CONTRE LE MOUSSAGE BIOLOGIQUE

La présente invention concerne le domaine du traitement des eaux. En particulier, la présente invention est relative à des agents de prévention et/ou de lutte contre les bactéries filamenteuses et à leur utilisation notamment pour la prévention et/ou la lutte contre le moussage biologique impliquant des bactéries filamenteuses.

Les bactéries filamenteuses sont susceptibles de se développer au sein de stations de traitements d'eaux mettant en œuvre différents types de procédés incluant notamment des biofiltres, des membranes immergées et tout particulièrement des boues activées. Ces bactéries sont associées à certains dysfonctionnements de ces stations de traitements d'eaux qui se manifestent principalement sous deux formes : le foisonnement et le moussage biologique.

Le foisonnement induit une mauvaise décantation des boues activées suite à une augmentation du volume occupé par celles-ci.

Le moussage biologique se caractérise par la formation d'une couche épaisse de mousse biologique en surface des ouvrages. Les principales bactéries présentes dans les mousses biologiques appartiennent aux genres Microthrix, Nocardia et Gordonia. En particulier, Nocardia amarae a été identifiée comme étant l'espèce bactérienne majeure responsable du moussage biologique (Pagilla et al., 2002, water science and technology, vol. 46, p519-524 ; Iwahori et al., 2001, J. Bioscience Bioengineering, p 77-79).

En outre, ces phénomènes de foisonnement et de moussage biologique s'accompagnent le plus souvent de départs de matières en suspension dans l'eau traitée pouvant conduire, en plus des problèmes opérationnels sur les stations de traitements des eaux, à une détérioration de la qualité de l'eau traitée et ainsi à des dépassements plus ou moins importants des normes de rejet.

Le développement de solutions techniques permettant de contrôler le développement des bactéries filamenteuses constitue donc un enjeu majeur pour assurer le bon fonctionnement des installations de traitements d'eaux et en particulier des installations d'assainissements d'eaux. Les moyens de lutte contre les bactéries filamenteuses dont disposent actuellement les exploitants de stations de traitement d'eaux impliquent essentiellement l'utilisation d'oxydants chimiques (tels que le chlore et ses dérivés, le peroxyde d'hydrogène, l'acide péracétique), l'utilisation de composés floculants (tels que les sels métalliques, le chlorure de fer, le talc, les carbonates de calcium) ou encore l'utilisation de moyens mécaniques (tels que la cavitation).

Toutefois, ces différents moyens ne sont pas spécifiques des bactéries filamenteuses et présentent des efficacités très variables en fonction du type de dysfonctionnement rencontré. En outre, ces moyens ne sont pas toujours sans conséquences sur la qualité des eaux traitées et notamment sur l'activité de la biomasse épuratrice lors de traitements biologiques. En outre, certains de ces moyens présentent l'inconvénient d'utiliser des produits ne respectant pas l'environnement et/ou dont la mise en œuvre peut être coûteuse en énergie. L'utilisation de ces agents, notamment chimiques, peut également se révéler contraignante. En effet, certains de ces agents présentant des effets secondaires particulièrement indésirables (par exemple en étant toxique vis-à-vis de micro-organismes bénéfiques), leur utilisation (dose, point d'injection, durée) requiert un contrôle rigoureux et constant. Enfin, la mise au point de procédés mettant en œuvre ces agents peut être longue, coûteuse et difficilement adaptable aux différentes situations de dysfonctionnements rencontrés dans les stations de traitement d'eaux.

Il existe donc un besoin pour des agents permettant de lutter efficacement et spécifiquement contre les bactéries filamenteuses présentes dans les eaux à traiter, en particulier les eaux usées et les boues activées, tout en préservant la qualité du traitement des eaux, en particulier de l'assainissement des eaux usées, ainsi que les microorganismes bénéfiques, assurant éventuellement le traitement desdites eaux, et tout en étant simple d'utilisation.

Les inventeurs ont maintenant découvert l'efficacité d'agents biologiques permettant de résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus. Ces agents sont des enzymes ayant la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses présentes aussi bien dans des cultures bactériennes que dans des eaux à traiter, en particulier des eaux usées, que dans des boues activées ou encore dans des mousses biologiques. En effet, les inventeurs ont montré de manière surprenante que ces enzymes conservent leur activité enzymatique dans des milieux aussi déstabilisants que des mousses biologiques, des boues activées et des eaux à traiter. En outre, les inventeurs ont mis en évidence que de manière inattendue, ces enzymes ont la capacité de lyser non seulement la souche de bactéries filamenteuses dont elles sont issues (soit du génome bactérien de ladite souche, soit du génome d'un bactériophage infectant ladite souche), mais également d'autres souches impliquées dans le moussage biologique, notamment des souches appartenant à l'espèce Gordonia amarae. Or, il a été démontré que Gordonia amarae est l'espèce bactérienne majeure responsable du moussage biologique (Pagilla et al., 2002, water science and technology, vol. 46, p519-524 ; Iwahori et al., 2001, J. Bioscience Bioengineering, p 77-79).

Ainsi selon un premier aspect, l'invention a pour objet un premier type d'agent de lyse d'au moins une souche de bactéries filamenteuses comprenant :

- au moins un premier type de polypeptide selon l'invention choisi parmi les polypeptides suivants :

a) polypeptide dont la séquence d'acides aminés est l'une des séquences SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°7 ;

b) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N°5, ou SEQ ID N°7 ; c) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés est celle d'un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°5, ou SEQ ID N°7 ;

d) polypeptide comprenant au moins un polypeptide tel que défini en a), b) ou c) ;

- et/ou au moins un premier type de polynucléotide selon l'invention dont la séquence d'acides nucléiques est l'une des séquences SEQ ID N°6 ou SEQ ID N°8.

La séquence SEQ ID N°5 correspond à une séquence identifiée jusqu'à présent comme celle d'une putative enzyme lytique du phage GTE5 de Gordonia terrae, ci-après désignée Gter.

La séquence SEQ ID N°7 correspond à la séquence SEQ ID N°5 dans laquelle a été insérée après le premier résidu méthionine, la séquence d'acides aminés suivante « HHHHHHIEGR » correspondant à une étiquette polyhistidine (« 6x-HisTAG ») suivie d'un site de clivage protéolytique pour le facteur Xa, afin de faciliter la purification de la protéine.

Avantageusement, ledit premier type de polypeptide selon l'invention est constitué de la séquence SEQ ID N°5 ou de la séquence SEQ ID N°7, en particulier de la séquence SEQ ID

N°5. La séquence SEQ ID N°6 correspond à une séquence d'acides nucléiques codant l'enzyme de séquence SEQ ID N°5.

La séquence SEQ ID N° 8 correspond à une séquence d'acides nucléiques codant l'enzyme de séquence SEQ ID N°7.

