intestino no puede debido a Ia falta de maquinaria enzimática. Los productos generados por esta degradación son principalmente utilizados como nutrientes para el epitelio intestinal, como sucede con los ácidos grasos de cadena corta. Además, Ia presencia de esta microbiota tiene un efecto de inmuno-modulación, ya que Ia principal característica fisiológica de Ia mucosa intestinal es Ia capacidad de montar una respuesta enérgica contra patógenos invasivos que pueden colonizar el epitelio intestinal, y al mismo tiempo presentar una nula respuesta a bacterias contenidas en alimentos o frente a Ia microbiota residente. Esta falta de respuesta es un proceso activo de varios mecanismos, llamado tolerancia oral. Este proceso es esencial para que el huésped no desarrolle una respuesta inflamatoria frente a Ia presencia de cualquier microorganismo y de esta forma puede presentar diferentes respuestas frente a distintos microorganismos, ayudando así, a Ia estabilidad de Ia flora intestinal. Razón por Ia cual, tener una microbiota de composición normal puede ayudar al huésped al desarrollo fisiológico, inmune y metabólico. Este ecosistema se mantiene en equilibrio, y cualquier causa que rompa este equilibrio puede desencadenar alguna patología (diarreas, enfermedades inflamatorias).

Es de interés entender Ia importancia de este ecosistema, Ia función de cepas no patológicas o "bacterias buenas". Sobre esta idea se ha desarrollado el concepto de probióticos como mediadores de Ia salud humana. Dentro de las diferentes áreas estudiadas, Ia influencia de los probióticos sobre Ia modulación de Ia expresión génica en diferentes situaciones, es una de las más interesantes.

Como ya se indicó anteriormente, Ia presente invención aisla bacterias ácido lácticas y bifidobacterias con mejores propiedades probióticas a partir de heces de niños alimentados exclusivamente al pecho. Para esto, a las bacterias aisladas se les evaluó Ia resistencia a pH, sales biliares y capacidad de adhesión a células epiteliales intestinales. Los resultados fundamentales de Ia presente invención indican que en las heces de estos lactantes existen bacterias altamente resistentes a pH gástrico, a las sales biliares y con capacidad de adhesión a células epiteliales del intestino, que pueden ser usadas como probióticos.

Para comprobar Ia actividad probiótica de las bacterias, éstas deben ser inicialmente sometidas a una serie de ensayos in vitro que simulen las condiciones a las que dichas bacterias se verán sometidas en el organismo, debiendo mantenerse viables en dichas condiciones, y conservando por tanto sus propiedades beneficiosas para Ia salud. En Ia presente invención, las bacterias controles empleadas (Ejemplo 12), frente a las cuales las bacterias de Ia invención muestran sus mejores propiedades probióticas son, para Bifidobacterias: Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longum, suministrado por Hero España S.A., y para Lactobacilos, se utilizan 2 lactobacilos comerciales: Lactobacillus casei (Danone®) y Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (VALIÓ®).

Teniendo en cuenta el interés de las bacterias que constituyen esta invención en Ia estimulación del sistema inmune y en su actuación sobre los principales patógenos digestivos, estas bacterias control han sido seleccionadas porque están actualmente comercializadas a nivel internacional en forma de leches fermentadas y otras formas farmacéuticas y existen varias publicaciones sobre sus efectos probióticos especialmente en Ia prevención de Ia diarrea aguda en niños y Ia modulación del sistema inmnológico tanto en animales como en humanos

Así, los ensayos in vitro indicados se refieren a:

Resistencia a Ia acidez gástrica

Antes de alcanzar el tracto intestinal, las bacterias probióticas deben sobrevivir a su paso a través del estómago (Henriksson et al. 1999). La secreción de ácido gástrico en el estómago constituye un primer mecanismo de defensa frente a Ia mayoría de Ia carga de microorganismos que entran vía oral. Por ello, Ia supervivencia de las cepas bacterianas en ácido gástrico es Ia más certera indicación de su habilidad para pasar a través del estómago. The University College of Cork-based Probiotic Research Group aisló con éxito e identificó bacterias ácido lácticas que mostraban rasgos de probiótico ideal (Dunne et al. 1999). Llevaron a cabo unos experimentos preliminares para determinar el grado de resistencia inicial que presentaban cepas de lactobacillos y bifidobacterias aisladas del íleon humano. El jugo gástrico humano fue obtenido de individuos sanos por aspiración a través de un tubo nasogástrico. Dado que el pH en el estómago es fluctuante (puede llegar a 1.5), se midió antes de usarlo. Este ácido fue añadido al medio MRS (Médium Rogosa Sharpe). La supervivencia inicial de las cepas se valoró en 108% y 106% para Lactobacillus y Bifidobacterium respectivamente, en medio MRS (De Man et al 1960) con HCI que corrige el valor de pH entre 2.0 y 3.4. Los resultados mostraban una mayor sensibilidad a Ia acidez por parte de Bifidobacterium (Thornton 1996). Así, las cepas que constituyen Ia presente invención, presentan unos valores se resistencia mayor que los de las cepas estudiadas en dichos experimientos, es decir presentan mayor resistencia a Ia acided (figuras 1 y 4).

Resistencia a las sales biliares

Como anteriormente se ha expuesto, para caracterizar un potencial probiótico, este debe también ser capaz de resistir las sales biliares (Lee y Salminen 1995). Los ácidos biliares son sintetizados en el hígado a partir de colesterol y son secretados desde Ia vesícula biliar al duodeno en forma de conjugados (500-700 mL/día) estos ácidos experimentan más modificaciones químicas (desconjugación, deshidrolización, deshidrogenación, y desglucuronidación) en el colon casi sólo como resultado de Ia actividad microbiana. Ambos ácidos conjugados y desconjugados, presentan actividad antibacteriana inhibiendo el crecimiento de cepas Escherichia coli, Klebsiella sp., y Enterococcus sp in vitro (Lewis et al 1972; Stewart et al 1986). Las formas desconjugadas son más inhibitorias y las Gram positivas más sensibles que las Gram negativas (Floch et al. 1972; Percy-Robb 1972). El grupo de Dunne (Dunne et al. 1999) para evaluar Ia resistencia a sales biliares de las cepas que seleccionaron, en un primer ensayo, usaron un medio sólido de crecimiento suplementado con ácido biliar de origen bovino, porcino, y humano hasta una concentración final de 0.3% y 7.5%. Tras dejar crecer lactobacilos y bífidobacterias, el resultado fue, que exhibían resistencia al ácido biliar de origen bovino y que el de origen porcino resultaba mucho más inhibitorio para ambos grupos bacterianos (Thornton 1996). Así, en relación a Ia búsqueda del posible probiótico para el consumo humano, el resultado más relevante es su capacidad para crecer en Ia bilis de origen humano. Teniendo en cuenta que Ia bilis humana no está estandarizada y que su contenido en ácidos biliares varía mucho de un individuo a otro, es práctica habitual en esl estado de Ia técnica el uso de bilis de origen bovino, estandarizada en su contenido en ácidos biliares (OXGALL), como sustitutivo de Ia bilis humana, permitiendo protocolizar ensayos reproducibles. Este ha sido el método seguido en Ia presente invención para el estudio de Ia resistencia a sales biliares de las bacterias que constituyen Ia presente invención. Los resultados obtenidos, muestran que dichas bacterias presentan mayor resistencia a sales biliares que sus controles comerciales (figuras 2 y 5).

Adherencia epitelio intestinal de cepas probióticas

La adhesión de las cepas adheridas al tejido epitelial del intestino y Ia habilidad para colonizar el tracto gastrointestinal debe ser también valorada en Ia selección. La importancia de este hecho reside en que después de seleccionados muchos de los probióticos más tarde no son capaces de colonizar a su hospedador diana. De hecho, de los actualmente disponibles parece que solo L rhamnosus GG permanece dentro del tracto gastrointestinal un período significativo de tiempo (Berg et al. 1998; Goldin et al. 1992 L. rhamnosus GG se adhiere a células Caco-2 Las células HT-29 y Caco-2 pertenecen a líneas celulares intestinales humanas, expresan las características morfológicas y fisiológicas de un colonocito normal humano y son usadas para probar los mecanismos mediadores de Ia adhesión de enteropatógenos (Bernet 1994). En estudios recientes se han utilizado para Ia selección que manejamos, y de esta forma valorar a las posibles bacterias ácido lácticas o bifidobacterias en base a su capacidad de adhesión (Coconnier et al 1992; Bernet et al. 1993; Greene & Klaenhammer 1994; Crociani et al 1995; Sarem et al. 1996; Tuomola & Salminen 1998). De los estudios realizados con estas líneas celulares se infiere que Ia adherencia de las cepas de lactobacilos de Ia presente invención, en comparación con Ia bien caracterizada cepa Lactobacillus rhamnosus GG, que es del orden del 9% sobre células Caco-2 y del orden del 5% sobre células HT-29 (Tuomola et al, 1998; Dunne et al, 2001 ; Botes et al, 2008) es muy superior (7.5% para L.rhamnosus CNCM I4036 y 15.5 % para L.paracasei CNCM I-4034 (figura 3). El estado de Ia técnica contempla que Ia adhesión de las bifidobacterias es pequeña en comparación con los lactobacilos, con independencia de Ia especie que se trate (Dunne et al, 2001). Sin embargo, las cepas de Bifidobacteríum bifídum y B.longum utilizadas por Ia firma HERO España, que se han considerado como controles en Ia presente invención, se adhieren a células HT-29 con valores cercanos al 9%. Asimismo, Ia bifidobacteria objeto de Ia presente invención se adhiere a dichas células con un valor muy superior del 16.7% (figura 6).

Selección de las bacterias

Así, en Ia presente invención, Ia selección de las bacterias se llevó a cabo empleando medios de cultivo específicos (Ejemplo 4) tanto para bifidobacterias como para lactobacilos. Durante el aislamiento se utilizaron tres nuevos medios de cultivos descritos como específicos para bifidobacterias, estos son: BFM (Nebra y Blanch 1999),

Columbia y Beerens modificado (Beerens 1991.ejemplos 4.1 , 4.2 y 4.3), con los que se obtuvo mejores resultado en Ia obtención de colonias de bifidobacterias. Para Ia selección de lactobacilos, el medio de cultivo empleado fue medio Rogosa Agar (ejemplo 4.4).

