KIT E PROCESSO PARA DETECÇÃO DE IMUNOGLOBULINAS E E

IMUNOGLOBULINAS G1

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se à detecção de Imunoglobulinas E (IgE) e Imunoglobulinas G1 (lgG1 ) específicas em amostras biológicas, utilizando a técnica ELISA indireta. A presente invenção se situa no campo da medicina e farmácia, enfermagem, nutrição, biomedicina e bioengenharia, mais especificamente, a análise de material biológico.

Antecedentes da Invenção

[0002] A alergia alimentar (AA) é um problema de saúde pública que apresentou um crescimento nas últimas décadas, provavelmente devido à maior exposição da população a um número maior de alérgenos alimentares disponíveis, como também o acesso mais fácil a esses alimentos. Ela vem se tornando um problema de saúde pública em todo o mundo e está associada a um impacto negativo significativo na qualidade de vida (CHARLES et al, 201 1 ).

[0003] A AA é mais comum em crianças, estima-se uma prevalência de aproximadamente 6% a 8% em menores de três anos e de 3,5% em adultos. Esta maior prevalência na infância pode ser principalmente devido ao sistema imunológico não apresentar sua maturação completa (BATISTA; FREITAS; HAACK, 2009).

[0004] Apesar das diferenças de culinárias regionais, existem dados de prevalência mundial que responsabilizam um grupo de oito alimentos que causam de 80 a 90% das reações alérgicas, entre eles estão o leite, ovo, soja, trigo, peixes, frutos do mar, amendoim e castanhas (SAMPSON et al, 201 1 ), no Brasil o milho pode ser incluído neste grupo, por ser muito utilizado na alimentação brasileira (PALMA et al, 2009).

[0005] Estudos realizados na Inglaterra e Estados Unidos (EUA), têm demonstrado que a alergia ao amendoim dobrou na última década em crianças, e que a tolerância ocorre em 20% dos casos por volta dos 5 anos de idade. Já os adultos apresentaram mais alergia a mariscos (2%), seguido pelo amendoim (0,6%), castanha (0,5%) e peixe (0,4%). As reações alérgicas a frutas e vegetais não são consideradas severas, porém cerca de 5% da população desse estudo são alérgicas (SICHERER, 2011 ). Por volta de 35% das crianças com dermatite atópica, moderada e grave, apresentaram alergia alimentar mediada pela IgE e em de 6% à 8% das crianças asmáticas têm manifestações alérgicas induzidas por alimentos (HALKEN, 2003; BARAL; MANDAL; CHATTOPADHYAY, 2005). Além disso, a AA parece ser a causa mais importante de anafilaxia fora dos hospitais levando ao atendimento de cerca de 30 casos tratados nas emergências hospitalares a cada ano nos EUA (SAMPSON, 2005).

[0006] A identificação e a eliminação das proteínas alergênicas da dieta devem levar à resolução dos sintomas. Na criança, o alimento considerado maior responsável pela AA são as proteínas do leite de vaca (2,5%), seguido pelas proteínas do ovo (1 ,3%), amendoim (0,8%), trigo (0,4%), castanhas (0,2%), peixes (0,1 %) e mariscos (0,1 %) (SICHERER, SAMPSON, 2006), e a alergia a aditivos alimentares (corantes, conservantes, edulcorantes, espessantes, etc.) são responsáveis por menos de 1 % dos casos (GAZOLA, 2008).

[0007] Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando incrementar o diagnóstico de alergia para que seja rápido, de baixo custo e eficaz, já que a população infantil é a mais afetada, levando a um fator negativo na qualidade de vida tanto dos pacientes quando dos familiares envolvidos.

[0008] Mesmo com o avanço dos conhecimentos atuais sobre os mecanismos alérgicos, e com a variedade existente de métodos in vivo e in vitro para o diagnóstico nessa área (ASBAI, 2009), a investigação laboratorial das doenças alérgicas pode ser uma tarefa difícil tanto para médicos quanto para profissionais da área da saúde. No entanto, o diagnóstico correto da alergia alimentar é fundamental para o tratamento adequado e para que não se instituam dietas desnecessárias (CHEHADE; MAYER, 2005).

