以下に、本発明の実施例を記載するが、本� ��明はこれらによって制限されるものではな� ��。なお、記載中の「%」は特に断らない限り 、質量基準である。
[実施例1]
<クロストリジウム属細菌由来イソプロピ� �アルコール生成酵素遺伝子群発現ベクター� �よび該発現ベクター形質転換体の構築>
 クロストリジウム属細菌のイソプロピルア� ��コール生成酵素4種のアミノ酸配列と遺伝子 の塩基配列は既に報告されている。すなわち 、チオラーゼはGenBank  accession  number  AE001 437に記載のゲノム配列の相補鎖3005963~3007364に 記載されている。またCoAトランスフェラーゼ はGenBank  accession  number  X72831に、アセト� �酸デカルボキシラーゼはGenBank  accession  nu mber  M55392に、イソプロピルアルコールデヒ� ��ロゲナーゼはGenBank  accession  number  AF1573 07に記載されている。さらにこれら4種の遺伝 子を発現させるために必要なプロモーターの 塩基配列は、上記チオラーゼの塩基配列中に 存在するチオラーゼプロモーターの配列を使 用することができる。

 チオラーゼプロモーターとチオラーゼ遺� ��子を取得するために、Clostridium  acetobutylicu m  ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて 、TTT  GAA  TTC  CAT  GAT  TTT  AAG  GGG  G TT  AGC  ATA  TGC  A(配列番号1)、及びTTT  G GT  ACC  CTA  GCA  CTT  TTC  TAG  CAA  TAT   TGC  TGT  TCC(配列番号2)によりPCR法で増幅� �、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及 びKpnIで消化することでチオラーゼプロモー� �ーをコードするDNA配列を含む約1.5kbpのチオ� �ーゼフラグメントを得た。

 またCoAトランスフェラーゼ遺伝子を取得� ��るために、Clostridium  acetobutylicum  ATCC824の ゲノムDNAをテンプレートに用いて、TTT  GGT   ACC  CAA  CCT  TAA  ACC  TTC  ATA  TTT  CA A  CTA  CTT(配列番号3)  、及びTTT  GGA  TCC   CTA  AAC  AGC  CAT  GGG  TCT  AAG  TTC(配 列番号4)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフ� ��グメントを制限酵素KpnI及びBamHIで消化する� ��とで約1.4kbpのCoAトランスフェラーゼフラグ� ��ントを得た。

 アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子と� ��ーミネーター配列を取得するために、Clostri dium  acetobutylicum  ATCC824のゲノムDNAをテンプ レートに用いて、TTT  GGA  TCC  AGC  TAA  A CA  TTA  TTA  AAT  TTA  GGA  AGG  TG(配列番 号5)、及びTTT  GTC  GAC  CCA  ATG  AAC  TTA� � GAC  CCA  TGG  CTG(配列番号6)によりPCR法で 増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素 BamHI及びSalIで消化することでターミネーター をコードするDNA配列を含む約880bpのアセト酢� ��デカルボキシラーゼフラグメントを得た。

 なお、Clostridium  acetobutylicum ATCC824は細� �・微生物・遺伝子バンクであるアメリカン� �イプカルチャーコレクションより入手する� �とができる。

 更に、イソプロピルアルコールデヒドロ� ��ナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium   beijerinckii  NRRL  B-593のゲノムDNAをテンプ� �ートに用いて、TTT  GGT  ACC  GCG  AAA  TAG   CGA  TGA  ACA  GGC  AG(配列番号7)、及びTT T  GGT  ACC  GCA  GAT  TTT  GCT  ACT  CTT � �GGA  GC(配列番号8)によりPCR法で増幅し、得� �れたDNAフラグメントを制限酵素KpnIで消化す� ��ことで約1.4kbpのイソプロピルアルコールデ� ��ドロゲナーゼフラグメントを得た。

 なお、Clostridium  beijerinckii  NRRL  B-593� �細胞・微生物バンクであるVTTカルチャーコ� �クションより入手することができる。

 上記の4つのDNAフラグメントと、プラスミ ドpUC19を制限酵素EcoRI及びSalIで消化すること� ��得られるフラグメントを混合し、リガーゼ� ��用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5� �株コンピテントセル(東洋紡績株式会社  DNA -903)に形質転換し、アンピシリン100μg/mLを含� ��、40mg/mLのX-galと20%IPTGを各々40μLずつ表面に� ��布したLB Broth,Miller培養液(Difco244620)寒天プ� �ートに生育する形質転換体を得た。得られ� �コロニーをアンピシリン100μg/mLを含むLB液体 培地で、37℃で一晩培養し、得られた菌体か� ��プラスミドpIPAを回収した。

 このプラスミドpIPAをエシェリシア・コリ B株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し、 アンピシリン100μg/mLを含むLB Broth,Miller培養� �寒天プレートで、37℃で一晩培養することに より、イソプロピルアルコール生成酵素遺伝 子群発現ベクター形質転換体pIPA/B株を得た。

 なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は� ��胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカ� ��タイプカルチャーコレクションより入手す� ��ことができる。