En Ia presente invención, las colonias de bacterias de los diferentes niños que fueron incubadas y sometidas a las pruebas de selección fueron 4680 colonias. Tras el primer ensayo de resistencia de pH 3.0 y a sales biliares, con una viabilidad de 90%, quedaron 758, tras las pruebas de adhesión a las células epiteliales intestinales quedan sólo 90 colonias (Ejemplos 5, 6 y 7)

Estas colonias se separaron en lactobacilos y bifidobacterias según el medio de cultivo de procedencia. Se procedió directamente a su identificación molecular (Ejemplo 10) mediante amplificación del gen 16S rRNA de cada colonia, para su posterior secuenciación y búsqueda de homología en Ia base de datos del NCBI (BLAST).

Finalmente, fueron 29 cepas bacterianas aisladas del medio de Beerens, 13 del medio de Rogosa y 10 del medio Columbia modificado, las que lograron superar Ia selección. Dado el número de colonias seleccionadas, como hemos expuesto, se procedió directamente a su identificación molecular mediante amplificación del gen 16S rRNA de cada colonia, para su posterior secuenciación y búsqueda de homología en Ia base de datos del NCBI (BLAST).

Las cepas clasificadas como lactobacilos se secuenciaron y estas secuencias fueron alineadas entre ellas para saber si existían bacterias que presentaran el mismo gen rADN 16s, y se encontró que las 41 bacterias se pueden separar en 2 grupos:

Un grupo que presentaba una homología del 99% del gen rADN 16s de un fragmento de 1474 bp con:

Lactobacillus rhamnosus strain R-11

Lactobacillus rhamnosus strain La

Lactobacillus rhamnosus, strain: MNFLM01

Lactobacillus rhamnosus strain IDCC 3201

Lactobacillus rhamnosus strain: YIT 0105 (= ATCC 7469)

Lactobacillus rhamnosus strain Lcr35 16S

Con estos resultados, se seleccionó una bacteria con los mejores valores de las pruebas de resistencia del grupo (ejemplos 7 y 9) y se llamó Lactobacillus rhamnosus HERO 22A, (ulteriormente numerada por el lnstituo Pasteur [CNCM Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR 25, Rué du Docteur Roux F-75724 Paris] como Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4036, donde fue depositada el 2 de Julio de 2008j.

El otro grupo que presentaba una homología del 100% del gen rADN 16s de un fragmento de 1276 bp con:

Lactobacillus paracasei, strain: T11-9

Lactobacillus paracasei, strain: T7-10

Lacto£>ac///tvs casei strain KLDS 1.0720

Lactobacillus casei strain L5 Lactobacillus casei, strain: YIT 0209 (= NCDO 151 )

Lactobacillus casei, strain: YIT 0180 (= ATCC 334) Lactobacillus paracasei strain IMPC 2.1 Lactobacillus paracasei, strain: NRIC 1944 Lactobacillus paracasei, strain: NRIC 1942 Lactobacillus paracasei, strain: NRIC 1938 Lactobacillus paracasei, strain: NRIC 1934 Lactobacillus paracasei, strain: NRIC 0638 Lactobacillus casei ATCC 334 Lactobacillus paracasei strain DJ1 Lactobacillus casei strain Ru2-2i

Lactobacillus paracasei isolate 3C

Lactobacillus paracasei isolate 2C Lactobacillus paracasei Lactobacillus casei strain MCRF-284 Lactobacillus sp. L02 Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei, strain SM20 Lactobacillus casei strain BL23 Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei

Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei

Lactobacillus casei

Lactobacillus paracasei subsp. Tolerans

Con estos resultados, se selecciono una bacteria con los mejores valores de las pruebas de resistencia (ejemplos 7 y 9) de este segundo grupo y se denominó inicialmente como Lactobacillus paracasei HERO 7, (ulteriormente numerada por el Instituto Pasteur [CNCM Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR 25, Rué du Docteur Roux F-75724 Paris] como Lactobacillus paracasei CNCM 1-4034, donde fue depositada el 2 de Julio de 2008J.

Posteriormente, se efectuó Io mismo con el grupo de las bifidobacterias, encontrándose un solo grupo, que presentaba una homología del 100% del gen rADN 16s de un fragmento de 1136 bp con:

Uncultured bacterium clone rRNA235

Bifidobacteríum breve, strain: ATCC 15700

Con estos resultados, se seleccionó una bacteria del grupo de bifidobacterias con los mejores resultados de resistencia (139.6% a pH 2.5) (ejemplos 7 y 9) y se denominó incialmente Bifidobacterium breve HERO 15B, (posteriormente denominada por el Instituto Pasteur [CNCM Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR 25, Rué du Docteur Roux F-75724 Paris] Bifidobacterium breve CNCM I-4035, donde fue depositada el 2 de Julio de 2008).

Así, estas bacterias clasificadas como:

Lactobacillus rhamnosus HERO 22A

Lactobacillus paracasei HERO 7

Bifidobacterium breve HERO 15B.

y fueron enviadas al Instituto Pasteur para su depósito, donde fueron reconocidas como únicas y se les asignó Ia siguiente denominación final: Denominación Inicial: Denominación final:

Lactobacillus paracasei HERO 7 CNCM 1-4034

Bifidobacteríum breve HERO 15B CNCM I-4035

Lactobacillus rhamnosus HERO 22A CNCM I-4036

Resultados de resistencia a pH, sales biliares y adhesión celular

Como se ha indicado anteriormente, para que las cepas probióticas ejerzan un efecto beneficioso en el intestino, deberían sobrevivir al paso a través del estómago, resistiendo su acidez (pH 2.5-3.5) (Holzapfel et al 1998) y por otro lado, deben ser resistentes a las sales biliares presentes en el intestino delgado, para alcanzar el colon (Otles et al. 2003).

En el presente estudio, se incubaron las bacterias a pH 3.0 durante 3 horas, aunque se ha descrito que 90 minutos debieran ser suficientes para reproducir el tiempo que transcurre entre Ia entrada y Ia salida del estómago (Jin et al. 1998). En este caso, las cepas aisladas y los controles presentaron una viabilidad cercana al 100%, (ejemplo 12/ figuras 1 y 4) pero Ia exposición a pH 2.5 mostró ser muy selectiva, ya que ningún control presentó viabilidad y sólo Io hizo Ia cepa Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I- 4036). Es decir Ia cepa de Ia invención Lactobacillus rhamnosus 22A es considerablemente más resistente al ácido que las bacterias controles por Io que su paso al tracto gastrointestinal y Ia subsiguiente colonización están facilitados. Por otra parte, Ia cepa Lrhamnosus 7 A de Ia invención presenta una mayor viabilidad a pH 3.0 que las cepas utilizadas como controles (Ejemplo 12, figuras 1, 4), Io que presupone un mayor paso al intestino delgado.

La viabilidad de cultivos probióticos a pH 3.0 durante 2 horas y en medios que contengan 500-1000 mg (0.05-0.1%) de ácidos biliares por litro, son consideradas pruebas estándares de tolerancia al ácido y a sales biliares (Snelling 2005), aunque concentraciones de 0.3% de sales biliares sería adecuada para seleccionar probióticos. Nuestras pruebas de sales biliares efectuadas a diferentes concentraciones (0.3% y 0.7%), presentaron valores superiores al 100% en todos los casos para las bacterias objeto de Ia invención y superiores a las bacterias comerciales utilizadas como controles (ejemplo 12, figuras 2 y 5). En conclusión las cepas de lactobacilos de Ia invención son más resistentes al pH y a las sales biliares que otras bacterias utilizadas como probióticos actualmente. Se ha descrito que los lactobacilos en general presentan una mayor resistencia a las condiciones gastrointestinales, especialmente frente a Ia acidez y a sales biliares (Ross et al 2005). Los resultados encontrados concuerdan con esta descripción, ya que los valores de resistencia a las condiciones gastrointestinales son levemente mayores en lactobacilos que en bifidobacterias.

Como también se ha indicado anteriormente, otro aspecto que es muy importante para Ia entrada de los probióticos en Ia microbiota intestinal es Ia capacidad de adhesión sobre las células epiteliales intestinales, ya que evitan que las cepas probióticas sean eliminadas debido a los movimientos peristálticos y a otras bacterias que componen Ia microbiota intestinal. Además, Ia adhesión es el primer paso para Ia colonización y es probablemente un pre-requisito para Ia exclusión competitiva de enteropatógenos (Forestier et al 2001 ; Lee et al 2003) y para Ia inmunomodulación del huésped (Ouwehand et al.1999; Plant y Conway 2002).

En Ia presente invención, las propiedades de adhesión de las diferentes cepas, se estudiaron utilizando las células HT-29 como un modelo in vitro de epitelio intestinal

(ejemplo 12, figuras 3 y 6). El patrón de adhesión mostró ser especifico para cada cepa, ya que siendo de Ia misma especie presentaron valores muy diferentes. Esto se puede comprender comparando Ia capacidad de adhesión de diferentes probióticos descritos, por ejemplo, el Lactobacillus casei (Fyos®) presenta una adhesión de un 14,4 %, mientras que Lactobacillus casei (Lactophilus®) posee un 2.6% de adhesión (Morata De

Ambrosini et al., 1999). Como se ha indicado anteriormente, Ia adherencia de las cepas de lactobacilos de Ia presente invención es muy superior (7.5% para L.rhamnosus

CNCM I4036 y 15.5 % para Lparacasei CNCM I-4034) a Ia de otras bacterias como

Lactobacillus rhamnosus GG, que es del orden del 5% sobre células HT-29 (Dunne et al, 2001) (Tabla 3). Asi mismo, Ia bifidobacteria que constituye uno de los objetos de Ia presente invención, S. breve CNCM I-4035, se adhiere a dichas células con un valor muy superior del 16.7% (figura 5) comparado con el 9% de las bacterias utilizadas como controles.

Estos datos confirman los resultados de Ia presente invención, que muestran Ia variabilidad existente en las diferentes cepas probióticas. En este caso concreto, los controles de lactobacilos presentan una adhesión (4%) que corresponde a Ia mitad de Ia que presentan los controles para bifidobacterias (8%), sin embargo, las cepas aisladas en Ia presente invención presentan una adhesión mayor que sus controles, debido a que en el momento de alinear los 16s rARN de los diferentes grupos se seleccionó los que presentaban mejores valores para Ia adhesión epitelial.

Así, en el caso de los lactobacilos se seleccionaron las cepas que presentaban adhesión del orden 7,48 y 11 ,55% frente al 4.80 y 4,09% de sus controles (figura 3), y en el caso de las bifidobacterias se seleccionaron aquellas que presentaban adhesión del 16,7%, frente al 8,8 y 9,1% de sus controles (figura 6). Es decir, las bacterias que constituyen los diferentes objetos de Ia presente invención, presentan mayor capacidad de colonización y permanencia en el intestino y por Io tanto, darán lugar a un mayor efecto probiótico.

