L'invention se place dans le domaine de la surveillance de la qualité de l'environnement, en particulier dans l'étude de la qualité des sols, et plus particulièrement encore dans la gestion des déchets et des eaux usées, notamment au sein d'unités de traitement de boues par procédés anaérobies (méthanisation par exemple), dans le cadre de l'exploitation des stations d'épuration biologiques, mais également dans le domaine de la santé. L'invention concerne un kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon, ainsi que l'utilisation dudit kit pour identifier, caractériser et quantifier par détection unique les groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon. L'identification de la nature des composés organiques dissous (généralement regroupés sous le terme intég ratif de Carbone Organique Dissous, COD) est limitée à une semi-spéciation permettant de déterminer la teneur en composés hydrophiles et hydrophobes (séparation sur résines macroporeuses par filtration de gel puis par ultrafiltration), à estimer un indice d'humification ou, dans le meilleur des cas, en différentes fractions réalisées par extractions séquentielles sur résines ioniques ou non ioniques permettant de définir des teneurs en composés plus ou moins biodisponibles suivant les extradants utilisés.

En aval de ces étapes d'extraction, une caractérisation des groupements fonctionnels est parfois réalisée par analyse spectrale dans le domaine du proche infrarouge (PIR), par Résonance Magnétique Nucléaire du carbone (RMN-C ¹³ ) ou par Pyrolyse couplée à la Chromatographie en phase Gazeuse et détection par Spectrométrie de Masse (Pyr-CG-SM.).

La fonction carboxylique peut être estimée par la quantification séparée des acides aliphatiques à chaîne carbonée courte (acides formique, lactique, pyruvique, propionique, succinique, glycérique et citrique) par chromatographie ionique ou chromatographie liquide généralement couplée à un détecteur conductimétrique ou spectrophotométrique UV-visible. La chromatographie liquide (HPLC) peut également être couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse (LC/MS). La chromatographie en phase gazeuse (GC) a également été appliquée, couplée à des détecteurs à ionisation de flamme ou à des spectromètres de masse, les acides carboxyliques étant quantifiés après une étape de dérivation et une étape d'extraction liquide-liquide ou solide-liquide. On peut également citer des couplages plus complexes de type GC/EI- MS (Spectrométrie de masse à impact d'électron), CG/CI-MS (spectrométrie de masse avec ionisation chimique) avec quantification après micro-extraction en phase solide.

Plus récemment, les acides carboxyliques ont été analysés par électrophorèse capillaire (CE). Certaines de ces méthodes peuvent présenter des interférences sérieuses avec des cations métalliques di ou trivalent, qui peuvent être réduites par l'ajout d'EDTA avant analyse. Souza et collaborateurs (S. R. Souza et al. Journal of Chromatography A 796, 335-346, 1998.) ont comparé l'analyse de 7 acides carboxyliques principaux par chromatographie ionique (IC) et électrophorèse capillaire couplées à un détecteur UV et ont conclu que le choix de la méthode analytique dépendait du type d'échantillon analysé, la méthode IC présentant l'inconvénient de mal séparer les différents acides, la méthode CE manquant quant à elle de sensibilité.

Pour améliorer les caractéristiques analytiques de ces méthodes chromatographiques, de nombreux travaux se sont orientés vers la dérivation des acides carboxyliques, afin de former un sous-produit présentant par exemple une fluorescence très intense et permettant une quantification très sensible. Pour atteindre des rendements de dérivation suffisants, il est préalablement nécessaire de procéder à l'activation du groupement carboxylique, à l'aide de réactifs tels que carbodiimides, sels de pyridinium ou disulfites. Pour la dérivation, de nombreux composés fluorescents peuvent être utilisés. Les plus courants sont les bromoalkyles, les diazométhanes, les hydrazines, et les aminés.