[実施例2]
<エシェリヒア・コリpIPA/B株、エシェリヒ� �・コリB野生株によるイソプロピルアルコー� ��生産>
 前培養として14mL容量のプラスチックチュー ブ(FALCON社製 2057)にアンピシリン0.1g/L、グル� ��ース2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を5mL入れ� �実施例1において得られたエシェリヒア・コ� ��pIPA/B株を植菌し、一晩、培養温度37℃、120rp mで振とう培養を行った。またアンピシリン� �含まない以外は同様の培地組成並びに培養� �件でエシェリヒア・コリB野生株を振とう培� ��した。各々の前培養液全量を、アンピシリ� ��0.1g/L、グルコース20g/Lを含むLB Broth,Miller培� ��液を60mL入れた300mL容の三角フラスコに移し� ��培養を行った。培養は攪拌速度120rpm、培養� ��度37℃で行った。培養開始48時間後に菌体培 養液をサンプリングし、遠心操作によって菌 体を除いた後、得られた培養上清中のイソプ ロピルアルコール、ブタノール、エタノール 、アセトンの蓄積量をHPLCで定法に従って測� �した。結果を表1に示す。エシェリヒア・コ� ��pIPA/B株において、培養48時間後で2.1g/Lのイ� �プロピルアルコールの蓄積が確認された。� �の時ブタノール及びエタノールの蓄積はな� �った。

[実施例3]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpIP A/B株によるイソプロピルアルコール生産(1)> ;
 本実施例では、図1に示される生産装置10を� ��いて処理を行った。培養槽12には1リットル� ��のものを使用し、トラップ槽40には500mL容の ものを使用した。培養槽12、トラップ槽40、� �入管16、連結管30、排出管44は、すべてガラ� �製のものとした。トラップ槽40には、トラッ プ液42としての水(トラップ水)が400mLの量で注 入されている。

 前培養として、試験管にアンピシリン0.1g /L、グルコース2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液� �4mL入れ、実施例1において得られたエシェリ� ��ア・コリpIPA/B株を接種して、18時間、培養� �度37℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養液 全量を、アンピシリン0.1g/L、グルコース20g/L� ��アデカノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液50 0mLを入れた1L培養槽に接種し、培養を行った� ��培養は攪拌速度500rpm、培養温度37℃で行い� �12.5%アンモニア溶液を用いて培養液のpHを7.0� ��コントロールした。また、培養開始から25� �間目に0.5g/mL濃度のグルコースを20mL添加した 。培養開始から48時間後に菌体培養液をサン� ��リングし、遠心操作によって菌体を除いた� ��、得られた培養上清中のイソプロピルアル� ��ール、ブタノール、エタノール、アセトン� ��蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結果 を表2に示す。エシェリヒア・コリpIPA/B株に� �いて、培養48時間後で3.0g/Lのイソプロピルア ルコールの蓄積が確認された。この時ブタノ ール及びエタノールの蓄積はなかった。なお 、表2中の各測定値は、培養後の培養液とト� �ップ水(400mL)中の合算値である。

[実施例4]
<エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝� �、エシェリヒア・コリ由来CoAトランスフェ� �ーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来� �セト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロ� �トリジウム属細菌由来イソプロピルアルコ� �ルデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターお� �び該発現ベクター形質転換体の構築>
 エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエ� ��ェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼの� ��ミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告� ��れている。すなわち、チオラーゼをコード� ��る遺伝子はGenBank  accession  number  U00096に 記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列 の2324131~2325315に記載されている。またCoAトラ ンスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エ シェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469~2 322781に記載されている。これらと共に実施例 1記載のクロストリジウム属細菌由来のアセ� �酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロ� �ルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発� �させることでイソプロピルアルコールの生� �が可能である。上記の遺伝子群を発現させ� �ために必要なプロモーターの塩基配列とし� �、GenBank accession number X02662の塩基配列情報� ��おいて、397-440に記されているエシェリヒア ・コリ由来のグリセルアルデヒド3-リン酸デ� ��ドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)の プロモーター配列を使用することができる。

 GAPDHプロモーターを取得するためエシェ� �ヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレー� �に用いてCGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(配列番号9 )、及びCGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(配列番号10)� �よりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメン� �を制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bp� ��GAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメント� �得た。得られたDNAフラグメントとプラスミ� �pBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素Nd eI及びSphIで消化することで得られるフラグメ ントを混合し、リガーゼを用いて結合した後 、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセ� ��(東洋紡績株式会社  DNA-903)に形質転換し、 アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに� �育する形質転換体を得た。得られたコロニ� �をアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37� �で一晩培養し、得られた菌体からプラスミ� �pBRgapPを回収した。

 イソプロピルアルコールデヒドロゲナー� ��遺伝子を取得するために、Clostridium  beijeri nckii  NRRL  B-593のゲノムDNAをテンプレート� �用いて、AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(� ��列番号11)、及びGCGGATCCGGTACCTTATAATATAACTACTGCTTTAA TTAAGTC(配列番号12)によりPCR法で増幅し、得ら� ��たDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消� ��することで約1.1kbpのイソプロピルアルコー� ��デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得� ��れたDNAフラグメントと先に作成したプラス� ��ドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化するこ とで得られるフラグメントを混合し、リガー ゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリ DH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 � �DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを� ��むLB寒天プレートに生育する形質転換体を� �た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mL を含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得ら� �た菌体からプラスミドpGAP-IPAdhを回収した。

 エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺� ��子を取得するためエシェリヒア・コリMG1655� ��のゲノムDNAをテンプレートに用いてATGGATCCGC TGGTGGAACATATGAAAAATTGTGTCATCGTCAG(配列番号13)、及びG CAGAAGCTTGTCTAGATTAATTCAACCGTTCAATCACCATC(配列番号14)に よりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメント を制限酵素BamHI、HindIIIで消化することで約1.2 kbpのチオラーゼフラグメントを得た。得られ たDNAフラグメントと先に作成したプラスミド pGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びHindIIIで消化する� �とで得られるフラグメントを混合し、リガ� �ゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コ� �DH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社   DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを 含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を� ��た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/m Lを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得ら� ��た菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoBを回収し� ��。

