Stand der Technik : Dehydrogenasen sind vielseitig einsetzbare Katalysatoren zur enantioselektiven Re- duktion von Aldehyden oder Ketonen zu den korrespondierenden Alkoholen. Man un- <BR> <BR> terscheidet dabei (R) -und (S) -spezifische Dehydrogenasen. Diese Katalysatoren wer- den im verstärkten Maß für die industrielle Synthese von optisch aktiven Alkoholen eingesetzt. Optische Aktivität ist die Voraussetzung für die selektive Wirkung von vielen Pharma-und Agrowirkstoffen. Hier kann das eine Enantiomer die gewünschte, das andere Enantiomer eine genotoxische Wirkung haben. Aus diesem Grund werden in der Synthese von Pharma-und Agrowirkstoffen zur Herstellung von optisch aktiven Alkoholen Katalysatoren eingesetzt, die die notwendige Stereospezifität besitzen.

3-Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol ("Duloxetinealkohol") ist Baustein in der Du- loxetine-Synthese. Duloxetine ist ein Pharmawirkstoff, der sich momentan in der Zulas- sung befindet und im Indikationsgebiet Depression und Inkontinenz eingesetzt werden soll.

In der Literatur (vgl. EP-A-0 273 658) sind Synthesewege zum Duloxetinealkohol und Duloxetin beschrieben. Nachteil dieser Synthesewege ist, dass die Synthese zum ra- cemischen Alkoholgemisch führt und anschließend eine Racematspaltung durch Über- führung des Racemats in eine Mischung aus Diastereomeren durch Salzbildung mit einem optisch aktiven Gegenion erforderlich ist. Anschließend erfolgt eine physikali- schen Trennung der Diastereomere. Hieraus resultieren hohe Verfahrenskosten

augfrund wiederholter Fest-Flüssigtrennungen und der erhöhte Einsatzstoffaufwand durch Zugabe eines optisch aktiven Salzes zur Trennung.

Einen preisgünstigeren Zugang zum Duloxetinealkohol würde die stereospezifische Reduktion des 3-Methylamino-1- (2-thienyl)-propanon bieten.

Kurze Beschreibung der Erfindung : Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine Weg zur stereospezifischen Reduktion von substituierten Alkanonen, wie dem 3-Methylamino-1- (2-thienyl)-propan- 2-on, zu finden.

Diese Aufgabe wurde durch den überraschenden Befund gelöst, dass Enzyme mit L- Carnitin Dehydrogenase-Aktivität zur stereospezifischen Katalyse der obigen Reaktion befähigt sind.

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen, ins- besondere enantioselektiven Herstellung von substituierten (S)-Alkanolen der Formel I worin n für einen ganzzahligen Wert von 0 bis 5, insbesondere 0,1 oder 2, steht ; Cyc für einen gegebenenfalls substituierten, ein-oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen Ring, insbeson- dere einen gegebenenfalls substituierten, ungesättigten, einkernigen hete- rocyclischen Ring, steht, und R'für Halogen, SH, OH, NO2, NR2R3 oder NR2R3R4+X-, insbesondere Halogen oder NR2R3 steht, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl-oder Niedrigalkoxy-Rest stehen und X-für ein Gegenion steht, wobei man in einem ein Alkanon der Formel II

worin n, Cyc und R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, enthaltenden Medium, a) einen ein Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität produzierenden Mikro- organismus kultiviert, oder b) ein Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität inkubiert, wobei die Verbindung der Formel It zur Verbindung der Formel I enzymatisch reduziert wird, und man das in im Wesentlichen enantiomerenreiner Form gebildete Produkt isoliert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dient das Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol der Formel 111 wobei man in einem 3-Methylamino-1- (2-thienyl)-propan-2-on der Formel IV

enthaltenden Medium diese Verbindung zur Verbindung der Formel 111 enzymatisch reduziert wird, und man das in im Wesentlichen enantiomerenreiner Form gebildete Produkt isoliert.

Vorzugsweise verwendet man bei diesen Verfahren ein Enzym mit L-Carnitin Dehydro- genase-Aktivität, das ausgewählt ist unter L-Carnitin Dehydrogenasen (E. C. 1.1. 1.108) und 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenasen (E. C. 1.1. 1.35).

