说 明 书 用于预防及治疗多种自身免疫疾病的新化合物 技术领域 本发明涉及一系列新异恶唑和 3-氧代丁腈类化合物及其制备方法， 包含它们作为 有效成份的药物组合物及其在免疫性疾病中应 用。 发明背景

Janus激酶 （JAK _S ) 是一类细胞内非受体酪氨酸激酶， 属于蛋白质激酶家族中成 员。 JAKs的分子量约为 120 -HOkDao 在哺乳动物中， JAKs家族共有四个成员- JAK1 , JAK2和 JAK3和 TYK2。 这些激酶通过同细胞因子和细胞因子受体的相 互作用 来发挥自己的作用 （参考文献： Rodig S. et al "Disruption of the Jakl gene demonstrates obligatory and nonredundant roles of the Jaks in cytokine-induced biologic responses". Cell 1998, 93 (3), 373-83 ) 。

JAKS激酶存在于细胞因子受体中富含脯氨酸� �区域。 细胞因子同细胞因子受体的 结合导致受体构象变化和相关的 Janus激酶聚集， 触发 Janus激酶之间的磷酸化反应， 并显著增加它们的催化活性， 从而加速了细胞因子受体的磷酸化活化和 Janus激酶受 体链的聚集。 这些过程最终会产生一个激活的受体复合物 (参考文献： Pellegrini S. et al, Eur. J. Biochem. 1997, 248(3), 615-33)。 这种复合物会吸附新的底物分子并将其进一步 磷酸化。 STATs蛋白便是其中一种 底物分子。 STATs蛋白被磷酸化后会从激活的受体复合物上� ��落， 然后形成二聚体。 磷酸化的 STATs二聚体然后再转运到细胞核内， 在那里他们调节选定的基因的转录， 从而发挥作用 （参考文献： Leonard WJ and O'Shea JJ, "JAKs and STATs: biological implications". Annu. Rev. Immunol. 1998, 16, 293-322 ) 。 哺乳动物 JAK激酶的四个成员在血液的形成和免疫反应中 细胞因子受体信号传输 中是至关重要的。 JAK基因的突变和易位会导致 JAKs蛋白质的组成性激活。 组成性 激活导致各种造血系统恶性肿瘤， 包括骨髓增生性疾病和白血病。 与此相反， 损失功 能性; FAK3和 TYK2基因突变导致免疫缺陷。 JAK3主要表达在造血细胞中， 如 NK细 胞， T细胞和 Β细胞。 它通过响应于白细胞介素受体的酪氨酸磷酸化 来激活和转导信 号。 JAK3 非活性突变会导致常染色体显性遗传的 SCID (重症联合免疫缺陷病） 。 JAK7 STAT传输路径也已被证明在哮喘反应， 慢性阻塞性肺病， 支气管炎， 慢性过敏 性反应及其他呼吸道炎症性疾病的发病机制中 有重要的作用。 总之， 许多疾病同被上调的 JAKs活性所涉及的细胞因子信号传导有关。 抑制 JAKs激酶的活性可能提供一种治疗， 预防和抑制由 JAKs介导的疾病的方法， 例如， 自身免疫性疾病， 炎症性疾病， 过敏性疾病和癌症等。 具体包括 （但不限于） ： 多发 性硬化症， 红斑狼疮， 类风湿关节炎， 牛皮癣， 癌症， 哮喘， 眼干燥症， 过敏性皮 炎， 自身免疫性甲状腺疾病， 慢性或急性器官移植排斥反应， 溃疡性结肠炎， Crohn 氏病， 白血病， 1 型糖尿病和其它可通过免疫抑制来治疗的疾病 （参考文献： Costa- Pereira, A. et al etc. "Dysregulation of Janus kinases and signal transducers and activators of transcription in cancer", Am. J. Cancer. Res. 2011 , 1(6), 806-816 ) 。 头菲替尼 Tofacitinib是目前唯一被 FDA批准在美国市场上销售的 JAKs抑制剂， 用于治疗类风湿关节炎 （参考文献： Kremer, J. et al "The safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active rheumatoid arthritis: Results of a double-blind, placebo- controlled phase Ila trial of three dosage levels of CP-690,550 versus placebo". Arthritis& Rheumatism 2009, 60 (7), 1895-1905 ) 。 然而， 服用头菲替尼的患者有一些不良反应， 可能有严重的感染及增加癌症和心 脏衰竭的风险。 这些不良反应可能是由 tofacitinib对 JAK1， JAK2和 JAK3具有抑制 作用所导致。 另外， tofacitinib在某些动物或人体中的半衰期较短， 需要日服两次。 因此， 具有更好药代特性的 JAKs抑制剂会提供更好的疗效和减少患者的不� �反应。 附图说明

图 1 ; 化合物 2口服和静脉注射后比格犬血液中的浓度 图 2: 化合物 2每天一次口服给药对爪体积的抑制 （每公斤 2， 6， 20毫克） 图 3 : 化合物 2每天一次口服给药关节炎分数的抑制 （每公斤 2 , 6， 20毫克） 发明内容 本发明的一方面涉及一种治疗， 预防或抑制患者体内的不良免疫和炎症性疾病 的 的方法， 其特征在于， 包括给予所述患者有效剂量的通式 I， II化合物或其药学上可 接受的盐。 在本发明的第一方面， 本发明提供了通式 I、 II化合物或者其药学上可接受的盐或 立体异构体及其溶剂化物：

其中，

X是 N， 或 O (当不存在 R ₅ 取代基时) 其中， Q是 CO或 S0 _2; 其中， M被进一步定义为式 III或 IV：

III IV

Ri , R ₂ ， R ₃ ， ， R6 , R ₇ , R ₈ 各自独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧 基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1- C6 ) 烷基， （C1-C6) 垸氧基， （C3-C10) 环垸基， 所述的垸基， 烷氧基或环垸基任 选被一个或多个独立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6 ) 烷基， （C1-C6) 烷氧基的基团进一步取代； 当 R ₅ 存在时， 独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， ( C2-C6 ) 烯基， （C2-C6 ) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6 ) 垸基， （C1- C6) 垸氧基， （C3-C10) 环烷基， 所述的垸基， 烷氧基或环垸基任选被一个或多个独 立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 烷 氧基的基团进一步取代； 当 R ₉ 存在时， 独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， (C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 烷基， （C C6) 垸氧基， （C3-C10) 环垸基， 所述的烷基， 烷氧基或环垸基任选被一个或多个独 立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 烷基， （C1-C6) 垸 氧基的基团进一步取代；

Rio- Rn， R 和 R ₁₃ 各自独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝 基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 垸 基， （C1-C6) 烷氧基， （C3-C10) 环烷基， 所述的垸基， 烷氧基或环烷基任选被一 个或多个独立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 烷基， (C1-C6) 垸氧基的基团进一步取代； 上述的 R ₇ 或者 R ₈ 可以分别同 R ₃ ， R4或者 Rio形成 3〜6元的环烷基或杂环； 当 X是 N,上述的 R ₇ 或者 R ₈ 可以同 R ₅ 形成 4〜7元的饱和杂环； 上述 可以同 R ₅ 形成 3〜6元杂环； 其中所述 3〜6元环烷基、 4〜7元饱和杂环和 3〜6元杂环任选被一个或多个独立 地选自以下的基团取代： 氢， 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C2- C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （ -C6) 烷基， （取代的 C1- C6) 烷氧基， （C3-C10) 环垸基， 其中烷基， 烷氧基或环烷基， 任选取代的氢， 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 烷氧基；