L'invention a également pour objet un deuxième type d'agent de lyse d'au moins une souche de bactéries filamenteuses comprenant :

- au moins un deuxième type de polypeptide selon l'invention choisi parmi les polypeptides suivants :

e) polypeptide dont la séquence d'acides aminés est l'une des séquences SEQ ID N°9 ou SEQ ID N ⁰ I l;

f) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N°9 ou SEQ ID N°l 1; g) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés est celle d'un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°9 ou SEQ ID N°l 1;

h) polypeptide comprenant au moins un polypeptide tel que défini en e), f) ou g) ;

- et/ou au moins un deuxième type de polynucléotide selon l'invention dont la séquence d'acides nucléiques est l'une des séquences SEQ ID N ⁰ IO ou SEQ ID N°12.

La séquence SEQ ID N°9 correspond à une séquence identifiée jusqu'à présent comme celle d'une putative N-acetyl muramoyl-L-alanine amidase de Nocardia farcinica, ci-après désignée NFar.

La séquence SEQ ID N ⁰ I l correspond à la séquence SEQ ID N°9 dans laquelle a été insérée après le premier résidu méthionine, la séquence d'acides aminés suivante « HHHHHHIEGR » correspondant à une étiquette polyhistidine (« 6x-HisTAG ») suivie d'un site de clivage protéolytique pour le facteur Xa, afin de faciliter la purification de la protéine.

Avantageusement, ledit deuxième type de polypeptide selon l'invention est constitué de la séquence SEQ ID N°9 ou de la séquence SEQ ID N°l 1, en particulier de la séquence SEQ ID N°9.

La séquence SEQ ID N ⁰ IO correspond à une séquence d'acides nucléiques codant l'enzyme de séquence SEQ ID N°9. La séquence SEQ ID N° 12 correspond à une séquence d'acides nucléiques codant l'enzyme de séquence SEQ ID N°l 1.

Le premier type d'agent de lyse selon l'invention peut comprendre en outre au moins un deuxième type de polypeptide selon l'invention et/ou au moins un deuxième type de polynucléotide selon l'invention.

Avantageusement, dans les premier et deuxième types d'agents de lyse selon l'invention, les premier et deuxième types de polynucléotides selon l'invention sont compris dans un vecteur d'expression. Les vecteurs d'expression utilisables peuvent être sous toute forme appropriée selon l'application visée.

Les inventeurs ont maintenant montré que les enzymes Gter et Nfar dans lesquelles a été insérée ou non une étiquette (« HHHHHHIEGR ») ont une activité lytique et en particulier ont la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, notamment impliquées dans le moussage biologique.

De telles enzymes sont donc particulièrement intéressantes pour lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, notamment impliquées dans le moussage biologique.

Ainsi, l'invention a également pour objet l'utilisation non thérapeutique d'au moins un premier ou deuxième type de polypeptide selon l'invention et/ou d'au moins un premier ou deuxième type de polynucléotide selon l'invention, pour lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, en particulier une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique.

Ces enzymes lytiques (lysines) Gter et Nfar, dans lesquelles a été insérée ou non une étiquette (« HHHHHHIEGR »), peuvent également être utilisées dans des compositions pour le traitement prophylactique et thérapeutique d'infections causées par des bactéries filamenteuses et en particulier des bactéries du genre Nocardia ou Gordonia. En effet, les bactéries des familles Nocardia et Gordonia sont des pathogènes opportunistes responsables d'infections d'origine pulmonaire et peuvent conduire à des infections systémiques ou à localisations secondaires. Elles sont aussi responsables de nocardioses sous-cutanées pouvant se produire d'emblée chez des sujets sains et succédant à des piqûres ou des blessures. Ainsi, ces enzymes lytiques peuvent être des alternatives aux antibiotiques conventionnels. Elles peuvent avoir des applications pour le nettoyage de plaies ou être utilisées en prévention lorsqu'elles sont appliquées sur des pansements. Ces enzymes lytiques peuvent également être utilisées pour le nettoyage de matériel médical et en particulier des cathéters afin d'éviter les infections. Enfin, ces enzymes lytiques Gter et Nfar peuvent avoir des applications dans l'hygiène dentaire pour le traitement et la prévention de maladies péridentaires, des caries et plaques dentaires dues à certaines bactéries incluant Actinomyces et Nocardia.

Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses comprenant :

- au moins une enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; et/ou

- au moins un organisme exprimant ladite enzyme ; et/ou

- au moins un lysat bactérien comprenant ladite enzyme.

Lesdits agents de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention présentent notamment les avantages suivants :

- Ils sont efficaces et spécifiques d'au moins une souche de bactéries filamenteuses et préservent ainsi les autres microorganismes assurant éventuellement le traitement des eaux ;

- Ils sont sans conséquences négatives sur la qualité des eaux traitées ;

- Ils sont respectueux de l'environnement ;

- Leur mise en œuvre est simple, rapide et peu coûteuse en énergie.

On entend par « moussage biologique » au sens de la présente invention, la formation de mousse biologique liée à la prolifération d'au moins une souche de bactéries filamenteuses.

On entend par « mousse biologique » au sens de la présente invention, la mousse formée, liée à la prolifération d'au moins une souche de bactéries filamenteuses.

On entend par « lysat bactérien » au sens de la présente invention, le produit de la lyse cellulaire bactérienne. Il est possible d'obtenir un lysat bactérien selon toute technique bien connue de l'Homme du Métier telle que par exemple par sonication, French press, ou encore en utilisant des tampons de lyse (tels que : 10OmM KCl, 25mM Hepes pH 7.6, 0.1 mM EDTA, 12.5mM MgC12, 10% glycérol, 0.1% Nonidet P40, 0.5 mg/mL lysozyme).

Lesdites enzymes capables de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses peuvent être des enzymes lytiques, en particulier des enzymes autolytiques encore dénommées lysines et autolysines respectivement. Les gènes codant lesdites enzymes peuvent être issus de génomes de bactériophages ou de micro-organismes, en particulier de génomes bactériens. En particulier, lesdites enzymes ont la capacité de lyser non seulement la souche de bactéries filamenteuses dont elles sont issues (soit du génome bactérien de ladite souche, soit du génome d'un bactériophage infectant ladite souche), mais également d'autres souches impliquées dans le moussage biologique, notamment des souches appartenant au même ordre bactérien et en particulier des souches appartenant à l'espèce Nocardia amarae.

Lesdites enzymes selon l'invention, capables de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses peuvent être identifiées par des procédés comprenant :

- la sélection d'enzymes putatives ou déjà décrites capables de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, par des études in silico et/ou bibliographiques suivie de tests de l'activité enzymatique recherchée, à partir des enzymes putatives ou décrites ainsi sélectionnées.

Lesdites enzymes selon l'invention capables de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses peuvent également être identifiées sur la base de banques génomiques construites à partir d'échantillons de cultures bactériennes ou d'échantillons d'eaux à traiter, en particulier d'eaux usées ou de boues activées, ou encore de mousses biologiques, présentant au moins une souche de bactéries filamenteuses. Selon cette seconde approche, il est possible à partir d'échantillons de cultures bactériennes ou d'échantillons d'eaux à traiter, en particulier d'eaux usées ou de boues activées, ou encore de mousses biologiques, après induction ou non de cycle lyrique de bactériophages (par exemple par la mitomycine) :

- d'une part de construire une banque métagénomique et de la cribler pour l'activité enzymatique recherchée ; et

- d'autre part d'isoler des bactériophages à partir de plages de lyse, de construire des banques génomiques des phages ainsi isolés et de les cribler pour l'activité enzymatique recherchée.