Derartige Enzyme mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität sind insbesondere ausge- wählt unter Enzymen aus Mikroorganismen der Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Xanthomonas, Staphylococcus, Rhizobium, Agrobacterium, Streptomyces und Ar- chaeglobus.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Enzym mit L- Carnitin Dehydrogenase-Aktivität ausgewählt unter Enzymen, welche eine Aminosäu- resequenz gemäß SEQ ID NO : 2,3, 4,5, 6,7, 8,9 oder 10 umfassen, oder von davon abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden ; und funktionalen Äquivalenten dieser Enzyme, welche L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität besitzen und die enantio- selektive Synthese einer Verbindung der Formel I katalysieren.

Beispielsweise kann das Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität von einem Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 1 oder einem funktionalen Äquivalent davon kodiert werden.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Zugabe von Reduktions- äquivalenten (NADH oder NADPH) oder die bei der Umsetzung verbrauchten Redukti- onsäquivalente regenerierenden (biochemischen oder elektrochemischen) Bedingun- gen durchgeführt.

Weiterhin ist es bevorzugt, die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel II, wie z. B. der Formel IV, in Gegenwart eines Mikroorganismus erfolgen zu lassen, der ausgewählt ist unter Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae und Nocardiaceae. Der Mikroorganismus kann ins- besondere ein rekombinanter Mikroorganismus sein, der mit einem Nukleinsäurekon- strukt transformiert ist, welche für ein Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition kodiert.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren gemäß obiger Definition, wobei man a) einen ein Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität produzierenden Mikroor- ganismus aus einer natürlichen Quelle isoliert oder rekombinant herstellt, b) diesen Mikroorganismus vermehrt,

c) aus dem Mikroorganismus das Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität ge- gebenenfalls isoliert oder eine dieses Enzym enthaltende Proteinfraktion herstellt, und d) den Mikroorganismus gemäß Stufe b) oder das Enzym gemäß Stufe c) in ein Medi- um überführt, das eine Verbindung der Formel I enthält.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der all- gemeinen Formel V worin n, Cyc, und R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und Ar für einen ein-oder mehrkernigen, gegebenenfalls substituierten Aryl-Rest steht, und wobei man a) zunächst auf mikrobiologischem Weg gemäß der Definition in einem der vorherge- henden Ansprüche eine Verbindung der Formel I herstellt ; und b) die Verbindung der Formel I mit eine aromatischen Verbindung der Formel VI Ar-Y (Vi) worin Ar die oben angegebenen Bedeutungen besitzt und Y für eine Abgangs- gruppe steht, umsetzt und c) die Verbindung der Formel V isoliert und gegebenenfalls in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz, wie z. B. Oxalate überführt.

Vorzugsweise stellt man dabei eine Verbindung der Formel V her, worin Ar für 1- Naphthyl, Cyc für 2-Thienyl, R'für Monomethyfamino und n für 1 steht.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Polypeptide, welche eine Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO : 2,3, 4,5, 6,7, 8,9 oder 10 umfassen, oder von davon abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden ; und funktionale Äquivalente die- ser Enzyme, welche L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität besitzen und die enantioselek- tive Synthese einer Verbindung der Formel 1 und/oder 111 katalysieren.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem kodierende Nukleinsäuresequenzen, um- fassend die kodierende Sequenz für ein Polypeptid gemäß obiger Definition.

Weiterhin betrifft die Erfindung Expressionskassetten, umfassend in operativer Ver- knüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine kodierende Nuk- leinsäuresequenz gemäß obiger Definition.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind rekombinante Vektoren, umfassend we- nigstens eine solche Expressionskassette.

Die Erfindung betrifft auch prokaryotische oder eukaryotische Wirte, welche mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind.

Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Enzyms mit L- Carnitin Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition oder eines dieses Enzym produzierenden Mikroorganismus zur Herstellung von Verbindungen der Formeln I oder 111, wie insbesondere zur Herstellung von Duloxetine der Formel VII Detaillierte Beschreibung der Erfindung : A. Allgemeine Begriffe und Definitionen Werden keine andere Angaben gemacht, so gelten folgende allgemeine Bedeutungen : "Halogen"steht für Fluor, Chlor, Brom oder Jod, insbesondere Fluor oder Chlor.

