技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域， 具体而言， 本发明涉及发酵生产 L-赖氨酸的方法及其 衍生的方法和应用， 和可以用在这些方法和应用中的细菌等。 背景技术

通过产 L-赖氨酸的细菌 （如， 埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌 ） 发酵 来生产 L-赖氨酸已经得到了产业化应用。 这些细菌， 可以是从自然界分离的细菌， 也可 以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌， 或者两者兼而有之。 当前的文献报道中， 通 过基因工程改造的注意力主要集中在 pnt、 dap及 ppc等基因上， 未见为了 L-赖氨酸生产 而关注编码乌头酸酶 （如， 大肠杆菌中的乌头酸酶 A， 谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌中的 乌头酸酶） 的基因的调控元件。

乌头酸酶 （Aconitase) 是三羧酸循环中的一个酶， 该酶催化两步化学反应， 分别为 柠檬酸转化为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬 酸。目前已知在埃希氏菌中， acnA基因（其 核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示）编码乌头酸酶 A， 但是可能是由于其代谢距离最终的 L-赖氨酸产物太远， 中间代谢分支太多且复杂， 而在 L-赖氨酸发酵中一直未引起人们的 重视。 至于其他赖氨酸发酵菌， 如谷氨酸棒杆菌等， 乌头酸酶对 L-赖氨酸发酵的影响更 没有报道。在诸如中国专利 CN1289368 A和 CN101631871 A等文献中提及的乌头酸酶都 与 L-谷氨酸的发酵相关， 没有教导乌头酸酶对 L-赖氨酸发酵的影响。

本发明人经过长期研究和实践， 尤其凭借了一些运气， 偶然发现乌头酸酶基因及其 调控元件的改造能够有助于提高 L-赖氨酸的产量。

另外，现有技术要么通过增加拷贝和 /或定点突变导入表达量和 /或酶活性提高的有益 的酶基因，要么通过敲除不利的基因以使之酶 活性和 /或表达量消失。但是与之不同的是， 本发明人发现， 乌头酸酶基因及其调控元件不能简单地提高或 敲除， 尤其是敲除后 acnA 基因的不表达使得细菌生长困难， 难以实际应用， 因此开发了新的改造乌头酸酶基因和 / 或其调控元件的方法， 以此来提高 L-赖氨酸的产量。

而且， 该方法与现有改造的大量高产 L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突， 可以叠加提高的效果， 从而在实践上可用于多种细菌发酵生产 L-赖氨酸。 发明内容 本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生 产 L-赖氨酸的方法及其相关的方法， 包括相对于未改造细菌提高 L-赖氨酸的发酵生产量的方法， 改造的细菌在发酵生产 L-赖 氨酸中的应用， 改造的细菌在相对于未改造细菌提高 L-赖氨酸的发酵生产量的应用， 和 / 或， 改造细菌的方法等。 另外， 本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷 酸、 载体 和 /或细菌等。

具体而言， 在第一方面， 本发明提供了发酵生产 L-赖氨酸的方法， 其包括：

( 1 ) 改造细菌染色体上乌头酸酶基因和 /或其调控元件， 使其乌头酸酶的酶活性和 /或表 达量降低但不消失； 和，

(2) 用步骤 （1 ) 改造而得到的细菌发酵生产 L-赖氨酸。

在本文中， 术语"改造"指的是是相应被改造的对象发生变� ��， 从而达到一定的效果。 改造位于染色体上的基因或调控元件的手段包 括但是不限于， 诱变、 定点突变、 和 /或同 源重组， 优选是后两者。 改造位于染色体上的基因或调控元件使得该基 因或调控元件的 核苷酸序列被添加、 缺失或替换一个或多个核苷酸。 这些技术手段广泛记载于分子生物 学和微生物学文献中， 有许多甚至已经商品化了。 在本发明的具体实施方式中， 根据同 源重组的原理， 可以采用 Addgene公司商品化的 pKOV质粒系统来进行改造， 也可以采 用 pK18mob _SaC B质粒系统来进行改造，将未改造细菌染� �体上的乌头酸酶基因和 /或其调 控元件， 改造成能够使改造获得的细菌的乌头酸酶的表 达量和 /或酶活性降低但不消失的 新的乌头酸酶基因和 /或其调控元件。 因此， 在本文文中， 优选改造是通过同源重组进行 的改造。