 エシェリヒア・コリ由来のCoAトランスフ� ��ラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア� ��コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用� ��てGCTCTAGAGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATTACAAGAC(配 列番号15)、及びTAGCAAGCTTCTACTCGAGTTATTTGCTCTCCTGTGAAA CG(配列番号16)によりPCR法で増幅し、得られた DNAフラグメントを制限酵素XbaI、HindIIIで消化� ��ることで約600bpのCoAトランスフェラーゼαサ ブユニットフラグメントを得た。得られたDNA フラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-I PAdh-atoBを制限酵素XbaI及びHindIIIで消化するこ� ��で得られるフラグメントを混合し、リガー� ��を用いて結合した後、エシェリヒア・コリD H5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社   DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを� �むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得 た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mL� ��含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られ た菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoDを回収� ��た。

 さらにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノ� ��DNAをテンプレートに用いてAAGTCTCGAGCTGGTGGAACAT ATGGATGCGAAACAACGTATTG(配列番号17)、及びGGCCAAGCTTCAT AAATCACCCCGTTGC(配列番号18)によりPCR法で増幅し� �得られたDNAフラグメントを制限酵素XhoI、Hind IIIで消化することで約600bpのCoAトランスフェ� ��ーゼβサブユニットフラグメントを得た。� �られたDNAフラグメントと先に作成したプラ� �ミドpGAP-IPAdh-atoB-atoDを制限酵素XhoI及びHindIII� ��消化することで得られるフラグメントを混� ��し、リガーゼを用いて結合した後、エシェ� ��ヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡� ��株式会社  DNA-903)に形質転換し、アンピシ� ��ン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形 質転換体を得た。得られたコロニーをアンピ シリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培 養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-a toB-atoD-atoAを回収した。

 アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を� ��得するために、Clostridium  acetobutylicum  ATCC 824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、CAGGTA CCGCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAGC(配列番� �19)、及びGCGGATCCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC(配列� �号20)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラ� �メントを制限酵素KpnI、BamHIで消化すること� �約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラ グメントを得た。得られたDNAフラグメントと 先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA� �制限酵素KpnI及びBamHIで消化することで得ら� �るフラグメントを混合し、リガーゼを用い� �結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コン ピテントセル(東洋紡績株式会社  DNA-903)に� �質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天� ��レートに生育する形質転換体を得た。得ら� ��たコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液 体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体か� ��プラスミドpGAP-Iaaaを回収した。

 このプラスミドpGAP-Iaaaをエシェリシア・コ� ��B株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し� ��アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天� ��レートで37℃で一晩培養することにより、� �シェリヒア・コリpGAP-Iaaa/B株を得た。
 なおエシェリヒア・コリMG1655株、Clostridium   acetobutylicum ATCC824、エシェリシア・コリB株� ��細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリ� ��ンタイプカルチャーコレクションより入手� ��ることができる。

[実施例5]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 1)>
 実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��前培養として三角フラスコに入れたアンピ� ��リン0.1g/Lを含むLB Broth, Miller培養液25mLを用 い、実施例4において得られたエシェリヒア� �コリpGAP-Iaaa/B株を接種して、16時間、培養温� ��35℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養液� �量を、グルコース50g/L、アデカノール1滴を� �むLB Broth,Miller培養液475mLを入れた1L培養槽に 接種し、培養を行った。培養は攪拌速度500rpm 、培養温度35℃で行い、24wt/wt%水酸化ナトリ� �ム溶液を用いて培養液のpHを7.0にコントロー ルした。培養開始から24時間後に菌体培養液� ��サンプリングし、遠心操作によって菌体を� ��いた後、得られた培養上清中のイソプロピ� ��アルコール、ブタノール、エタノールの蓄� ��量をHPLCで定法に従って測定した。培養24時� ��後で5.5g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積� ��確認された。この時ブタノール及びエタノ� ��ルの蓄積はなかった。また48時間後のイソ� �ロピルアルコールの蓄積量は5.0g/Lであった� �なお、測定値は、培養後の培養液とトラッ� �水(500mLに変更)中の合算値である。

[実施例6]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 2)>
 実施例5と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��1L培養槽での培養において表3に示す組成の� ��地475mLを用いた。この時の硫安由来の窒素� �子の質量%は、培養開始時の培養培地全質量� ��対して0.04質量%である。また50wt/wt%のグルコ ース水溶液を10g/L/時間の流速で添加した。そ の結果、培養24時間後で7.4g/Lのイソプロピル� ��ルコールの蓄積が確認された。この時ブタ� ��ール及びエタノールの蓄積はなかった。ま� ��48時間後のイソプロピルアルコールの蓄積� �は6.2g/Lであった。なお、測定値は、培養後� �培養液とトラップ水(500mL)中の合算値である� ��

[実施例7]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 3)>
 実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��1L培養槽での培養において30時間後に(NH ₄ ) ₂ SO ₄ を0.2質量%(2g/L)追加した。本実施例における� �安由来の窒素原子の質量%の合計は、培養開� ��時の培養培地全質量に対して0.08質量%であ� �。その結果、培養24時間後で7.2g/Lのイソプロ ピルアルコールの蓄積が確認された。この時 ブタノール及びエタノールの蓄積はなかった 。また48時間後のイソプロピルアルコールの� ��積量は13.4g/Lであった。なお、測定値は、培 養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値� �ある。硫酸アンモニウムといった窒素源を� �当量加えることで生産性が向上することが� �された。