"Niedrigalkyl"steht für geradkettige oder verzweigte Alkylreste 1 bis 6 C-Atomen, wie Methyl, Ethyl, i-oder n-Propyl, n-, i-, sec.-oder tert.-Butyl, n-Pentyl oder 2-Methyl- Butyl, n-Hexyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methyl-pently, 2-Ethyl-butyl.

"Niedrigalkenyl"steht für die ein-oder mehrfach, vorzugsweise einfach oder zweifach ungesättigten Analoga oben genannter Alkylreste mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Doppelbindung in beliebiger Position der Kohlenstoffkette liegen kann.

"Niedrigalkoxy"steht für die Sauerstoff-terminierten Analoga obiger Alkylreste.

"Aryl"steht für einen ein-oder mehrkernigen, vorzugsweise ein-oder zweikernigen, gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest, insbesondere für Phenyl oder für ein über eine beliebige Ringposition gebundenes Naphthyl, wie 1-oder 2-Naphthyl. Diese Arylreste können gegebenenfalls 1 oder 2 gleiche oder verschiedene Substituenten tragen, ausgewählt unter Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkoxy gemäß obiger Definition oder Trifluormethyl.

B. Substituierte Alkanone, (S)-Alkanole und Derivate davon Erfindungsgemäß durch enzymatische Katalyse zugängliche Alkanole sind solche obi- ger Formel (I) worin n für einen ganzzahligen Wert von 0 bis 5 steht ; Cyc für einen gegebenenfalls substituierten, ein-oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen Ring steht, und R'für Halogen, SH, OH, NOz, NR2R3 oder NR2R3R4+X-steht, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl-oder Niedrigalkoxy-Rest stehen und X-für ein Gegenion steht.

Die zur enzymatischen Synthese verwendeten Alkanole obiger Formel II sind an sich bekannte Verbindungen und unter Anwendung allgemein bekannter organischer Syn- theseverfahren zugänglich (vgl. z. B. EP-A-0 273 658).

Vorzugsweise steht n in obigen Verbindungen für 0,1 oder 2, insbesondere für 1.

Als Beispiele für carbo-und heterocyclische Gruppen Cyc sind insbesondere ein-oder zweikernigen, vorzugsweise einkernige, Gruppen mit bis zu 4, vorzugsweise 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Ring-Heteroatomen, ausgewählt unter O, N und S sind zu nennen : Diese carbo-oder heterocyclischen Ringe umfassen insbesondere 3 bis 12, vorzugs- weise 4,5 oder 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden Cyc- lopropyl, Cyclobutyl, Cyclopenty, Cyclohexyl, Cycloheptyl, die ein-oder mehrfach un- gesättigten Analoga davon, wie Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclohep- tenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptadienyl ; sowie 5-bis 7-gliedrige gesättigte oder ein oder mehrfach ungesättigte heterocyclische Reste mit 1 bis 4 Heteroatomen, die aus- gewählt sind unter O, N und S, wobei der Heterocyclus gegebenenfalls mit einem wei- teren Heterocyclus oder Carbocyclus kondensiert sein kann. Insbesondere sind zu nennen heterocyclische Reste, abgeleitet von Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Piperidin, Morpholin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyridin, Pyran, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Cumaron, Indol und Chinolin.

Die Reste Cyc können dabei über eine beliebige Ringposition, vorzugsweise über ein Ring-Kohlenstoffatom, an das Alkanon bzw. das Alkanol gebunden sein.

Beispiele für geeignet Cyc-Reste sind 2-Thienyl, 3-Thienyl ; 2-Furanyl, 3-Furanyl ; 2- Pyridyl, 3-Pyridyl oder 4-Pyridyl ; 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5-Thiazolyl ; 4-Methyl-2- thienyl, 3-Ethyl-2-thienyl, 2-Methyl-3-thienyl, 4-Propyl-3-thienyl, 5-n-Butyl-2-thienyl, 4- Methyl-3-thienyl, 3-Methyl-2-thienyl ; 3-Chlor-2-thienyl, 4-Brom-3-thienyl, 2-lod-3- thienyl, 5-lod-3-thienyl, 4-Fluor-2-thienyl, 2-Brom-3-thienyl, und 4-Chlor-2-thienyl.