L'activité enzymatique recherchée, à savoir la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses peut être déterminée par des tests bien connus de l'Homme du Métier. A titre d'exemple, on peut citer, l'utilisation d'un spectrophotomètre par mesure de la densité optique (à 600 nm avec une dilution d'une suspension bactérienne), ou l'observation microscopique associée à des colorations de la structure, morphologie des filaments ou encore l'utilisation de kits de viabilité bactériennes comme le kit « LIVE/DEAD® Bacterial Viability Kit » ( BacLight™) de chez Molecular Probes.

Les tests enzymatiques peuvent être réalisés sur des échantillons de cultures bactériennes ou sur des échantillons d'eaux à traiter, en particulier d'eaux usées ou de boues activées, ou encore de mousses biologiques susceptibles de comprendre au moins une souche de bactéries filamenteuses cibles.

La présente invention englobe les enzymes conformes à l'invention qui sont natives, synthétiques, hémi-synthétiques, recombinantes et leurs analogues.

En particulier, ladite enzyme selon l'invention peut se présenter sous la forme d'une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant au moins un domaine enzymatique ayant la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, ledit domaine étant lié de manière opérationnelle à au moins un autre polypeptide.

Ledit autre polypeptide peut être par exemple une « étiquette » permettant le marquage de la protéine de fusion. Cette étiquette peut permettre la détection, la purification de la protéine de fusion et/ou l'immobilisation de la protéine de fusion sur un support. À titre d'exemple de telles étiquettes, on peut citer celles bien connues de l'Homme du Métier telles que GST, His-Tag, Tag-V5. La protéine de fusion comprenant une étiquette His-Tag pourra ainsi être avantageusement immobilisée et/ou purifiée sur un support comportant des cations divalents (Nickel, Cobalt, cuivre).

Ledit autre polypeptide peut également comprendre un domaine de liaison à un substrat, favorisant ainsi l'immobilisation de la protéine de fusion sur un support comportant ledit substrat. Ainsi ledit second polypeptide peut comprendre un domaine de liaison au maltose (« Maltose Binding Protein ») qui permettra à la protéine de fusion d'être avantageusement immobilisée sur un support présentant des molécules de maltose.

Par ailleurs, ledit autre polypeptide peut comprendre par exemple au moins un domaine enzymatique ayant la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses. Ainsi avantageusement, ladite enzyme selon l'invention peut se présenter sous la forme d'une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant plusieurs sites actifs, plusieurs domaines enzymatiques ayant la capacité de lyser différentes souches de bactéries filamenteuses.

En particulier, ladite au moins une enzyme selon l'invention peut comprendre un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants :

- ledit premier type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ;

ledit deuxième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ;

- un troisième type de polypeptide selon l'invention, ledit troisième type de polypeptide étant choisi parmi les polypeptides suivants : i) polypeptide dont la séquence d'acides aminés est l'une des séquences SEQ ID

N°l ou SEQ ID N°3 ;

j) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, encore plus préférentiellement au moins 90 % et de manière préférée entre toutes au moins 95 % d'identité avec l'une des séquences SEQ ID N°l ou SEQ ID N°3 ;

k) polypeptide ayant une activité lytique et dont la séquence d'acides aminés est celle d'un fragment de l'une des séquences SEQ ID N°l ou SEQ ID N°3 ;

1) polypeptide comprenant au moins un polypeptide tel que défini en i), j) ou k).

Avantageusement, ledit troisième type de polypeptide selon l'invention est constitué de la séquence SEQ ID N°l ou de la séquence SEQ ID N°3, en particulier de la séquence SEQ ID N ⁰ I.

La séquence SEQ ID N°l correspond à la séquence d'une lysine du phage AV-I d'Actinomyces viscosus, ci-après désignée Av-I.

La séquence SEQ ID N°3 correspond à la séquence SEQ ID N°l dans laquelle a été insérée après le premier résidu méthionine, la séquence d'acides aminés suivante « HHHHHHIEGR » correspondant à une étiquette polyhistidine (« 6x-HisTAG ») suivie d'un site de clivage protéo lytique pour le facteur Xa, afin de faciliter la purification de la protéine.

De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que les trois enzymes Av-I, Gter et Nfar, dans lesquelles a été insérée ou non une étiquette (« HHHHHHIEGR »), ont la capacité de lyser la souche de bactéries filamenteuses dont elles sont issues (soit du génome bactérien de ladite souche, soit du génome du bactériophage infectant ladite souche), mais également d'autres souches impliquées dans le moussage biologique, en particulier des souches de bactéries filamenteuses appartenant aux familles Nocardiaceae, Gordoniaceae et au genre Microthrix et tout particulièrement des souches appartenant à l'espèce Nocardia amarae. En outre, les inventeurs ont montré que de manière inattendue, ces enzymes conservent leur activité dans des milieux aussi déstabilisants que des eaux à traiter, en particulier des eaux usées, des boues activées, ou encore des mousses biologiques.

Les fragments des séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°3, SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N ⁰ I l ont des tailles minimales permettant de conserver l'activité lytique et en particulier de conserver la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses, de préférence impliquées dans le moussage biologique.

En particulier, ladite enzyme selon l'invention comprend un des domaines enzymatiques des séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°9 qui ont la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses.

En particulier, ladite enzyme selon l'invention peut être une protéine de fusion comprenant au moins un des domaines enzymatiques des séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°9 qui ont la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses.

Avantageusement, ledit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention peut comprendre au moins une enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; ladite au moins une enzyme comprenant un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants :

- ledit premier type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ;

ledit deuxième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ;

- ledit troisième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus.

Avantageusement, ledit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention peut comprendre :

i)- au moins une première enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; et/ou

- au moins un organisme exprimant ladite première enzyme ; et/ou

- au moins un lysat bactérien comprenant ladite première enzyme ;

ladite au moins une première enzyme comprenant un premier type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ; et

ii)- au moins une deuxième enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; et/ou

- au moins un organisme exprimant ladite deuxième enzyme ; et/ou

- au moins un lysat bactérien comprenant ladite deuxième enzyme ; ladite au moins une deuxième enzyme comprenant un deuxième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ; et

iii)- au moins une troisième enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; et/ou

- au moins un organisme exprimant ladite troisième enzyme ; et/ou

- au moins un lysat bactérien comprenant ladite troisième enzyme ;

ladite au moins une troisième enzyme comprenant un troisième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus.

Avantageusement, ledit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention peut comprendre :

i)- au moins une première enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ;

ladite au moins une première enzyme comprenant un premier type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ; et

ii)- au moins une deuxième enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ;

ladite au moins une deuxième enzyme comprenant un deuxième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ; et

iii)- au moins une troisième enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ;

ladite au moins une troisième enzyme comprenant un troisième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus.