Ar为二元稠合杂环； 所述的二元稠合杂环任选被 1-5个取代基取代， 所述取代基 各自独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯 基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 垸氧基， (C3-C10) 环垸基， 所述的垸基， 垸氧基或环垸基任选被一个或多个独立地选自 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 烷氧基的基团进 一步取代。 上述 3〜6元环垸基或杂环可以为 3、 4、 5或 6元环垸基或杂环， 4〜7元饱和杂环 可以为 4、 5、 6或 7元饱和杂环。 在进一步优选的实施方案中， 优选 为！^。 在上述实施方案中， 优选 Q为 CO。 在上述实施方案中， 优选 Ri， R ₂ ， R ₉ 各自独立地选自： 甲基， 乙基， 环丙基， 异 丙基， 叔丁基， 氯甲基， 三氟甲基。 在上述实施方案中， 优选 R ₃ ， R4， ， R ₇ ， R ₈ 各自独立地选自： 氢， 甲基， 乙 基。 在上述实施方案中， 优选 R ₅ 为： 甲基。 在上述实施方案中， 优选 M为式 III, 其中 0和 如上所定义， 进一步优选 R ₁₀ 和 Ru为： 氢。 在上述实施方案中， 优选 M为式 IV， 其中 R _1C) ， R _n ， R ₁₂ 和 R ₁₃ 如上所定义， 进 一步优选 R ₁₍₎ ， Ru， R ₁₂ 和 R ₁₃ 为： 氢。 在上述实施方案中， 优选 Ar为： 二元稠合杂环。 在进一步的实施方案中， 优选 Ar具有式 （V ：

其中 R ₁₄ ， R ₁₅ ， R ₁₆ 和 R ₁₇ 各自独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 烷氧基， （C3-C10) 环烷基， 所述的烷基， 垸氧基或环垸基任选被 一个或多个独立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6 ) 垸 基， （C1-C6) 烷氧基的基团进一步取代。 优选 R ₁₄ ， R, ₅ , R ₁₆ 和 R ₁₇ 各自独立地选 自： 氢， 卤素， （C1-C6) 垸基。

在上述式 II化合物中， 当 R ₉ 是 H时， 式 II化合物可同它的烯醇互变， 它的烯醇 式可通过垸基化形成式 V或 VI。 由此， 在本发明的另一方面， 本发明提供了式 、 VI 化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物:

VI 式中， Ar为二元稠合杂环。 所述的二元稠合杂环可有 1-5取代基， 分别独立地选 自- 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔 基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6 ) 垸基， （C1-C6 ) 烷氧基， （C3-C10) 环垸 基， 所述的烷基， 垸氧基或环垸基任选被一个或多个独立地选自 氘， 卤素， 氨基， 羟 基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 烷氧基的基团进一步取代。 其中各基团如以上所定义。 在进一步的实施方案中， 优选 Ar杂环具有式 （VD) ：

其中 R ₁₄ ， R ₁₅ ， R ₁₆ 和 R ₁₇ 各自独立地选自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 垸氧基， （C3-C10) 环垸基， 所述的垸基， 烷氧基或环烷基任选被 一个或多个独立地选自氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6 ) 烷 基， （C1-C6) 垸氧基的基团进一步取代。

Ri , R ₂ - R ₃ ， ， R ₅ ， R6， R ₇ ， R ₈ ， ， Rio. Rn， i ₂ , R ₁₃ ， R ₁₈ 各自独立地选 自： 氢， 氘， 氨基， 羟基， 卤素， 羧基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6) 炔 基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1-C6) 垸基， （C1-C6) 垸氧基， （C3-C10) 环垸基 其特征在于， 所述的烷基， 烷氧基或环垸基任选取代的氢， 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧基， 硝基， 氰基， （C1-C6) 烷基， （C1-C6) 垸氧基。 上述的 R ₇ 或者 R ₈ 可以分别同 ， R4或者 R ₁₍ )形成 3〜6元的环垸基或杂环； 当 X是 N,上述的 R ₇ 或者 R ₈ 可以同 R ₅ 形成 4〜7元的饱和杂环； 上述 R4可以同 R ₅ 形成 3〜6元杂环； 其中这些环烷基或杂环上的取代基团可任选自 ： 氢， 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 羧 基， 硝基， 氰基， （C2-C6) 烯基， （C2-C6 ) 炔基， 三氟甲基， 三氟甲氧基， （C1- C6) 烷基， （取代的 C1-C6) 垸氧基， （C3-C10) 环垸基， 其中烷基， 烷氧基或环烷 基， 任选取代的氢， 氘， 卤素， 氨基， 羟基， 硝基， 氰基， （C1-C6 ) 烷基， （C1- C6)烷氧基。

在上述实施方案中， 除非另有说明， 在本发明中， "垸基"， "是一至六个碳原子 的直链或支链烷基。 "烯基 "和"炔基是二到六个碳的直链或支链经。 例如， 在本发明中 包括甲基， 乙基， 丙基， 丁基， 戊基或己基， 乙烯基， 丙烯基， 丁烯基， 戊烯基， 或 己烯基， 乙炔基， 丙炔基， 丁炔基， 戊炔基或己炔基分别和它们的异构体。 术语"羟基"是指具有结构式 -OH的基团。 术语"卤素"或"卤"是指氟， 氯， 溴或碘基。 术语"环垸基"是指单 -或多-环碳环， 其中每个环中含有 3至 10个碳原子数的， 并 且其中的任何环可以包含一个或多个双键或叁 键。 实例包括基团如环丙基， 环丁基， 环戊基， 环己基， 环烯基， 和环庚基。 术语"环垸基 "附加地包括螺环系统， 其中的环 烷基环上有一个共同的碳环原子。 术语"硝基"是指具有 -N0 ₂ 的基团。 术语"氨基"是指具有结构 -NH ₂ 的基团。 氨基可有与一个， 两个或三个基团， 如垸 基， 链烯基， 炔基， 芳基， 和类似物。 术语"氰基"是指具有结构式 -CN的基团。 术语"垸氧基"是指含有垸基的基团同一个氧原� ��连接， 如甲氧基团的部分结构。 垸氧基部分的垸氧基的氧原子键合到分子的其 他部分。 这样的基团的实例包括甲氧 基， 乙氧基， 丙氧基， 异-丙氧基， 丁氧基和叔丁氧基。 术语 "芳基"是指芳香烃基， 并且其可包括苯基、 萘基以及茚基， 优选为碳原子数 为 6-10的芳基。 术语 "杂芳基"是指一价的五元或六元芳香族杂环基� �� 其具有选自氮 原子、 氧原子和 硫原子中的一个或多个相同或不同的杂原子， 并且可与苯环稠合。 "杂芳基"可包括 （例如） 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哒嗪基、 吡咯基、 批唑基、 咪 唑基、 噁唑基、 噻唑基、 噻吩基、 呋喃基、 噁二唑基、 噻二唑基、 喹啉基、 异喹啉 基、 苯并噻唑基、 苯并噁唑基、 吲哚基、 吲唑基、 喹喔啉 基和喹唑啉基， 优选的是哒 嗪基、 批啶基、 批嗪基、 噻唑基、 吡唑基和硫代噁唑基。 术语"羧基"是指羧基基团， -C0 ₂ H， 或它的盐。 当组合使用时， 例如， "烷芳基"或"芳垸基， "上面列出的各个条款有上面所指出 的意义。 在本发明的另一方面， 本发明提供了一种药物组合物， 其中包含活性有效量的上 述化合物。 在所述药物中， 除了本发明的活性成分之外， 还可以含有一种或者多种其 他可以协同使用的活性成分， 比如依那西普、 英利昔单抗、 阿达木单抗、 甲氨喋呤和 / 或艾拉莫德。 在所述药物组合物中， 除了活性成分之外， 还含有可药用的载体或赋形 剂， 这些可药用的载体或赋形剂是本领域熟知的那 些， 并且， 可以将所述药物组合物 制成任意适宜的剂型， 包括针剂， 口服， 皮肤或肌肉注射， 眼滴。 在本发明的另一方面， 本发明提供了上述化合物在制备能够治疗或者 预防一种 或者多种与抑制 JAKs激酶活性相关的疾病的药物中的应用。 所述疾病可以为自身免 疫性疾病， 炎症性疾病， 过敏性疾病和癌症等等， 例如多发性硬化症， 红斑狼疮， 类 风湿性关节炎， 牛皮癣， 癌症， 哮喘， 眼干燥症， 特应性皮炎， 自身免疫性甲状腺疾 病， 慢性或急性器官移植排斥反应， 溃疡性结肠炎， Crohn 氏病， 白血病， 阿尔茨海 默氏病， 1型糖尿病。 特别优选为类风湿性关节炎。 在本发明的另一方面， 本发明提供了一种治疗或者预防与抑制 JAKs激酶活性相 关的疾病的方法， 包括给药对象治疗有效量的本发明化合物。 在本发明的另一方面， 本发明提供了一种抑制一种或者多种 〗AKs激酶活性的方 法， 来达到治疗所述患者的目的， 包括使用有效量的本发明化合物。