Die Reste Cyc können weiterhin ein-oder mehrfach, wie z. B. ein-oder zweifach, sub- stituiert sein. Vorzugsweise sitzen die Substituenten an einem Ring-Kohlenstoffatom.

Beispiele für geeignete Substituenten sind Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, Niedrigalkoxy,-OH,-SH,-NO2 oder NR2R3, wobei R2 und R3 obige Bedeutungen be- sitzen, bevorzugt Halogen oder Niedrigalkyl.

R'steht insbesondere für Halogen, NR2R3 oder NR2R3R4+X-, wobei R2, R3 bzw. R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl-oder Niedrigalkoxy-Rest stehen und X-für ein Gegenion steht, wobei vorzugsweise einer der Reste R2, R3 und

R4 für H steht. Geeignete Gegenionen sind beispielsweise Säureanionen, wie sie bei- spielsweise bei Herstellung eines Säureadditionssalzes anfallen. Beispiel hierzu sind z. B. in der EP-A-0 273 658 genannt, worauf hiermit Bezug genommen wird. Bevorzug- te Beispiele für Reste R1 sind insbesondere Fluor oder Chlor, sowie NR2R3 worin R2 und R3 gleich oder verschieden sind und für H oder Methyl, Ethyl oder n-Propyl stehen ; besonders bevorzugt steht R'für Chlor oder-NHMethyl.

C. Enzyme mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität Das erfindungsgemäße Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität ist insbesonde- re ausgewählt unter L-Carnitin Dehydrogenasen (E. C. 1.1. 1.108) und 3-Hydroxyacyl- CoA Dehydrogenasen (E. C. 1.1. 1.35) (vgl. auch Kleber HP (1997) FEMS Microbiology Letters 147 1-9).

Diese L-Carnitin Dehydrogenasen/Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenasen lassen sich in Organismen, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen oder Pilzen, finden.

Das Enzym bzw. die Enzyme besitzen eine hohe enzymatische Aktivität zur Reduktion von Alkanonen der Formel II, wie 3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-on zu 3- Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol. Andere Substrate, wie z. B. die Dimethylderiva- te des Ketons werden wie die Monomethylverbidungen ebenfalls von der Dehyrdoge- nase umgesetzt.

Ohne darauf beschränkt zu sein sind solche Enzyme bevorzugt aus Mikroorganismen der Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Xanthomonas, Staphylococcus, Rhizobium, Agrobacterium, Streptomyces und Archaeglobus zugänglich.

Bevorzugte Enzym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität umfassen eine Aminosäu- resequenz gemäß SEQ ID NO : 2,3, 4,5, 6,7, 8,9 oder 10.

Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls"funktionale Äquivalente"der konkret of- fenbarten Enzyme mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.

"Funktionale Äquivalente"oder Analoga der konkret offenbarten Ezyme sind im Rah- men der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die

gewünschte biologische Aktivität, wie z. B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter"funktionalen Äquivalenten"Enzyme, die von 3-Methylamino-1- (2- thienyl)-propan-1-on zum entsprechenden S-Alkohol reduzieren und die mindestens 20 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Aktivität eines Enzyms, umfassend eine der unter SEQ ID NO : 2 bis 10 aufgeführten Aminosäuresequenz, aufweist. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 10 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 20°C bis 80°C.

Unter"funktionalen Äquivalenten"versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäu- resequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotz- dem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen."Funktionale Äquiva- lente"umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen,- Substitutionen,-Deletionen und/oder-Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwi- schen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d. h. bei- spielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt wer- den.

"Funktionale Äquivalente"im obigen Sinne sind auch"Präkursoren"der beschriebenen Polypeptide sowie"funktionale Derivate"und"Salze"der Polypeptide.

"Präkursoren"sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktiviät.

Unter dem Ausdruck"Salze"versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Sal- ze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen-und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze

mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

"Funktionale Derivate"erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Ami- nosäure-Seitengruppen oder an deren N-oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhält- lich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin ; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen ; oder 0-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgrup- pen.

"Funktionale Äquivalente"umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermit- teln.

"Funktionale Äquivalente"umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Do- mänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z. B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

"Funktionale Äquivalente"sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben ge- nannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funk- tioneller N-oder C-terminaler Verknüpfung (d. h. ohne gegenseitigen wesentliche funk- tionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispie- le für derartige heterologe Sequenzen sind z. B. Signalpeptide oder Enzyme.