[0009] A determinação de IgE total costuma ser solicitada na investigação de alergia, porém numerosos fatores (predisposição genética, sexo, idade, infecções, poluição e tabagismo) contribuem para variação do nível sérico de IgE e devem ser considerados para a sua interpretação correta. O nível sérico de IgE total é detectado por ensaio imunoenzimático (ELISA) mostrando resultados quantitativos e é variável de acordo com a idade, sendo indetectável no neonato e atingindo concentrações máximas em adultos jovens (ASBAI, 2009).

[0010] Vale ressaltar que o nível de IgE elevado não indica a presença de doença alérgica, pois avalia apenas sua quantidade momentânea e não especifica o antígeno causador das manifestações. Os resultados elevados de IgE também podem estar associados à parasitoses intestinais ou cutâneas, mieloma, síndrome de hiper-lgE, entre outras (BOYCE et al, 2010).

[0011] Outro dado importante a ser destacado é que os testes in vitro apresentam algumas desvantagens em relação ao custo, tempo de execução e sensibilidade para alguns alérgenos. Porém são considerados a melhor alternativa para pacientes em uso de anti-histamínicos, pós-quadro de anafilaxia (até 6 semanas), quando não há disponibilidade de certos extratos em testes cutâneos, quando há risco de reações sistémicas, dentre outros (ASBAI, 2009).

[0012] Importante destacar que o teste hoje considerado padrão ouro é o teste de provocação oral (PAYOT et al, 2013), o qual consiste na oferta de alimentos em doses crescentes e em intervalos regulares, sob supervisão médica, com monitoramento das reações clínicas possíveis. Entretanto é um método invasivo, custo elevado, requer ambiente hospitalar para sua realização já que pode levar o paciente a um quadro anafilático. Outro fator a ser mencionado, é por esse método consistir da ingestão gradativa do alérgeno pelo paciente, este apresentará reações alérgicas levando a um desconforto imediato (WANG, SAMPSON, 2011 ).

[0013] Outros métodos sorológicos vêm sendo estudados no sentido de confirmar o diagnóstico de AA, já que hoje os testes encontrados são feitos com o sangue ou na pele do paciente e necessitam de vários parâmetros para um diagnóstico mais fidedigno, pois com a utilização de apenas 1 deles não se pode dar diagnóstico de alergia (SOLÉ et al, 2012).

[0014] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0015] O documento de AMADO. L. A. Saliva como espécime clínico para o estudo da hepatite A: aplicações no diagnóstico, na epidemiologia molecular e na patogênese. 2010. 148f. Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, 2010, revela a aplicabilidade das amostras de saliva para o diagnóstico da hepatite A através da detecção de anti-HAV IgM.

[0016] O documento de Liu J, Duan Y. Saliva: A mídia potencial para diagnóstico de doenças e monitoramento. Oncologia Oral. 2012; 48: 569-577, revela o diagnóstico de câncer bucal através detecção eletroquímica de proteínas salivares e ácidos nucleicos.

[0017] O documento de Oliveira S. A. et al, Diagnosis of rubella infection by detecting specific immunoglobulin M antibodies in saliva samples: a clinic based study in Niterói, RJ, Brazil. Ver Soc Bras Med Trop. 2000; 33 (4): 335- 339, revela o diagnóstico de rubéola através detecção da imunoglobulina M.

[0018] O documento de Berroterán A et al. Prevalecia de Helicobacter pylori em amostras de placa dental de um grupo de pacientes venezuelanos, mediante técnica de PCR. Acta Odontol Venez 2002; 40 (2):2002, revela o diagnóstico da infecção por Helicobacter pylori através detecção do DNA da bactéria pela técnica do PCR.

[0019] O documento de Rujner j. et al, Séricos antigliadina e IgA salivar e anticorpos anti-endomísio soro como teste de triagem para a doença celíaca, Acta Pediatr 1996; 85: 814-7, revela o diagnóstico de doença celíaca através detecção da IgA salivar gliadina.

[0020] O documento de Mortimer P. P.; Parry J. V., Detection of antibody to HIV in saliva: a brief review Clin. Diagn. Virol, Agosto 1994; 2 (4-5): 231 -43 (doi: doi:10.1016/0928-0197(94)90048-5), revela o diagnóstico de HIV através detecção da IgG salivar.