合成方法 本发明通过实施例和本文中所公开的化合物来 例示。 在本发明的具体化合物选自 下组被公开的实施例中的化合物和它们的药学 上可接受的盐及它们的单独的非对映体 的化合物或盐 下面的反应方案阐述了本发明化合物的制备路 径。 除非另有说明， 在下面的反应方案和讨论中， Ar, M, R!， R ₂ , R ₃ ， R4， R ₅ , ， R ₇ ， R ₈ ， R ₉ ， R ₁₀ , 1„，1 ₁₂ ，1 ₁₃ ,1 ₁₄ ,1 ₁₅ ,1 ₁₆ ,1 ₁₇ 和1 ₁₈ 的定义如上述。 反应式方案 1

苄基保护的起始原料 A (X= N或 O 时， 没有 R ₅ 基团， 在适当的碱 （例如 LHMDS) 或金属催化剂 (如二氯化钯 [膦 （邻 -甲苯基） 3] ₂ )及在适当的溶剂 (如 Ν,Ν-二 甲基甲酰胺)和温度下， 可与芳基卤 ArY反应生成中间体8。 通过适当的还原试剂， 如 氢气， 在适当的催化剂的存在下， 如 10%钯 -碳， 并在适当的溶剂中， 如甲醇， 可除 去反应中间体 B的苄基而得到胺中间体 C.在合适的缩合试剂 （如 HATU) 和适当的溶 剂 （如二氯甲烷） 中， 胺中间体 C可与酸 D进行反应得到酰胺产物 I。 在式 I中， 当 R ₂ 是 H时， 式 I的异恶唑可以用适当的碱， 例如， 甲氧基钠进行开环反应， 在适当的 溶剂（如甲醇和四氢呋喃的混合物)中可生成� �基酮中间体 Ia。

反应式方案 2

胺中间体 C可与酸或酯进行反应得到酰胺产物 E， 转化成化合物 F, 再和羟胺 关环成化合物 I。 胺中间体 C也可在碱性条件下和溴化氰生成化合物 Ia。 类似方法曾 用于来氟米特及其衍生物的合成。

反应式方案 3

氰基酮中间体结构 la同烯醇结构 Ila和 lib是处于平衡状态。 在适当的条件下， la 可与烷基化试剂 R ₁₈ Z反应得到共轭的烯醇醚产物 IX或 XI。 氰基酮中间体结构 la也可以用一个适当的亲电子试剂 R ₉ 进行垸基化， 得到化 合物 II。 实例 1

((3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1-基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲 酮

步骤 A: 4-氯 -7- (对甲苯磺酰基) -吡咯并 [2,3-d]嘧啶

将对甲苯磺酰氯（67.5 g, 348 mmol, 1.10 eq.)和 4-氯 -7-H吡咯并 [2,3-d]嘧啶（50 g, 320 mmol, 1.0 eq.)溶解在丙酮（500 mL)中， 在 0 °C下向其中慢慢加入氢氧化钠溶液（2 M in water, 200 mL, 1.20 eq.), 反应在 20 °C下搅拌 6个小时， 将析出的固体过滤并且 用丙酮和水洗涤得到白色的目标化合物 (90 g,收率 = 90%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 1.43 min; m/z = 307.9 [M+H] ⁺ .

Ή NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz): δ 8.80 (s, 1H)， 8.15 (d, 2H)， 7.92 (d, 1H), 7.40 (d, 2H)， 6.71 (s, 1H), 2.39 (s, 3H).

步骤 B: N-[(3R,4R)-1-苄基 -4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7- (对甲苯磺酰基）吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺

把化合物（3R， 4R)小苄基 -N, 4-二甲基 -哌啶 -3-胺（4.3 g, 19.7 mmol, 1.0 eq.)溶解在 180 mL水中， 然后向其中加入化合物 4-氯 -7- (对甲苯磺酰基) -吡咯并 [2,3-d]嘧啶（12.3 g, 39.2 mmol, 2.0 eq.)和碳酸钾（16.6 g, 119 mmol, 6.0 eq.)。 反应在 100 °C下进行 16小 时， 将其冷却到室温后加入乙酸乙酯（500 mL)萃取三次， 然后用水和食盐水反洗一次, 用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品化合物采用过柱分离 （乙酸乙酯 /石油醚 = 1/1 ) 得到 浅黄色目标化合物（8.6 g，收率 - 90%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 1.22 min; m/z = 490.2 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz): δ 8.37 (s, 1H), 8.12 (d, 2H)， 7.48 (d, 1H), 7.20-7.38 (m,7H), 6.70-6.60 (m, 1H), 5.30-5.00 (m, 1H), 3.60-3.40 (m, 5H), 2.90-2.50 (m, 3H)， 2.39 (s, 3H), 2.40-2.05 (m, 2H), 1.80-1.60 (m, 2H), 0.90-0.80 (d， 3H).

步骤 C: N-[(3R，4R)- 苄基 -4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺

将化合物 N-[(3R，4R)- 苄基 -4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7- (对甲苯磺酰基)吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4-胺溶解于 50%的氢氧化钠溶液（210 mL)中。 反应液在 100 °C下反应过夜然后 冷却到室温， 加入乙酸乙酯（200 mL)萃取四次， 然后用水和食盐水反洗一次， 用硫酸 钠干燥后旋干， 得到的粗品化合物采用过柱分离 （二氯甲烷 /甲醇 = 10/1 ) 得到黄色目 标化合物 (4.6 g,收率 = 78%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 1.01 min; m/z = 336.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz): δ 8.25 (s, 1H)， 7.40-7.20 (m， 5H), 7.02 (d， 1H), 6.59 (d, 1H)， 5.20 (br, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.55 (s, 2H), 2.97-2.62 (m, 1H)， 2.80-2.60 (m, 2H)， 2.50- 2.30 (m, 2H), 2.30-2.10 (m, 1H), 1.90-1.80 (m, 1H), 1.80-1.60 (m, 1H)， 0.85 (d, 3H).

步骤 D: N-[(3R，4R)- 4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-胺

将化合物 N-[(3R，4R)-1-苄基 -4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7-H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-胺 (4.6 g， 13.7 mmol, 1.0 eq.)溶解在异丙醇和水（180 mL/36 mL) 的混合液中， 加入钯碳 (20%, 920 mg)和乙酸（820 mg, 13.7 mmol, 1.0 eq.)， 用氢气球置换反应中的空气。 将 反应器加热到 50 °C并反应 16个小时， 冷却至室温后用硅藻土过滤， 滤液用氢氧化钠 溶液调到 pH = 8， 加入二氯甲烷（100 mL)萃取三次， 然后用水反洗一次， 用硫酸钠干 燥后旋干， 得到白色目标化合物（2.5 g，收率 = 74%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 0.79 min; m/z = 246.0 [M+H] ⁺ .