La mise en oeuvre de ces premier, deuxième et troisième types de polypeptides selon l'invention dans ledit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention, présente l'avantage d'obtenir un large spectre d'activité vis-à-vis des souches de bactéries filamenteuses.

Ledit organisme exprimant l'enzyme selon l'invention, peut être un microorganisme unicellulaire ou pluricellulaire.

En particulier, ledit organisme exprimant l'enzyme peut être choisi parmi les bactéries et les champignons. En particulier, ledit organisme exprimant l'enzyme est un microorganisme capable de dégrader au moins partiellement, les substances organiques présentes dans les eaux à traiter ; l'utilisation d'un tel microorganisme permet d'optimiser le traitement des eaux. Lesdites eaux à traiter incluent notamment :

- les eaux usées ;

- les eaux usées à tous les stades d'épuration et au stade post-épuration ;

- les eaux destinées à être traitées en vue de leur potabilisation telles que les eaux de surface, les eaux karstiques, les eaux souterraines, l'eau de mer ;

- les eaux à tous les stades de potabilisation et au stade post-potabilisation.

On entend par « bactérie filamenteuse » au sens de la présente invention, toute bactérie capable de former un filament bactérien. Un filament bactérien est une colonie de cellules qui, après division cellulaire, ne se séparent pas. Cette colonie croît selon un axe unique ou ramifié, formant ainsi un filament. L'identification des bactéries filamenteuses repose sur des critères morphologiques associés le plus souvent à des colorations (Eikelboom, 1975) et/ou sur des homologies de séquences phylogénétiques (basé par exemple sur l'homologie de séquences de l'ADN 16S).

En particulier, ladite souche de bactéries filamenteuses peut être incluse dans le groupe comprenant les souches de bactéries de l'ordre des Actinomycetales.

En particulier, ladite souche de bactéries filamenteuses peut être incluse dans le groupe comprenant :

- les souches de bactéries de la famille des Nocardiaceae;

- les souches de bactéries de la famille des Gordoniaceae;

- les souches de bactéries de la famille incluant le genre Microthrix ;

- les souches de bactéries de la famille incluant le type d'Eikelboom 0675 ;

- les souches de bactéries de la famille incluant le type d'Eikelboom 0581.

En particulier, ladite souche de bactéries filamenteuses peut être incluse dans le groupe comprenant :

- les souches de bactéries du genre Nocardia ;

- les souches de bactéries du genre Gordonia,

- les souches de bactéries du genre Microthrix ;

- les souches de bactéries du genre incluant le type d'Eikelboom 0675 ;

- les souches de bactéries du genre incluant le type d'Eikelboom 0581. Plus particulièrement, ladite souche de bactéries filamenteuses peut être incluse dans le groupe comprenant :

- les souches de bactéries des espèces Nocardia farcinica, Nocardia formes ;

- les souches de bactéries des espèces Gordonia terrae, Gordonia amarae ;

- les souches de bactéries de l'espèce Microthrix parvicella ;

- les souches de bactéries du type d'Eikelboom 0675 ;

- les souches de bactéries du type d'Eikelboom 0581.

Dans ledit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention, ladite au moins une enzyme et/ou ledit au moins un organisme exprimant l'enzyme selon l'invention peuvent être immobilisés sur un support.

L'utilisation d'un support présente notamment les avantages de protéger les enzymes de la biodégradation par des protéases ou des micro-organismes susceptibles d'être présents dans les eaux. L'utilisation d'un support est donc particulièrement intéressante dans le cas du traitement biologique des eaux tels que les procédés à boues activées mettant en œuvre des micro-organismes. En outre l'immobilisation sur un support permet de limiter la dénaturation et/ou l'inactivation de l'enzyme qui peut être due à des variations de pH, des températures élevées, des agents dénaturants, des métaux lourds, des acides gras ou encore des sels de biles. L'utilisation d'un support peut également avoir l'avantage de permettre la récupération de l'enzyme, du système d'expression selon l'invention après usage.

La stabilité sur le support de l'enzyme et/ou de l'organisme exprimant ladite enzyme selon l'invention peut en outre être améliorée en modifiant son microenvironnement, ce qui peut être réalisé :

- en bloquant les groupements chimiques restés libres sur le support après immobilisation de l'enzyme ou du système d'expression;

- en greffant à proximité de l'enzyme ou du système d'expression des macromolécules hydrophiles ;

- en immobilisant l'enzyme sur le support via un espaceur.

Ainsi, l'immobilisation de l'enzyme sur le support peut être directe ou indirecte via un espaceur (lieur, « linker »). À titre d'exemples d'espaceurs utilisables on peut citer l'aldéhyde dextran, le PEG diamine, l'amino dextran, l'albumine et l'acide 6 amino caproique. L'immobilisation de l'enzyme ou du système d'expression de ladite enzyme sur le support peut être réalisée selon toute technique bien connue de l'Homme du métier telle que par liaison covalente, par adsorption, par greffage, par « cross-linking » covalent avec des réactifs poly- fonctionnels ou encore par un système ligand-récepteur.

L'immobilisation par adsorption présente l'avantage d'être un procédé simple et peu coûteux, mais repose sur des liaisons faibles. Il est toutefois possible d'éviter les problèmes de désorption en réalisant un « cross-linking », au glutaraldéhyde par exemple, après l'adsorption (Greenberg et Mahoney, 1981, Proc. Biochem., Feb/March : 2-8).

L'immobilisation covalente présente l'avantage, lorsqu'elle implique des groupements fonctionnels situés à l'écart du site actif de l'enzyme, d'obtenir une meilleure activité spécifique et un meilleur rendement que lors de l'immobilisation par adsorption. Il existe en outre des méthodes permettant de choisir les groupements impliqués dans la liaison au support (Cano et al., 2006, J. Membrane Sci., 280(1-2) :383-388). En outre, cette technique permet l'utilisation d'espaceurs (lieurs, « linkers ») permettant de créer un microenvironnement hydrophile et ainsi d'optimiser la stabilité et l'activité enzymatique.

L'immobilisation par un système « ligand-récepteur » repose sur l'affinité d'un récepteur pour un ligand placé sur le support. Cette technique peut permettre également la purification de l'enzyme. À titre d'exemples, il est possible d'utiliser le système « streptavidine-biotine », dans lequel l'enzyme est biotynilée in vitro et la streptavidine est greffée sur le support. On peut également citer les systèmes maltose et His-Tag décrits ci- dessus. Ce système « ligand-récepteur » permet d'améliorer l'activité enzymatique et d'augmenter la durée de vie de l'enzyme par rapport aux techniques d'immobilisation par adsorption ou covalente.