Erfindungsgemäß mit umfasste"funktionale Äquivalente"sind Homologe zu den kon- kret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z. B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988,2444-2448. Eine pro- zentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet ins-

besondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße"funktio- nale Äquivalente"Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abge- wandelt Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z. B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.

Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z. B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispiels- weise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z. B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degene- rierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden.

Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtli- cher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Protein- sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z. B. Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39 : 3 ; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53 : 323 ; Itakura et al., (1984) Science 198 : 1056 ; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 : 477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausge- wählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transfor-

mieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der ge- wünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Tech- nik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombi- nation mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89 : 7811-7815 ; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6 (3) : 327-331).

D. Kodierende Nukleinsäuresequenzen Die Begriffe"exprimieren"oder"Überexpression"beschreiben im Kontext der Erfin- dung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden.

Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhan- denes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein ent- sprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die für ein En- zym mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität kodieren. Bevorzugt sind Nukleinsäurese- quenzen umfassend-eine Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 ; oder von den Aminosäure- sequenzen gemäß SEQ ID NO. : 2 bis 10 abgeleitete Nukleinsäuresequenzen.

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel-und doppelsträngige DNA-und RNA-Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Frag- mentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann bei- spielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auf- lage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in

Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel-und dop- pelsträngige DNA-und RNA-Sequenzen, wie z. B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z. B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsge- mäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z. B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequen- zen vom 3'-und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer um- fassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter"stringenten"Bedingun- gen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40,50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Ein"isoliertes"Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abge- trennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Stan- dard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrie- ben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäu- remolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nuklein- säure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide kön- nen ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z. B. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Or- ganismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, wie SEQ ID NO : 1 oder die Homologen davon, aus Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus gram-negativen Bakterien vorteilhaft aus alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Familien Ente- robacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae, ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, Pseudomonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, wie SEQ ID No : 1 oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybri- disierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien, z. B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisie- rung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielswei- se aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit der L-Carnitin Dehydrogenase in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber

auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nuk- leinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelz- temperaturen für DNA : DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA : RNA- Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwi- schen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridi- sierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperatu- ren für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmeiztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrie- ben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berech- nen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbü- chern entnehmen : Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York ; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford ; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.

So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z. B. von SEQ ID NO : 1 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs-oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.

Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d. h. die betreffen- de Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den kon- kret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Poly- morphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der na- türlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 40 % Homo- logie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 60 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 % Homologie über den gesamten Sequenz- bereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausfüh- rungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.

Weiterhin sind unter Derivate auch Homologe der erfindungsnemäßen Nukleinsäure- sequenzen, insbesondere der SEQ ID NO : 1, beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. So besitzten z. B. Homologe zur der SEQ ID NO : 1 auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 40 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevor-

zugt von mindestens 80 % über den gesamten in SEQ ID NO : 1 angegebenen DNA- Bereich.

Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen.

Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, kön- nen durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Verände- rung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Pro- motoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von-1 bis-1000 Basen stromaufwärts vor dem Startkodon oder 0 bis 1000 Basen stromabwärts nach dem Stopkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben ge- nannten kodierenden Sequenzen unter"stingenten Bedingungen"hybridisieren. Diese Polynukleotide lassen sich bei der Durchmusterung von genomischen oder cDNA- Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthe- tisiert werden. Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines Poly-oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Se- quenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwi- schen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplemen- tärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispiels- weise in der Northern-oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispiels- weise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50-70 °C, vorzugsweise 60 - 65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0, 1x SSC-Puffer mit 0, 1% SDS (20x SSC : 3M NaCI, 0, 3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA- Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße

komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Be- dingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z : B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6. beschrieben.

E. Erfindungsgemäße Konstrukte Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsge- mäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz ; sowie Vektoren, umfassend we- nigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Termi- natorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einer"operativen Verknüpfung"versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expressi- on der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete re- gulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Techno- logy : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Unter einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind insbesondere die L- Carnitin Dehydrogenasegene mit Sequenz SEQ ID NO : 1 und die Derivate und Homo- logen davon sowie die von SEQ ID NO : 2 bis 10 ableitbaren Nukleinsäuresequenzen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z. B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wur- den.