'Η NMR (CDCI3, 400 MHz): δ 8.29 (s, 1H), 7.05 (d， 1H)， 6.58 (d, 1H), 4.95-4.85 (m, 1H)， 3.40 (s， 3H), 3.34-3.25 (m, 1H), 3.10-3.05 (m, 1H)， 3.03-2.93 (m, 1H), 2.90-2.80 (m, 1H), 2.55-2.45 (m, 1H), 1.95-1.73 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H), 1.08 (d, 3H). 步骤 E: ((3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基)哌啶 -1-基 )-(5-甲基异恶 唑 -4-基)甲酮

在冰浴下和氮气保护下把二异丙基乙胺 (1.32 g, 10.02 mmol, 5.0 eq.)慢慢加入到 N- [(3R，4R)-4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺（0.5 g, 2.04 mmol, 1.0 eq.), 5-甲基异恶唑 -4-羧酸（0.284 g， 2.24 mmol, 1.1 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑 -1-基) - 1 ,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（0.94 g, 3.06 mmol, 1.5 eq.)的二氯甲烷溶液（15 mL)中并将 反应液在室温下搅拌 3个小时。 将反应液用二氯甲烷稀释， 然后用碳酸氢钠溶液和食 盐水各洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干。 得到的粗品采用 HPLC 纯化（仪器: SHIMADZU LC-8A,分离柱： synergi-10 mi，250x50mm I.D.流动相， A: H ₂ 0 (l%o TFA, v/v)和 B: 乙腈，梯度： B 30-80% .流速： 80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先用碳酸氢 钠溶液调至 pH = 8， 然后再用乙酸乙酯进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次后， 用硫 酸钠干燥旋干得到目标化合物（800 mg,收率 = 80%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 Ί分钟)： RT = 2.81 min; m/z = 355.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400 MHz): δ 8.52 (br, 1H), 8.14 (d, 1H), 7.13 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.16-5.05 (m, 1H), 4.30-3.90 (m, 2H), 3.80-3.50 (m, 2H), 3.45 (s, 3H)， 2.60-2.50 (m, 4H)， 2.00-1.70 (m, 2H), 1.15 (d, 3H).

实例 2

2-((3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-P比咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基） 哌啶 -1 -羰基 )-3-氧代丁腈

将甲醇钠（180 mg, 3.39 mmol, 1.5 eq.)的甲醇溶液慢慢加入到化合物 ((3R，4R)-4-甲 基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1-基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮（0.8 g， 2.26 mmol, 1.0 eq.)的四氢呋喃溶液中并且在 25°C下搅拌两个小时。 反应液旋干后溶解 在水中， 用 2N HC1水溶液调节至 pH = 3，用二氯甲垸萃取两次， 合并后的有机层用水 反洗一次， 有机层用硫酸钠干燥后旋干得到目标化合物 (497.8 mg,收率 = 62.5%).

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 2.45 min; m/z = 355.2 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400 MHz): δ 8.36 (s, 1H), 7.40 (d, 1H), 6.95 (d, 1H), 5.10-5.00 (m, 1H), 4.20-4.10 (m, 2H), 4.00-3.80 (m, 2H)， 3.54 (s, 3H), 3.49 (s, 1H), 2.65-2.53 (m, 1H), 2.32 (s， 3H), 2.05-1.90 (m, 1H)， 1.90-1.80 (m, 1H), 1.18 (d， 3H).

实例 3

(3-((7H-吡咯并 [2，3-d]-嘧啶 -4-基)氧) -哌啶 -1-基) (甲基异恶唑 -4-基)甲酮

步骤 A: 2-[[4-[(1-苄基 -3-哌啶)氧] -吡咯并 [2，3-d]-嘧啶 -7-基]甲氧基]乙基-三甲基 -硅垸 把化合物 1-苄基 -哌啶 -3-醇（4.82 g， 25.2 mmol, 1.3 eq)溶解在 50 mL无水四氢呋喃 中， 在冰水浴下加入 NaH (1.55 g, 38.8 mmol, 2.0 eq. 60%在矿物油里).， 室温下搅拌一 个小时， 然后滴加 2-[(4-氯-吡咯并 [2，3-d]-哌啶 -7-基)甲氧基]乙基-三甲基 -硅烷 (5.5 g, 19.4 mmol, 1.0 eq)的无水四氢呋喃（30 mL)溶液。 反应在 60 °C搅拌过夜， 向反应液加 入水 (30 mL), 再用乙酸乙酯（70 mL)萃取三次。 合并的萃取液用水和食盐水反洗一 次， 硫酸钠干燥后旋干得到目标化合物（10 g)。

步骤 B: 2-[[4-[(1-苄基 -3-哌啶)氧] -吡咯并 [2，3-d]-嘧啶 -7-基]甲醇

将化合物 2-[[4-[(1-苄基 -3-哌啶)氧] -吡咯并 [2，3-d]-7-基]甲氧基]乙基-三甲基 -硅烷 (14.5 g,粗品 )溶解于二氯甲垸（300 mL)中， 加入 20 mL三氟乙酸。 将反应液回流过 夜， 然后自然冷却到室度， 减压浓缩得到目标化合物（14.5 g)。

步骤 C: 4-(1-苄基 -3-哌啶)氧 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶

将化合物 2-[[4-[(1-苄基 -3-哌啶)氧]-吡咯并 [2,3-d]-嘧啶 -7-基]甲醇（10 g,粗品）溶解 在甲醇 （280 mL) 中， 加入化合物乙二胺（14 mL)， 反应液在室温下搅拌过夜。 减压 浓缩得到目标化合物（4.5 g， 三步的收率： 75%)。

步骤 D: 4-(3-哌啶)氧 -7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶

将化合物 4-(1-苄基 -3-哌啶)氧 -7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶（200 mg, 0.65 mmol, 1.0 eq.)溶 解在异丙醇和水（8.8 mL/ 1.8 mL)的混合液中， 加入 10%钯碳（100 mg)和乙酸（40 mg, 0.65 mmol, 1.0 eq.)并且用氢气球置换反应中的空气。 反应加热到 50 °C反应 16个小 时， 然后用硅藻土进行过滤， 滤液用氢氧化钠溶液调 pH = 8， 加入二氯甲垸（100 mL) 萃取三次， 合并的萃取液用食盐水反洗一次， 硫酸钠干燥后旋干， 得到目标化合物 (60 mg,收率 = 42.6%)。

步骤 E: (3-((7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氧)哌啶小基 )-(5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮

在冰浴下和氮气保护下把二异丙基乙胺（176 mg, 1.375 mmol, 5.0 eq. )慢慢加入到 4-(3-哌啶)氧 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶）（60 mg, 0.275 mmol, 1.0 eq.), 5-甲基异恶唑 -4-羧酸 (41.9 mg, 0.33 mmol, 1.2 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑小基) -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷 酸酯（157 mg, 0.413 mmol, 1.5 eq.)的二氯甲烷溶液（5 mL)中， 并将反应在室温下搅拌 3小时。 反应结束后， 将反应液用二氯甲垸稀释， 用碳酸氢钠溶液和食盐水各反洗一 次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯化 (仪器： SHIMADZU LC-8A, 分离柱： synergi-ΙΟμηι, 250x50mm I.D.流动相， A: H ₂ 0 (l%o TFA, v/v)和 B: 乙腈，梯 度： B 30-80% .流速： 80毫升 /分)， 分离回来的目标组分先用碳酸氢钠溶液调至 pH = 7- 8， 然后再用二氯甲烷进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次后， 硫酸钠干燥旋千得到目 标化合物（15 mg,收率 = 17 %)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长 7分钟)： RT = 2.909 min; m/z = 328.0 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400 MHz): δ 8.47-8.22 (m, 2H)， 7.30 (d, 1H)， 6.55 (s， 1H)， 5.55-5.51 (m, 1H)， 4.30-4.06 (m, 2H), 3.87-3.83 (m, 1H), 3.65-3.40 (m， 1H), 2.55-2.45 (m, 1H)， 2.27- 2.03 (m, 5H)， 1.85-1.70 (m, 1H).

实例 6

2- (3-((7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶 -1-羰基） -3-氧代丁腈

将甲醇钠（6 mg, 0.1 mmol, 2.5 eq.)溶解在甲醇中， 然后缓慢地加入到化合物（3-((7H-吡 咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶小基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮（13 mg, 0.04 mmol, 1.0 eq.)的 四氢呋喃溶液中并且在室温下搅拌 3小时， 将反应液旋干后溶解在水中并且用 1 N HC1水 溶液调节 pH = 3-4， 用二氯甲垸萃取三次， 合并后的有机层用水反洗一次， 用硫酸钠干燥 后旋干得到目标化合物（6.5 mg,收率 = 50 %)

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 3.382 min; m/z = 328.0 [M+H] +.

Ή NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 8.34 (s， 1H), 7.30 (d, 1H), 6.41 (d, 1H)， 5.49 (br, 1H), 4.54-4.49 (m, 1H), 4.16-4.12 (m， 1H), 3.80-3.75 (m, 1H), 3.37-3.35 (m, 1H), 2.12-2.07 (m, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.70-1.67 (m, 1H).