[0021] O documento de Mortimer P. P.; Parry J. V., Detection of antibody to HIV in saliva: a brief review Clin. Diagn. Virol., Agosto 1994; 2 (4-5): 231 -43 (doi: doi:10.1016/0928-0197(94)90048-5), revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE total e específico bem como IgG específico no soro de pacientes pelo ensaio imunoenzimático.

[0022] O documento de Carvalho S. et al: ImmunoCAP ISAC®:

Tecnologia microarray no estudo da alergia alimentar em contexto de reactividade cruzada. Ver. Port. Imunoalergologia 2010; 18 (4): 331 -352, revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE no soro de pacientes pelo ImmunoCAP®.

[0023] O documento de Ferrer M et al: Molecular diagnosis in

Allergology: application of the microarray tecnique. J Investig Allergol Clin Immunol 2009, 19 (1 ): 19-24, revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE no soro de pacientes pelo microarray.

[0024] O documento US201 1 195401 utiliza fluidos corporais para diagnosticar alergia alimentar por meio de um KIT chamado FIXANAL que detecta a presença de das imunoglobulinas IgE e IgG. Diferentemente desse documento, a presente invenção revela um processo para investigar a alergia alimentar, utilizando extratos brutos dos alimentos a serem investigados, por meio da técnica de ELISA, que detecta a presença de imunoglobulinas IgE e lgG1 em amostras biológicas de um paciente.

[0025] O documento RU2442980 utiliza a imunoglobulina IgA na saliva, após 5 dias do contato com o alérgeno, para diagnosticar alergia alimentar através da técnica de ELISA. Diferentemente desse documento, a presente invenção detecta as imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva por meio da técnica de ELISA, podendo ser realizado o exame no mesmo dia do contato com o alérgeno.

[0026] O documento PI0114343-3 revela o diagnóstico de alergia alimentar através detecção de IgE e IgG no sangue de pacientes utilizando a técnica microarray. Diferentemente desse documento, a presente invenção apresenta um processo para detecção de IgE e lgG1 a partir da saliva ou do soro utilizando a técnica de ELISA e extrato bruto dos alimentos investigados.

[0027] O documento WO2016094961 revela o diagnóstico de alergia alimentar através da técnica Methylation Patter que detecta regiões/genes metilados no DNA de diversos fluidos corporais, tendo a saliva como um deles. Esta patente não realiza ensaios imunoenzimáticos e por isso não detecta imunoglobulinas, o que a torna diferente da presente invenção, que provê uma investigação da alergia alimentar por meio da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva e no soro do paciente, utilizando a técnica de ELISA e o extrato bruto dos alimentos investigados.

[0028] O documento US2014315749 revela o diagnóstico de alergia alimentar através da detecção de linfócitos B em fluidos corporais com a técnica de citometria de fluxo. Diferentemente desse documento, a presente invenção realiza a investigação de alergia alimentar em pacientes por meio da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 na saliva utilizando extrato bruto dos alimentos investigados e a técnica de ELISA.

[0029] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0030] Não obstante, em vista dos métodos atuais utilizados para a investigação de sinalizadores fisiológicos de alergias alimentares em pacientes, não exaustivamente, destaca-se o problema constante no estado da técnica de alguns processos serem invasivos (coleta de sangue), e necessitarem a repetição dos testes, o que pode causar dor e desconforto ao paciente investigado, tornando um problema principalmente quando se trata de um público infantil; além disso os outros processos não invasivos, não permitirem o detecção de sinalizadores fisiologicos de alergia alimentar, utilizando extratos brutos dos alimentos investigados, por meio da técnica de ELISA que detecta a presença das imunoglobulinas Ige e lgG1 na saliva e no soro.

[0031] Outro ponto importante, é que nos testes existentes atualmente há necessidade de jejum por de 8 horas em crianças aproximadamente e 4 horas em adultos, o que muitas vezes causam angústia, ansiedade e/ou tristeza aos candidatos a serem investigados, assim como os pais destes (no caso de crianças).

Sumário da Invenção

[0032] Desta forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir do desenvolvimento do desenvolvimento de um método detectar Imunoglobulinas IgE e lgG1 específicas para alimentos, envolvendo a técnica de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) de forma não invasivo, mais fidedigno em seus resultados, de rápido resultado, em um único teste podem ser testados vários alimentos. Além disso, o método descrito não requer que o paciente esteja de jejum e pode ser aplicado em qualquer idade.