La fonction thiol est contenue dans de nombreux composés soufrés d'importance biologique ou écologique, tels que glutathion, phytochélatines, cystéine, glycine... Ces composés sont très souvent produits par des plantes ou du phytoplancton suite à un stress induit par la présence de micropolluants métalliques et/ou organiques. Kawakami et collaborateurs (S. K. Kawakami et al. Trends in Analytical Chemistry, 25, 2, 133-142, 2006). ont effectué une revue des principales méthodes de détection des thiols dans différentes matrices biologiques ou environnementales. Les thiols peuvent être dosés directement par différentes méthodes électrochimiques : polarographie, voltamétrie ou bien ampérométrie. Ces méthodes présentent cependant des inconvénients de sélectivité et d'interférences de matrices. Plus classiquement, les thiols sont généralement dosés indirectement après dérivation et séparation par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire avec détection par spectrométrie UV visible ou spectrométrie de masse. Lock et Davis (J. Lock, J. Davis Trends in Analytical Chemistry, 21 , 12, 807-815, 2002) ont publié une revue des différents agents de dérivation principalement utilisés pour le dosage des thiols : haloacétamide, maleimides, benzoxadizoles, isoindoles.

Le dosage de la fonction aminé est généralement effectué par séparation des composés aminés par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire après dérivation. A. Ônal (A. Ônal Food Chemistry 103, 1475-1486, 2007.) a récemment publié une revue bibliographique détaillant les différentes méthodes de dosages des aminés d'intérêt biologique. On peut y relever que la dérivation des aminés est principalement réalisée par 4 composés : o-phthalaldéhyde (OPA), dansylchloride (DNS), 4-chloro-7-nitrobenzofurazan ou 1 ,2-naphtoquinone-4-sulfonate. La détection est assurée par un détecteur UV-visible ou fluorimétrique. Il n'existe que quelques méthodes dans lesquelles l'étape de dérivation préalable n'est pas utilisée, la séparation étant assurée par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire, et la détection par conductimétrie, enzymologie ou ampérométrie. La méthode la plus utilisée reste cependant la séparation des dérivés de l'OPA. L ¹ OPA réagit avec les aminés primaires en présence d'un composé thiol, en milieu tamponné par le borate. Des recherches récentes ont été menées afin de déterminer quel composé thiol donne des dérivés stables, ou bien encore pour synthétiser des réactifs réagissant avec les aminés et formant des dérivés plus absorbants ou plus fluorescents. Cependant, nombre de ces composés nouvellement synthétisés ne sont pas commerciaux.

On constate donc que la plupart des méthodes de quantification des composés carboxyliques, thiols ou aminés passent par une étape de séparation chromatographique ou électrophorétique. Ceci induit des temps d'analyse relativement long (10 à 30 minutes suivant les méthodes). D'autre part, ces méthodes utilisent un matériel assez complexe d'utilisation et ne pouvant être mis en œuvre qu'en laboratoire.

Il existe donc un besoin en méthodes d'identification, de caractérisation et de quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon simples, rapides, peu coûteuses et surtout utilisables sur le terrain sans avoir besoin de mettre en oeuvre des équipements lourds et coûteux.

C'est un des buts de l'invention. Ainsi l'invention a pour objet un kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon, comprenant a. au moins un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques ; b. au moins une aminé primaire fluorescente, c. au moins un solvant d'extraction ; d. au moins un composé de la famille des dialdéhydes ; e. au moins une aminé non fluorescente ; f. au moins un tampon modulateur de pH ; g. au moins un thiol non fluorescent. Le kit selon l'invention ne nécessite qu'un investissement raisonnable au niveau de l'appareillage pour sa mise en œuvre qui est simple et facilement réalisable sur site.

La mise en œuvre dudit kit, bien que ne permettant pas une quantification séparée de tous les composés carboxyliques, aminés ou thiols contenus dans l'échantillon, permet la quantification globale des groupements fonctionnels visés (concentration totale en thiols et concentration totale en aminés, concentration totale en acides carboxyliques aliphatiques : Acides Gras Volatils = AGV) et donne en quelques minutes une indication fiable sur la qualité d'une eau, d'un sol ou d'un déchet, ou bien encore l'état de fonctionnement d'un procédé de traitement.

Selon l'invention, l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques peut être choisi parmi les carbodiimides, comme par exemple le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) ou le 1- cyclohexy!-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide métho-para-toluène sulfonate (CMC), ou encore le N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), le Bis(triméthylsilyl)carbodiimide (BTSC), et préférentiellement de l'EDC ou du CMC, très préférentiellement de l'EDC.

Selon une variante de l'invention, le kit peut comprendre en outre au moins un agent activateur secondaire, activateur des carbodiimides, eux-mêmes activateurs des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques, qui peuvent être choisis parmi la NHS (N-hydroxysuccinimide) ou du 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) ou du tétrafluorophénol (TTP), préférentiellement de l'HOBT.