实例 7

(3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基）氨基）哌啶- 1-基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮 步骤 A: 1-苄基 -N-甲基 -哌啶 -3-胺

将化合物 1-苄基 -哌啶 -3-酮（1.89 g, 10 mmol, 1.0 eq),四异丙基氧基钛（4.4 g, 20 mmol, 2.0 eq),甲胺盐酸盐（1.35 g, 20 mmol, 2.0 eq)和三乙胺（2.02 g, 20 mmol, 2.0 eq)溶 于无水乙醇中， 该反应液在氩气保护下室温搅拌 8小时。 加入硼氢化钠 （0.57 g, 15 mmol, 1.5 eq)后继续搅拌 8小时。 然后将反应液倒入氨水中， 将析出的无机物过滤并 用二氯甲垸洗涤。 有机层分离并将水层用二氯甲烷萃取一次， 有机层合并并用盐酸洗 涤。 水相用二氯甲垸反洗一次， 然后用强氧化钠溶液调 pH = 10-12， 用二氯甲垸萃 取。 有机层合并后用硫酸钠干燥旋干得到目标化合 物。

1H NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz): δ 7.40-7.30 (m, 5H), 3.50 (s， 2H), 2.70-2.60 (m, 1H), 2.55- 2.50 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.10-2.00 (m, 1H), 2.00-1.90 (m, 1H), 1.70-1.50 (m， 2H), 1.20- 1.10 (m, 1H). 步骤 B: N- [ 苄基 -3-哌啶] -N-甲基 -7- (对甲苯磺酰基) B比咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺

把化合物 1 -苄基 -N-甲基 -哌啶 -3-胺（1.4 g， 7.0 mmol, 1.0 eq.)溶解在 50 mL水中， 然 后向其中加入化合物 4-氯 -7- (对甲苯磺酰基)-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 （4.2 g， 14.0 mmol, 2.0 eq. ) 和碳酸钾 (5.6 g, 42 mmol, 6.0 eq.), 反应在 100 °C下进行 16小时， 冷却到室温后 加入乙酸乙酯（50 mL)萃取三次。 合并的有机层用水和食盐水反洗一次， 硫酸钠干燥 后旋干， 得到的粗品化合物采用过柱分离 （乙酸乙酯 /石油醚 = 1/1 ) 得到目标化合物 (1.26 g，收率 = 50%).

LC/MS (METHOD UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 0.929 min; m/z = 476.1 [M+H] ⁺ .

步骤 C: N-[l-苄基 -3-哌啶] -N-甲基 -7-H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺

将化合物 N-[l-苄基 -3-哌啶] -N-甲基 -7- (对甲苯磺酰基)吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺（0.8 g， 1.63 mmol, 1.0 eq.)溶解于 50%的氢氧化钠溶液中（20 mL), 反应液在 100 ^e C下反应 过夜然后冷却到室温， 加入乙酸乙酯（20 mL)萃取四次， 然后用水和食盐水反洗一 次， 用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品化合物采用过柱分离 （二氯甲垸 /甲醇 = 10 ） 得到目标化合物（0.36 g,收率 = 60%)

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 2分钟)： RT = 1.068 min; m/z = 322.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz): δ 10.70 (br, 1H), 8.35 (s, 1H)， 7.40- 7.30 (m, 5H), 7.00 (d， 1H), 6.50 (d, 1H), 4.70- 4.60 (br, 1H)， 3.60- 3.50 (m, 3H), 3.25 (s, 3H), 3.10-3.00 (m, 1H), 3.00-2.90 (m, 1H), 2.30-1.50 (m, 5H).

步骤 D: N-(3-哌啶） -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺 将化合物 N-[l-苄基 -3-哌啶] -N-甲基 -7-H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺（0.23 g, 0.72 mmol 1.0 eq.)溶解在异丙醇和水 （5 mL/1 mL) 的混合液中， 后加入氢氧化钯 /碳（46 mg)和 乙酸（43 mg, 0.72 mmol, 1.0 eq.), 并且用氢气球置换反应中的空气。 反应加热到 50 °C 反应 16个小时， 然后用硅藻土进行过滤。 滤液用氢氧化钠溶液调到 pH = 8后， 加入 二氯甲烷（10 mL)萃取三次， 合并的有机层用水反洗一次， 硫酸钠干燥后旋干， 得到 白色目标化合物（0.08 g，收率 = 50%)。

LC/MS (方法 UFLC， 总长度 2分钟)： RT = 0,797 min; m/z = 232.0 [M+H]+.

步骤 E: (3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基）氨基）哌啶 -1-基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮

在冰浴下和氮气保护下把二异丙基乙胺（0.20 g, 1.52 mmol, 5.0 eq.)慢慢加入到化 合物 N- (3-哌啶） -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺（0.07 g, 0.303 mmol, 1.0 eq.), 化 合物 5-甲基异恶唑 -4-羧酸（0.04 g, 0.33 mmol, 1.1 eq.)和化合物 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮 唑小基 )-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（0.173 g, 0.46 mmol, 1.5 eq.)的二氯甲垸溶液（5 mL)中， 反应在室温下搅拌 3个小时。 反应结束后将反应液用二氯甲垸稀释， 然后用 碳酸氢钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC 纯化 (仪器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： Phenomenex Synergi max-RP 150x30mm I.D.流 动相， A: H ₂ 0 (0.05% HC1 TFA, v/v)和 B: 乙腈，梯度： B 10-20% .流速： 30毫升 /分)， 机分回来的目标组分旋蒸一下后冻干得到目标 化合物（51 mg, yield = 50%)。 LC/MS (方法 UFLC， 总长度 7分钟)： RT = 2.807 min; m/z = 341.0 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 9.00-8.50 (m, 1H)， 8.10 (s, IH), 7.10 (s, IH), 6.70- 6.50 (m, IH), 4.70-4.50 (br, IH), 3.90-3.70 (m, IH), 3.45 (s, 3H)， 3.20-3.00 (m,lH), 2.90-2.60 (m, lH),2.50 (s, 3H), 2.20-1.80 (m, 3H), 1.70-1.60 (m, IH), 1.40-1.30 (m, IH).

实例 8

2- (3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基）氨基）哌啶 -1-羰基） -3-氧代丁腈

将溶解在甲醇中甲醇钠（10 mg， 0.176 mmol, 1.5eq.)慢慢加入到化合物（3- (甲基 (7H- 吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基）氨基）哌啶 -1-基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮（0.03 g, 0.09 mmol, 1.0 eq.)的 四氢呋喃溶液中， 并且在 25°C下搅拌两个小时。 反应液旋干后得到的粗品 采用 HPLC纯化 (仪器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： Gemini -5μτη, 250x20mm I.D.流动 相， A: Η ₂ 0 (1%ο TFA, v/v) B: 乙腈，梯度： B 0-30% .流速： 30毫升 /分)， 收集目标 组分后旋干并冻干得到目标化合物（27 mg， yield = 90%).

LC/MS (方法 UFLC， 总长 7分钟)： RT = 2.29 min; m/z = 341.1 [M+H] ⁺ .