本发明人经过长期研究发现，在大肠杆菌和棒 状杆菌等细菌中，使得乌头酸酶的表达 量消失， 如采用基因敲除的手段， 将造成细菌本身生长困难， 甚至无法产酸。 因此， 本 发明的 "改造 "要相对于未改造的细菌， 使改造获得的细菌的乌头酸酶的表达量降低但 不 消失， 优选使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量降低 20%~95%， 更优选降低 50 ~90 , 如降低 65%、 70%或 80%等。

相应地， 本发明还提供了其他的应用或方法。例如， 在第二方面， 本发明提供了提高

L-赖氨酸的发酵量的方法， 其包括：

( 1 ) 改造细菌染色体上乌头酸酶基因和 /或其调控元件， 使其乌头酸酶的酶活性和 /或表 达量降低但不消失； 和，

(2) 用步骤 （1 ) 改造而得到的细菌发酵生产 L-赖氨酸。

L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物， 大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的 L-赖氨酸。 尽管低产 L-赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产 L-赖氨酸， 但是通过本发 明的方法， 仍旧能提高 L-赖氨酸的发酵量， 仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。 当然， 在本文中， 优选细菌是高产 L-赖氨酸的细菌。 通过本发明的方法， 可以进一步提 高其产量。 另外， 在本发明的方法或应用中， 除了改造细菌染色体上乌头酸酶基因和 /或 其调控元件以外， 可以不再进行其他改造， 如甚至在改造了乌头酸酶基因的调控元件之 后， 可以不改造细菌染色体上的乌头酸酶基因， 反之亦然。 例如， 尤其对于高产 L-赖氨 酸的细菌来说， 可以仅仅改造细菌染色体上乌头酸酶基因和其 调控元件中的一个。

又如， 在第三方面， 本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产 L-赖氨酸中的应用， 其中， 所述改造获得是改造细菌染色体上乌头酸酶基 因和 /或其调控元件而获得， 而且使 改造获得的细菌的乌头酸酶的酶活性和 /或表达量降低但不消失。

改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产 L-赖氨酸中， 也可以和其他产 L-赖氨酸的 细菌混合发酵生产 L-赖氨酸， 或者以其他方式应用于发酵生产 L-赖氨酸中。 在本文中， 如无特别限定 （如未以"改造获得"来限定）， 术语"细菌"是未改造或改造前的细菌， 其染 色体的乌头酸酶基因及该基因座位前后的调控 元件是没有使乌头酸酶的酶活性和 /或表 达量降低的乌头酸酶基因及调控元件， 如野生型细菌中的乌头酸酶基因及调控元件。

还如， 在第四方面， 本发明提供了改造获得的细菌在提高 L-赖氨酸的发酵量中的应 用， 其中， 所述改造获得是改造细菌染色体上乌头酸酶基 因和 /或其调控元件而获得， 而 且使改造获得的细菌的乌头酸酶的酶活性和 /或表达量降低但不消失。

在本文中， 细菌可以是产 L-赖氨酸的细菌， 如埃希氏菌属或棒杆菌属的细菌。 在一 个优选的方面， 细菌可以是埃希氏菌属细菌， 更优选是大肠杆菌， 如大肠杆菌 K-12菌株 的后续菌株，包括 W3110衍生的菌株；在另一个优选的方面，细菌� ��以是棒杆菌属细菌， 更优选是谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌。 由于现有技术几乎没有在 L-赖氨酸生产 /发酵中关 注过细菌的乌头酸酶基因和 /或其调控元件， 改造的染色体的基因大多集中于 pnt、 dap及 ppc等基因座位上， 因此现有技术中的产 L-赖氨酸的细菌（尤其是埃希氏菌属或棒杆菌� �� 的细菌， 如大肠杆菌、 谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌） 的乌头酸酶基因和 /或其前后的调控 元件没有被报道改造过， 因此基本上都带有野生型的乌头酸酶基因及其 前后的调控元件， 基本上都可以采用本发明的方法进行改造， 提高 L-赖氨酸的发酵量。 在本发明的具体实 施方式中， 无论高产还是低产 L-赖氨酸的细菌， 通过本发明的方法进行改造， 都能使得 L-赖氨酸的发酵量得到提高。

更本质地， 在第五方面， 本发明提供了改造细菌的方法， 其包括改造所述细菌染色体 上乌头酸酶基因和 /或其调控元件，使改造获得的细菌的乌头酸� �的酶活性和 /或表达量降 低但不消失。 本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够 用于发酵生产或产生 L-赖氨酸。 因此， 在第六方面， 本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获 得的细菌。