Resultados de caracterización de las bacterias aisladas

Estudio del 16s RNA

Diferentes técnicas moleculares han comenzado a estar disponibles para Ia identificación, composición y enumeración del total de Ia comunidad bacteriana del intestino, Ia mayoría se basan en el estudio del gen 16s ribosómico ARN (rARN), ya que durante Ia ultima década, el gen 16s rARN ha revolucionado Ia manera de como los taxonomistas han clasificado e identificado las bacterias. El gen 16s rARN comprende desde regiones altamente variables a altamente conservadas, y Ia diferencia de secuencias son usadas para determinar las relaciones filogenéticas y distinguir bacterias desde especies a cepas. Existen bases de datos disponibles con más de 200.000 genes 16s rARN, como por ejemplo NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), ribosomal datábase project-RPD (http://rpd.cme.msu.edu/htlm) y EMBL (http://www.embl- heidelberg.de/), estas bases de datos comparan las secuencias del gen 16s rARN existentes, con nuevas secuencias obtenidas. Tal y como muestra el ejemplo 2, las cepas aisladas en Ia presente invención presentaron una alta homología a Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei y Bifidobacterium breve, Io que es consistente con los antecedentes que dicen que en niño alimentados con leche materna presentan altos niveles de bifidobacterias en heces, entre 40-60% del total de Ia microbiota, donde el Bifidobacterium breve se encuentra en porcentaje importante (Harmsen et al. 2000). También, existe un alto porcentaje de lactobacilos, principalmente L.casei, Lparacasei, Lacidophilus, entre otros (Heiling et al. 2002, Satokari et al. 2002).

El porcentaje de homología del gen 16s rARN de las cepas aisladas fue muy alto (99-100%) de acuerdo a Ia base de datos NCBI/BLAST (ejemplo 2). Los fragmentos del gen16s rARN son de aproximadamente 1.4 kb, y los fragmentos secuenciados varían entre 1474bp para Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036), 1274bp para

(CNCM 1-4034)7 HERO y 1118bp para Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035). Precisamente este último, presenta una homología de 100% con Bifidobacterium breve ATCC 15700 y un clon no cultivable de Bifidobacterium, por Io que seria de interés ampliar el fragmento secuenciado del gen 16s rARN, pero en este caso, no se pudo obtener un fragmento mas amplio debido a que los oligonucleótidos 27F (SEQ. ID. NO 1) y 1492R (SEQ. ID. NO 2), que amplifican un fragmento de aproximadamente 1400bp, no fueron capaces de amplificar el gen 16s rARN de Ia cepa Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035). Por ello, se utilizaron otros oligonucleótidos universales que amplifican fragmentos más pequeños, como son 39F (SEQ. ID. NO 3) y 1391 R (SEQ. ID. NO 4).

Los fragmentos secuenciados del gen 16s rARN de las cepas de lactobacilos aislados muestran una homología de 99% con un grupo de Lactobacillus rhamnosus y Ia otra cepa, presenta una homología de 100% con una gran variedad de Lactobacillus paracasei, y con un pequeño número de Lactobacillus casei. Los fragmentos de 16s rARN de los controles, de las cepas Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) y Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034), y un fragmento de L. paracasei que presentaba una alta homología con Ia cepa aislada fueron alineadas. A partir de esto, se puede observar que existe una diferencia de 4 bases entre las cepas controles, Lrhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) y L.paracasei 7 HERO (CNCM 1-4034). También, hay 4 bases de diferencia entre los controles LGG y L.casei. La cepa Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM 1-4036) presenta 1 base de diferencia con ambos controles, 1 base de diferencia con el control LGG y 3 bases con L.casei. En este caso, las diferencias entre las cepas alineadas son pocas, Io que indicaría que en estas cepas el gen 16s rARN se encuentra bastante conservado.

Para poder ampliar Ia información genómica de las cepas bacterianas estudiadas, se recurrió a amplificar el espacio intergénico que está presente entre el gen 16s y 23s, el cual es conocido por presentar una gran variabilidad de tamaño (Barry et al. 1991 & Navarro et al. 1992), Ia cual ha sido utilizada para diferenciar especies de procariontes (Barry et al. 1991). En las cepas aisladas los fragmentos del espacio intergénico varían de longitud entre Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) 579bp, Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) 512bp y Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM 1-4035)182bp. Los fragmentos íntergénicos 16s-23s, se compararon con los que se encuentran en Ia base de datos del NCBI/BLAST, los resultados muestran una homología de 100% para Ia cepa Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) con Lactobacillus rhamnosus ¡solated TS1 y Lactobacillus rhamnosus PS1 16S. Si comparamos los resultados de homología mostrados para 16s rARN, los resultados son totalmente diferentes, por Io que posiblemente es una cepa que no está en Ia base de datos o que Ia base de datos NCBI/BLAST tiene mayor información del 16s rARN y no del espacio intergénico 16s-23s. Estos resultados indican que Ia bacteria aislada objeto de Ia invención es única, Io que ha sido confirmado por el Instituto Pasteur al darle una nomenclatura específica Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036

En el caso de Ia cepa Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034), los resultados del espacio intergénico 16s-23s entregan una homología de 100% para Lactobacillus casei ATCC 334. La base de datos NCBI/BLAST contiene su genoma completo y esta en Ia lista de L.casei que entrega una homología de 100% para el 16s rARN, por Io que existe una alta probabilidad de que Ia cepa que aislamos sea L.casei ATCC 334, de todas maneras al secuenciar otros fragmentos de su genoma, como genes 23s, 5s u otros, podrían ratificar o descartar que corresponda exactamente a esta cepa. En este sentido tras los análisis pertinentes, el Instituto Pasteur ha reconocido Ia cepa como única.

Para el caso de Ia cepa de bifidobacteria, el fragmento es bastante pequeño, por Io que se amplificó el espacio intergénico de los controles, entregando 165bp para Bifidobacterium longum y 298bp para Bifidobacterium bifidum, Io cual ratifica Ia existencia de una gran variación en el tamaño del fragmento. Las cepas controles, Ia cepa aislada, Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035). y Ia cepa que entregó una homología de 99% (NCBI/BLAST) con nuestra cepa, fueron alineadas, observando una gran diferencia entre los controles y las cepas de Bifidobacterium breve, sin embargo, hay sólo una base de diferencia entre nuestra cepa y Ia que presenta una homología del 99% (Bifidobacterium breve 16S-23S internal transcribed spacer (ITS), strain Y8). Esta cepa es totalmente diferente a Ia cepa con 100% de homología para el 16s rARN, por Io que podría ser una cepa que no esta ingresada en esta base de datos.

Todos estos resultados demuestran que las tres cepas aisladas en Ia presente invención son nuevas, no habiendo sido anteriormente descritas en el estado de Ia técnica".

Identificación fenotípica

Según muestra el ejemplo 11 , Ia presente invención empleó un kit de fermentación de carbohidratos (API 50CH) (figura 8) y un kit de actividad enzimática (API Zym) (figura 9) para el análisis de las capacidades bioquímicas de las especies aisladas.

Estos constituyen un método rápido y teóricamente reproducible para Ia identificación fenotípica de cultivos bacterianos puros. Estos tests han sido utilizados para Ia caracterización e identificación de lactobacilos en leche (Medina et al. 2001), yogur y otros fermentados lácteos (Andrighetto et al. 1998), y quesos (Andrighetto et al. 1998, Bouton et al. 1998 y De Angelis et al. 2001). Aunque Ia fiabilidad de estos tests ha sido cuestionada, especialmente para API 50CH, ya que inicialmente fue desarrollado para identificar cepas de lactobacilos de uso clínico, y que, Ia base de datos del fabricante no esta actualizada para algunas especies de lactobacilos, entregando resultados ambiguos para su identificación (Andrighetto et al. 1998 y Collins et al. 1993), sin embargo, Ia información que nos ofrece resulta valiosa para caracterizar fenotípicamente las cepas aisladas.

Tal como se observa en Ia figura 8, las cepas aisladas, así como los controles, presentan una baja actividad proteolítica como tripsina y α-quimotripsina, aunque presentaron actividad de forma diferenciada a leucina, para valina presentan una actividad mínima en bifidobacterias, y muy alta en lactobacilos.

Las bifidobacterias, también presentan una alta actividad para α y β-galactosidasa y para α-glucosidasa. La actividad α-galactosidasa y α-glucosidasa podría diferenciar a las bifidobacterias de otras bacterias ácido lácticas, como fue descrito por Desjardins et al. (1990).

Se observa que en las bifidobacterias y en Ia cepa aislada Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) existe una alta actividad de α-galactosidasa. Esto es importante, ya que Ia hidrólisis de azúcares específicos como α-D-galactosil- oligosacarido permite una selectiva proliferación de bifidobacterias en el tracto intestinal (Gopal et al. 2001 ; Gulewicz et al. 2002), debido a que las bifidobacterias pueden utilizar galacto-oligosacáridos. La evaluación de las características fenotípicas de las bifidobacterias ha permitido confirmar su clasificación previa realizada por medios genéticos y determinar que sus acciones enzimatícas permiten utilizar varios sustratos hidrocarbonados, prefereníémene polímeros de glucosa con enlaces de tipo α para Ia producción de ácido láctico.

Se ha descrito que pocas cepas de otros orígenes y géneros incluyendo los lactobacilos presentan capacidad β-glucuronidasa (Gopa et al.2001 ; Hopkins et al. 1998). Así, las cepas de lactobacilos y bifidobacterias, de Ia presente invención, como sus controles, no presentan niveles de actividad de β-glucuronidasa, Io que se interpreta como una característica favorable. La no presencia de actividad β-glucuronidasa es una característica que deben presentar todos los probióticos considerados como buenos, ya que esta enzima es producida por las enzimas fecales (nitroreductasa, azoreductasa) de origen microbiano, que producen que los pro-carcinógenos se conviertan en carcinógenos (Kurman 1988). Nanno et al. (1986) demostró que extractos de bacteria β- glucuronidasa positivo, aumentan Ia activación mutagénica de metabolitos biliares de benzopireno, mientras extractos de β-glucuronidasa negativo no presentan esta actividad. En resumen, podemos decir que estas bacterias al presentar baja actividad a otras fuentes de carbono como son mañosa, fucosa y glucurónidos, prefieren Ia lactosa y glucosa como fuentes de carbono para su metabolismo, aunque Ia cepa aislada Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM 1-4036), presenta una actividad enzimática para α-fucosa, Io que implica un efecto favorable sobre Ia fermentación de derivados de fucosil-lactosa como los presentes en leche materna y cuyo efecto favorecedor del crecimiento de bifidobacterias es conocido. Esta propiedad hace que los probióticos de Ia presente invención tengan aplicación muy particular en alimentación infantil, aunque también pueden ser aplicados en alimentación adulta y especial.