[0033] Em um primeiro objeto a presente invenção descreve um kit para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , compreendendo (1 ) um coletor de saliva, (2) componentes para preparar um extrato de alimentos;

em que o dito componente (2), deve apresentar pelo menos um PBS 1X, em que o PBS 1 X é composto por cloreto de sódio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio dibásico e água destilada.

[0034] Em um segundo objeto a presente invenção descreve um processo para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , executado em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), tendo seus resultados coletados e compreendendo os componentes:

- um antígeno, em o dito antígeno é obtido a partir de um alimento ou medicamento que podem ocasionar alergias;

- amostra biológica, em que a dita amostra biológica selecionada entre soro ou saliva;

em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,

em que o resultado positivo para alergia é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte,

em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.

[0035] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados é a detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , para a investigação reações alérgicas de alimentos.

[0036] Este e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0037] A Figura 1 mostra um teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.

[0038] A Figura 2 mostra um teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de lgG1 para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.

[0039] A Figura 3 mostra um Teste “Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com saliva de crianças alérgicas e não alérgicas na diluição de 1 :100, revelando a presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos quando comparados aos não alérgicos.

[0040] A Figura 4 mostra uma comparação dos testes“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro e saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.

[0041] A Figura 5 mostra uma comparação dos testes“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro e saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de lgG1 para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.

[0042] A Figura 6 mostra uma comparação do Teste“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com soro de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE e lgG1 específicas para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos.

[0043] A Figura 7 mostra uma comparação do Teste“Enzyme linked immunossorbent assay” (ELISA) com saliva de crianças na diluição de 1 :100, revelando a detecção da presença de IgE e lgG1 específicas para as proteínas dos alimentos (milho, mamão, leite de vaca, clara de ovo, soja, amendoim) no grupo dos pacientes alérgicos

Descrição Detalhada da Invenção

[0044] A presente invenção refere-se a um processo que utiliza amostra biológica coletadas de candidatos humanos, para a investigação de sinalizadores específicos para alergias alimentares, a partir de testes laboratoriais. Vale ressaltar que uma vez coletada a mostra biológica, o processo aqui descrito não envolve nenhuma outra etapa in vivo. Mais precisamente, a presente invenção descreve o desenvolvimento de processo para detecção de imunoglobulinas E (IgE) e imunoglobulinas G1 (lgG1 ) de amostras biológicas de candidatos humanos, preferencialmente utilizando a saliva como material biológico. O processo tem com objetivo fomentar a investigação de reações alérgicas alimentares através da presença de IgE e lgG1 , utilizando extrato brutos de alimentos, saliva coletada e a técnica de ELISA.

[0045] As amostras biológicas coletadas na presente invenção podem ser diversas. Sendo que para isso diversos métodos de coletadas de material já conhecidos na técnica podem ser utilizados na presente invenção. Preferencialmente, o material biológico utilizado na presente invenção é a saliva.

[0046] Entre as vantagens da presente invenção, destaca-se que pelo fato do material biológico ser a saliva, por tal motivo o processo torna-se não invasivo. Interessante dizer que, em outros processos, na fase do diagnóstico de alergia os pacientes podem ter seu sangue coletado inúmeras vezes. Assim, a construção de um teste não invasivo a repetição dos testes poderiam acontecer de uma forma que não causasse dor nem desconforto ao paciente investigado, tornando um argumento importante por se tratar de um maior público infantil. Outro fato importante a mencionar e a presente invenção não necessitara grandes quantidades do material (saliva) para realização do teste, tornando-o mais viável.

[0047] A presente invenção apresenta uma solução no que refere-se a um processo para investigação de alergia alimentar através da detecção das imunoglobulinas IgE e lgG1 específicas para determinados alimentos. Uma vez que a determinação de IgE total, utilizada nos testes diagósticos existentes atualmente, pode variar com numerosos fatores (predisposição genética, sexo, idade, infecções, poluição e tabagismo) o que não torna os resultados fidedignos. Além disso, os testes diagnóstico atuais, exceto o por provocação oral, só consegue detectar a imunoglobulina E diagnosticando apenas um tipo de alergia (mediada por IgE), ou apenas doenças associadas com sua elevação sérica parasitoses intestinais ou cutâneas, mieloma, síndrome de hiper-lgE, entre outras . Dessa forma, a presente invenção será mais fidedigna por se tratar da detecção de imunoglobulinas especificas, além de conseguir diagnosticar os três tios de alergias existentes (mediada por IgE, não mediada por IgE e mistas) através da detecção da imunoglobulina lgG1 , a qual está presente em pessoas alérgicas em geral e não sofrem variações com fatores externos.