Selon l'invention, l'aminé primaire fluorescente peut être un composé de la famille des benzofurazanes, ou de la famille des aminophénanthrènes, ou de la famille des coumarines, ou de la famille des dérivés "dansyles", du N-1- éthylènediaminonaphthalène (EDAN), ou de la 5-aminofluorescéine (5-AF) ₁ ou de la monodansylcadavérine (MDC) ou du chlorure de bleu du Nil (NBCI), préférentiellement de I ¹ EDAN.

Selon l'invention, le solvant d'extraction de l'aminé primaire fluorescente peut être ^• un solvant organique, non miscible à l'eau, comme par exemple du méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), de l'acétate d'éthyle, du cyclohexane ou encore du dichlorométhane, préférentiellement du MTBE. Selon l'invention le composé de la famille des dialdéhydes peut par exemple être de l'ophthaldialdéhyde (OPA) ou du naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA)), préférentiellement de l'OPA.

Toujours selon l'invention, l'aminé non fluorescente peut être du 2-aminoéthanol, de la glycine, de la valine, de la leucine, de la butylamine, de la tert-butylamine ou bien encore de la N-ε-acetyl-L-lysine, préférentiellement du 2-aminoéthanol.

Selon encore l'invention, le modulateur de pH peut être un tampon borate, un tampon phosphate, un tampon citrate, un tampon organique comme l'HEPES (acide 1- Piperazineethane sulfonique) ou encore un tampon TRIS (tris(hydroxymethyl)aminoéthane), préférentiellement un tampon borate pour la détermination des thiols et des aminés et un tampon phosphate pour la détermination des acides carboxyliques.

Toujours selon l'invention, le thiol non fluorescent peut être choisi parmi de nombreux composés thiols tels que le glutathion, l'acide mercaptoacétique, la cystéine, l'acide mercaptoéthanesulfonique, le 2-mercaptoéthanol, l'acide 3- mercaptopropionique, l'acide 2-mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, de la N-acétyl-cystéine (NAC), le méthanethiol, le monothioglycérol, l'acide thioglycolique, des sels de sulfites ou encore des sels de thiosulfates, préférentiellement le mercaptoéthanol. Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre au moins un agent réducteur, pouvant être avantageusement choisi parmi les composés de la famille des hydrazines, des hydrures, des thiols comme par exemple le dithioérythritol (DTE) ou le dithiothritol (DDT), ou des trialkylphosphines dont la tri-n-butylphosphine (TBP) ou encore de l'hydrochlorure de tris-2-carboxyéthyl-phosphine (TCEP), préférentiellement de la tri-n-butylphosphine.

Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un tampon de dissolution de l'échantillon à tester, ledit tampon ayant un pH pouvant être compris entre 3,5 et 5,5, préférentiellement entre 4,0 et 5,0, très préférentiellement 4,5.

Selon une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un acide comme par exemple de l'acide chlorhydrique (HCI).

Selon encore une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un solvant organique, non miscible à l'eau, comme par exemple du méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), de l'acétate d'éthyle, du cyclohexane ou encore du dichlorométhane, préférentiellement du MTBE. Selon encore une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre une base inorganique, comme de la soude (NaOH). Selon encore une autre variante de l'invention, le kit peut en outre comprendre un activateur de fluorescence comme un tensioactif (ou surfactant) ou un composé de la famille des cyclodextrines, préférentiellement un tensioactif, à une concentration comprise entre 100 et 120% de sa CMC (Concentration Micellaire Critique), et très préférentiellement 100% de la CMC.

Selon une autre variante de l'invention, le kit peut également comprendre un agent actif halogène, qui peut être de l'hypochlorite de sodium, de la N-chlorosuccinimide ou bien encore un composé de la famille des chloramines.

Le kit selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes souhaitées compatibles avec une commercialisation. Avantageusement il pourra se présenter sous la forme d'une plaque multialvéolaire, chaque alvéole comprenant une quantité suffisante de chacun des éléments nécessaires à l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon tels que décrits précédemment. Selon cette variante, chaque alvéole peut contenir les éléments nécessaires à l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon en quantité suffisante pour une analyse. Selon encore cette variante les éléments nécessaires pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon peuvent être sous forme liquide et alors la plaque pourra être munie de moyen de fermeture des alvéoles, ou encore sous forme lyophilisée.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un kit tel que décrit précédemment, pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon.

Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques, peut être mis en œuvre dans un procédé pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels carboxyliques (par ailleurs dans le texte dénommé procédé de détermination des groupements carboxyliques) dans lequel a. dans une première étape on mélange un échantillon à analyser préalablement prélevé, avec une solution de dissolution dudit échantillon à tester préalablement préparée par mélange d'au moins un tampon, un agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques et un agent activateur secondaire, et on incube ce mélange pendant un temps compris entre 4 et 8 minutes, préférentiellement entre 5 et 7 minutes ; b. dans une seconde étape on ajoute au mélange obtenu à la première étape une aminé primaire fluorescente dissoute dans de l'eau ultrapure ; c. dans une troisième étape on ajoute une base inorganique, pour obtenir un pH compris entre 5,5 et 11 préférentiellement entre 8,0 et 8,5, on agite et on incube ce mélange pendant un temps compris entre 2 et 6 minutes, préférentiellement entre 3 et 5 minutes ; d. dans une quatrième étape, on ajoute au mélange obtenu à la troisième étape un acide pour obtenir un pH compris entre 1 ,0 et 7,0, préférentiellement entre

4,5 et 5,0, très préférentiellement un pH de 4,8 et un solvant organique, on agite puis on laisse décanter jusqu'à obtention de la séparation des phases organiques et aqueuses ; e. dans une cinquième étape on prélève la phase organique obtenue à la quatrième étape et on lui ajoute un tampon pouvant avoir un pH compris entre

4 et 6, préférentiellement entre 4,5 et 5,5 ; f. dans une sixième étape on mesure la fluorescence de la phase organique obtenue à la cinquième étape, après excitation à une longueur d'onde de 335 nm, et mesure de l'émission induite à une longueur d'onde de 396 nm ; g. dans une septième étape on reporte la valeur obtenue à la sixième étape sur une courbe étalon préalablement établie dans les mêmes conditions. Selon l'invention, à la première étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, le tampon de la solution de dissolution de l'échantillon à tester peut être un tampon phosphate à une concentration qui peut être comprise entre 40 mM et 60 mM, préférentiellement entre 45 mM et 55 mM, très préférentiellement 50 mM.

Toujours à la première étape dudit procédé, la solution de dissolution de l'échantillon à tester peut avoir un pH compris entre 2 et 6, préférentiellement entre 4,0 et 5,0, très préférentiellement 4,5. Toujours à la première étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques peut être choisi parmi les composés de la famille des carbodiimides, avantageusement parmi le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)- carbodiimide (EDC) ou le 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)carbodiimide métho-para- toluène sulfonate (CMC), ou encore le N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), du N ₁ N'- Diisopropylcarbodiimide (DIC), le Bis(triméthylsilyl)carbodiimide (BTSC). Préférentiellement l'agent activateur primaire des carbones porteurs des groupements fonctionnels carboxyliques pourra être de l'EDC ou du CMC, très préférentiellement de I ¹ EDC.

Selon l'invention, toujours à ladite première étape, l'agent activateur secondaire de l'agent activateur primaire décrit précédemment, peut être choisi parmi la NHS (N- hydroxysuccinimide) ou la 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) ou le tétrafluorophénol (TTP), préférentiellement de l'HOBT.

Selon l'invention, à la seconde étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'aminé primaire fluorescente peut être à une concentration comprise entre 0 et 6 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 0,05 et 2 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 0,5 mg par ml d'échantillon à analyser, avantageusement mélangé à l'échantillon liquide, à un pH compris entre 5,5 et 11 ,0, préférentiellement entre 8,0 et 9,0, très préférentiellement 8,5. Selon l'invention, toujours à la seconde étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'aminé primaire fluorescente peut être un composé de la famille des benzofurazanes, ou de la famille des aminophénanthrènes, ou de la famille des coumarines, ou de la famille des dérivés "dansyles", du N-1- éthylènediaminonaphthalene (EDAN), ou de la 5-aminofluorescéine (5-AF), ou de la monodansylcadaverine (MDC) ou du chlorure de bleu du Nil (NBCI), préférentiellement de IΕDAN. Ladite aminé primaire fluorescente peut être à une concentration comprise entre 0 et 6 mg par ml d'échantillon à analyser, préférentiellement entre 0,05 et 2 mg par ml d'échantillon à analyser, très préférentiellement 0,5 mg par ml d'échantillon à analyser, avantageusement en solution à un pH compris entre 5,5 et 11 ,0, préférentiellement entre 8,0 et 9,0, très préférentiellement 8,5.

Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, la base inorganique dont l'utilisation a pour objet de faire varier le pH pour obtenir un pH pouvant être compris entre 7 et 9, préférentiellement entre 8,0 et 8,5, peut être de la soude (NaOH), de la potasse (KOH) ou tout autre hydroxyde alcalin ou alcalinoterreux, préférentiellement de la soude.

Selon l'invention, à la quatrième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'acide peut être un acide inorganique, préférentiellement de l'acide chlorhydrique (HCI).

Toujours à la quatrième étape, le solvant organique peut être du méthyl-tertiobutyl éther (MTBE), de l'acétate d'éthyle, du cyclohexane ou encore du dichlorométhane, préférentiellement du MTBE. Selon une variante de l'invention, la cinquième étape de prélèvement de la phase organique peut être omise et une lecture directe sur l'échantillon obtenue à la quatrième étape de la fluorescence de cette phase peut être réalisée.

Selon l'invention, à la septième étape du procédé de détermination des groupements carboxyliques, l'acide carboxylique de référence peut être choisi parmi tout acide monocarboxylique, comme par exemple l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide formique, l'acide lactique, l'acide p-hydroxybenzoique, préférentiellement l'acide acétique.

Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels thiols (par ailleurs procédé de détections des thiols) peut être mis en oeuvre dans un procédé dans lequel a. dans une première étape on mélange un échantillon préalablement prélevé, avec un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, comme la naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou l'o-phthaldialdéhyde (OPA) et une aminé non fluorescente, préférentiellement le 2-aminoéthanol, préalablement dissous dans un solvant mixte (solvant organique/eau), à pH compris entre 6 et 11 , préférentiellement entre 8 et 9,5, très préférentiellement entre 8,5 et 9,5, ; b. dans une deuxième étape on mesure la fluorescence du mélange obtenu à la première étape après excitation à une longueur d'onde de 335 nm, et mesure à une longueur d'onde de 450 nm pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels monothiols ; c. Dans une troisième étape on reporte les valeurs obtenues à la troisième étape sur des courbes étalons préalablement établies dans les mêmes conditions avec un composé porteur de groupements thiols de référence.

Selon l'invention, à la première étape du procédé de détection des thiols, le composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes, peut être le naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde (NDA) ou l'o-phthaldialdéhyde (OPA), préférentiellement l'OPA. De même à cette première étape, l'aminé non fluorescente peut être du 2- aminoéthanol, de la glycine, de la valine, de la leucine, de la butylamine, de la tert- butylamine ou bien encore de la N-ε-acétyl-L-lysine, préférentiellement du 2- aminoéthanol.

Toujours à cette première étape, le solvant organique constituant le solvant mixte (solvant organique/eau) est avantageusement choisi parmi tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol. Les proportions entre le solvant organique et l'eau n'ont que peu d'importance, cependant avantageusement selon l'invention le solvant mixte (solvant organique/eau), est préférentiellement dans des proportions 75/25, très préférentiellement dans des proportions 50/50.

Selon une variante de l'invention, à la première étape du procédé de détection des thiols on peut ajouter un agent réducteur choisi parmi les composés de la famille des hydrazines, des hydrures, des thiols comme par exemple le dithioérythritol (DTE) ou le dithiothritol (DDT), ou des trialkylphosphines dont la tri-n-butylphosphine (TBP) ou encore de l'hydrochlorure de tris-2-carboxyéthyl-phosphine (TCEP), préférentiellement la tri-n-butylphosphine avantageusement dissout dans tout solvant organique miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol, et un solvant organique non miscible à l'eau, préférentiellement du dichlorométhane, afin de réduire les composés thiols oxydés en composés monothiols.

A la deuxième étape du procédé de détection des thiols, on mesure la fluorescence de la phase aqueuse obtenue à la première étape après excitation à une longueur d'onde de 335 nm, et mesure à une longueur d'onde de 450 nm pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels thiols totaux.