Ledit support selon l'invention peut présenter au moins une des caractéristiques suivantes :

- une densité inférieure à celle desdites eaux et le cas échéant à celle des boues activées, en particulier une densité inférieure à 1 ;

- des pores ayant un diamètre au moins égal au diamètre des bactéries filamenteuses, en particulier au moins égal à 10 μm, plus particulièrement au moins égal à 20 μm et tout particulièrement au moins égal à 50 μm ;

- non biodégradable, en particulier non dégradable par les micro -organismes présents dans lesdites eaux ; - insoluble dans l'eau ;

- une résistance mécanique suffisante pour permettre une manipulation aisée ;

- une taille suffisante pour permettre sa récupération après usage ;

- des propriétés géométriques conduisant à une surface disponible supérieure à 1500 m ² /m ³ .

En particulier, ledit support peut être adapté afin de permettre son utilisation en surface des bassins de traitements des eaux, où sont localisées les mousses biologiques impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses.

En particulier, ledit support peut comprendre au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant : l'argile frittée en particulier l'argile frittée expansée, le polystyrène en particulier le polystyrène expansé, le polyuréthane, l'alumine, le verre, le nylon, le polyester, la laine de roche, le silicate, le liège, la céramique, la polysulfone, les copolymères d'alcool vinylique et de vinyl-butyral, les polymères de polyamine, polyazetidine, polyphénylalanine- lysine, polyéther-oléfïnique.

Certains matériaux peuvent être utilisés pour une immobilisation directe. Dans ce cas, ledit support peut comprendre au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant l'argile frittée expansée, le polystyrène expansé, le polyuréthane, l'alumine, le verre, le nylon, le polyester, la laine de roche, le silicate, le liège, la céramique, le polysulfone, les copolymères d'alcool vinylique et de vinyl-butyral, de préférence l'argile frittée expansée, le polystyrène expansé, le polyuréthane, l'alumine, le verre, le nylon et le liège.

D'autres matériaux peuvent être utilisés pour une immobilisation indirecte. Dans ce cas, ledit support peut comprendre un premier matériau recouvert d'un second matériau comprenant des polymères. Ainsi, l'enzyme ou le système d'expression selon l'invention peuvent être immobilisés sur au moins un polymère choisi dans le groupe comprenant les polymères de polyamine (notamment polyéthylène-imine), polyazetidine, polyphénylalanine- lysine, polyéther-oléfïnique, polysulfone, ledit au moins un polymère étant déposé sur au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant le polystyrène, l'alumine, le verre, le nylon, le polyester.

Ledit support peut être sous toute forme adaptée à l'application visée. En particulier, ledit support peut être un support solide sous forme sphérique telle qu'une bille, une balle, un granulé, de préférence de taille supérieure à 5 mm et de densité inférieure à 1 , ou sous forme d'une bâche telles qu'une membrane, une fibre, un tissu. Selon un mode de réalisation particulier dudit agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique selon l'invention, ladite au moins une enzyme et/ou ledit au moins un organisme exprimant l'enzyme et/ou ledit au moins un lysat bactérien selon l'invention peuvent être lyophilisés.

En effet, les inventeurs ont montré que les trois enzymes Av-I, Gter et Nfar dans lesquelles a été insérée ou non une étiquette (« HHHHHHIEGR »), conservent leur activité lytique même lorsqu'elles ont été lyophilisées.

La forme lyophilisée présente les avantages de stabiliser l'enzyme et de réduire les volumes d'enzyme et/ou dudit organisme exprimant l'enzyme et/ou dudit lysat bactérien à utiliser.

Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un kit de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses comprenant :

- au moins un agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses selon l'invention, ledit agent étant défini ci-dessus ; et

- au moins un support apte à immobiliser ledit agent.

Ledit support peut être tout support tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins une enzyme selon l'invention capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique ; et/ou

- d'au moins un organisme exprimant ladite enzyme ; et/ou

- d'au moins un lysat bactérien comprenant ladite enzyme ;

en tant qu'agent de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses.

Ladite au moins une enzyme selon l'invention est telle que définie ci-dessus. En particulier, ladite au moins une enzyme peut comprendre un polypeptide choisi parmi les polypeptides suivants:

ledit premier type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ;

- ledit deuxième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus ; - ledit troisième type de polypeptide selon l'invention tel que défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'eaux incluant une étape de prévention et/ou de lutte contre le moussage biologique desdites eaux, ledit moussage biologique impliquant au moins une souche de bactéries filamenteuses, ladite étape comprenant la mise en contact desdites eaux avec au moins un agent de prévention et/ou de lutte contre au moins une souche de bactéries filamenteuses selon l'invention ; ledit agent selon l'invention étant tel que défini ci-dessus.

Lesdites eaux dans les procédés de traitement d'eaux selon l'invention incluent notamment :

- les eaux usées ;

- les eaux usées à tous les stades d'épuration et au stade post-épuration ;

- les eaux destinées à être traitées en vue de leur potabilisation telles que les eaux de surface, les eaux karstiques, les eaux souterraines, l'eau de mer ;

- les eaux à tous les stades de potabilisation et au stade post-potabilisation.

Ainsi, dans les procédés de traitement d'eaux selon l'invention, ledit agent de prévention et/ou de lutte contre au moins une souche de bactéries filamenteuses peut être mis en contact avec les eaux à traiter, en particulier les eaux usées, les boues activées ou encore les mousses biologiques.

Lesdits procédés de traitement d'eaux selon l'invention peuvent être variés et inclure à titre non limitatif des bio filtres, des lits bactériens, des bassins à alimentation séquencée, des membranes immergées, un lagunage naturel ou encore des boues activées.

En particulier, lesdits procédés de traitement d'eaux selon l'invention mettent en œuvre des boues activées.

En particulier, dans les procédés de traitement d'eaux selon l'invention, ladite enzyme, ledit organisme exprimant ladite enzyme, ledit lysat bactérien sont tels que définis ci-dessus et peuvent être sous toute forme appropriée à l'application visée. Avantageusement, ladite enzyme, ledit organisme exprimant ladite enzyme ou ledit lysat bactérien comprenant ladite enzyme sont sous forme lyophilisée ; leur mise en contact avec lesdites eaux permettant leur hydratation. La lyophilisation présente les avantages de stabiliser l'enzyme et de réduire les volumes d'enzymes, dudit organisme exprimant ladite enzyme et dudit lysat bactérien selon l'invention à utiliser dans les procédés de traitement d'eaux selon l'invention. De manière avantageuse, les procédés selon l'invention peuvent mettre en œuvre au moins un des domaines, de préférence l'ensemble des domaines enzymatiques des séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°9 qui ont la capacité de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses.

La mise en œuvre de l'ensemble desdits domaines enzymatiques des séquences SEQ ID N°l, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°9 présente l'avantage d'obtenir un large spectre d'activité vis- à-vis des souches de bactéries filamenteuses.

Selon un mode de réalisation particulier des procédés de traitement d'eaux selon l'invention, ledit agent est immobilisé sur un support. Ledit support peut être défini tel que ci- dessus. Les méthodes d'immobilisation utilisables peuvent être celles définies ci-dessus. Les avantages liés à l'utilisation d'un support dans les procédés de traitements des eaux selon l'invention sont tels que décrits ci-dessus.