Otro aspecto que merece Ia atención es el resultado de API 50CH (figura 9B), donde Ia cepa Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM 1-4034) fermenta inulina, capacidad que no presentan sus controles. La capacidad de fermentar Ia inulina no es una propiedad común entre lactobacilos (Cebeci y Gurakan 2003; Makras et al. 2005). Esto indica que Ia cepa de Ia invención tiene capacidad de fermentar los oligofructosacáridos (FOS), ampliamente utilizados como prebióticos, en alimentación infantil, promoviendo el desarrollo de una microbiota intestinal en Ia que predominan los lactobacilos y las bifidobacterias. Esta característica de las bacterias de Ia invención, refuerza el hecho de que los probióticos de Ia presente invención tengan aplicación muy particular en alimentación infantil, aunque también pueden ser aplicados en alimentación adulta y especial. Para Ia inulina y los FOS se ha demostrado su capacidad de aumentar el número de bifidobacterias en el colon (Roberfroid et al. 1998; Van Loo et al. 1999).

Actividad Probiótica

Una vez superados los requerimientos anteriores, de resistencia a pH, resistencia a sales biliares, adherencia a células epiteliales intestinales y Ia secuenciación de su 16S, ya nos encontramos con el microorganismo probiótico aislado y definido. El siguiente paso consiste en caracterizar sus actividades probióticas, en concreto, sería necesario caracterizar las propiedades probióticas de Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM

1-4036) y/o Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034) y/o Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035).

Teniendo en cuenta el cumplimiento de los requisitos de un probiótico relativos a resistencia a pH, sales biliares y adherencia por parte de las bacterias de Ia invención, dichas bacterias encontrarán aplicación en las distintas áreas en las que es conocido del

Estado de Ia Técnica el empleo de probióticos, entre otros en el tratamiento y prevención de distintas patologías como Ia malabsorción de lactosa, Ia reducción de los niveles plasmáticos de colesterol, diferentes tipos de diarreas, enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer, trastornos generados por bacterias patógenas, etc. Así, dichos probióticos serán de aplicación en diferentes campos, como en Ia acción sobre los principales patógenos digestivos y en Ia estimulación del sistema inmune entre otros.

Bacterias patógenas

Dentro de los diferentes tipos de estudios realizados a los probióticos, es de especial interés los que involucran bacterias patógenas del sistema gastrointestinal. Al momento de elegir una bacteria patógena, hay que tener en cuenta su mecanismo de patogenicidad el cual varía entre una y otra. Una bacteria de interés es Ia Escherichia coli enterotoxigenica, debido a Ia producción de su enterotoxina es causante importante de diarrea en humanos. Estudios recientes, han descrito que ciertas bacterias ácido lácticas tienen un efecto antagonista frente a Escherichia coli enterotoxigenica (Gopal et al. 2001 ;

Todoriki et al. 2001 ; Chu et al. 2005; Tsai et al. 2007) y frente a otras bacterias patógenas como Salmonella typhimorium y Shigella flexneri (Tien et al. 2006; Jankowska et al. 2008.

Otro aspecto de interés de las cepas probióticas, es Ia posible producción de sustancias llamadas bacteriocinas, estas son secretadas por algunas bacterias para poder competir con otros microorganismos que están creciendo en el mismo nicho. Estas sustancias pueden inhibir el crecimiento o adhesión de bacterias patógenas sobre las células epiteliales intestinales, las cuales pueden ser producidas por algunas bacterias ácido lácticas (Klaenhamer 1993; Jack et al. 1995; Sablón et al. 2000).

Un aspecto importante es conocer Ia interacción de las bacterias, ya sean probióticas o patógenas, con las células epiteliales intestinales, ya que con éstas interactúan en forma directa todas las bacterias presentes en Ia microbiota humana.

Se ha descrito que Ia presencia de bacterias patógenas en las células epiteliales intestinales estimula un perfil de respuesta pro-inflamatoria (Th1), liberando citoquinas como TNF-α e IL-8, activando el NF-κB, (Tien et al. 2006; O ^' Hara et al. 2006) y aumentando su expresión. Esta respuesta en Ia mayoría de los casos se ve parcialmente disminuida en presencia de una bacteria probiótica, Io cual indicaría un efecto beneficioso (Servin 2004).

Así, algunos probióticos podrían modular las propiedades de las DC, incluyendo su capacidad de activar una respuesta inmune especifica (Kelsall et al. 2002). Un equilibrio entre estimulación y tolerancia después del contacto con bacterias probióticas en el intestino podría ser importante para mantener su homeostasis y poder llevar a cabo sus funciones beneficiosas de protección frente a bacterias patógenas en el sistema digestivo del huésped.

Las cepas probióticas de Ia presente invención demuestran tener un efecto inhibidor del crecimiento de los microorganismos patógenos intestinales, tales como bacterias patógenas, entre otros, Helicobacter pylorí, Listeria monocytogenes, Shigella sonnei, Escherichia coli enterotoxigénica, Escherichia coli enteropatogena, Slamonella entérica, así como virus entéricos, tales como, Rotavirus.

Malabsorción de Lactosa

Los mamíferos nacen con suficiente actividad lactasa como para usar Ia lactosa procedente de Ia leche de sus madres. Tras el destete esta actividad se va viendo reducida con Ia edad, y Ia ingestión de alimento que Ia contenga da lugar a signos y síntomas relacionados con Ia intolerancia a lactosa (incremento anormal de gas, dolor abdominal, diarrea, etc.). Es conocido que el empleo de probióticos que liberan lactasa favore Ia digestión de Ia lactosa en el lumen del intestino, combatiendo los síntomas de intolerancia a lactosa.

Reducción de los niveles de colesterol

El alto nivel de lípidos en sangre, tales como el colesterol y triglicéridos implican un elevado riesgo para Ia salud humana, debido a su asociación con las cardiopatías. Puesto que el consumo de alimentos con bajo contenido graso o con microorganismos que participan en el metabolismo de lípidos, es muy beneficioso para evitar estas afecciones, se han caracterizado cepas de lactobacilos reguladores de los lípidos séricos. Este efecto probiótico está estrechamente relacionado con Ia hidrólisis de sales biliares. Así, se ha observado en diferentes estudios en animales (Akalin et al. 1997;

Fukushina y Nakano 1996) y en humanos (Lin et al. 1989), que Ia administración de probióticos puede disminuir Ia concentración sérica de colesterol.

Diarrea

Es un hecho que Ia aplicación clínica mejor documentada de un probiótico, es Ia del tratamiento de Ia diarrea aguda. Ensayos clínicos han mostrado eficacia del uso de probióticos en el tratamiento para Ia prevención y/o tratamiento de varios desórdenes intestinales incluidos Ia diarrea inducida por antibióticos (Mc Farland et al. 1995), diarrea en adultos (Hócter et al. 1990), niños (Cetina-Sauri y Sierra 1994) y diarrea del viajero (Kollaritsch et al. 1993).

En estos casos, el probiótico empleado como agente bioterapéutico afecta Ia expresión y Ia actividad de un gran número de enzimas y proteínas, ejerciendo regulación sobre el epitelio intestinal y posiblemente sobre Ia microbiota.

En relación a Ia diarrea asociada a antibióticos el hecho de tomar probióticos cuando se ha prescrito el antibiótico, puede reducir Ia aparición y/o acortar Ia duración de

Ia diarrea. Los microorganismos más usados son: Enterococcus faecium SF6

(Wunderlich et al. 1989), Lactobacillus GG (Siitonen et al. 1990; Vanderhoof et al. 1999),

Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus, y Saccharomyces Boulardii. Estos agentes contribuyen a reducir Ia alteración de Ia microbiota en el intestino, el cambio en Ia consistencia de las deposiciones y Ia frecuencia de estas.

La diarrea causada por Clostridium difficile, el cual es un patógeno oportunista que aprovecha Ia alteración de Ia microbiota intestinal provocada por Ia toma de antibióticos, presenta un amplio espectro de manifestaciones clínicas, que van desde Ia diarrea leve de curso benigno, hasta una colitis intensa con desarrollo de megacolon tóxico, complicaciones intraabdominales y sistémicas que pueden llevar a Ia muerte del paciente. Las diarreas suelen aparecer al par de semanas del inicio de Ia antibiótico-terapia. La secuencia patogénica se inicia con una alteración de Ia microbiota bacteriana intestinal, inducida por los antibióticos, Io que permite Ia colonización por C. difficile, si Ia persona está expuesta a Ia ingestión de este agente. Posteriormente, Ia bacteria libera toxinas que producen el daño tisular. Las cepas patógenas de C. difficile son productoras de toxinas, denominadas A y B. S. Boulardii inhibe las toxinas A y B por liberación de una proteasa de 54 kDa que corta estas toxinas y sus receptores de membrana (Castagliuolo et al. 1999). Para reestablecer Ia microbiota normal de los pacientes se ha comprobado que ha sido eficiente Ia administración oral de Lactobacillus rhamnosus GG y Saccharomyces boulardii.

En cuanto a Ia diarrea del viajero, ésta se debe a una infección por una bacteria, virus o parásito. Los microorganismos causantes son muchos y probablemente son diferentes de un país a otro. Entre ellos y por frecuencia son: E. coli, Shigela, Salmonella,

Campylobacter, Rotavirus y Giardia lamblia. La diarrea de viajero afecta a Ia mitad de los viajeros que realizan visitas a zonas de alto riesgo. Las bacterias usadas en disitintos estudios como prebióticos han sido: Lactobacillus, Bifídobacterium, Streptococci y enterococci. Lactobacillus GG ha sido el probiótico que más acertado se ha encontrado frente a Ia diarrea de viajero.

Enfermedades inflamatorias intestinales

Uno de los principales usos de los probióticos es el que involucra un desequilibrio en Ia microbiota y el sistema inmune. De acuerdo a este interés, el estudio de las enfermedades inflamatorias intestinales es uno de los focos de más interés para el posible uso de los probióticos como terapias clínicas. Los estudios realizados en esta área nos han entregado importante información sobre el uso clínico de los probióticos y Ia expresión génica de diferentes intermediarios involucrados en estas enfermedades.

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), son desórdenes inflamatorios crónicos del intestino de origen desconocido (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), Ia patogénesis es compleja e involucra a Io menos 3 elementos importantes: factores de susceptibilidad genética, microflora entérica y daño mediado por inmunidad. Se ha hipotetizado que las EII se producirían debido a una respuesta anormal de las células T frente a Ia microbiota, también se ha especulado que Ia presencia de organismos patógenos podrían causar estas enfermedades.