经本发明人试验发现，埃希氏菌属细菌（如， 大肠杆菌）中许多的乌头酸酶基因（acnA) 的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示， 棒杆菌属细菌 （如， 谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌） 中许多的乌头酸酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 2所示，对这些乌头酸酶基因进行改 造， 使改造获得的细菌的乌头酸酶的酶活性和 /或表达量降低但不消失， 能够提高 L-赖氨 酸的发酵量。所以，在本发明的具体实施方式 中，所述乌头酸酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1或 2所示。 对于其他细菌， 通过测序和序列同一性比较等手段， 也能够获得细 菌中的乌头酸酶基因的核苷酸序列， 从而根据本发明的方法进行改造。

在本发明中，优选的改造细菌染色体上乌头酸 酶基因是对所述乌头酸酶基因的核苷酸 序列进行添加、 缺失或替换一个或多个核苷酸， 只要能够使改造获得的细菌的乌头酸酶 的酶活性和 /或表达量降低但不消失即可。

根据本发明人的经验， 细菌经过长期进化， 提高其酶的活性和 /或表达量通常较为困 难， 可选的改造位点需要精细研究， 而降低其酶的活性和 /或表达量相对方便。 例如， 可 以突变酶结构域外的核苷酸序列。 在本发明中， 优选的改造细菌染色体上乌头酸酶基因 可以是对所述乌头酸酶基因的核苷酸序列进行 替换一个或多个核苷酸。 例如， 替换包括 对所述乌头酸酶基因的起始密码子进行替换， 优选替换为 GTG。 这对于大肠杆菌、 谷氨 酸棒杆菌和北京棒杆菌等均可进行。 在本发明中， 优选的改造细菌染色体上乌头酸酶基 因也可以是对所述乌头酸酶基因的核苷酸序列 进行缺失一个或多个核苷酸。 例如， 缺失 包括对所述乌头酸酶基因的核苷酸序列进行缺 失， 优选缺失 1-120个核苷酸， 更优选缺 失 1-90个核苷酸， 最优选缺失 90个核苷酸， 如对所述乌头酸酶基因的核苷酸序列的终 止密码子前缺失 90个核苷酸。这对于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌� ��北京棒杆菌等均可进行。

在本文中， 调控元件指的是位于基因（如， 乌头酸酶基因）的上游或下游并能调控该 基因的转录和 /或表达从而影响该基因表达量的多核苷酸， 包括非编码序列和编码序列。 调控元件可以是基因的启动子、 增强子、 阻遏序列或其他与转录和 /或表达调控相关的多 核苷酸。 优选的调控元件可以是启动子。 在本发明的一个具体实施方式中， 所述启动子 的核苷酸序列如 SEQ ID No: 4或 6所示。优选的调控元件也可以是阻遏序列， 如转录阻 遏蛋白。 在本发明的一个具体实施方式中， 所述转录阻遏蛋白的核苷酸序列如 SEQ ID No: 7所示。 通过对启动子和 /或阻遏序列进行改造， 能够使改造获得的细菌的乌头酸酶 的酶活性和 /或表达量降低但不消失。

在本发明中，优选的改造细菌染色体上乌头酸 酶基因的调控元件是对所述乌头酸酶基 因的调控元件的核苷酸序列进行添加、 缺失或替换一个或多个核苷酸， 只要能够使改造 获得的细菌的乌头酸酶的酶活性和 /或表达量降低但不消失即可。

根据本发明人的经验，细菌经过长期进化，提 高其启动子或增强子的转录活性通常较 为困难， 可选的改造位点需要精细研究， 而降低其启动子或增强子的转录活性对方便。 例如， 可以添加一个或几个核苷酸序列以增加启动子 和基因的起始密码子之间的距离， 或者用弱转录启动子替换原来存在的启动子。 在本发明中， 优选的改造细菌染色体上乌 头酸酶基因的调控元件可以是对所述乌头酸酶 基因的启动子进行替换一个或多个核苷 酸， 如替换为弱转录启动子， 更优选替换为如 SEQ ID No: 3或 5所示的核苷酸序列。