Lesdits procédés de traitement d'eaux selon l'invention peuvent comprendre en outre l'étape suivante :

- la séparation de ladite enzyme, dudit organisme exprimant l'enzyme et/ou dudit lysat bactérien et desdites eaux.

Une telle séparation peut être effectuée par toute technique bien connue de l'Homme du Métier telle que par exemple par immunoprécipitation.

Lorsque ladite enzyme et/ou ledit organisme exprimant l'enzyme est immobilisé sur un support, lesdits procédés de traitement d'eaux selon l'invention peuvent comprendre en outre l'étape suivante :

- la séparation dudit support et desdites eaux.

Selon un autre aspect, l'enzyme, ledit organisme exprimant ladite enzyme et ledit lysat bactérien comprenant ladite enzyme selon l'invention peuvent être utiles pour détecter au moins une souche de bactéries filamenteuses dans des échantillons d'eaux.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, les procédés de traitement d'eaux selon l'invention peuvent comprendre une étape de détection d'au moins une souche de bactéries filamenteuses, ladite étape comprenant les phases suivantes :

- la mise en contact d'un échantillon desdites eaux susceptible de comprendre au moins une souche de bactéries filamenteuses avec ledit au moins un agent de prévention et/ou de lutte contre au moins une souche de bactéries filamenteuses selon l'invention ; et - la détection des bactéries lysées et/ou la détection de la lyse des bactéries avec au moins un système de détection approprié.

Cette étape de détection d'au moins une souche de bactéries filamenteuses peut être mise en œuvre avantageusement avant l'étape de lutte contre le moussage biologique dans les procédés de traitement d'eaux selon l'invention. Ainsi, les agents de lutte contre le moussage biologique selon l'invention, peuvent être choisis pour cibler spécifiquement au moins ladite souche de bactéries filamenteuses ainsi détectée. Cette étape permet alors d'optimiser la lutte contre le moussage biologique.

À titre d'exemple de système de détection approprié à la détection des bactéries lysées, on peut citer des marqueurs d'ADN fluorescents tels que le Syto 9 (marqueur des bactéries intactes et lysées), l'iodure de propidium (marqueur des bactéries lysées) ou encore la technique d'EMA-PCR tel que décrit dans l'article de Rudi K et al. (2005) (Rudi K, Moen B, Dromtorp SM, Holck AL. Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable andDdead cells in complex samples. Appl Environ Microbiol. 2005 Feb;71(2): 1018-24).

À titre d'exemple de système de détection approprié à la détection de la lyse des bactéries, on peut citer l'ATPmétrie tel que décrit dans l'article de Schuch et al. (Schuch R, Nelson D, Fischetti VA.A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature. 2002 Aug 22;418(6900):884-9).

La présente invention a également pour objet un kit de détection d'au moins une souche de bactéries filamenteuses comprenant :

- une enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses ; et/ou

- un système d'expression de ladite enzyme ; et/ou

- un lysat bactérien comprenant ladite enzyme ; et

- un système de détection des bactéries lysées et/ou de la lyse des bactéries.

En particulier, dans le kit de détection selon l'invention, ladite enzyme, ledit système d'expression de ladite enzyme, ledit lysat bactérien sont tels que définis ci-dessus et peuvent être sous toute forme appropriée à l'application visée. En particulier, ladite enzyme, ledit système d'expression ou ledit lysat bactérien comprenant ladite enzyme sont sous forme lyophilisée. Selon un mode de réalisation particulier dudit kit de détection selon l'invention, ledit agent est immobilisé sur un support. Ledit support et lesdites méthodes d'immobilisation utilisables peuvent être tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro, de la présence d'au moins une souche de bactéries filamenteuses dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :

- la mise en contact d'un échantillon susceptible de comprendre au moins une souche de bactéries filamenteuses avec :

- une enzyme capable de lyser au moins une souche de bactéries filamenteuses selon l'invention ; et/ou

- un système d'expression de ladite enzyme ; et/ou

- un lysat bactérien comprenant ladite enzyme ;

- la détection des bactéries lysées et/ou de la lyse des bactéries avec au moins un système de détection approprié.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent.

Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif.

La figure 1 illustre l'activité lytique des enzymes Gter, Av-I et Nfar et du mélange de ces trois enzymes (« mix lysines ») sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux, avant lyophilisation desdites enzymes.

La figure 2 illustre l'activité lytique du mélange des trois enzymes (« mix lysines ») sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux, après lyophilisation des enzymes.

La figure 3 représente l'effet de la dose (100 μl, 200 μl et 300 μl) du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar (« mix lysines ») sur l'inhibition de la croissance de la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux.

La figure 4 illustre l'absence d'activité d'inhibition de la croissance du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, sur la bactérie Escherichia coli.

La figure 5 illustre l'absence d'activité d'inhibition de la croissance du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar sur la bactérie Bacillus subîilis. La figure 6 illustre l'activité d'inhibition de la croissance du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux.

La figure 7 représente l'état des membranes des bactéries appartenant à la souche Gordonia amarae ATCC 27809 en l'absence du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, « mix lysines ».

La figure 8 représente l'état des membranes des bactéries appartenant à la souche Gordonia amarae ATCC 27809 en présence du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, « mix lysines », pendant 30 minutes, 95 minutes ou 1595 minutes.

La figure 9 illustre l'activité lytique de l'enzyme Av-I non lyophilisée sur différentes mousses biologiques diluées prélevées en station de traitement d'eaux et sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 (témoin).

La figure 10 illustre l'activité lytique de l'enzyme Gter non lyophilisée sur différentes mousses biologiques diluées prélevées en station de traitement d'eaux et sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 (témoin).

La figure 11 illustre l'activité lytique de l'enzyme Nfar non lyophilisée sur différentes mousses biologiques diluées prélevées en station de traitement d'eaux et sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 (témoin).

La figure 12 illustre l'activité lytique du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar « mix lysines » non lyophilisé sur différentes mousses biologiques diluées prélevées en station de traitement d'eaux et sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809 (témoin).

La figure 13 (A et B) représente l'effet du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar « mix lysines » lyophilisé sur un échantillon de mousses biologiques non diluées prélevées en station de traitement d'eaux ; La figure 13 A représente un échantillon de mousses biologiques non diluées prélevées en station de traitement d'eaux en l'absence du « mix lysines », ledit échantillon étant observé au microscope après marquage « Baclight » ; La figure 13B représente un échantillon de mousses biologiques non diluées prélevées en station de traitement d'eaux après 180 minutes d'incubation avec le « mix lysines », ledit échantillon étant observé au microscope après marquage « Baclight ». Exemples

I. Exemple 1 : Evaluation de l'activité lytique des enzymes Gter, Av-I, Nfar sur des souches pures de bactéries filamenteuses

Les séquences des enzymes Gter, Av-I et Nfar, à savoir les séquences SEQ ID N°4, SEQ ID N°8 et SEQ ID N°12 (optimisées pour l'expression dans Escherichia colï) ont été clonées et exprimées dans Escherichia coli pour permettre la synthèse des protéines correspondantes.