Existe una reducción de Lactobacillus y Bifidobacerium en biopsias de colon de pacientes con EII (Fabia et al. 1993; Favier et al. 1997). Los tratamientos convencionales para tratar las EII están enfocados a suprimir o modular Ia inmunidad del huésped, dentro de estos, el uso de antibióticos es un efectivo tratamiento para Ia enfermedad de Crohn. Lo cual, nos indicaría que el uso de probióticos para modificar Ia microflora puede ser importante en el tratamiento de EII.

Dentro de los antecedentes, existe un reciente estudio donde se ha encontrado que los pacientes con enfermedad de Crohn tienen cantidades disminuidas de β-galactosidasas en heces durante los periodos activos de Ia enfermedad. Esta disminución se correlaciona con Ia disminución de Bifidobacterias, las cuales son Ia fuente de β-galactosidasa (Favier et al. 1997).

Cáncer

El cáncer colorectal es una de las más serias complicaciones de EII, incluidas Ia colitis ulcerosa y Ia enfermedad de Crohn (Eaden et al. 2001). El mecanismo preciso por el cual EII puede generar un proceso de carcinogenico es muy poco entendido. Se asume que podría ser causa de un proceso inflamatorio crónico (Weitzman & Gordon 1990), el cual en algunos modelos experimentales puede funcionar como promotor de un tumor.

La microbiota intestinal junto con el sistema inmune juega un papel importante en

Ia regulación de Ia carcinogénesis. En ambos pueden influir los probióticos, de ahí que se hayan dirigido esfuerzos hacia este campo de actuación contra el cáncer de colon. Se ha comprobado que los probióticos pueden disminuir las concentraciones de enzimas, mutagénicos, sales biliares secundarias que posiblemente estén involucradas en el proceso carcinogenico del colon (Wollowski et al 2001). Los datos epidemiológicos apoyan que el consumo diario de productos fermentados tiene un efecto protector contra los adenomas de colon o cáncer (Rafter y Glinghammar 1995).

Se han utilizado una combinación simbiótica para el estudio de Ia prevención de cáncer, esta es una mezcla de un probiótico más un prebiótico. Esta combinación aumentó los niveles de ácidos grasos de cadena corta, que son los principales productos de Ia fermentación bacteriana, siendo su principal rol ser fuente de nutriente para el epitelio intestinal. Están asociados con una inducción de diferenciación, supresión de proliferación y aumento de apoptosis in vitro. (Heerdt y col. 1997; Medina et al. 1997) pudiendo jugar un rol en Ia prevención de algunas enfermedades como desordenes gastrointestinales y cáncer (Julia et al. 2006).

La presente invención no sólo demuestra Ia capacidad de las cepas seleccionadas para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y virus entéricos intestinales, sino también demuestra una superioridad en las características que definen las propiedades probióticas de los microorganismos, tales como, resistencia a pH, sales biliares y adherencia al intestino, en comparación con bacterias probióticas control conocidas del Estado de Ia Técnica.

Los resultados han mostrado en todos los casos las mejores propiedades probióticas de las bacterias de Ia invención frente a dichas bacterias control. Así, es conocido que las bacterias que han sido empleadas como controles centran su actividad en los siguientes campos:

L. casei inmunitas de Danone

Los efectos beneficiosos asociados a composiciones probióticas que contienen L casei inmunitas (Actimel ®) son los de mejorar Ia respuesta inmune frente a distintos agentes infecciosos, aumentando el nivel de citoquinas activadoras del sistema inmune, mejorando Ia respuesta proliferativa de las células T y modulando Ia expresión de las células NK. Se ha observado que Ia toma de Actimel ® mejora el pronóstico de las diarreas infantiles asociadas a infecciones reduciendo Ia severidad y duración de Ia misma.

Las composiciones que contienen L. casei inmunitas a su vez, tienen efectos positivos antiinflamatorios sobre Ia mucosa del colon humano debido a que incrementan Ia respuesta inmunitaria del hospedador Io cual resulta beneficioso para individuos con enfermedades inflamatorias intestinales y para prevención de cáncer de colon.

A Ia vista de Io anterior, y de los distintos experimentos comparativos llevados a cabo que han mostrado las mejores propiedades probióticas de Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034) frente a L. casei inmunitas, Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034) encuentra excelente aplicación, entre otros, en Ia prevención de distintas patologías como Ia malabsorción de lactosa, reducción de los niveles plasmáticos de colesterol, diferentes tipos de diarreas, enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer, etc. en Ia mejora de Ia respuesta inmune frente a distintos agentes infecciosos, en Ia mejora de diarreas infantiles, como antiinflamatorio de Ia mucosa del colon humano (y como consecuencia en Ia prevención de cáncer de colon).

LGG

Lactobacillus GG se adhiere a las células intestinales, estimulando Ia respuesta inmune y previniendo de Ia diarrea patogénica. Distintos estudios han demostrado que el consumo de composiciones que contiene LGG, como Bioactif de Kaiku ®, inhibe Ia colonización competitiva del intestino por microorganismos patógenos. Estos microorganismos a su vez, producen compuestos antimicrobianos que inhiben el crecimiento de cepas patógenas, con Ia consecuente inhibición del crecimiento de cepas patógenas. De esta forma, el consumo de composiciones con LGG mantienen o restauran el equilibrio de Ia microflora intestinal optimizando los procesos absortivos de Ia función de Ia mucosa intestinal.

A Ia vista de Io anterior, y de los distintos experimentos comparativos llevados a cabo que han mostrado las mejores propiedades probióticas de Lactobacillus rhamnosυs HERO 22A (CNCM 1-4036) frente a Lactobacillus GG ₁ Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036) encuentra excelente aplicación, entre otros, estimulando Ia respuesta inmune y previniendo de Ia diarrea patogénica y manteniendo o restarurando el equilibrio de Ia microflora intestinal.

Bifidobacteríum Longum y Bifidobacterium bifídum

Del estado de Ia Técnica es conocido que Bifidobacterium Longum son resistentes a los antibióticos, por Io que su consumo en periodos en los que los individuos están en tratamiento con antibióticos previene Ia diarrea ocasionalmente generada en pacientes. Otras aplicaciones de estos microorganismos están dirigidas a reducir el colesterol, alivian los síntomas de intolerancia a Ia lactosa, estimulan el sistema inmune y previenen el cáncer.

El consumo de composiciones con B. bifídum alivian los síntomas asociados a Ia diarrea. A su vez, son microorganismos que aumentan Ia respuesta inmunologica del individuo incrementando Ia actividad fagocítica en Ia sangre periférica.

A Ia vista de Io anterior, y de los distintos experimentos comparativos llevados a cabo que han mostrado las mejores propiedades probióticas de Bifidobacterium Breve

HERO 15B (CNCM I-4035). frente a Bifidobacterium Longum y β. bifídum,

Bifidobacterium Breve HERO 15B (CNCM I-4035) encuentra excelente aplicación, entre otros, estimulando Ia respuesta inmune y previniendo de Ia diarrea por antibióticos, en Ia reducción del colesterol, mejorando los síntomas de intolerancia a Ia lactosa, en Ia prevención del cáncer, etc.

Probiótícos en alimentos, bebidas, fármacos, etc

La incorporación de microrganismos viables en los alimentos se lleva a cabo desde muy antiguo. El yogur y otras leches fermentadas son los alimentos que tradicionalmente han incorporado microorganismos vivos. El desarrollo de los alimentos funcionales en los últimos años ha propiciado que se hayan desarrollado nuevas aplicaciones basadas en el uso de microorganismos capaces de producir efectos beneficiosos para el organismo. El área de Ia alimentación infantil no ha sido una excepción dentro del campo de los alimentos funcionales y los últimos años han visto Ia incorporación de este tipo de ingredientes a los diferentes tipos de alimentos infantiles. Los probióticos han sido una de las líneas principales de desarrollo, con una aplicación mayoritaria en el campo de las leches de fórmula, principalmente, de continuación y crecimiento. El objetivo que se persigue con Ia incorporación de probióticos a los _^ alimentos es su implantación en el colon del huésped y Ia consecución de una serie de efectos beneficiosos (reducción de flora patógena, producción de vitaminas y otras sustancias nutricionales, reducción del pH del medio, etc.).

Las bacterias probióticas que constituyen Ia presente invención, son todas ellas reconocidas como especies encuadradas dentro del grupo de bacterias lácticas, reconocidas desde hace mucho tiempo e internacionalmente por su nulo poder patogénico. Por ello, son susceptibles de ser empleadas para Ia fermentación de productos lácteos, entre otros, de forma aislada o en conjunto con otras bacterias lácticas, por ejemplo Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Streptococcus lactis, etc. Asimismo, su empleo en leches infantiles, como cualquier otra bacteria láctica, no supone ningún problema potencial de seguridad alimentaria

La incorporación de estos probióticos en alimentos y bebidas debe asegurar mediante el empleo de un proceso de mezcla adecuado (o de fermentación en su caso) un determinado número de bacterias vivas en el producto final después del periodo de vida máxima del producto.

Los probióticos de Ia presente invención tienen aplicación tanto en alimentación infantil como adulta y especial. Dichos probióticos pueden ser utilizados en forma de polvo solos o mezclados con otros excipientes conocidos del estado de Ia técnica como azúcares, proteínas, leche en polvo, etc., o bien, como ingredientes activos en Ia fermentación de productos preferentemente de base láctea. Así, dichos probióticos pueden ser incorporados en polvo o en forma líquida en alimentos empleados por Ia población general. En particular, leches y productos lácteos derivados, especialmente leches fermentadas y quesos; cereales y derivados, incluidas masas panarias; sopas y otros productos similares en forma deshidaratada; productos cárnicos fermentados; derivados de frutas, zumos y bebidas refrescantes; alimentos para usos nutricionales específicos, incluyendo leches infantiles, cereales infantiles, alimentos infantiles listos para comer, etc. También pueden encontrarse en complementos alimenticios y fórmulas especiales para nutrición oral y enteral para uso clínico. Si se trata de un producto final en polvo (leche infantil, cereales...), Ia incorporación se haría por mezclado en seco sobre el producto final. Así, los probióticos de Ia presente invención pueden ser incorporados en alimentos en polvo destinados a ser reconstituidos con agua u otro líquido como leche (leches infantiles en polvo, cereales...).

En su empleo para fermentar leche o productos lácteos y preparar leches acidificadas, los probióticos son añadidos a Ia base líquida de leche durante una etapa intermedia del proceso y produciéndose una fermentación a temperatura y tiempo controlados para obtener una leche acidificada.

Los probióticos de Ia invención también son de aplicación en complementos alimenticios e incluso productos farmacéuticos, que prodían presentarse en forma de preparados en polvo, comprimidos, grageas, etc. Estos productos encuentran su campo de actuación en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias intestinales, úlcera gástrica, diarrea aguda y otras enfermedades del tracto gastrointestinal.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS INTERGENICOS 16S-23S.