另外，在本发明中，优选的改造细菌染色体上 乌头酸酶基因的调控元件也可以是对所 述乌头酸酶基因的转录阻遏蛋白的核苷酸序列 进行添加， 如添加新的转录阻遏蛋白的核 苷酸序列或者增加原有的转录阻遏蛋白的核苷 酸序列的拷贝数。 转录阻遏蛋白可以添加 在启动子 （尤其是强转录启动子） 之后以增加其表达量， 从而更有效地抑制乌头酸酶基 因的转录。在本发明的具体实施方式中， 添加的是串联如 SEQ ID No: 8和 7所示的核苷 酸序列。

另外， 本发明还提供了可以用于上述方法中的中间产 物， 如多核苷酸和 /或载体等物 质， 以及它们的应用等。 例如， 在第七方面， 本发明提供了多核苷酸， 其核苷酸序列选 自，

(a) 对如 SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列的起始密码子进行替换 （优选替换为 GTG) 后获得的核苷酸序列；

(b) 对如 SEQ ID No: 1或 2所示的核苷酸序列进行缺失 （优选缺失 1-120个核苷酸， 更优选缺失 1-90个核苷酸，最优选缺失 90个核苷酸）后获得的核苷酸序列，如对如 SEQ ID No: 1或 2所示的核苷酸序列的终止密码子前缺失 90个核苷酸后获得的核苷酸序列； 和，

(c) 串联如 SEQ ID No: 8和 7所示的核苷酸序列。

在第八方面， 本发明提供了载体， 其包含本发明第七方面的多核苷酸。

在第九方面， 本发明提供了本发明第七方面的多核苷酸和 /或本发明第八方面的载体 在本发明第一、 二、 三和 /或四方面的方法或应用中的应用。 即在本发明第一、 二、 三和 /或四方面的方法或应用中，使用了本发明提� �了本发明第七方面的多核苷酸和 /或本发明 第八方面的载体。

在第十方面， 本发明提供了本发明第七方面的多核苷酸和 /或本发明第八方面的载体 在制备本发明第五方面的细菌中的应用。 即在制备本发明第五方面的细菌中， 使用了本 发明提供了本发明第七方面的多核苷酸和 /或本发明第八方面的载体。 本发明的有益效果在于， 开辟并且实践证明了新的提高 L-赖氨酸的发酵量的方式， 对于高产和低产 L-赖氨酸的细菌都适用， 而且与现有改造的大量高产 L-赖氨酸的细菌的 染色体改造位点没有冲突， 观察到了可以叠加提高产量的效果， 从而在实践上可用于细 菌发酵生产 L-赖氨酸， 便于推广应用。 为了便于理解， 以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地 描述。需要特别指出的 是， 这些描述仅仅是示例性的描述， 并不构成对本发明范围的限制。 依据本说明书的论 述， 本发明的许多变化、 改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的 。

另外， 本发明引用了公开文献， 这些文献是为了更清楚地描述本发明， 它们的全文 内容均纳入本文进行参考， 就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一 样。 具体实 式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如 未特别指明，实施例中所用的技术手段 为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的 常用仪器、 试剂， 可参见 《分子克隆实验 指南 （第 3版）》 （科学出版社）、 《微生物学实验 （第 4版）》 （高等教育出版社） 以及相 应仪器和试剂的厂商说明书等参考。 实施例 1 替换乌头酸酶的起始密码子 ATG为 GTG 以抽提的野生型大肠杆菌 E. coli K12 W3110菌株 （可购自日本技术评价研究所生物 资源中心 (NITE Biological Resource Center, NBRC) ) 基因组染色体为模板， 以引物 P1和 P2、 P3和 P4分别进行 PCR扩增，获得长度分别为 510 bp和 620 bp的两条 DNA片段（分 别命名为 Upl和 Downl片段）。其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 。C 退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 30 s (秒） （30个循环）。 其中， 引物序列如下： P1： 5 '-CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-S '

P2： 5 ' -TCTCGTAGGGTTC ACC ACACAGCTCCTCCTTAATGACAGG -3 '

P3： 5 '-CCJ'GTCATTAAGGAGGAGCTGTGTCGTCAACCCTACG AG A-3 '

P4: fy -ATTGCGGCCGC FCC ATTCACCGTCC']: GCA AT- 3 '

将上述两条 D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， 再以上述两条 D N A片段混 合为模板， 以 P1 和 P4为引物， 通过 Overlap PCR扩增长约 1200 bp 的片段 (命名为 Up-Downl片段)。其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 60 s (秒） （30个循环）。