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Se- quenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls

genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz (wie z. B. SEQ ID NO : 1 oder seine Homologen) insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder meh- rere der schon erwähnten"Enhancer"Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Pro- motor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert wer- den, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind bei- spielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder im lambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Wei- tere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase, beispielswei- seaus Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhaft- erweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inse- riert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese

Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeig- nete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101, pIJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können bei- spielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren ent- haltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Ge- nexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder"Enhancer"verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts- organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor

wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsge- mäßen Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage"zu verändern. Der"codon usage"läßt sich anhand von Computeraus- wertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz so- wie einem Terminator-oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations-und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.

Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cloning Vectors" (Pou- wels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den.

F. Erfindungsgemäß brauchbare Wirte Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen her- stellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemä- ßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und expri- miert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten

Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Da- zu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion,-Addition oder-Substitution eingebracht worden ist, um die erfin- dungsgemäße Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disrumpieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe-oder Insek- tenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombina- tion mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganis- men wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, beson- ders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.

Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta- Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden.

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit L-Carnitin De- hydrogenaseaktivität kodieren (Kleber HP (1997) FEMS Microbiology, 147,1-9).

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirts- organismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroor- ganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stick- stoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Tempe- raturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauer- stoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann"batch"-weise,"semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstof- fe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinu- ierlich nachgefüttert werden. Das Keton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebe- nen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reakti- on verwendet werden.

Die Wirtsorganismen enthalten vorteilhaft 1 U/1 Enzymaktivität, wie z. B. L- Carnitinedehydrogenaseaktivität, bevorzugt 100 U/I, besonders bevorzugt mehr als 1000 U/t.

G. Rekombinante Herstellung der Polypeptide : Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenen- falls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Po- lypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fer- mentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei ei- ner Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultra- schall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z. B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind bei- spielsweise als Anker fungierende sogenannte"Tags", wie z. B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y. ) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden.

Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarb- stoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reakti- onsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

H. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von (S)- Alkanolen Die Enzyme mit L-Carnitin Dehydrogenase-Aktivität, wie Carnitin Dehydrogenase oder die Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, können im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0 °C bis 95 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 85 °C, besonders bevorzugt zwischen 15 °C bis 75 °C durchgeführt.

Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehalten.

Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Produkten, wie 3-Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol, sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiome- renreinheiten von mindestens 70 % ee, bevorzugt von min. 80 % ee, besonders bevor- zugt von min. 90 % ee, ganz besonders bevorzugt min. 98 % ee erreicht.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren ent- halten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Be- handlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z. B.

French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden.

Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft

geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren ver- wendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.

Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwen- det, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt, wie 3-Methylamino-1- (2- thienyl)- (S)-propanol, läßt sich vorteilhaft aus der wässrigen Reaktionslösung über Ex- traktion oder Destillation oder vorteilhaft über Extraktion und Destillation gewinnen. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Beispiele für geeignete Extraktionsmittel sind Lösungsmittel, wie Toluol, Methylenchlorid, Butylace- tyt, Diisopropylether, Benzol, MTBE oder Essigester, ohne darauf beschränkt zu sein.

Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 80 % chemische Reinheit, gewonnen wer- den. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0 °C bis 10 °C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wässrigen Lösung erfolgen.

Das auskristallisierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lö- sungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristalli- siert werden. Durch die anschließende vorteilhafte mindestens einmalig durchgeführte Kristallisation kann die Enantiomerenreinheit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden.

Bei den genannten Aufarbeitungsarten lässt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100 %, bevorzugt von 80 bis 100 %, besonders bevorzugt von 90 bis 100 %, bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte Substrat, wie z. B. von 3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-on, isolieren. Das isolierte Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von > 90 %, bevorzugt > 95 % be- sonders bevorzugt von > 98 % aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantio- merenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuier- lich betrieben werden.

Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen, wie z. B. beschrieben in Biotechnology, Band 3,2. Auflage, Rehm et al Hrsg., (1993) insbe- sondere Kapitel II.

Die obige Beschreibung und die nachstehenden Beispiele dienen nur der Verdeutli- chung der Erfindung. Die für den Fachmann offensichtlichen, zahlreich möglichen Ab- wandlungen sind erfindungsgemäß ebenfalls umfasst.