Se amplificaron los segmentos íntergénicos de las cepas seleccionadas, se secuenciaron y se efectuó Ia búsqueda de homología en Ia base de datos del NCBI (BLAST), Io cual entregó los siguientes resultados:

• Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036) presenta una homología del 100%, de un fragmento de 579 bp con:

- Lactobacillus rhamnosus isolate TS 1

- Lactobacillus rhamnosus isolate PS1 16S

• Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) presenta una homología del 100%, de un fragmento de 512 bp con:

- Lactobacillus casei ATCC 334

• Bifidobacterium breve 15B (CNCM I-4035), presenta una homología del 99% del espacio intergénico 16s-23s, de un fragmento de 182 bp con: - Bifidobacterium breve (ITS), strain Y8

- Bifidobacterium longum (ITS), strain Y10

Ejemplo 2. ALINEAMIENTO DE SECCIONES SECUENCIADAS.

Se utilizó Ia herramienta on-line del programa Clustalw (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). para alinear las secciones secuenciadas de las cepas seleccionadas y los controles.

El alineamiento global de las secuencias del gen rDNA 16S de las cepas con los controles mostró Ia existencia de diferencias entre las secuencias de los controles y las muestras L. rhamnosus 22A y Lparacasei 7, y se observa una homología completa entre Ia muestra 7 y una secuencia de L paracasei seleccionada.

En relación a Ia muestra β. breve 15B seleccionada, se observa una diferencia entre las secuencias de los controles y Ia muestra B. breve 15B, y una homología del 100% entre B. breve 15B y una secuencia de B. breve seleccionada.

El alineamiento global de las secuencias del espacio intergénico 16S-23S de Ia cepa 15B y controles permito observar una gran diferencia entre Ia secuencia de los controles y Ia muestra B. breve 15B.

El hecho de que Ia secuenciación del espacio intergénico 16S-23S sea única y no coinicida con ninguno descrito anteriormente para una bifidobacteria indica que Ia cepa de Ia invención es única, aspecto reconocido por el Instituto Pasteur al darle una denominación también única.

Ejemplo 3. TOMA Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Toma de muestras.

En Ia consulta del pediatra JM, inventor de esta patente y en condiciones de anaerobiosis, se tomaron heces de niño de entre 2 y 4 meses de vida, alimentados exclusivamente a pecho. Se pidió a los padres que llevaran a sus hijos, a primera hora de Ia mañana, a Ia consulta, se esperó a que los niños evacuaran tras estimulación y al hacerlo las heces se recogieron en un recipiente estéril mediante una cucharilla de plástico que tiene adherida en su tapa. Una vez terminada Ia recolección, el recipiente con Ia muestra se introdujo en una jarra anaeróbica (Anaerojan®, Oxoid, Hampshire, Reino Unido) acompañada de un sobre generador de atmósfera anaeróbica (Anaerogen®, Oxoid, Hampshire, Reino unido) y se procedió al cierre hermético de Ia jarra y a su transporte al laboratorio donde las muestras fueron procesadas en un tiempo no superior a 2 horas.

Procesamiento y siembra de las muestras.

Las muestras a analizar se pueden manipular una vez recogidas o previa congelación a -8OºC en tubos eppendorf correctamente identificados.

Así, se prepara una suspensión de heces al 10% en PBS (Fosfato Salino amortiguador (PBS, Sigma-Aldrich, Madrid, España)) e hidrocloruro de L-cisteína (Scharlau CEIME, Barcelona, España) (0.05%). Se realizan 7 diluciones de esta preparación, desde 10 ¹ a 10 ⁷ , finalmente se siembran 50μl de cada dilución en los dos medios de cultivo seleccionados, y se incuban en anaerobiosis, para cultivo de bifidobacterias (Anaerogen®) y medio rico en CO ₂ para lactobacilos (CO ₂ Gen) durante 72 horas a 37ºC.

Ejemplo 4. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

A continuación se indican 3 medios de cultivo específicos para bifidobacterias y un medio de cultivo específico para lactobacilos:

1. Medio de Beerens {Beerens 1990): este medio es utilizado para determinar bifidobacterias.

Para su preparación, en un matraz Erlenmeyer de un litro se mezclan 47 g de Brain Herat Infusión Agar, 5g de D-(+) Glucosa, 0.5 g de citrato de Hierro III, 0.5 g de L- cisteína y un litro de agua_dest¡lada. Esta mezcla se calienta con agitación constante, sobre una placa agitadora con calor, hasta que hierva durante un par de minutos, luego se deja enfriar a temperatura ambiente. Una vez que alcanza los 55ºC se Ie agrega 5ml de ácido propiónico y 2,2 mi de hidróxido de sodio 2Eq/L, luego, se ajusta el pH a 5.0.

2. Medio BFM (Nebra & Blanch 1999): este medio es específico para bifidobacterias. Dicho medio presenta los siguientes componentes, en las proporciones indicadas, por litro de disolución:

• Extracto de Carne 2 g

• Extracto de Levadura 7 g • Almidón 2 g

• Hidrocloruro de L-cisteína 0,5 g

• Cloruro de Sodio 5 g

• Peptona 5 g

• Tryptona 2 g

• Lactulosa 5 g

• Riboflavina* 1 mg

• Tiamina ^* 1 mg

• Azul de metileno 16 mg

• Cloruro de litio 2 g

• Ácido propiónico 5 mi

• Agar 15 g

Para preparar 500 mi de este medio selectivo para bifidobacterias se emplean las cantidades correspondientes. Esta mezcla se calienta con agitación constante, sobre una placa agitadora con calor, hasta que hierva durante un par de minutos, luego Ia solución se autoclava. Finalmente, las vitaminas ( ^* ) se preparan en soluciones concentradas (solución madre 1mg/ml), luego, se filtran y se adicionan, junto al ácido propiónico, al medio de cultivo cuando Ia solución alcanza aproximadamente 55ºC.

3. Medio Columbia Modificado (pH 5.0): este medio es específico para bifidobacterias. Dicho medio presenta los siguientes componentes, en las proporciones indicadas, por litro de disolución:

• Medio Columbia Agar (Oxoid, Hampshire, Reino Unido).

• Glucosa (5g/L).

• Cisteína (0.5g/L).

• Agar (hasta 15g/L). Para preparar 100OmI de este medio selectivo para bifidobacterias se emplean las cantidades anteriormente indicadas. La mezcla se calienta con agitación constante, sobre una placa agitadora con calor, y hasta que hierva durante un par de minutos, luego Ia solución se autoclava. Finalmente, se adicionan el ácido propiónico al medio de cultivo cuando Ia solución alcanza aproximadamente 55 ^a C y se ajusta el pH a 5.0 con una solución de NaOH 1 N.

4. Medio Rogosa Agar: este medio se utiliza para determinar lactobacilos. Para su preparación se siguen las especificaciones suministradas por Ia casa comercial.

Se prepara siguiendo las especificaciones suministradas por Ia casa comercial.

Ejemplo 5. SIEMBRA DE LAS MUESTRAS

Una vez realizadas las diluciones, se siembran por triplicado cada una de ellas, por medio de un asa de siembra. Posteriormente, todas las placas con los diferentes medios de cultivo se incuban en una estufa con temperatura controlada a 37ºC.

Las placas con los medios de cultivo para bifidobacterias son previamente introducidos en jarras de anaerobiosis a las que se les incorpora un sobre de

Anaerogen® (Sistema generador de atmósfera anaeróbica) y en aquellas que contengan las placas de cultivo para lactobacilos un sobre de CO2Gen® (Sistema generador de atmósfera CO ₂ ), finalmente, se incuban durante 72 h a 37ºC.

Ejemplo 6. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS.

Posterior a Ia incubación, se seleccionan las diluciones que presenten un crecimiento mayor a 10 unidades formadoras de colonia (UFC) y se procede a realizar el recuento de las UFC en cada uno de los medios, a través de un lápiz contador de colonias electrónico (Colony countermodelo 608702, Bio Co, Kobe, Japón). Por último, se calcula el número total de UFC mediante Ia siguiente formula:

Una vez realizados los cultivos, las muestras restantes de las heces se almacenaron a -80 ^B C hasta Ia realización de los estudios de Biología Molecular. Ejemplo 7. DETERMINACIÓN DE RESISTENCIA A pH Y SALES BILIARES.

Después de 72 horas de incubación, se seleccionan 100 colonias de cada uno de los medios de cultivo, por niño, teniendo en cuenta Ia morfología observada a simple vista. Dichas colonias tanto lactobacilos como bifidobacterias, se incuban en medio Man Rogosa Shape (MRS) líquido y en condiciones anaeróbicas durante 48 horas. Posteriormente, se realiza de forma inmediata un stock de glicerol de cada una de ellas (MRS+ Glicerol 10%).

Al mismo tiempo que se realizan los stocks de glicerol de las distintas colonias, se analiza su viabilidad tanto a pH 3.0 como a concentración de sales biliares (3%) (Oxgall, Sigma-Aldrich, España). Para ello se opera de Ia siguiente manera:

1. Las colonias se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos.

2. Eliminar el sobrenadante y se resuspende en PBS estéril.

3. Volver a centrifugar en las mismas condiciones anteriores.

4. Los pasos del 1 al 3 se repiten tres veces.

5. Resuspender, por último, en 1 mi de PBS estéril.

6. Inocular 100 mi de Ia suspensión anterior en 900 mi tanto de PBS a pH 7.0 como a pH 3.0 y Oxgall 0.3% disuelto en PBS.

7. Incubar en condiciones anaeróbicas durante 3 horas a 37ºC.

8. Se realizan diversas diluciones (10 ¹ a Ia 10 ⁵ ) de cada una de las condiciones en las que se han realizado las incubaciones.

9. Sembrar 50μl de cada dilución.

10. Incubar 72 horas a 37ºC en anaerobiosis.

11. Determinar mediante contaje, el número de colonias presentes tanto en el control como a pH y Oxgall.

12. Determinar Ia viabilidad de cada colonia mediante el cociente:

Todas aquellas colonias que muestran una viabilidad tanto a pH 3.0 como a Oxgall 0.3% mayor al 90% se consideran como positivas, las cuales se guardan para realizar el resto de las pruebas. Las demás colonias se eliminan.

Ejemplo 8. BACTERIAS CONTROLES:

Las colonias utilizadas con controles positivos, fueron las siguientes:

Para Bifidobacterias: Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longυm, suministrado por Hero España S.A.

Para Lactobacilos: Se utilizaron 2 lactobacilos comerciales: Lactobacillus casei (Danone®) y Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (KAI KU®).