L'activité lytique de ces trois enzymes ainsi produites a été testée sur les deux types de souches cibles suivantes :

- des souches pures de bactéries filamenteuses dont les trois enzymes Gter, Nfar et Av- 1 sont normalement spécifiques, à savoir les espèces Gordonia terrae, Nocardia farcinica et Actinomyces viscosus. En effet, l'enzyme Gter a été identifiée dans le génome du phage GTE5 ayant pour cible Gordonia terrae, l'enzyme Av-I a été identifiée dans le génome d'un phage spécifique d 'Actinomyces viscosus et l'enzyme Nfar a été identifiée chez Nocardia farcinica ; et

- des souches pures de bactéries filamenteuses isolées à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux, à savoir les souches Gordonia amarae DSM 43392 et Gordonia amarae ATCC 27809. En effet, Gordonia amarae a été identifiée comme l'espèce bactérienne prédominante dans les mousses biologiques. En outre, il a été démontré que Gordonia amarae est l'espèce bactérienne majeure responsable du moussage biologique (Pagilla et al., 2002, water science and technology, vol. 46, p519-524 ; Iwahori et al., 2001, J. Bioscience Bioengineering, p 77-79).

L'activité lytique de ces trois enzymes a été évaluée par détermination de la cinétique de lyse des souches pures de bactéries filamenteuses par mesure de la densité optique à 600 nm (DOβoo). Une diminution régulière dans le temps de la densité optique à 600 nm (DOβoo) reflète l'efficacité des enzymes à lyser les souches cibles de bactéries filamenteuses.

Cette mesure est effectuée avec un spectrophotomètre UV- Visible dans des microplaques à 96 puits (puits de 200 μL). Les conditions de réalisation des mesures sont exposées dans le tableau 1.

Tableau 1 : Composition des milieux réactionnels pour l'évaluation de l'activité des lysines

Des mesures de la densité optique à 600nm sont effectuées en cinétique toutes les minutes sur les puits témoin et test.

Les résultats sont exprimés en Delta DO 600 = f (t), sachant que :

Delta DO à 600nm = DO test (avec lysines) - DO témoin (sans lysines, avec BSA)

En retranchant, la valeur de la densité optique à 600nm (DO 600) du témoin négatif à celle de l'essai avec lysines, les interférences éventuelles liées à l'échantillon sont éliminées. Dans le cas d'une efficacité avérée des lysines, le delta DO est donc censé être négatif.

L'activité lytique des enzymes est ainsi déterminée en calculant en présence d'une enzyme (« enzyme ») et en absence d'une enzyme (« témoin »), la différence de la densité optique à 600 nm (DOβoo) à un temps donné t (Do _t ) par rapport au to (DO _to ), comme ci-après:

(Dθ _r DO _to )enzyme-(Dθt- DO _to )témoin

Les résultats de ces tests sont indiqués dans le tableau 2 suivant :

Tableau 2 : Activité lytique des trois enzymes sur différentes souches pures de bactéries filamenteuses. (+) représente une importante activité lytique ; (+/-) représente une faible activité lytique ; (-) représente l'absence d'activité lytique.

Comme le montre le tableau 2 ci-dessus, les trois enzymes Gter, Av-I et Nfar produites dans E. coli présentent une activité lytique non seulement vis-à-vis des bactéries filamenteuses dont elles sont normalement spécifiques, à savoir respectivement Gordonia terrae, Actinomyces viscosus et Nocardia farcinica, mais également vis-à-vis de souches pures de bactéries filamenteuses isolées à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux, telles que la souche Gordonia amarae ATCC 27809.

Cette expérience montre l'efficacité de chacune des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar à inhiber la croissance de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique, dont notamment la souche Gordonia amarae ATCC 27809.

II. Exemple 2 : Évaluation de l'effet de la lyophilisation sur l'activité des lysines

L'effet de la lyophilisation sur l'activité lytique des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar a été testé.

L'activité lytique des différentes enzymes Gter, Av-I et Nfar ainsi que d'un mélange de ces trois enzymes (dénommé « mix lysines ») a ainsi été testée sur la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux, avant (figure 1) et après (figure 2) lyophilisation desdites enzymes.

L'activité lytique des enzymes a été déterminée comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1. Les résultats sont présentés sur les figures 1 et 2.

Comme le montrent les figures 1 et 2, la lyophilisation des lysines n'a pas d'impact sur l'activité lytique des différentes enzymes.

Cette expérience démontre que l'activité lytique des enzymes Gter, Av-I et Nfar a été conservée après lyophilisation de celles-ci.

III. Exemple 3 : Effet de la dose du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar (« mix lysines ») sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809

Différentes doses (100, 200 et 300 μl) du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, ont été testées sur la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809 isolée à partir de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux. L'efficacité d'inhibition de la croissance a été mesurée.

Dans les témoins négatifs correspondants, les enzymes ont été remplacées par de la BSA (Sérum Albumine Bovine). La cinétique de croissance de la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809 a été déterminée par mesure au spectrophotomètre de la densité optique à 600 nm (DOβoo) sur 8 jours.

Les résultats sont présentés sur la figure 3.

Comme le montre la figure 3, dès l'application d'une dose de 200 μl du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, la croissance de la bactérie filamenteuse Gordonia amarae ATCC 27809 est totalement inhibée.

Cette expérience confirme l'efficacité des enzymes Gter, Av-I et Nfar à inhiber la croissance de bactéries filamenteuses impliquées dans le moussage biologique.

IV. Exemple 4 : Évaluation de la spécificité du mélanges (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar,

L'activité lytique du mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar a été étudiée sur des micro-organismes utiles à l'épuration, incluant deux micro-organismes modèles : Escherichia coli (Bactérie Gram négatif) et Bacillus subtilis (Bactérie Gram positif). L'expérience contrôle a été effectuée sur la souche Gordonia amarae ATCC 27809.

Les bactéries ont été incubées avec le mélange « mix lysines » pendant 7 ou 13 jours.

Dans les témoins négatifs correspondants, les enzymes ont été remplacées par de la BSA (Sérum Albumine Bovine).

La cinétique de croissance des différentes bactéries a été déterminée par mesure au spectrophotomètre de la densité optique à 600 nm (DOβoo) sur 7 ou 13 jours.

Les résultats sont présentés sur les figures 4 à 6.

Comme le montrent les figures 4 à 6, l'addition du « mix lysines » au moment de l'inoculation des cultures des différentes souches pures bactériennes montre que si le « mix lysines » inhibe efficacement la croissance de la souche G. amarae 27809 même après 7 jours d'incubation avec ledit « mix lysines », celui-ci n'a aucun impact sur la croissance des bactéries Bacillus subtilis et E. coli et ceci même après 7 ou 13 jours d'incubation.

Ces essais démontrent bien que l'action des lysines est spécifique des bactéries filamenteuses, notamment impliquées dans le moussage biologique. Les enzymes Gter, Av-I et Nfar présentent l'avantage de ne pas avoir d'effet néfaste sur d'autres micro-organismes, notamment sur la biomasse utile au traitement de l'eau.