[0048] A tecnologia utilizada na presente invenção é o ensaio imunoenzimático (ELISA) já utilizado atualmente por ser de rápido resultado. Na presente invenção, com apenas um teste é possível investigar a vários alimentos ao mesmos tempo. Além disso, o extrato de alimentos utilizados pode ser em sua forma bruta ou liofilizadas.

[0049] Além da detecção de IgE e lgG1 específicas para alimentos, o teste também pode ser utilizada para o diagnóstico de reações alérgicas causadas por medicamentos (antibióticos como penicilina, dipirona etc).

[0050] Ainda, a presente invenção descreve um para kit diagnóstico, hábil à produção em escala industrial, para possibilitar que o teste esteja presente em hospitais e até mesmo consultórios e Unidades de Saúde, já que a presente invenção será autoexplicativa podendo ser executada por qualquer professional de saúde, o que facilita o diagnóstico de alergia alimentar na população.

KIT para Detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1

[0051] O Kit compreende um coletor de material biológico (1 ) que tem como objetivo coletar a saliva ou soro para ser analisado. O dito coletor de material biológico (1 ) pode ter inúmeras formas e estruturas. Preferencialmente, o coletor de material biológico (1 ) é um coletor de saliva.

[0052] O kit ainda compreende um componente para preparação do antígeno (2), sendo tem a função de tratar um extrato de alimento ou medicamento para prover os antígenos presentes. Para a preparação de um extrato de alimentos, o componente para preparação do antígeno (2) é preferencialmente uma solução PBS, mais preferencialmente é uma solução PBS 1 X, em que a dita solução destaca-se por compreender cloreto de sódio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio dibásico e água destilada.

[0053] Dessa forma, em um primeiro objeto a presente invenção descreve um kit para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , compreendendo coletor de material biológico (1 ), (componente para preparação do antígeno (2);

em que o dito componente (2), compreende um PBS prover antígenos de a partir de um extrato de alimentos, ou um X prover antígenos de a partir de um medicamento.

[0054] Na invenção, o kit pode ser utilizado junto com um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para poder realizar a detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1.

[0055] Dessa forma, KIT descrito destaca-se para ser utilizado para a execução do processo para detecção de imunoglobulinas E (IgE) e imunoglobulinas G1 (lgG1 ). Sendo que tal processo é mais bem descrito abaixo.

Processo para Detecção de Imunoglobulinas E e Imunoglobulinas G1

[0056] Em um segundo objeto a presente invenção descreve um processo para detecção de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 , executado em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), tendo seus resultados coletados e compreendendo os componentes:

- um antígeno, em o dito antígeno é obtido a partir de um alimento ou medicamento que podem ocasionar alergias;

- amostra biológica, em que a dita amostra biológica selecionada entre soro ou saliva;

em que a análise dos resultados, envolve uma análise da absorbâncias obtida no final do ensaio imunoenzimático indireto realizado, para determinação dos valores de imunoglobulinas E e imunoglobulinas G1 ,

em que o resultado positivo para alergia é identificado por um valor de absorbância maior que o ponto de corte,

em que pelo ponto de corte ser definido através uma análise estatística da soma da média das absorbâncias das amostras de controle negativo, com adição de três vezes o desvio padrão.

[0057] Em outra concretização do segundo objeto, o alérgeno é um extrato de alimento selecionado entre: leite de vaca, milho, soja, amendoim, clara de ovo e mamão.

[0058] Em outra concretização do segundo objeto, a etapa de preparo de ensaio imunoenzimático ELISA indireto, compreende a etapa de sensibilização do ensaio imunoenzimático ELISA indireto com extratos de alergênicos.