[実施例8]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 4)>
 実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��1L培養槽での培養における培地組成の内、(N H ₄ ) ₂ SO ₄ の量を0.4質量%(4g/L)とした。本実施例におけ� �硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時� ��培養培地全質量に対して0.08質量%である。� �の結果、培養24時間後で11.6g/Lのイソプロピ� �アルコールの蓄積が確認された。なお、測� �値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)中� ��合算値である。硫酸アンモニウムといった� ��素源を適当量加えることで生産速度が向上� ��ることが示された。

[実施例9]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 5)>
 実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��1L培養槽での培養における培地組成の内、(N H ₄ ) ₂ SO ₄ の量を0.5質量%(5g/L)とした。本実施例におけ� �硫安由来の窒素原子の質量%は、培養開始時� ��培養培地全質量に対して0.11質量%である。� �の結果、培養24時間後で11.2g/Lのイソプロピ� �アルコールの蓄積が確認された。また55時間 後には21.3g/Lのイソプロピルアルコールの蓄� �が確認された。なお、測定値は、培養後の� �養液とトラップ水(500mL)中の合算値である。

[実施例10]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 6)>
 実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��pH調整剤は12.5質量%のアンモニア水を使用し た。その結果、培養24時間後で13.3g/Lのイソプ ロピルアルコールの蓄積が確認された。また 55時間後には28.4g/Lのイソプロピルアルコール の蓄積が確認された。培養55時間後までに添� ��した12.5質量%アンモニア水の質量は69.0gであ り、本実施例におけるアンモニア水由来の窒 素原子の質量%の合計は、培養開始時の培養� �地全質量に対して0.73質量%である。なお、測 定値は、培養後の培養液とトラップ水(500mL)� �の合算値である。

[実施例11]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGA P-Iaaa/B株によるイソプロピルアルコール生産( 7)>
 実施例6と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産検討を行った。ただし� ��1L培養槽での培養における培地組成の内、� �リペプトン2g/Lにかわりコーンスティープリ� ��ー(日本食品化工製)を20g/L加え、(NH ₄ ) ₂ SO ₄ の量を5g/Lとした。その結果、培養24時間後で 10.9g/Lのイソプロピルアルコールの蓄積が確� �された。また55時間後には17.8g/Lのイソプロ� �ルアルコールの蓄積が確認された。本実施� �における硫安由来の窒素原子の質量%の合計� ��、培養開始時の培養培地全質量に対して0.11 質量%である。なお、測定値は、培養後の培� �液とトラップ水(500mL)中の合算値である。培� ��栄養源として幅広い成分を利用できること� ��示された。

[実施例12]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpIP A/B株によるイソプロピルアルコール生産(2)> ;
 実施例3と同様な条件で、1L培養槽を使用し� ��pIPA/B株のイソプロピルアルコール培養検討� ��行った。ただし、培養開始時に(NH ₄ ) ₂ SO ₄ を0.5%(5g/L)添加した。本実施例における硫安� �来の窒素原子の質量%は、培養開始時の培養� ��地全質量に対して0.11質量%である。その結� �、培養48時間後で4.5g/Lのイソプロピルアルコ ールの蓄積が確認された。

[実施例13]
<蒸留法による培養液からのイソプロピル� �ルコールの回収>
 蒸留に供する培養液として、実施例3の方法 に準じてpIPA/B株を培養し、培養液180gを得た� �これを培養液Aとした。培養液A178.6gを200mL容� ��のナスフラスコに入れ、オイルバスで攪拌� ��ながら加温し、定法に従って単蒸留を行っ� ��。培養液Aの各工程における塔頂温度と液量 を表4に示す。蒸留前の培養液と蒸留により� �取した液及び残液の中に含まれるイソプロ� �ルアルコール、ブタノール、エタノールの� �有量をHPLCで定法に従って測定した。結果を� ��5に示す。本実施例にかかるpIPA/B株を培養し た培養液からは、塔頂温度99.1~99.5℃で含有す るイソプロピルアルコールの殆ど全てを回収 することができた。この時、分取した液から ブタノール及びエタノールは検出されなかっ た。

[比較例1]
 特開昭61-67493号公報に記載のクロストリジ� �ム・sp.172CY-02株の培養液組成を模し、LB Broth ,Miller培養液にn-ブタノール9.9g/L、エタノール 0.6g/L、イソプロピルアルコール7.2g/Lを加えた 培養液を180g調製し、これを比較培養液Bとし� ��。比較培養液B177.9gを200mL容量のナスフラス� ��に入れ、オイルバスで攪拌しながら加温し� ��定法に従って単蒸留を行った。比較培養液B の各工程における塔頂温度と液量を表4に示� �。蒸留前の液と蒸留により分取した液及び� �液の中に含まれるイソプロピルアルコール� �ブタノール、エタノールの含有量をHPLCで定� ��に従って測定した。結果を表5に示す。比較 培養液Bでは、3種の混合アルコール成分のう� ��特にイソプロピルアルコールとブタノール� ��同じ留出挙動を示し、イソプロピルアルコ� ��ルのみを分離して回収することはできなか� ��た。