Ή NMR (DMSO- ₆ , 400MHz): <5 8.21 (s, IH), 7.23 (d， 1H)， 6.80 (d, IH), 4.85-4.80 (m, IH), 4.55-4.45 (m, 2H)， 3.40 (s, 3H)， 3.30-3.20 (m, IH), 3.10-2.90 (m, IH), 2.29 (s, 3H), 2.18-1.95 (m, 3H), 1.80-1.73 (m, IH). 实例 11

(5-乙基异恶唑 -4-基）（(3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基) 甲酮 步骤 A: 5-乙基异恶唑 -4-羧酸乙酯 将乙基 -3-氧代戊酸叔丁酯（10 g, 69 mmol, 1.0 eq.)溶解在 1，1 -二甲氧基 -N, N-二 甲基甲胺（8.2 g, 69 mmol, l.O eq.)中， 把反应液加热到 60 °C并搅拌 2个小时。 将生成 的油状物溶解于甲醇（20mL)和水（10 mL)中， 并向其加入盐酸羟胺（4.86 g, 69 mmol, 1.0 eq 将反应液在 60 °C下继续搅拌 16个小时后旋干得到油状化合物 5-乙基异恶唑- 4-羧酸乙酯。

步骤 B : 5-乙基异恶唑 -4-羧酸

将化合物 5-乙基异恶唑 -4-羧酸乙酯（12 g, 70 mmol, 1.0 eq.)溶解在浓醋酸 /盐酸 (10 mL/10 mL)中并加热回流 16个小时。 待反应完毕后将反应液旋干后再溶解于水中， 过 滤后用盐酸酸化并用二氯甲垸萃取， 干燥旋干得到粗品目标化合物。 该粗品直接用于 下一步反应。

步骤 C : ( ⁵ -乙基异恶唑 - ⁴ -基）（(3R, ⁴ R)- ⁴ -甲基 - ³ _ (甲基 (7H-吡咯并 [ ² ，3-d]嘧啶 - ⁴ -基)氨基）哌 啶 -1 -基)甲酮

在冰浴和氮气保护下把二异丙基乙胺（0.264 g, 2.04 mmol, 5.0 eq.)慢慢加入到 N- [(3R,4R)-4-甲基 -3-哌啶] 甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺 （0.100 g, 0.41 mmol, 1.0 eq.)， 5-乙基异恶唑 -4-羧酸（0.097 g， 0.69 mmol, 1.6 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑 -1- 基) -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（0.312 g, 0.82 mmol, 2.0 eq.)的二氯甲烷溶液 (5 mL) 中。 反应在室温下继续搅拌 1.5小时。 反应结束后， 将反应液用二氯甲垸稀释， 用碳 酸氢钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯 化 (仪器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： synergi-10/xm, 250x50mmI.D流动相， A: H ₂ 0 (1%O TFA, V/V)和 B : 乙腈，梯度： B 30-80% .流速： 80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先 用碳酸氢钠溶液调至 pH = 7-8， 然后再用二氯甲垸进行萃取， 有机层用食盐水反洗一 次后， 有机层干燥旋干得到目标化合物 (47 mg，收率 = 31 %)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长 7分钟)： RT = 2.583 min; m/z = 369.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 8.50 (br, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.10 (d, 1H), 6.65 (s, 1H), 5.10-4.99 (m, 1H), 4.00-3.90 (m, 1H)， 3.80-3.60 (br, 2H), 3.42 (s, 3H), 3.00-2.90 (m， 2H)， 2.60-2.45 (m, 1H), 2.00-1.85 (m, 1H)， 1.80-1.70 (m, 1H), 1.28-1.24 (m, 4H), 1.12 (d, 3H).

实例 12

2-((3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基) - 3-氧代戊腈

将甲醇钠（0.020 g, 0.37 mmol, 3.9 eq.)溶解在甲醇中， 然后缓慢加入到化合物（5-乙 基异恶唑 -4-基) -((3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基) 甲酮（0.035 g, 0.09 mmol, 1.0 eq.)的四氢呋喃溶液中并且在室温下搅拌 3小时。 反应液 旋干后溶解在水中并且用 1 N HC1水溶液调节 pH = 3-4， 水层用二氯甲垸萃取三次， 合并后的有机层用水反洗一次， 硫酸钠干燥后旋干得到目标化合物（18.0 mg,收率 = 51 %)

LC MS (方法 UFLC， 总长度 Ί分钟)： RT = 3.042 min; m/z = 369.1 [M+H] ⁺ .

Ή NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 8.15 (s， 1H), 7.15 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.10-5.00 (m _; 1H), 3.90 (s, 1H)， 3.80-3.60 (m, 2H), 3.42 (s, 3H)， 2.55-2.46 (m, 3H), 2.00-1.75 (m, 2H), 1.28-1.24 (m, 2H), 1.20 (d, 3H), 0.88 (br, 3H). 实例 15

(5-环丙基异恶唑 -4-基）（(3R, 4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基)哌啶 -1 - 基)甲酮

在冰浴和氮气保护下把二异丙基乙胺（0.242 g, 1.87 mmol, 6.2 eq.)慢慢加入到 N- [(3R,4R)-4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺（0.0735 g， 0.30 mmol, 1.0 eq.). 5-环丙基异恶唑 -4-羧酸（0.0458 g， 0.30 mmol, 1.0 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮 唑 -1-基) -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（0.204 g, 0.54 mmol, 1.9 eq.)的二氯甲垸溶液（15 mL)中。 反应在室温下搅拌 1.5小时。 反应结束后， 将反应液用二氯甲烷稀释， 用碳 酸氢钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯 化 (仪器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： synergi-ΙΟμπι, 250x50mmI.D流动相， A: H ₂ 0 (l°/oo TFA, v/v)和 B: 乙腈，梯度： B 30-80% .流速： 80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先 用碳酸氢钠溶液调至 pH = 8， 然后再用二氯甲烷进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次 后， 硫酸钠干燥旋干得到目标化合物（61 mg,收率 = 53%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 2.718 min; m/z = 403.1 [M+Na] ⁺ .

】H NMR (CD ₃ OD, 400 MHz): 8.48 (br, 1H), 8.13 (s， 1H), 7.12 (d, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.12-5.09 (m, 1H), 4.19-4.00 (m, 2H), 3.83-3.62 (m, 2H), 3.49 (s, 3H), 2.64-2.52 (m, 1H), 2.31-2.24 (m, 1H), 2.05-1.96 (m, 1H), 1.77-1.60 (m, 1H), 1.40-0.89 (m, 7H). 实例 16

2- (环丙甲酰基 )-3-((3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d] 嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基） -3- 氧代丙腈

将甲醇钠（0.010 g， 0.18 mmol, 1.8 eq.)溶解在 5 mL甲醇中， 然后缓慢加入到化合物 (5-环丙基异恶唑 -4-基）（(3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶- 1 -基)甲酮（0.038 g, 0.10 mmol, 1.0 eq.)的四氢呋喃溶液中并且在室温下搅拌 2小时， 反 应液旋干后溶解在水中并且用 1 N HC1水溶液调节 pH = 3, 用二氯甲烷萃取三次， 合 并后的有机层用水反洗一次， 用无水硫酸钠干燥后旋干得到目标化合物（15. 0 mg,收率 = 39.5%)

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 3.393 min; m/z = 381.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD， 400MHz): δ 8.14 (s, 1H)， 7.13 (d, 1H), 6.68 (s， 1H)， 5.13-5.05 (m, 1H), 4.10-4.05 (m， 2H), 4.00-3.83 (m, 2H), 3.42 (s, 3H), 2.51-2.40 (m, 1H), 2.31-2.23 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 1H), 1.88-1.82 (m, 1H), 1.26-0.89 (m, 8H)..

实例 19

(5-异恶唑 -4-基）（(3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基)甲酮

在冰浴和氮气保护下把二异丙基乙胺（0.309 g, 2.39 mmol, 6.3 eq.)慢慢加入到 N- [(3R,4R)-4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺 （0.093 g, 0.38 mmol, 1.0 eq.)> 5-异丙基异恶唑 -4-羧酸（0.284 g, 2.24mmol, l.leq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑 -1- 基) -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯 （0.94 g, 3.06mmol, 1.5eq.) 的二氯甲垸溶液 （15 mL) 中。 反应在室温下搅泮 1.5小时。 反应结束后， 将反应液用二氯甲烷稀释， 用碳酸氢 钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯化 (仪 器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： synergi-10 xm, 250x50mmI.D流动相， A: Η ₂ 0 (1%ο TFA，v/v)和 B: 乙腈，梯度: B 30-80% .流速：80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先用碳 酸氢钠溶液调至 pH = 8， 然后再用二氯甲烷进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次后， 有机层干燥旋干得到目标化合物（61 mg,收率 = 53%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 Ί分钟)： RT = 2.884 min; m/z = 383.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 8.48 (br, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.65 (s, 1H), 5.10- 5.03 (m， 1H), 3.98-3.93 (m, 1H)， 3.63-3.53 (m, 2H), 3.50-3.42 (m, 5H)， 2.54-2.45 (m, 1H) , 1.95-1.84 (m, 1H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.40-1.33 (d, 6H), 1.16-1.10 (d, 3H).