Selon une variante de l'invention, à la deuxième étape du procédé de détection des thiols, on peut ajouter un activateur de fluorescence comme un tensioactif (ou surfactant) ou un composé de la famille des cyclodextrines, préférentiellement un tensioactif, et très préférentiellement le BRIJ, à une concentration comprise entre 100 et 120% de sa CMC (Concentration Micellaire Critique), et très préférentiellement 100% de sa CMC.

Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détection des thiols, le composé porteur de groupements thiols de référence peut être choisi parmi l'acide mercaptoacétique, la cystéine, l'acide mercaptoéthanesulfonique, le 2-mercaptoéthanol, l'acide 3-mercaptopropionique, le glutathion, l'acide 2mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le méthanethiol, la monothioglycérol, l'acide thioglycolique, préférentiellement le glutathion ou la cystéine, et très préférentiellement la cystéine. Selon l'invention, le kit pour l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique des groupements fonctionnels aminés (par ailleurs procédé de détection des aminés) peut être mis en œuvre dans un procédé dans lequel : a. dans une première étape on mélange un échantillon préalablement prélevé, avec un composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes et un composé thiol non fluorescent tel que le mercaptoéthanol, la N-acétyl- cystéine (NAC), ou encore l'acide 3-mercapto propionique, ledit composé thiol étant préalablement dissous en solution à pH compris entre 6 et 11 , préférentiellement entre 9 et 10,5, dans un solvant aqueux ou dans un solvant mixte solvant organique/eau ; b. dans une deuxième étape, on mesure la fluorescence du mélange obtenu à la première étape après excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et

340 nm, et on mesure à une longueur d'onde comprise entre 430 et 460 nm pour l'identification, la caractérisation et la quantification des groupements fonctionnels aminés ; c. dans une troisième étape, on reporte les valeurs obtenues à la deuxième étape sur des courbes étalons préalablement établies dans les mêmes conditions avec un composé porteur de groupements aminés de référence. Selon l'invention, à la première étape du procédé de détection des aminés, le composé choisi parmi les membres de la famille des dialdéhydes peut être le naphthalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) ou Po-phthaldialdéhye (OPA), préférentiellement l'OPA.

Toujours à cette première étape le composé thiol non fluorescent peut être choisi parmi de nombreux composés thiols tels que le mercaptoéthanol, la N-acétyl-cystéine (NAC), ou encore l'acide 3-mercaptopropionique, préférentiellement le 2-mercaptoéthanol. Toujours à cette première étape, le solvant mixte solvant organique/eau est avantageusement constitué d'un solvant organique totalement miscible à l'eau, préférentiellement du méthanol.

Selon l'invention, à la troisième étape du procédé de détection des aminés, le composé porteur de groupements aminés de référence peut être choisi parmi des aminés primaires, des aminés secondaires, des aminés tertiaires ou des acides aminés, préférentiellement l'aminoéthanol, la glycine ou la butylamine et très préférentiellement la glycine.

Selon une variante de l'invention, à la première étape du procédé de détection des aminés, on peut ajouter un agent actif halogène, qui peut être de l'hypochlorite de sodium, de la N-chlorosuccinimide ou bien encore un composé de la famille des chloramines, préférentiellement de l'hypochlorite de sodium, afin de transformer les aminés secondaires et tertiaires en aminés primaires.

Selon l'invention, la mesure de la fluorescence qui intervient en fin de procédure d'analyse peut être réalisée sur tout spectrophotomètre à fluorescence, particulièrement sur un lecteur de microplaques tel celui de marque PERKIN ELMER. Selon l'invention, l'échantillon peut être un échantillon de déchets ou d'eaux usées ou de sols, ou de boues issues d'une unité de traitement de boues par méthanisation, avantageusement dans les procédés anaérobies, un échantillon issu de l'exploitation des stations d'épuration biologiques, ou encore un échantillon issu du domaine de la santé (fluides biologiques tels que des urines, du sang, des échantillons salivaires, de la sueur, ...).

On comprend bien entendu que l'un des intérêts du kit selon l'invention est qu'il permet de réaliser dans le même temps l'identification, la caractérisation et la quantification par détection unique (fluorescence sur microplaque) des groupements fonctionnels carboxyliques, thiols et aminés contenus dans un échantillon.