Una vez concluido el screening inicial, con las colonias seleccionadas se ejecuta un segundo screennig. En este caso, se verifica Ia viabilidad a pH 2.5 y 2.0 y a Oxgall 0.5% y 0.7%. El protocolo a seguir es idéntico al utilizado en el primer ensayo. Una vez determinada Ia viabilidad, se determinan intervalos de viabilidad. En este segundo screening, los controles de bacterias comerciales presentaron valores menores a cero, por Io que se procedió a determinar como intervalo inicialmente óptimo para Ia selección de colonias positivas aquel que tuviera porcentajes de viabilidad mayor a 4%. Dividiendo las colonias en 3 grupos:

Grupo 1. Colonias con viabilidad mayor al 66%.

Grupo 2. Colonias con viabilidad entre el 33 y el 66%.

Grupo 3. Colonias con viabilidad mayor del 4%.

La Figura 1 y 4 muestran los resultados de resistencia y supervivencia a pH de las cepas objeto de Ia invención. En el caso de las cepas Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036) así como Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034), los resultados se ilustran en Ia Figura 1 y demuestran que a pH 3.0 las cepas presentan una resistencia similar o ligeramente superior a las cepas comercialmente ensayadas. No obstante, a pH 2.0, Ia cepa 22A presenta una viabilidad muy elevada comparada con el resto de las cepas que no sobreviven a ese pH. En el caso de Ia cepa Bifidobacterium breve CNCM I-

4035, los resultados se ilustran en Ia Figura 4, donde puede observarse que a pH 3.0 Ia cepa 15B muestra una resistencia significativamente muy superior a Ia de las otras dos bifidobacterias ensayadas, siendo su viabilidad superior al 100%, Io que indica que Ia bacteria puede reproducise a ese pH.

Las Figuras 2 y 5 muestran los resultados de Ia influencia de las sales biliares sobre Ia supervivencia de las cepas de Ia presente invención. En Ia Figura 2 se presentan los resultados relativos a las cepas CNCM I-4036 y CNCM I-4034. Según se desprende, ambas cepas muestran un porcentaje de supervivencia muy superior a las cepas comerciales ensayadas, siendo el porcentaje de supervivencia superior al 100% Io que indica que pueden incluso reproducirse en presencia de estas sales. En Ia Figura 5 se presentan los resultados referentes a Ia cepa CNCM I-4035. Tal y como se ilustra en esta figura, esta cepa muestra una mayor supervivencia a concentraciones más elevadas, si comparada con las bifidobacterias control del estado de Ia técnica.

Ejemplo 9. PRUEBAS DE ADHESIÓN A CÉLULAS EPITELIALES INTESTINALES.

Con las colonias ya seleccionadas por Ia resistencia a pH y a sales biliares, se procede a realizar el ensayo de adhesión celular. Dicho ensayo se ha realizado con células epiteliales intestinales HT29. Primero, se realizó una serie de intentos para determinar Ia adhesión celular mediante diferentes tinciones: Gram, azul de metileno, giemsa, etc. Observando que era muy difícil determinar el porcentaje de adhesión a las células HT29, por este medio.

Se planteó cual podría ser el mejor método para determinar el porcentaje de adhesión, llegando a Ia conclusión de que probablemente el mejor método seria aquel que permitiera recuperar todas las bacterias que se adhirieran. Por ello se eligió el método de tripzinización, y para ello se procedió de Ia siguiente manera:

1. Incubar las células HT29 a 37ºC y 5% de CO ₂ hasta confluencia en placas de 24 pocilios.

2. Incubar en anaerobiosis las distintas colonias a ensayar.

3. Poner en contacto las bacterias con las células siguiendo los pasos descritos a continuación:

a. Centrifugar las bacterias a 5000 rpm durante 5 minutos. b. Eliminar el sobrenadante y resuspender las bacterias en 1 mi de PBS estéril.

c. Repetir los pasos a y b dos veces más.

d. Determinar Ia D. O de cada bacteria a 600 nm.

e. Diluir el cultivo bacteriano hasta D. O de 0.8 en medio de cultivo de células, previamente preparado sin FBS (suero bovino fetal) y antibióticos ( 1 a 5x10 ⁶

CFU/ml).

f. Eliminar el medio de cultivo de las células.

g. Lavar varias veces con PBS estéril para eliminar los restos de FBS y antibióticos.

h. Añadir 25OmI de Ia suspensión bacteriana a cada pocilio. Se realiza el experimento por triplicado.

i. Incubar a 37ºC y 5% CO2 durante 90 minutos.

4. Una vez incubadas las bacterias con las células se realiza Io siguiente:

a. Eliminar el medio por aspiración con una pipeta pasteur.

b. Lavar 4 ó 5 veces con PBS 1X (pH 7.0).

c. Añadir 100μl de tripsina e incubar 10-15 minutos a 37ºC.

d. Recuperar todo el volumen del pocilio y pasar a un eppendorf.

e. Lavar el pocilio con 150μl de PBS e incorporar al mismo Eppendorf.

f. Realizar varias diluciones de cada muestra (4 ó 5).

g. Sembrar 50μl de cada dilución.

h. Incubar en anaerobiosis a 37ºC durante 72 horas,

i. Contar el número de colonias. 5. Determinar el % de adhesión.

La Figura 3 muestra los resultados de adhesión de las cepas CNCM I-4036

(cepa22A) y CNCM I-4034 (cepa 7), objeto de Ia invención. Ambas cepas presentan unos porcentajes de adhesión muy superiores a los porcentajes mostrados por las cepas control, (en el caso de Ia cepa 22A superior al doble), Io cual indica su potencial acción en Ia modulación de actividades celulares del intestino, incluida Ia inmunomodulación.

La Figura 6 muestra los resultados de adhesión de Ia cepa CNCM 1-4035 (cepa

15B), indicando también un porcentaje de adhesión celular muy superior a Ia de las cepas control.

Ejemplo 10. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS.

Aislamiento de DNA, amplificación y secuenciación del fragmento 16S rRNA.

Dado el número de colonias seleccionadas en Ia prueba de adhesión, se procede directamente a su identificación mediante amplificación del fragmento 16S rRNA de cada colonia, secuenciación y búsqueda de homología en Ia base de datos de Ia National Center of Biotechnology Information (NCBI).

En primer lugar, se incuban las colonias seleccionadas en medio MRS durante 48 hrs a 37ºC en anaerobiosis. Luego se lavan con PBS. Para ello:

1. Las colonias se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos.

2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el pellet bacteriano en 1ml de PBS estéril.

3. Repetir los pasos 1 y 2 tres veces.

4. Por último, resuspender el pellet en 1 mi de PBS estéril.

Luego, se extrae el ADN genómico de las bacterias, para Io cual se procede de Ia siguiente manera: 1. Centrifugar la suspensión anterior a 5000 rpm durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante.

2. El pellet bacteriano se resuspende en 567ml de tampón Tris-EDTA (TE).

3. Agregar 3OmI de Dodecil sulfato de sodiodo (SDS) al 10% y 3ml de proteinasa K (20mg/ml).

4. Incubar Ia mezcla a 37ºC durante 1 hora.

5. Agregar 100ml de NaCI 5M y 8OmI de cetil trimetilamonio bromuro (CTAB)/NaCI.

6. Mezclar e incubar a 65ºC durante 10 minutos.

7. Agregar igual volumen (78OmI) de Ia mezcla cloroformo/alcohol isoamílico (24:1).

8. Mezclar y centrifugar durante 5 minutos a 10000 rpm.

9. Extraer Ia fase acuosa superior y transferir a un nuevo Eppendorf.

10. Agregar igual volumen de Ia mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1).

11. Mezclar y centrifugar durante 5 minutos a 10000 rpm.

12. Extraer Ia fase acuosa superior y transferir a un nuevo Eppendorf.

13. Agregar 0.6 volúmenes de isopropanol.

14. Centrifuga durante 13 minutos a 13000 rpm a 4ºC.

15. Eliminar el sobrenadante y agregar al ADN precipitado, 1ml de etanol al 70%.

16. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm a 4ºC.

17. Eliminar el sobrenadante y el precipitado de ADN, luego dejar secar a temperatura ambiente.

18. Resuspender entre 20-50 mi de agua.

19. Medir Ia concentración por medio de un espectrofotómetro a 260nm y obtener Ia relación 260/280, para verificar su pureza. Amplificación del gen rADN 16S y espacio intergénico 16s-23s por PCR.

• Oligonucleótidos utilizados:

Para amplificar el gen rADN 16s, se utilizaron los siguientes juegos de oligonucleótidos universales:

27F 5 ^' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ^' (M = A + C) (SEQ. ID. NO. 1)

1492R 5 ^' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ^' (Y = C + T) (SEQ. ID. No. 2)

Amplifica un fragmento de aproximadamente 1450 bp a una temperatura de hibridación de 55ºC, tiempo de amplificación de 90 seg y 35 ciclos.

39F 5 ^' -TGGCTCAGRWYGAACGCTRG-3 ^' (R = A + G ₁ W = A + T, Y = C + T) (SEQ. ID. No. 3)

1391 R 5 ^' -GACGGGCGGTGWGTRCA-3' (SEQ. ID. No. 4)

Amplificar un fragmento de aproximadamente 1350bp a una temperatura de hibridación de 52ºC, tiempo de amplificación de 90 seg y 35 ciclos.

Además se diseñaron oligonucleótidos específicos para bifidobacterias, estos son:

Bif 250bp F 5 ^' -CTCGTAGGCGGTTCGTCG-3 ^' (SEQ. ID. No. 5)

Bif 250bp R 5--AACGGGCCCCACATCCAG-3 ^' (SEQ. ID. No. 6)

Amplificar un fragmento de aproximadamente 250bp a una temperatura de hibridación de 65ºC, tiempo de amplificación de 20 seg y 30 ciclos.

Para amplificar las zonas intergénicas 16s-23s, de bacterias lactobacilos y bifidobacterias, se utilizaron los siguientes juegos de oligonucleótidos:

lactoF 5 ^' -ACACCGCCCGTCACACCATG-3 ^' (SEQ. ID. No. 7)

lactoR 5 -CCHSTTCGCTCGCCGCTACT-3 ^' (H = A + T, S = G + C) (SEQ. ID. No.8)

Oligonucleótidos específicos para lactobacilos. Amplificar un fragmento de aproximadamente 600 bp a una temperatura de hibridación de 65ºC, tiempo de amplificación de 30 seg y 30 ciclos.