实例 20

4-甲基 -2-((3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基)- 3-氧代戊 腈

将甲醇钠（0.018 g, 0.33 mmol, 0.6 eq.)的甲醇溶液慢慢加入到化合物（5-异恶唑 -4- 基）（(3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基)甲酮（0.022 g, 0.52 mmol, 1.0 eq.)的四氢呋喃溶液中并且在室温下搅拌三个� �时。 反应液旋干后溶解 在水中并且用 1 N HC1水溶液调节 pH = 3。 水层用二氯甲烷萃取两次， 合并后的有机 层用水反洗一次， 硫酸钠干燥后旋千得到目标化合物（15 mg,收率 = 68 %)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 3.530 min; m/z = 383.1 [M+H] ⁺ .

Ή NMR (CDC1 ₃ , 400MHz): δ 8.15 (s, 1H), 7.14 (d, 1H)， 6.69 (d, 1H), 5.12-5.06 (m: 1H), 4.15-4.10 (m, 1H), 3.88-3.78 (m， 2H), 3.43 (s, 3H), 3.35-3.30 (m, 2H), 3.19-3.06 (m _: 1H), 2.60-2.50 (m, 1H), 2.05-1.80 (m， 2H)， 1.30-1.20 (d, 6H), 1.16-1.10 (d, 3H),

实例 21

(5- (氯甲基)异恶唑 -4-基）（(3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 - 基)甲酮

在冰浴和氮气保护下把二异丙基乙胺（0.635 g, 4.91 mmol, 4.2 eq.)慢慢加入到 N- [(3R,4R)-4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-胺 （0.287 g, 1.17 mmol, 1.0 eq.)> 5-氯甲基异恶唑 -4-羧酸（0.173 g, 1.07 mmol, 0.9 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三氮唑- 1-基) -1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（0.534 g， 1.40 mmol, 1.2 eq.) 的二氯甲烷溶液（15 mL) 中。 反应在室温下搅拌 2小时。 反应结束后， 将反应液用二氯甲垸稀释， 有机层用碳 酸氢钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯 化 (仪器： SHIMADZU LC-8A,分离柱： synergi-lO m, 250x50mmI.D流动相， A: H ₂ 0 (l%o TFA, v/v)和 B: 乙腈,梯度： B 30-80% .流速： 80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先 用碳酸氢钠溶液调至 pH = 8， 然后再用二氯甲烷进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次 后， 硫酸钠干燥旋干得到目标化合物（51 mg, yield = 12.2 %)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 0.900 min; m/z = 41 U [M+Na] ⁺ . Ή NMR (CD ₃ OD， 400MHz): δ 8.67 (br, 1H)， 8.15 (s, 1H), 7.15 (d, 1H), 6.70 (s， 1H) _; 5.20-5.00 (m, 3H), 4.20-3.90 (m, 2H), 3.80-3.50 (m， 2H), 3.45 (s, 3H), 2.54-2.45 (m, \ U), 2.10-190 (s, 1H), 1.85-1.65 (m, 1H), 1.15 (d, 3H) 实例 31

((3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基)哌啶 -1 -基）（3-甲基异恶唑 -4-基)甲

在冰浴和氮气保护下把二异丙基乙胺 (131 mg, 1 mmol, 5.0eq.)慢慢加入到化合物 N-[(3R，4R)-4-甲基 -3-哌啶] -N-甲基 -7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-胺 （50 mg, 0.2 mmol, 1.0 eq.)， 化合物 3-甲基异恶唑 -4-羧酸（28.5 mg, 0.22 mmol, 1.1 eq.)和 2-(7-氮杂 -1H-苯并三 氮唑 -1-基) -1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯（116 mg, 0.3 mmol, 1.5 eq.)的二氯甲垸溶液（10 mL)中。 反应在室温下搅拌 3个小时， 然后将反应液用二氯甲垸萃取。 有机层用碳酸 氢钠溶液和食盐水各反洗一次， 再用硫酸钠干燥后旋干， 得到的粗品采用 HPLC纯化 (仪器： SHIMADZU LC-8A，分离柱： synergi-10 mi, 250x50mmI.D流动相， A: Η ₂ 0 (1%ο TFA，v/v)和 B _: 乙腈，梯度：B 30-80% .流速：80毫升 /分)， 机分回来的目标组分先用碳 酸氢钠溶液调至 pH = 8， 然后再用乙酸乙酯进行萃取， 有机层用食盐水反洗一次后， 有机层干燥旋干得到目标化合物（ 16.5 mg,收率 = 23%)。

LC/MS (方法 UFLC, 总长度 7分钟)： RT = 3.004 min; m/z = 355.1 [M+H] ⁺ .

1H NMR (CD ₃ OD, 400MHz): δ 8.95 (br, 1 H), 8.40 (s, 1H), 7.42 (s， 1H), 6.93 (br, 1H), 5.10-5.00 (m, 1H), 4.00-4.30 (m, 2H), 3.74-3.60 (m， 2H), 3.51 (s, 3H), 2.70-2.50 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 2.10-1.70 (m, 2H), 1.15 (d,3H).

表 1中的其他实施例是根据上述流程 I与 II的程序， 用在实施例 1和实施例 2中 描述的类似操作方法制备。 表 1 : JAKS抑制剂化合物

实 结构式 名称 质谱 施 数据 例 [M+

1]+

1 ((3R，4R)-4-甲基 -3- (甲基 (7Η-吡咯并 [2，3-d]嘧 355 啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基) (5-甲基异恶唑 -4-基） 甲酮

2 2-((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d] 355 嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基 )-3-氧代丁腈

3 (3-((7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶 -1- 328 丫 ₀ 基) (甲基异恶唑 -4-基)甲酮

€0

4 (3S-((7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶 -1 - 328

。丫 ο·、 基) (甲基异恶唑 -4-基)甲酮

5 (3R-((7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶 -1 - 328 基) (甲基异恶唑 -4-基)甲酮

2- (3-((7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氧）哌啶- 328 1 -羰基） -3-氧代丁腈 (3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基）氨基） 341 丫 哌啶小基) (5-甲基异恶唑 -4-基)甲酮

J o

2- (3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4-基）氨 341 基）哌啶 -1-羰基） -3-氧代丁腈

2-((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7-甲基 -7H-吡咯并 369 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基 )-3-氧代 丁腈

2-甲基 -2-((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 369 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基 )-3-氧代 丁腈

(5-乙基异恶唑 -4-基） ((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 369 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 - 基)甲酮

2-((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d] 369 嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基) - 3-氧代戊腈

((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧 409 丫 x. 啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基）（5- (三氟甲基）异恶

唑 -4-基)甲酮 4,4,4-三氟 -2- ((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡 409 咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基 )-3- 氧代丁腈

(5-环丙基异恶唑 -4-基）（(3R，4R)-4-甲基 -3-(甲 381 丫 . 基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1

-基)甲酮

2- (环丙甲酰基 )-3-((3R，4R)-4-甲基 -3-(甲基 381 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 - 基） -3-氧代丙腈

( ⁴ -甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基） 355 氨基）哌啶 - 1 -基）（5-甲基异恶唑 -4-基）甲酮

2-(4-甲基 -3- (甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 355 基)氨基）哌啶 -1 -羰基) -3-氧代丁腈

(5-异恶唑 -4-基）（(3R，4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H- 383 吡咯并 [ ² ，3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基)甲 酮

4-甲基—2-((3R，4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 383 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -羰基)- 3-氧代 戊腈 2-( 3- (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶 -4-基）氨 327 基）吡咯烷 -1 -羰基） -3-氧代丁腈