 実施例13と比較例1の結果から、本発明に� ��かる培養液はイソプロピルアルコール以外� ��副生アルコール類を含まないために容易に� ��ソプロピルアルコールを回収することがで� ��る。このため、本発明にかかる培養液から� ��単蒸留等の簡易な精製プロセスでイソプロ� ��ルアルコールを回収することが可能である� ��

 一方、既存菌による培養液ではイソプロ� ��ルアルコールと副生アルコール類の分離が� ��しくイソプロピルアルコールを容易に回収� ��きないことが分かった。既存菌による培養� ��からイソプロピルアルコールを回収するた� ��には、精留塔等の設備を付加した蒸留が必� ��となると考えられ、その分精製プロセスが� ��雑になると予想される。

 これらのことから、本発明にかかるイソ� ��ロピルアルコール生産細菌は植物由来イソ� ��ロピルアルコール生産の実用化において従� ��技術と比べて格段に優れているといえる。

[実施例14]<試験例>
 本実施例では、図1に示される生産装置10を� ��いて処理を行った。培養槽12には1リットル� ��のものを使用し、トラップ槽40には500mL容の ものを使用した。培養槽12、トラップ槽40、� �入管16、連結管30、排出管44は、すべてガラ� �製のものとした。トラップ槽40には、トラッ プ液42としての水(トラップ水)が400mLの量で注 入されている。

 10g/Lのイソプロピルアルコール水溶液を処� �液として500mL培養槽12に注入した。攪拌速度5 00rpm、処理温度37℃で処理を行った。
 次いで、注入管16から、空気を0.5L/min(1vvm)の 速度でイソプロピルアルコール水溶液に注入 し、処理を開始した。培養槽12からの排気は� ��トラップ槽40中のトラップ液42にバブリング させた。トラップ槽40からの排気は装置系外� ��空気中に放出した。処理開始から0,2,4,8,24時 間後に培養槽12内の処理液とトラップ槽40内� �トラップ液42を各々サンプリングし、HPLC測� �によりサンプル中のイソプロピルアルコー� �の蓄積量を測定した。なお、HPLC測定は、信� ��化工社製、ULTRON PS-80H(8.0mm ID、300mm L)を用� ��、溶離液として0.1% HClO ₄ を用い、流速を1.0mL/min、カラム温度を50℃と� ��、検出器は示差屈折率検出器(RI)を用いて行 った。結果を表6に示す。

 表6に示されるように、培養槽12内のイソプ� ��ピルアルコールの濃度は時間の経過と共に� ��少し、トラップ液42中のイソプロピルアル� �ール濃度は徐々に増加した。24時間経過時点 で培養槽内のイソプロピルアルコールの70%が 培養槽から水ボトルへ移動していることが分 かった。また、その時の総イソプロピルアル コール量は10.1gでマテリアルバランスもほぼ� ��致していた。
 従って、培養槽12内での通気培養の排気を� �ラップ槽40内のトラップ液42にバブリングさ� ��ることにより、処理液中のイソプロピルア� ��コールを処理液から分離して、トラップ液4 2に溶解させることが可能であるとわかった� �

[実施例15]
<イソプロピルアルコールの生産>
 本実施例では、実施例3で使用したものと同 一の生産装置10を用いてイソプロピルアルコ� ��ルを生産した。なお、トラップ槽40には、� �ラップ液42としての水(トラップ水)が400mLの� �で注入されている。

 前培養として、φ19mm×長さ175mmの試験管に 、アンピシリン0.1g/Lと、グルコース2g/Lとを� �むLB Broth,Miller培養液を4mL入れ、実施例1で得 たpIPA/B株を接種し、培養温度37℃、120rpmで18� �間振とう培養を行った。

 アンピシリン0.1g/Lと、グルコース20g/Lと、� �デカノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液500mL� ��含む培養槽12に、4mlの前培養液を接種し、� �養を開始した。培養は、攪拌速度500rpm、培� �温度37℃で行い、培養液のpHは、12.5%アンモ� �ア水を用いて7.0に調整した。
 次いで、注入管16から、空気を0.5L/min(1vvm)の 速度で培養液中に注入して通気培養を開始し た。培養槽12からの排気は、トラップ槽40中� �トラップ液42にバブリングさせた。
 培養開始から23時間経過した時点で、培養� �内に0.5g/Lのグルコース溶液を20mL添加した。

<サンプル中のイソプロピルアルコールの� �出>
 培養開始から0、7、23、30、47、及び52時間後 に、培養槽12中の処理後の培養液とトラップ� ��40中の処理後のトラップ液42とをサンプリン グした。サンプリングした培養液については 、遠心操作を行うことによって、培養液中の 菌体等固形物を除いた。

 サンプリングした培養液及び水中の、イソ� ��ロピルアルコールの蓄積量を、それぞれHPLC で測定した。結果を表7に示す。
 更に、培養開始47時間後の培養液及びトラ� �プ水について、HPLC測定したときに検出され� ��ピークの数、Rt時間(Retention time;保持時間)� �び化合物名を、培養液について表8、トラッ� ��水について表9にそれぞれ示す。

 なお、表8及び表9において「IPA」は、イ� �プロピルアルコールを示す。また、表8にお� ��て「不明」として示されるものは、イソプ� ��ピルアルコールの通気培養により生成した� ��雑物であるものと推測される。