La Figure 1 présente une courbe étalon établie avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 0,5 et 10 mg/L. La figure présente l'intensité de la fluorescence mesurée à 396 nm après excitation à 335 nm en fonction de la concentration en acide acétique. La Figure 2 présente la parfaite corrélation entre les mesures réalisées à l'aide du kit selon l'invention et les mesures réalisées selon la méthode standard (détermination de ces acides carboxyliques par HPLC/MS).

La Figure 3 présente une courbe étalon établie avec de la cystéine à des concentrations comprises entre 0,02 et 1 ,6 mg/l. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1

On réalise une extraction à l'eau tamponnée à pH 4,5 (tampon phosphate 50 mM) de boues de station d'épuration prélevées à différentes étapes de la méthanisation. A 1 mL de l'extrait précédent on ajoute 3 mg de HOBT à pH compris entre 3,5 et 4 et 3 mg d'EDC.

Après agitation, on incube le mélange pendant 6 minutes, puis on ajoute 100 μL d'un mélange constitué de 3 mg d'EDAN, 550 μL d'un tampon phosphate pH 5, 50 μL d'HCI 1 M et 600 μL de CH ₂ CI ₂ . On ajoute alors au mélange précédemment obtenu de la soude 1M jusqu'à obtention d'un pH autour de 8,5 et on incube pendant 4 min, et on ajoute de l'acide chlorhydrique 1M jusqu'à obtention d'un pH autour de 4,5-5. On ajoute alors 900 μL de MTBE. Après agitation et décantation, on prélève 600 μL de la phase organique et on lui ajoute 600 μL d'un tampon phosphate à pH 5. Après agitation et décantation, on mesure la fluorescence de la phase organique par excitation à une longueur d'onde de 335 nm et mesure à une longueur d'onde de 396 nm. Parallèlement, une courbe de référence est réalisée dans les mêmes conditions que celles auxquelles l'échantillon a été soumis avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 0,5 et 50 mg/l. Cette courbe étalon est présentée à la Figure 1. L'intensité de fluorescence de l'échantillon traité comme indiqué précédemment mesurée est divisée par 25 pour la gamme 0,5-50 mg/L. Il est possible de doser des échantillons présentant des concentrations en acides carboxyliques plus élevées en appliquant une dilution plus importante.

La valeur de cette intensité est ensuite reportée sur la courbe étalon (Figure 1) ; il est alors possible d'exprimer le résultat de cette analyse en équivalent acide acétique et donc de déterminer le nombre d'équivalents acide acétique dans l'échantillon. Exemple 2

On réalise une extraction à l'eau tamponnée à pH 4,5 (tampon phosphate 50 mM) de différentes natures de sols. A 1 mL de l'extrait précédent on ajoute 3 mg de HOBT à pH compris entre 3,5 et 4 et 3 mg d'EDC.

Après agitation, on incube le mélange pendant 6 minutes, puis on ajoute 100 μL d'un mélange constitué de 3 mg d'EDAN, 550 μL d'un tampon phosphate pH 5, 50 μL d'HCI 1M et 600 μL de CH ₂ CI ₂ . On ajoute alors au mélange précédemment obtenu de la soude 1M jusqu'à obtention d'un pH autour de 8,5 et on incube pendant 4 min, et on ajoute de l'acide chlorhydrique 1M jusqu'à obtention d'un pH autour de 4,5-5. On ajoute alors 900 μL de MTBE. Après agitation et décantation, on prélève 600 μL de la phase organique et on lui ajoute 600 μL d'un tampon phosphate à pH 5. Après agitation et décantation, on mesure la fluorescence de la phase organique par excitation à une longueur d'onde de 335 nm et mesure à une longueur d'onde de 396 nm.

Parallèlement, une courbe de référence est réalisée dans les mêmes conditions que celles auxquelles l'échantillon a été soumis avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 0,5 et 50 mg/l. Cette courbe étalon est présentée à la Figure 1.

L'intensité de fluorescence de l'échantillon traité comme indiqué précédemment- mesurée est divisée par 25 pour la gamme 0,5-50 mg/L. Il est possible de doser des échantillons présentant des concentrations en acides carboxyliques plus élevées en appliquant une dilution plus importante. La valeur de cette intensité est ensuite reportée sur la courbe étalon (Figure 1) ; il est alors possible d'exprimer le résultat de cette analyse en équivalent acide acétique et donc de déterminer le nombre d'équivalent acide acétique dans l'échantillon.