((3R,4R)-3-((5-溴 -7H-吡咯并 [2,3-d] 嘧啶 -4- 434

。丫 , 基) (甲基)氨基） -4-甲基哌啶 -1-基）（5-甲基异

恶唑 -4-基）甲酮

2- ((3R,4R)-3-((5-溴 -7H-吡咯并 [2，3-d] 嘧啶- 434 4-基）（甲基)氨基） -4-甲基哌啶 -1-羰基） -3-氧 代丁腈

。 ½

(3,5-二甲基异恶唑 -4-基）（(3R,4R)-4-甲基 -3- 369 (甲基 (7H-吡咯并 [2，3-d] 嘧啶 -4-基)氨基）哌 啶 -1 -基）甲酮

((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d]嘧 355 啶 -4-基)氨基）哌啶 -1 -基）（3-甲基异恶唑 -4- 基）甲酮

((3R,4R)-4-甲基 -3- (甲基 (5-甲基 -7H-吡咯并 369 丫 cx. [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶小基) 5-甲基异

恶唑 -4-基)甲酮

2- ((3R,4R)-4-甲基 -3-(甲基 (5-甲基 -7H-吡咯 369 并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶小羰基） -3-氧 代丁腈 Ν-甲基 -N-[(3R,4R)-4-甲基 -1-(5-甲基异恶唑- 391 ο 4-基)磺酰基 -3-哌啶]- 7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶- 4-基)胺

2-[[(3R,4R)-4-甲基 -3-[甲基 (7H-吡咯并 [2,3-d] 391 嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1-基]磺酰基 ]-3-氧代丁 ο //W ο 丄 I

腈

(E)-3-乙氧基 -2-[[(3R，4R)-4-甲基 -3-[甲基 (7H- 383 吡咯并 [2,3-d]嘧啶 -4-基)氨基）哌啶 -1-基] -羰 基]丁 -2-烯腈

N-[l，l-二甲基 -2-[[(3R，4R)-4-甲基 -3-[甲基 440 (7H-吡咯并 [2，3-d] 嘧啶 -4-基）氨基）哌啶 -1- 基] -2-氧-乙基] -5-甲基异恶唑 -4-基-甲酰胺

(E)-2-腈基- N-[l，l-二甲基 -2-[[(3R,4R)-4-甲 440 基 -3- [甲基 ( ⁷ H-吡咯并 [ ² ， ³ -d]嘧啶 _ ⁴ _基)氨基） 哌啶 -1-基] -2-氧-乙基] -3-轻基-丁 -2-烯酰胺

生物实验部分

JAK1靶点化合物活性的测量实验方案 在含有 250mM HEPES (pH值 7.0) 的缓冲液中， 加入试验化合物， 参照化合物 或水 （对照） 。 然后再加入 JAKr激酶 (PerkinElmer, PV4774)混合均匀。 然后， 在上述混合溶液中加入 ULight-JAK-1 peptide (PerkinElmer, 1639096)和 ATP 开始反应， 并且将混合物在室温下孵育 60分钟。 对于控制基底的测量， 将这种酶是从反应混合物中省略。 孵育后， 通过添加 EDTA将反应停止。 再过 60多分钟后， 使用酶标仪 （Envision, Perkin Elmer公司制） , 在 620和 665 纳米两个波长测量荧光强度。 酶的活性是由在 665nm测得的信号除以在 620nm (比率） 计算得到。 激酶的活性结果由相对于控制酶的抑制百分数 来表示。

JAK2靶点化合物活性的测量实验方案 在含有 250mM HEPES (pH值 7.0) 的缓冲液中， 加入试验化合物， 参照化合物 或水 （对照） 。 然后再加入 JAK2激酶 (Invitrogen，PV4210)混合均匀。 然后， 在上述混合溶液中加入 TK-生物素 （Cisbio, 62TK0PEB ) 和 ATP开始反 应， 并且将混合物在室温下孵育 60分钟。 对于控制基底的测量， 将这种酶是从反应混合物中省略。 孵育后， 通过添加 EDTA将反应停止。 再过 60多分钟后， 使用酶标仪 （Envision, Perkin Elmer公司制） ， 在 620和 665 纳米两个波长测量荧光强度。 酶的活性是由在 665nm测得的信号除以在 620nm (比率） 计算得到。 激酶的活性结果由相对于控制酶的抑制百分数 来表示。

JAK3靶点化合物活性的测量实验方案 在含有 250mM HEPES (pH值 7.0) 的缓冲液中， 加入试验化合物， 参照化合物 或水 （对照） 。 然后再加入 JAK3激酶 (Invitrogen, PR7507B)混合均匀。 然后， 在上述混合溶液中加入 TK-生物素 （Cisbio, 62TK0PEB ) 和 ATP开始反 应， 并且将混合物在室温下孵育 60分钟。 对于控制基底的测量， 将这种酶是从反应混合物中省略。 孵育后， 通过添加 EDTA将反应停止。 再过 60多分钟后， 使用酶标仪 （Envision, Perkin Elmer公司制） ， 在 620和 665 纳米两个波长测量荧光强度。 酶的活性是由在 665nm测得的信号除以在 620nm (比率） 计算得到。 激酶的活性结果由相对于控制酶的抑制百分数 来表示。 表 2: JAKS抑制剂化合物的抑制数据 （其中， IC50值以具体的数值表示， 在 10 micromolar的抑制百分比在表格中以百分比表示� �

20 1372 1052 176

21 999 686 265

22 54% 2200 2279

23 113 338 92

24 6.0% 45% 46%

25 47% 60% 5344

26 76% 1413 47%

27 51% 9444 2455

30 3569 602 330

31 275 132 78

32 -10% 54% 3112

33 62% 835 315

34 2041 394 429

35 472 268 401

36 1222 2793 2094

37 - - 212

38 - - 117

^; -"代表没有测试

动物实验方法 雄性 SD大鼠 24小时内的药物代谢动力学试验共分为静脉和� ��服两组， 每组 3只 动物.静脉组取血时间点为给药前， 给药后 0.0833， 0.167, 0.5， 1， 2， 4， 8， 24小 时； 口服组取血时间点为给药前， 给药后 0.167， 0.5， 1， 2, 4， 8， 24小时。 采血完 毕后， 利用 HPLC-MS/MS进行生物分析， 报告化合物的血药浓度.计算出的药物代谢 动力学参数为静脉组动物的平均清除率 (Clp)， 平均表观分布容积 (Vdss)， 0-24h 曲线下 分布面积 (AUC)， 0-24小时的平均滞留时间 (MRT)， 半衰期 T1/2; 口服组动物在给药 后的平均最大药物浓度 (Cmax)， 0-24h曲线下分布面积 (AUC)， 0-24小时的平均滞留时 间 (MRT); 本次试验的平均相对生物利用度。 比格犬 24小时内的药物代谢动力学试验共分为静脉 （每公斤 1毫克） 和口服 （每 公斤 3毫克） 两组， 每组 3 只动物.静脉组取血时间点为给药前， 给药后 0.033， 0.083 , 0.25 , 0.5， 1， 3， 6， 9， 24 小时； 口服组取血时间点为给药前， 给药后 0.083, 0.25， 0.5， 1， 3， 6， 9， 24小时。 采血完毕后， 利用 HPLC-MS/MS进行生物 分析， 报告化合物的血药浓度.计算出的药物代谢动� �学参数为静脉组动物的平均清除 率 (Clp)， 平均表观分布容积 (Vdss)， 0-24h曲线下分布面积 (AUC)， 0-24小时的平均滞 留时间 (MRT)， 半衰期 T1/2; 口服组动物在给药后的平均最高药物浓度 (Cmax)， 0-24h 曲线下分布面积 (AUC)， 0-24小时的平均滞留时间 (MRT); 平均相对生物利用度。 结果 请参见图 1和表 3。

表 3 ; 化合物 2药代动力学参数 （比格犬)

新化合物对实验动物模型佐剂诱导的关节炎 （AA) 的治疗作用： Lewis大鼠 （实 验开始时 160-180 g) 由软件随机分多组， 以达到组间体重均值接近， 并将偏差控制在 允许范围内， 被注射结核分子杆菌 H37Ra: (Difico, Detroit, MI, USA) 。 在完成免疫 后， 口服给药， 每天一次或二次， 共 7-21天。 记录体重， 爪体积， 关节炎分数。 结果 请参见图 2和图 3。