V. Exemple 5 : Évaluation du mode d'action du mélange « mix lysines » des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar

V.l Inhibition de la croissance

Comme le montre la figure 6, le mélange (« mix lysines ») des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar a un effet inhibiteur de la croissance de la souche Gordonia amarae ATCC 27809 lorsqu'il est ajouté au début de la phase de croissance bactérienne et ceci même après 7 jours d'incubation.

V.2 Dégradation de la membrane des filaments

L'effet du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, (« mix lysines ») sur l'intégrité des membranes bactériennes appartenant à la souche Gordonia amarae ATCC 27809 a été étudié à l'aide du kit « LIVE/DEAD® Bacterial Viability Kit » ( BacLight™) de chez Molecular Probes selon les recommandations du fournisseur, combiné à une observation et un dénombrement au microscope.

Ce kit « LIVE/DEAD® Bacterial Viability Kit » génère un marquage différentiel qui permet de distinguer des micro -organismes présentant des membranes intègres de ceux dont les membranes sont dégradées.

lOOμL de milieu réactionnel (cf. tableau 1 de l'exemple 1) sont dilués au 1/10 dans du tampon. 3μL de solution de marquage Baclight sont ajoutés à ce mélange et après 15min d'incubation, 5μL sont placés entre lame et lamelles. L'observation se fait au microscope à épifluorescence à un grossissement x 1000. Pour chaque échantillon, les dénombrements des cellules sont effectués sur 20 champs microscopiques puis ramenés au volume initial de mousses ou de culture.

Les dénombrements ont ainsi été effectués sur des tubes test et témoin à TO, T+30min, T+90min et T+26h (1595min).

Les membranes des bactéries appartenant à la souche Gordonia amarae ATCC 27809 ont été observées 30 minutes (t30), 95 minutes (t95) et 1595 minutes (tl595) après l'addition (figure 8) ou non (figure 7) du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar, « mix lysines » aux bactéries.

Les résultats sont représentés sur les figures 7 et 8.

Comme le montrent les figures 7 et 8, dès 30 minutes d'incubation avec le "mix lysine", les proportions de bactéries présentant une membrane dégradée (par rapport au témoin sans lysines) sont très importantes. Ces résultats indiquent que les lysines Gter, Av-I et Nfar dégradent la membrane de bactéries filamenteuses, en particulier appartenant à la souche Gordonia amarae ATCC 27809.

VI. Exemple 6 : Évaluation de l'efficacité des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar et du mélange de ces trois enzymes « mix lysines », sur différents échantillons de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux

VLl Essais réalisés avec des mousses biologiques diluées prélevées en station de traitement d'eaux et des lysines non lyophilisées

L'activité lytique des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar et du mélange de ces trois enzymes « mix lysines », a été testée sur différents échantillons de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux. L'ensemble de ces différents échantillons de mousses biologiques comprend des bactéries appartenant au genre Nocardia et Gordonia à des concentrations variables. Certains de ces échantillons de mousses biologiques comprennent en outre des bactéries appartenant au genre Microthrix.

La présence relative des bactéries appartenant aux genres Nocardia, Gordonia et Microthrix dans ces différents échantillons de mousses biologiques est indiquée dans le tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3 : présence relative des bactéries appartenant au genre Nocardia, Gordonia et Microthrix dans les différents échantillons de mousses biologiques testés. (-) absence de bactéries ; (+) présence faible de bactéries ; (+++) présence importante de bactéries. Les tests ont été réalisés en parallèle avec comme témoin positif les bactéries appartenant à la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809.

Les échantillons de mousses biologiques (1 à 4) ont été dilués au 1/100 et incubés avec 100 μl d'enzymes Gter, Av-I ou Nfar ou du mélange de ces trois enzymes « mix lysines » pendant 90 minutes.

La cinétique de lyse des bactéries présentes dans les échantillons de mousses biologiques ou celle des bactéries appartenant à la souche pure Gordonia amarae ATCC 27809 a été déterminée par mesure au spectrophotomètre de la densité optique à 600 nm (DOβoo) sur 90 minutes. Cette mesure a été effectuée avec un spectrophotomètre UV-visible dans des cuves jetables dont le trajet optique est de 10 mm. Les conditions de réalisation des mesures sont exposées dans le tableau 4.

Tableau 4 : Composition des milieux réactionnels pour évaluation de l'activité des lysines

Les résultats sont présentés sur les figures 9 à 12.

Comme le montrent les figures 9 à 12, les trois lysines Gter, Av-I et Nfar ainsi que le mélange de ces trois enzymes lysent efficacement les bactéries présentes dans les différentes mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux.

L'utilisation du mélange des trois lysines en simultané (« mix lysines ») met en évidence une activité qui se rapproche de la moyenne des activités individuelles observées.

VI.2 Essais réalisées avec des mousses biologiques non diluées prélevées en station de traitement d'eaux et des lysines lyophilisées

L'activité lytique du mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar (« mix lysines ») sous forme lyophilisée a été testée sur des échantillons d'un type de mousses biologiques (mousse 5) prélevées en station de traitement d'eaux. La présence relative des bactéries appartenant au genre Nocardia, Gordonia et Microthrix dans ce type de mousses biologiques est indiquée dans le tableau 5 ci-dessous :

Tableau 5 : présence relative des bactéries appartenant au genre Nocardia, Gordonia et Microthrix dans les différents échantillons de mousses biologiques testés. (-) absence de bactéries ; (++++++) présence très importante de bactéries.

L'effet des lysines a été évalué par observation de la morphologie des filaments après incubation avec des échantillons d'un type de mousses biologiques (mousse 5) prélevées en station de traitement d'eaux avec le mélange des trois enzymes (« mix lysines ») sous forme lyophilisée et marquage « Baclight » (marquage différentiel qui permet de distinguer des micro-organismes présentant des membranes intègres de celles dont les membranes sont dégradées) combiné à une observation au microscope.

Les résultats après 180 minutes d'incubation sans ou avec le « mix lysines » sont représentés respectivement sur les figures 13A et 13B.

Sur les figures 13A et 13B, la couleur verte apparaît relativement blanche et les couleurs jaune-orangé et rouge apparaissent en gris.

Après 180 minutes d'incubation avec le « mix lysines », la couleur verte disparaît et des zones colorées en jaune et rouge apparaissent de manière discontinue sur la longueur des filaments, indiquant que le mélange des trois enzymes Gter, Av-I et Nfar (« mix lysines ») sous la forme lyophilisée dégrade efficacement la membrane des bactéries filamenteuses présentes dans les échantillons de mousses biologiques prélevées en station de traitement d'eaux.

Ces résultats indiquent que les enzymes Gter, Av- 1 et Nfar ainsi que le mélange de ces trois enzymes « mix lysines » permet de lutter efficacement contre des bactéries filamenteuses responsables du moussage biologique en inhibant leur croissance et en dégradant leur membrane.