ISBif F 5 ^' -GGGATGCTGGTGTGGAAGAGA-3 ^' (SEQ. ID. No. 9) ISBif R 5 ^' -TGCTCGCGTCCACTATCCAGT-3 ^' (SEQ. ID. NO. 10)

Oligonucleótidos específicos para bifidobacterias. Amplificar un fragmento de aproximadamente 240bp a temperatura de hibridación de 6OºC, tiempo de amplificación de 30 seg y 30 ciclos.

Para Ia amplificación del gen rADN 16s y del espacio intergénico 16s-23s, se cargaron entre 50-100 ng de ADN para una PCR de volumen final de 50μl, en cada ciclo se utilizó una temperatura de desnaturalización de 94ºC durante 30 seg. Luego se programó según las condiciones de cada juego de oligonucleótidos antes especificadas.

Se verificó el resultado de Ia amplificación en un gel de agarosa al 1.3%, se tiñeron las muestras con bromuro de etidio y se visualizaron en un transiluminador ultra violeta.

Las amplificaciones que resultaron negativas se repitieron, las que resultaban positivas se procedieron a amplificar con el kit de GE healthcare: Ilustra™ GFX™ PCR

DNA and gel Band Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez purificados se resuspendieron las muestras en 25ml de agua y se ratificó Ia purificación visualizando en un nuevo gel de agarosa al 1.3%.

Posteriormente, las muestras fueron llevadas al Servicio de Secuenciación de ADN del Instituto de Parasitología y Biomedicina "Lopez-Neyra" (CSIC).

Ejemplo 11. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE PRUEBAS DE FERMENTACIÓN.

Se utilizan los sistemas API ZYM y API 50 CHL (bioMerieux ^' s). El sistema API

ZYM es un método semi-cuantitativo para Ia medición de actividades enzimáticas. Este sistema posee 20 poc¡llos, ^" 19 de los cuales contiene un substrato deshidratado para Ia detección de Ia actividad de 19 enzimas (Figuras 7 y 8) se obtiene un resultado colorimétrico, el cual es indicativo del grado de actividad enzimática, y fue graduada en una escala de 0-5 en comparación con el control. También, se utilizó API 50 CH strips y API CHL medio (bioMerieux ^' s), el cual es un método para obtener un perfil de fermentación de 49 carbohidratos (Figuras 9 y 10). Se obtiene un resultado colorimétrico, pero en este caso sólo se clasifican como positivo (+), negativo (-), e intermedio (V), en comparación con el control. En todas las pruebas se utilizaron las bacterias controles. Ejemplo 12. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS CEPAS L.

PARACASEI CNCM I-4034, β. BREVE CNCM I-4035 Y L. RHAMNOSUS CNCM I-4036

Cepas en estudio y condiciones de cultivo y almacenamiento.

En el presente estudio se han analizado un total de 3 cepas pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Bidifobaterium (Tabla 1).

Tabla 1. Cepas utilizadas en el estudio y condiciones de cultivo.

Para estas cepas, se ha evaluado su capacidad antimicrobiana frente a agentes patógenos digestivos bacterianos {Helicobacter pylori, Listeria monocytogeπes, Shigella sonnei, Escherichia coli enterotoxigénica, Escherichia coli enteropatógena y Salmonella entérica) y víricos (virus Ito, Wa y Va70), recogidos en las Tablas 2 y 3.

Tabla 2. Cepas de microorganismos patógenos utilizados

Tabla 3. Cepas de microorganismos patógenos utilizados

En el caso de las bacterias, éstas fueron almacenadas en una solución de MRS adicionado con glicerol 20% (p/v) mediante congelación a -8OºC. Los virus fueron almacenados en medio MEM en congelación a -19OºC.

Obtención del sobrenadante libre de células para el estudio.

Para obtener sobrenadante concentrado para los distintos ensayos, las cepas se cultivaron en medio líquido durante 17h y 24h en medio MRS (CNCM I-4034 y CNCM I- 4036) o MRS adicionado de cisteína 0.05% (CNCM I-4035) a 37ºC. El sobrenadante de cada una de las cepas se recogió por centrifugación y se liofilizó. El concentrado obtenido se disolvió hasta obtener una solución concentrada 10x, se neutralizó el pH hasta un valor de 6.0 y se esterilizó mediante filtración por 0.22 μm. Alícuotas del sobrenadante neutralizado y esterilizado se almacenaron en congelación a -2OºC hasta su uso.

Ensayos de actividad en medio líquido frente a patógenos digestivos bacterianos.

Para llevar a cabo los ensayos de inhibición en medio líquido, se utilizó una modificación del protocolo de Spinler y colaboradores (2008). Brevemente, en placas multipocillo de 250 μl de volumen se adicionaron por separado los sobrenadantes obtenidos en porcentajes (v/v) crecientes (0.2% a 4%) a medio de cultivo inoculado al 5% con crecimiento overnight de cada uno de los patógenos. Las curvas de crecimiento se obtuvieron de forma monitorizada mediante medida de Ia DO 595nm utilizando el lector de placas Multiskan 5 Ascent. A partir de los resultados obtenidos en las distintas réplicas, se evaluó de forma cuantitativa Ia inhibición ejercida en forma de porcentaje de inhibición del crecimiento respecto a un control sin adición de sobrenadante de Ia cepa inhibidora.

Ensayos de actividad en medio líquido frente a patógenos digestivos víricos.

Los ensayos de reducción de Ia infección vírica a partir de sobrenadante de las cepas en estudio se llevaron a cabo según el protocolo publicado por Botic et al. (2007) con modificaciones para su adaptación al trabajo a realizar en este proyecto. En este caso, para Ia realización de estos ensayos se utilizó Ia línea de células intestinales humanas HT- 29. Resultados de los ensayos de actividad en medio líquido frente a los patógenos digestivos bacterianos: Listeria monocytogenes, Shigella sonnei y Helicobacter pylori

Para evaluar el efecto de los sobrenadantes de crecimiento de las cepas L paracasei, L rhamnosus y B. breve, se utilizaron sobrenadantes de crecimiento de 17 y 24h respectivamente, neutralizados y concentrados 10x.

Los resultados variaron mucho dependiendo tanto del probiótico como de Ia cepa patógena. En el caso de L. monocytogenes, Ia adición del sobrenadante obtenido tras el crecimiento durante 17 h de L paracasei tuvo un efecto inhibidor (Figura 10A). En el caso de L rhamnosus, los mejores resultados se obtuvieron a partir de Ia adición de sobrenadante de 24 h de cultivo. En el caso de B. breve, se destaca Ia inhibición en L monocytogenes CECT 4031 T (Figura 10B). Los resultados obtenidos para S. sonnei fueron similares a los de L. monocytogenes, dado que para L paracasei se obtuvieron los mejores resultados a partir de Ia adición del sobrenadante obtenido tras el crecimiento durante 17 h, y en L rhamnosus los mejores resultados se obtuvieron a partir de Ia adición de sobrenadante de 24 h de cultivo (Figura 10C). En el caso de H. pylori, se ha obtenido una disminución significativa en el crecimiento del patógeno a partir de los sobrenadantes de 17h y 24h de L. paracasei y B. breve, siendo Ia inhibición mayor en los sobrenadantes provenientes de 24h de cultivo. Los porcentajes de inhibición obtenidos quedan descritos en Ia siguiente tabla (tabla 4).

Tabla 4: porcentajes de inhibición obtenidos para cada una de los patógenos en medios de cultivo adicionados de sobrenadantes de las cepas en estudio. Resultados de los ensayos de actividad en medio líquido frente a los patógenos digestivos bacterianos: Salmonella typhi, Salmonella thyphimurium y Escherichia coli

Para el sobrenadante de Ia bacteria L. paracasei se observa una inhibición del crecimiento significativa para el grupo de las Salmonella ensayadas (Figura 11). Este efecto se debe principalmente al sobrenadante no neutralizado, Io que sugiere que se debe a Ia producción de ácido procedente de Ia fermentación, que limita el crecimiento del patógeno. En el caso de Ia Salmonella typhi CECT 725, se observa el efecto inhibidor ya sea al 1 % y 4% del sobrenadante independientemente de si este se encuentra o no neutralizado Io que sugiere que Ia inhibición se debe a algún tipo de bacteriocina u otro factor de naturaleza desconocida que estaría ejerciendo este efecto sobre el patógeno.

El sobrenadante de Ia bacteria B. breve ejerce una inhibición del crecimiento sobre Ia bacteria Salmonella typhi (CECT 725). Se observa este efecto utilizando el sobrenadante para todas las condiciones (17 y 24 h; neutralizado y no neutralizado; 1% y 4%), no descartándose nuevamente Ia producción de algún tipo de bacteriocina u otro factor de distinta naturaleza (Figura 12).

Para el sobrenadante de Ia bacteria L. rhamnosus se aprecia una inhibición significativa del crecimiento principalmente al 4%, para todos los grupos (E coli ETEC, E. coli EPEC y Salmonella entérica) (Figura 13). Este efecto se observa mayoritariamente con el sobrenadante no neutralizado, Io que de nuevo sugiere que se deba a productos ácidos derivados de Ia fermentación, que limitan el crecimiento del patógeno.

Aunque en el caso de Ia E. coli EPEC (CECT 742) y Salmonella typhimurium (CECT 4594) se observa inhibición con el sobrenadante neutralizado de 24 h, este efecto pude ser atribuido, como en casos anteriores, a Ia presencia de algún tipo de factor o bacteriocina procedente del medio de crecimiento de Ia bacteria probiótica (Figura 13).

Resultados de los ensayos de actividad en medio líquido frente a los patógenos digestivos víricos: Rotavirus humanos Ito, Wa y Va70

Se ha puesto a punto los protocolos de infección, detección de focos de infección y cuantificación de efecto protector para los rotavirus humanos Ito, Wa y Va70. Para obtener resultados Io más representativos posibles, los ensayos de infección y protección se han llevado a cabo en Ia línea celular humana HT-29. Una vez amplificados los virus en células MA-104, se procedió a su titulación en Ia línea HT-29. Los títulos obtenidos en unidades formadoras de focos de infección fueron 2,02x10 ⁶ uff/mL para el virus Ito, 6,80x10 ⁴ uff/mL para el virus Wa y 2,33x10 ⁵ uff/mL para el virus Va70. Los virus se llevaron a las concentraciones apropiadas de infección a partir de los resultados de titulación obtenidos. Para asegurar Ia corrección de los ensayos, se realizaron los ensayos de infección utilizando tres diluciones decimales seriadas consecutivas y se realizaron los ensayos por triplicado. La Figura 14 resume los resultados de reducción de focos de infección obtenidos en sobrenadantes sin concentrar previamente neutralizados, provenientes de cultivos de 24 h. Estos resultados indican que las cepas de Ia presente invención reducen los focos de infección de todos los virus ensayados, (Wa, Ito y Va70).

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