[0059] Em outra concretização do segundo objeto, o processo compreende as seguintes etapas:

i. sensibilização das placas através da adição de 5 pg dos extratos dos alimentos por poço;

ii. adição de 100 mI de tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6em cada poço;

iii. incubação de pernoite das placas a uma temperatura de 4°C;

iv. lavagem das placas com PBS;

v. bloqueio, utilizando 200 pL de PBS gelatina à 1 % por 2h em uma temperatura de 37 °C;

vi. incubação das placas com as amostras biológicas diluídas em PBS gelatina na proporção de 1 :100 pg/pL por 2 horas à 37 ^Q C;

vii. lavagem utilizando PBS Tween;

viii. repetição por duas vezes da etapa vii;

ix. adição de anticorpos anti-lgE e anti-lgG1 , diluídos em PBS gelatina (1 :2000);

x. descanso do material obtido na etapa ix por 1 h à temperatura de

37 ^Q C;

xi. lavagem utilizando PBS Tween;

xii. repetição por duas vezes da etapa xi;

xiii. adição de 100 mI_ por poço da solução reveladora tetrametilbenzidina;

xiv. descanso do material obtido na etapa xiii por 15 minutos;

xv. medição das absorbâncias em comprimento de onda de 620nm.

[0060] A presente invenção se destaca por apresentar uma técnica não invasiva, que detecta antígenos específicos, mais fidedigna em seus resultados, de rápido resultado, em um único teste podem ser testados vários alimentos, de fácil acesso e baixo custo. Além disso, não necessitando de jejum e pode ser aplicado em qualquer idade. Quando comparado ao teste existente atualmente, essas características não são encontradas.

Exemplos - Concretizações

[0061] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.

Exemplo 1. Processo para o Desenvolvimento do Teste Diagnóstico para Alergia a Alimentos e Medicamentos

Coleta da Saliva

[0062] As amostras de saliva foram coletadas com pipeta plástica descartável no período da manhã, não necessitando de jejum. Após a coleta, os materiais foram colocados em tubos plásticos de 1 ,5mL devidamente fechados, identificados e levados a um isopor contendo gelo. As amostras salivares foram centrifugadas durante 10 minutos e retirados os sobrenadantes para em seguida armazená-los à 20 ^Q C até as análises.

Preparo dos extratos alimentares [0063] Para os testes imunológicos, foram utilizados os extratos proteicos do leite de vaca, milho, soja, amendoim, clara de ovo e mamão, preparados no Laboratório de Biotecnologia e Biologia Molecular da UECE. Os alimentos foram escolhidos por fazer parte da alimentação habitual das crianças brasileiras, porém o amendoim foi escolhido devido ao seu poder alergênico.

[0064] Os extratos proteicos foram obtidos dos alimentos previamente macerados e centrifugados para obtenção do sobrenadante, contendo as proteínas solúveis em tampão fosfato pH 7,4. As proteínas do sobrenadante foram precipitadas com acetona 10% TCA (ácido tricloroacético). O precipitado proteico foi ressuspendido em tampão fosfato pH 7,4 e utilizado para a sensibilização das placas

Técnica Utilizada

ELISA (Enzvme Linked Immunosorbent Assav)

[0065] A técnica de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) indireta foi utilizada para avaliar os níveis de IgE e lgG1 presentes no soro e saliva dos pacientes alérgicos e não alérgicos. Para esse ensaio, foram usadas as placas de 96 poços.

[0066] As placas foram sensibilizadas com os extratos dos alimentos em estudo (5 pg/orifício), Todos os antígenos foram diluídos em tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6, sendo usado 100 mI em cada poço.

[0067] As placas foram incubadas‘overnight’ a uma temperatura de 4°C. Em seguida, as placas foram lavadas com PBS (NaCI, KH ₂ P0 ₄ , Na ₂ HP0 ₄ .12H ₂ 0 e KCI)-Tween (0,05 %) e bloqueadas por 2 h a uma temperatura de 37 °C com com 200 pL de PBS gelatina à 1 %. Logo após o descarte da solução de bloqueio, as placas foram incubadas com amostras dos soros e salivas dos pacientes também diluídos em PBS gelatina na proporção de 1 :100 pg/pL, onde permaneceram por mais 2 horas à 37 ^Q C, de acordo com a metodologia citada por Paschoal (2010).