 表7~表9に示されるように、イソプロピルア� ��コール生産細菌を用いた生産されたイソプ� ��アルコールが、通気培養によって培養液と� ��ラップ水に蓄積されていることが確認され� ��。
 また、培養開始から47時間後の培養液につ� �ては、グルコースと酢酸の他に、夾雑物と� �測される11個のピークが確認されたが、この ときのトラップ水について、イソプロピルア ルコールに相当するピーク以外のピークはな かった。従って、本生産方法によれば、培養 槽12からの排気をトラップ液42にバブリング� �せることにより、夾雑物とイソプロアルコ� �ルとを容易に分離することができることが� �かった。

 これにより、培養開始からイソプロピル� ��ルコールの回収まで、操作が簡便で、効率� ��よくイソプロピルアルコールを回収するこ� ��ができた。さらにイソプロピルアルコール� ��回収に水を用いることで夾雑物の無いイソ� ��ロピルアルコール水溶液を得ることができ� ��ことがわかった。このことから、本発明は� ��微生物の培養によるイソプロピルアルコー� ��生産の実用化において、精製工程負荷の少� ��い生産プロセス構築を可能にする画期的な� ��法であるといえる。

[比較例2]
<チオラーゼ遺伝子欠失pIPAプラスミドの構� ��及び該プラスミド形質転換体の構築>
 実施例1に記載のプラスミドpIPAからチオラ� �ゼ遺伝子を取り除いたプラスミドpIPAδthioを� ��製した。
 pIPAからチオラーゼプロモーターを単離する ために、pIPAをテンプレートに用いてTTT GAA T TC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(配列番 号21)、及びTTT TCT AGA TCT AAC TAA CCT CCT AAA  TTT TGA TAC GGG(配列番号22)によりPCR法で増幅� �、得られたフラグメントを制限酵素EcoRIとKpn Iで消化することで約240bpのチオラーゼプロモ ーターフラグメントを得た。

 更にpIPAからイソプロピルアルコールデヒ ドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、pIPA� �テンプレートに用いてTTT CTC GAG GCA GAT TTT� �GCT ACT CTT GGA GC(配列番号23)、及びTTT GGT AC C GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(配列番号24)に� ��りPCR法で増幅し、得られたフラグメントを� ��限酵素EcoRIとXbaIで消化することで約1.4kbpの� ��ソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺� ��子フラグメントを得た。

 上記の2つのDNAフラグメントと、プラスミ ドpIPAを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化すること� �得られる4.9kbpのフラグメントを混合し、リ� �ーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・� �リDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会� � DNA-903)に形質転換し、アンピシリン100μg/mL� ��含むLB寒天プレートに生育する形質転換体� �得た。得られたコロニーをアンピシリン100μ g/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得� ��れた菌体からプラスミドpIPAδthioを回収した 。pIPAδthioの塩基配列を定法に従って決定し� �チオラーゼプロモーターとイソプロピルア� �コールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNA配列に� �りがないことを確認した。

 このプラスミドpIPAδthioをエシェリシア・ コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換 し、アンピシリン100μg/mLを含むLB Broth,Miller� �養液寒天プレートで37℃で一晩培養すること により、形質転換体pIPAδthio/B株を得た。

 <1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリp IPAδthio/B株によるイソプロピルアルコール生� ��>
 実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産試験を行った。前培養� ��して、試験管にアンピシリン0.1g/L、グルコ� ��ス2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を4mL入れ、� �シェリヒア・コリpIPAδthio/B株を接種して、18 時間、培養温度37℃、120rpmで攪拌培養を行っ� ��。前培養液全量を、グルコース20g/L、アデ� �ノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液500mLを入� ��た1L培養槽に接種し、培養を行った。培養� �攪拌速度500rpm、培養温度37℃で行い、12.5%ア� ��モニア溶液を用いて培養液のpHを7.0にコン� �ロールした。また、培養開始から72時間目ま でに0.5g/mL濃度のグルコースを20mL添加した。� ��養開始から経時的に菌体培養液をサンプリ� ��グし、遠心操作によって菌体を除いた後、� ��られた培養上清中のイソプロピルアルコー� ��の蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。結 果を表10に示す。なお、表10中のイソプロピ� �アルコール量は、培養後の培養液とトラッ� �水中の合算値である。

 エシェリヒア・コリpIPAδthio/B株には、ア� ��ト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピル� ��ルコールデヒドロゲナーゼ及びCoAトランス� ��ェラーゼの各遺伝子が導入されているが、� ��オラーゼ遺伝子が導入されていないため、� ��の酵素の活性は生来のものに由来している� ��しかしながら、エシェリヒア・コリpIPAδthio /B株では、培養72時間後であってもイソプロ� �ルアルコールの蓄積はなかった。

[比較例3]
<チオラーゼ遺伝子及びCoAトランスフェラ� �ゼ欠失pIPAプラスミドの構築及び該プラスミ� ��形質転換体の構築>
 実施例1に記載のプラスミドpIPAからチオラ� �ゼ遺伝子とCoAトランスフェラーゼを取り除� �たプラスミドpIPAδthioδctfABを作製した。

 pIPAδthioを制限酵素KpnI及びBamHIで消化し、 DNA Blunting Kit(タカラバイオ株式会社)を用い� ��DNAの末端を平滑化して結合した後、エシェ� ��ヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡� ��株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリ ン100μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形� ��転換体を得た。得られたコロニーをアンピ� ��リン100μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培 養し、得られた菌体からプラスミドpIPAδthioδ ctfABを回収した。

 このプラスミドpIPAδthioδctfABをエシェリ� �ア・コリB株(ATCC11303)コンピテントセルに形� �転換し、アンピシリン100μg/mLを含むLB Broth,M iller培養液(Difco244620)寒天プレートで37℃で一� ��培養することにより、形質転換体pIPAδthioδc tfAB/B株を得た。