Experimenteller Teil : Beispiel 1 : Klonierung der Carnitin-oder Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenasen via PCR- Amplifikation Bakterien ausgewählt aus den Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Mesorhizobium und Rhizobium, Streptomyces und Archaeglobus wur- den 1-3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1 % Pepton, 1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCI) angezogen, geerntet, in Puffer gewaschen, resuspendiert (5 mi 50 mM Tris pH 7.0) und die genomische DNA mit Hilfe des QIAGEN-Genomic-tip- Systems der Fa. Qiagen präpariert. Anschließend erfolgte die PCR-Amplifikation der Carnitin-bzw. 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Gene. Hierzu wurden die dem Fachmann zugänglichen DNA-Sequenzen zu den Dehydrogenase-Sequenzen der Seq. ID 2-10 vom N-und C-Terminus (jeweils 25-30 bp) ausgewählt, wahlweise Restriktionsschnittstellen zur Klonierung angehängt und die entsprechenden Oligonukleotide synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde mit Pfu-Polymerase (Stratagene) oder Taq-Polymerase (Roche) durchgeführt. Für die PCR-Reaktionen wurde beispielsweise folgendes Temperatur-Programm durchgeführt : 95°C für 3 Minuten ; 30 Zyklen mit 95°C für 45 sec., 55°C für 45 sec, und 72°C für 2 min. 50 sec. ; 72°C für 10 min. ; Verwahrung bei 4°C bis zum ersten Gebrauch. Alle PCR Produkte wurden durch Agarosegel-Electrophorese (E-Gel, Invitrogen) und Säu-

len-Chromatography (GFX-Kit, Pharmacia) gereinigt. Die Klonierung in Vektoren wie pBluescript KSII, pKK223-3 und pDHE19. 2 erfolgte mit durch geeignete Restriktions- verdaus und Ligation nach Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY). In den pBADtopo-Vektor wurden Taq-PCR-Produkte direkt kloniert. Als geeignete Wirtsorganismen dienten E. coli XL1 B und TG1 (Stratagene).

Beispiel 2 : Klonierung der Carnitin-oder Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenasen durch Wachstumsselektion Organismen der in Beispiel 1 genannten Gattungen und andere Bakterien, Hefen und Pilze sowie Isolate aus Bodenproben und E. coli-Genbanken, die durch Klonierung von DNA aus Bodenproben hergestellt wurden, wurden auf geeigneten Minimalmedien mit Carnitin oder Methylamino-1-(2-thienyl)-(S)-propanol, beispielweise 1% D, L-Carnitin, 0,2% K2HP04, 0,05% MgS04x 7 H2O, 0,05% Hefe-Extrakt, ausgestrichen oder flüssig inkubiert, und nach einem Tag, drei Tagen, wöchentlich bzw. nach einem Monat in frisches Medium (wiederholt) überimpft. Die dadurch angereicherten Organismen wur- den über Einzelkolonien oder Sortierung im Cell-Sorter isoliert. Sie zeigten die Fähig- keit, auf Carnitin oder Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol als einziger C-und/oder N-Quelle zu wachsen. Die erhaltenen Stämmen konnten via PCR-Amplifikation (gemäß Beispiel 1) der Gewinnung neuer rekombinanter Dehydrogenase-Stämme dienen.

Beispiel 3 : Umsetzung von Methylamino-1- (2-thienyl)- (S)-propanol Biomasse der unter Beispiel 1 und 2 erhaltenen Stämme wurde nach Anzucht in Ge- genwart geeigneter Induktoren (z. B. 0,5 mM IPTG, 2 g/L Rhamnose, Carnitin) geerntet, in Puffer (z. B. 50 mM Tris-HCI pH 7.0) gewaschen und resuspendiert und die ruhenden Zellen mit NADH oder NADPH (0,1-5 mM), 1,6 mg-50 mg Methylamino-1- (2-thienyl)- <BR> <BR> (S)-propanol und wahlweise Glucose oder Isopropanol (1-100 mol äq. ) pro mi Ansatz versetzt und 1-24 h bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion konnte durch Extinktionsabnahme bei 340 nm oder HPLC-Analytik verfolgt werden. Die Aktivitäten der Stämme lagen zwischen 0 und 100 U/l.