[0068] Em seguida, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween e adicionados anticorpos anti-lgE e anti-lgG1 (anticorpos secundários conjugados à peroxidase), diluídos em PBS gelatina (1 :2000), permanecendo por mais 1 h à temperatura de 37 ^Q C. Para finalizar o processo as placas foram novamente lavadas 3 vezes com PBS Tween, para então receber 100 pL/poço da solução reveladora TMB (tetrametilbenzidina) para após 15 minutos medir as densidades ópticas em leitor de ELISA (PASCHOAL, 2010; FLORINDO et al., 2002).

[0069] Para a análise dos resultados, as médias das absorbâncias das amostras de sangue e saliva do grupo controle serviram para estabelecer o ponto de corte (cuttof), o qual foi calculado pela soma da média com três vezes o desvio padrão, segundo Oliveira et al (2006). Os valores encontrados acima do cuttof foram considerados positivos para alergia alimentar.

Testes com soro e saliva de crianças alérgicas e não alérgicas

[0070] O soro e a saliva de crianças alérgicas e não alérgicas foram coletados e testados com os extratos alimentares produzidos.

[0071] A amostra estudada foi composta por crianças sendo alérgicas à proteína do leite de vaca (APLV) e com ausência de sintomas alérgicos. A população alérgica do estudo foi composta por (55%) meninos e (45%) meninas com idade média de 14,7 meses (± 1 1 ,2 meses) e o diagnóstico de APLV aos 3,6 meses (± 4,1 meses). Os sintomas apresentados foram diarréia, urticária, distensão abdominal, vómitos, sangramentos, angioedema, dermatite atópica, baixo ganho de peso e dor abdominal.

[0072] Das amostras estudadas, 70,7% das crianças receberam leite materno, porém o tempo médio de amamentação foi de 3,7 meses (± 3,1 ). Em relação à avaliação antropométrica das pacientes, o peso médio encontrado de 0 a 12 meses de idade foi 7.161 Kg (± 1.973), dos 13 aos 24 meses de idade 9.456Kg (± 2.216) e as crianças dos 25 aos 51 meses foi de 12.263Kg (± 3.023).

[0073] A classificação segundo o Escore Z das crianças, de acordo com os parâmetros da Organização Mundial da Saúde - (WHO, 2007), a grande maioria apresentou adequação quanto à estatura/idade, peso/idade e peso/estatura, apresentando apenas 1 criança acima e 8 abaixo da curva.

[0074] No presente estudo, o soro e a saliva de todas as crianças foram submetidos ao teste de ELISA indireto para detectar a presença de imunoglobulinas lgG1 e IgE como indicadoras de reações alérgicas.

[0075] No grupo dos alérgicos foi feita uma análise de variância pela ANOVA e comparado as médias através do Teste Turkey entre os alimentos com o soro e a imunoglobulina E. A diferença estatisticamente significante (p<0,05) foi encontrada quando o mamão foi comparado com a albumina e o leite de vaca, bem como o leite de vaca com a soja e amendoim.

[0076] Quando analisados os soros e a lgG1 , os resultados estatisticamente significativos (p<0,05) foram obtidos quando comparado o leite de vaca com o milho, a albumina e o amendoim. O mesmo cruzamento foi feito entre os alimentos e a saliva, resultado o qual não mostrou significância.

[0077] Quando a placa foi sensibilizada com os precipitados de proteínas dos alimentos analisados, observou-se que em 85% das crianças alérgicas foi detectada a presença de IgE e em 98% a presença de lgG1 para o soro no leite de vaca. Já na saliva foi de 88% da população detectando a IgE e 100% de lgG1 , mostrando que tanto a saliva quanto o lgG1 foram mais sensíveis diante do sangue e IgE. Por outro lado, nenhuma reação nem variação relevantes foram observadas com os soros das 19 crianças não alérgicas, resultados semelhantes foram observados com os demais alimentos, como pode ser observado na figura 4 e tabela 1.

[0078] Quando comparado o grupo alérgico com o grupo o controle não alérgico, observa-se que utilizando o“teste QUI-QUADRADO”, os resultados de IgE e lgG1 no sangue e na saliva são significativamente diferentes com p < 0,05 para todos os alimentos, podendo ser dito o mesmo para o experimento com a saliva.

[0079] Enquanto a comparação entre os alimentos tanto utilizando o soro quanto a saliva, foi observado que o leite de vaca e o milho foram os alimentos com maior tendência a induzir a produção de IgE e lgG1.

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