 <1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリp IPAδthioδctfAB/B株によるイソプロピルアルコー ル生産>
 実施例3と同様に1L培養槽を使用したイソプ� ��ピルアルコール生産試験を行った。前培養� ��して、試験管にアンピシリン0.1g/L、グルコ� ��ス2g/Lを含むLB Broth,Miller培養液を4mL入れ、� �シェリヒア・コリpIPAδthioδctfAB/B株を接種し� ��、18時間、培養温度37℃、120rpmで培養を行っ た。前培養液全量を、グルコース20g/L、アデ� ��ノール1滴を含むLB Broth,Miller培養液500mLを入 れた1L培養槽に接種し、培養を行った。培養� ��攪拌速度500rpm、培養温度37℃で行い、12.5%ア ンモニア溶液を用いて培養液のpHを7.0にコン� ��ロールした。また、培養開始から72時間目� �でに0.5g/mL濃度のグルコースを20mL添加した。

 培養開始から経時的に菌体培養液をサン� ��リングし、遠心操作によって菌体を除いた� ��、得られた培養上清中のイソプロピルアル� ��ールの蓄積量をHPLCで定法に従って測定した 。結果を表11に示す。なお、表11中のイソプ� �ピルアルコール量は、培養後の培養液とト� �ップ水中の合算値である。

 エシェリヒア・コリpIPAδthioδctfAB/B株には 、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプ ロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子 が導入されているが、チオラーゼ遺伝子及び CoAトランスフェラーゼ遺伝子が導入されてい ないため、これらの酵素活性は生来のものに 由来している。しかしながら、エシェリヒア ・コリpIPAδthioδctfAB/B株では、培養72時間後で イソプロピルアルコールの蓄積はなかった。

 実施例1、2、3と比較例2及び3の結果から� �本発明によって得られる大腸菌は、アセト� �酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルア� �コールデヒドロゲナーゼの活性のみでなく� �本来大腸菌のゲノムに存在するチオラーゼ� �伝子及びCoAトランスフェラーゼ遺伝子でコ� �ドされるこれらの酵素の活性も付与しなけ� �ばイソプロピルアルコールを生産しないこ� �がわかる。

[実施例16]
<glyAプロモーターを用いたエシェリヒア・� ��リ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・� ��リ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロ� ��トリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボ� ��シラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌� ��来イソプロピルアルコールデヒドロゲナー� ��遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター� ��質転換体の構築>
 実施例4のGAPDHプロモーターに代わり、エシ� ��リヒア・コリ由来のセリンヒドロキシメチ� ��トランスフェラーゼ遺伝子(glyA)プロモータ� ��を用いた。
 エシェリヒア・コリのセリンヒドロキシメ� ��ルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺� ��子の塩基配列は既に報告されている。すな� ��ち、セリンヒドロキシメチルトランスフェ� ��ーゼをコードする遺伝子はGenBank  accession   number  V00283 に記載されている。このプロ� ��ーターを用い、イソプロピルアルコールの� ��産に必要な遺伝子群を発現させることがで� ��る。

 glyAプロモーターを取得するためエシェリ ヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレート に用いてTCGACCGGCTCCAGTTCG(配列番号25)、及びCTGTC GCATGCTGACTCAGCTAACAATAAAATTTTTGG(配列番号26)によりPC R法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制� �酵素SphIで消化することで約850bpのglyAプロモ� ��ターにあたるDNAフラグメントを得た。得ら� ��たDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank  accession number J01749)を制限酵素NdeI処理の後、 T4DNAポリメラーゼ処理により平滑末端化し、� ��らにSphIで消化することで得られるフラグメ ントを混合し、リガーゼを用いて結合した後 、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセ� ��(東洋紡績株式会社  DNA-903)に形質転換し、 アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに� �育する形質転換体を得た。得られたコロニ� �をアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37� �で一晩培養し、得られた菌体からプラスミ� �pBRglyPを回収した。

 以下、実施例4と同様にして、チオラーゼ、 CoAトランスフェラーゼ、イソプロピルアルコ ールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボ キシラーゼのそれぞれをコードする遺伝子を 順次導入し、プラスミドpGly-Iaaaを回収した。
 このプラスミドpGly-Iaaaをエシェリシア・コ� ��B株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し� ��アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天� ��レートで37℃で一晩培養することにより、� �シェリヒア・コリpGly-Iaaa/B株を得た。

[実施例17]
<gadAプロモーターを用いたエシェリヒア・� ��リ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・� ��リ由来CoAトランスフェラーゼ遺伝子、クロ� ��トリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボ� ��シラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌� ��来イソプロピルアルコールデヒドロゲナー� ��遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター� ��質転換体の構築>
 実施例4のGAPDHプロモーターに代わり、エシ� ��リヒア・コリ由来のグルタミン酸デカルボ� ��シラーゼA遺伝子(gadA)プロモーターを用いた 。
 エシェリヒア・コリのグルタミン酸デカル� ��キシラーゼAのアミノ酸配列と遺伝子の塩基 配列は既に報告されている。すなわち、グル タミン酸デカルボキシラーゼAをコードする� �伝子はGenBank  accession  number  M84024に記載� ��れている。このプロモーターを用い、イソ� ��ロピルアルコールの生産に必要な遺伝子群� ��発現させることができる。

 gadAプロモーターを取得するためエシェリ ヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレート に用いてCGACTCGCATATGTCGTTTTTCTGCTTAGG(配列番号27)� �及びCAGTCGCATGCTTCGAACTCCTTAAATTTATTTGAAGGC(配列番号2 8)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメ� ��トを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約13 0bpのgadAプロモーターにあたるDNAフラグメン� �を得た。得られたDNAフラグメントとプラス� �ドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵� �NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグ メントを混合し、リガーゼを用いて結合した 後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテント� ��ル(東洋紡績株式会社  DNA-903)に形質転換し 、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレート� �生育する形質転換体を得た。得られたコロ� �ーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で3 7℃で一晩培養し、得られた菌体からプラス� �ドpBRgadPを回収した。