Exemple 3 On réalise une extraction à l'eau tamponnée à pH 4,5 (tampon phosphate 50 mM) de différentes natures de composts.

A 1 mL de l'extrait précédent on ajoute 3 mg de HOBT à pH compris entre 3,5 et 4 et 3 mg d'EDC.

Après agitation, on incube le mélange pendant 6 minutes, puis on ajoute 100 μL d'un mélange constitué de 3 mg d'EDAN, 550 μL d'un tampon phosphate pH 5, 50 μL d'HCI 1 M et 600 μL de CH ₂ CI ₂ .

On ajoute alors au mélange précédemment obtenu de la soude 1 M jusqu'à obtention d'un pH autour de 8,5 et on incube pendant 4 min, et on ajoute de l'acide chlorhydrique 1 M jusqu'à obtention d'un pH autour de 4,5-5. On ajout alors 900 μL de MTBE. Après agitation et décantation, on prélève 600 μL de la phase organique et on lui ajoute 600 μL d'un tampon phosphate à pH 5. Après agitation et décantation, on mesure la fluorescence de la phase organique par excitation à une longueur d'onde de 335 nm et mesure à une longueur d'onde de 396 nm.

Parallèlement, une courbe de référence est réalisée dans les mêmes conditions que celles auxquelles l'échantillon a été soumis avec de l'acide acétique à des concentrations comprises entre 0,5 et 50 mg/l. Cette courbe étalon est présentée à la figure 1.

L'intensité de fluorescence de l'échantillon traité comme indiqué précédemment- mesurée est divisée par 25 pour la gamme 0,5-50 mg/L. Il est possible de doser des échantillons présentant des concentrations en acides carboxyliques plus élevées en appliquant une dilution plus importante.

La valeur de cette intensité est ensuite reportée sur la courbe étalon (Figure 1) ; il est alors possible d'exprimer le résultat de cette analyse en équivalent acide acétique et donc de déterminer le nombre d'équivalent acide acétique dans l'échantillon. Ces 3 exemples illustrent la capacité de la méthode développée à déterminer les teneurs en acides carboxyliques dans des matrices environnementales très variées.

La validation de la méthode a été réalisée par comparaison des résultats obtenus par le kit objet de la présente invention avec les résultats obtenus par la méthode standard (HPLC/MS) de détermination de ces acides carboxyliques (Figure 2). La figure 2 montre la parfaite corrélation entre les mesures réalisées à l'aide du kit selon l'invention et les mesures réalisées selon la méthode standard. Exemple 4

On réalise une extraction à l'eau tamponnée à pH 4,5 (tampon phosphate 50 mM) de boues de station d'épuration prélevées à différentes étapes du procédé d'épuration des eaux usées. A 1 ml_ de l'extrait précédent on ajoute 1 mL de TBP préparé à 1% dans le méthanol. Après agitation, on ajoute 2 mL de dichlorométhane et on laisse décanter la phase organique.

Après séparation des phases, on prélève 1 ,8 mL de la phase aqueuse supérieure et on y ajoute 0,1 mL d'OPA (1 ,5 mM dans un solvant mixte 99% d'eau et 1 % de méthanol) et 0,1 mL de 2-aminoéthanol (3,3 mM dans de l'eau tamponnée à pH 9,5 par du tampon borate). Après agitation et attente de 5 minutes, on mesure la fluorescence du mélange obtenu par excitation à une longueur d'onde de 335 nm et mesure à une longueur d'onde de 450 nm.

Parallèlement, une courbe de référence est réalisée dans les mêmes conditions que celles auxquelles l'échantillon a été soumis avec de la cystéine à des concentrations comprises entre 0,02 et 1 ,6 mg/l. Cette courbe étalon est présentée à la Figure 3.

L'intensité mesurée de la fluorescence de l'échantillon traité comme indiqué précédemment, est ensuite reportée sur le courbe étalon (Figure 3) ; il est alors possible d'exprimer le résultat de cette analyse en équivalent cystéine et donc de déterminer le nombre d'équivalent cystéine dans l'échantillon.