 以下、実施例4と同様にして、チオラーゼ、 CoAトランスフェラーゼ、イソプロピルアルコ ールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボ キシラーゼのそれぞれをコードする遺伝子を 順次導入し、プラスミドpGad-Iaaaを回収した。
 このプラスミドpGad-Iaaaをエシェリシア・コ� ��B株(ATCC11303)コンピテントセルに形質転換し� ��アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天� ��レートで37℃で一晩培養することにより、� �シェリヒア・コリpGad-Iaaa/B株を得た。

[実施例18]
<1L培養槽を使用したエシェリヒア・コリpGl y-Iaaa/B株およびpGad-Iaaa/B株によるイソプロピ� �アルコール生産>
 実施例5と同様に1L培養槽を使用したエシェ� ��ヒア・コリpGly-Iaaa/B株およびpGad-Iaaaによる� �ソプロピルアルコール生産検討を行った。� �の結果、培養24時間後でpGly-Iaaa/B株では3.1g/L� ��pGad-Iaaa/B株では2.6g/Lのイソプロピルアルコ� �ルの蓄積が確認された。なお、測定値は、� �養後の培養液とトラップ水(500mL)中の合算値� ��ある。
[実施例19]
<通気量1vvm又は2vvmでpGAP-Iaaa/B株を培養した� ��きのイソプロピルアルコールの生産性>
 本実施例では、実施例5で使用したものとト ラップ槽の容量を除いて同一の生産装置10を2 台用いてイソプロピルアルコールを生産した 。なお、それぞれのトラップ槽40は2000mL容量� ��あり、トラップ液42としての水(トラップ水) が2000mLの量で注入されている。

 前培養として三角フラスコに入れたアン� ��シリン0.1g/Lを含むLB Broth, Miller培養液25mLを 用い、実施例4において得られたエシェリヒ� �・コリpGAP-Iaaa/B株を接種して、16時間、培養� ��度35℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養� �全量を、グルコース50g/L、アデカノール1滴� �含むLB Broth,Miller培養液475mLを入れた1L培養槽 に接種し、培養を行った。培養は、攪拌速度 500rpm、培養温度35℃で行い、培養液のpHは、Na OHを用いて7.0に調整した。

 次いで、1台目の生産装置では、注入管16か� ��、空気を1vvmとなるように培養液中に注入し て通気培養を開始した。2台目の生産装置で� �、注入管16を2本用い、空気と窒素ガスを各� �1vvm、総通気量が2vvmとなるように培養液中に 注入して通気培養を開始した。培養槽12から� ��排気は、トラップ槽40中のトラップ液42にバ ブリングさせた。
 その結果、培養24時間後で、通気量1vvmでは5 .5g/L、2vvmでは3.3g/Lのイソプロピルアルコール の蓄積が確認された。なお、測定値は培養後 の培養液とトラップ水中の合算値である。ト ラップ水中のイソプロピルアルコール量は、 水中のイソプロピルアルコール濃度を4倍し� �養液量相当に換算して算出した。

[実施例20]
<通気量1vvm又は0.75vvmでpIPA/B株を培養したと きのイソプロピルアルコールの生産性>
 実施例3と同様にpIPA/B株の培養検討を行った 。ただし、グルコースは40g/Lとし、pH調整剤� �アンモニア水を用いた。なお、それぞれの� �ラップ槽40は500mL容量であり、トラップ液42� �しての水(トラップ水)が500mLの量で注入され� ��いる。気体は空気を用い、通気量は1vvm又は 0.75vvmとした。その結果、培養54時間後で、通 気量1vvmでは2.8g/L、0.75vvmでは2.8g/Lのイソプロ� ��ルアルコールの蓄積が確認された。なお、� ��定値は培養後の培養液とトラップ水中の合� ��値である。

 実施例19と実施例20の結果より、本願発明 者らは、イソプロピルアルコールの生産に適 する通気量があることを見出した。培養槽へ 注入する総通気量は2vvmよりも0.75~1vvmの方が� �ソプロピルアルコールの生産に好ましいこ� �を見出した。

 以上のように、本発明の実施形態によれば� ��副生するアルコール類が少なく、副生アル� ��ールの分離工程を必要とせずに簡単な精製� ��行うだけで、より精製されたイソプロアル� ��ールを簡便に且つ効率よく生産することが� ��きる。
 本発明により得られたイソプロピルアルコ� ��ルは、種々の用途に利用することができ、� ��えばプロピレンの製造原料として好適に使� ��することができる。

 日本出願番号2007-181571の開示はその全体が� �照により本明細書に取り込まれる。
 本明細書に記載された全ての文献、特許出� ��、および技術規格は、個々の文献、特許出� ��、および技術規格が参照により取り込まれ� ��ことが具体的かつ個々に記された場合と同� ��度に、本明細書中に参照により取り込まれ� ��。