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-Downl和 pKOV质粒 （可购自 Addgene公司） 分别用 Bam Hi/Not I进行双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于导入的 载体 pKOV-Up-Downl， 并将载体 pKOV-Up-Downl送测序公司进行测序鉴定， 表明其含 有正确点突变 （A-G) 的 acnA基因片段， 保存备用。

将构建好的 pKOV-Up-Downl质粒分别电转化入低产 L-赖氨酸的 E. coli NRRL B- 12185菌株 （可购自美国农业菌种保藏中心 （ Agricultural Research Service Culture Collection; NRRL); 其构建方法可参见 US4346170A) 和高产 L-赖氨酸的 E. coli K12 W3110 Δ3菌株 （可购自中科院微生物研究所， 其为经 E. coli K12 W3110诱变突变得到 的赖氨酸生产工程菌） （经测序确认这两个菌株染色体上均保留有野 生型的 acnA基因 (即 Genbank登录号 U00096.2中的 1333855至 1336530位及其上下游元件）， 于 30 °C、 100 rpm, 在 LB培养基中复苏 2 h后， 根据 Addgene公司的 pKOV质粒的商品指南， 挑 选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染 色体上的野生型 acnA基因的起始密码子由 ATG突变为 GTG， 分别得到 acnA起始密码子突变的 （低 /高产 L-赖氨酸） 大肠杆菌， 分 别被命名为 YP-13633和 YP-13664。 经检测， 获得的两个菌株的乌头酸酶表达量下降了 约 75~85% (在不同培养基中略有差异）。 实施例 2乌头酸酶基因序列突变降低乌头酸酶活性

( 1 ) 大肠杆菌的构建

缺失大肠杆菌 acnA基因终止密码子前 90 bp碱基以降低乌头酸酶活性。 具体而言， 以抽提的野生型大肠杆菌 E. coli K12 W3110基因组染色体为模板， 以引物 P5和 P6、 P7 和 P8分别进行 PCR扩增， 获得长度分别为 752 bp和 657 bp的两条 DNA片段 （Up2和 Down2片段）。 其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 30 s (秒） （30个循环）。 其中， 引物序列如下：

P5： 5 ' -CGCGGATCCCGTCACACGATCCGATACCT-3 '

P6: 5 " -CGGCA AGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACC AT -3'

P7: 5' -ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTATTTGCTTGCCG-3 '

P8: 5 ATTGCGGCCGC CATGGGGCGATTTCCTGATG- 3

将上述两条 D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， 再以上述两条 D N A片段混 合为模板， 以 P5和 P8为引物， 通过 Overlap PCR扩增长约 1400 bp 的片段 (命名为 Up-Down2片段)。其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 60 s (秒） （30个循环）。

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-Down2和 pKOV质粒 （可购自 Addgene公司） 分别用 Bam Hi/Not I双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于导入的载体 _P KOV-Up-Down2, 并将载体 pKOV-Up-Down2送测序公司进行测序鉴定， 表明其含有终 止密码子前 90 bp碱基缺失的 acnA基因片段， 保存备用。

根据 Addgene公司的 pKOV质粒的商品指南， 将构建好的 pKOV-Up-Down2质粒分 别电转化入低产 L-赖氨酸的 E. coli NRRL B-12185菌株；其构建方法可参见 US4346170A) 和高产 L-赖氨酸的 E. coli K12 W3110 Δ3菌株 （经测序确认这两个菌株染色体上均保留 有野生型的 acnA基因及其上下游元件）， 挑选出同源重组阳性的单克隆， 经测序确认其 染色体上的野生型 acnA基因的终止密码子前 90 bp碱基缺失， 分别得到 acnA酶活性降 低的 （低 /高产 L-赖氨酸） 大肠杆菌， 分别被命名为 YP-13675和 YP-13699。 经检测， 获 得的两个菌株的乌头酸酶酶活性下降了约 60~80% (在不同培养基中略有差异）。

(2) 棒状杆菌 （Corynebacterium) 的构建

缺失棒状杆菌 acn基因终止密码子前 90 bp碱基以降低乌头酸酶活性。构建过程基本 按照上述过程 （1 ) 相同的步骤， 所不同的是： 以北京棒杆菌 AS1.299 (Corynebacterium pekinense, 其与谷氨酸棒杆菌相似， 有时会被误认为是谷氨酸棒杆菌） （可购自中国普通 微生物菌种保藏管理中心（CGMCC) )的基因组为模板， 以下引物 P9~P12分别对应于上 述引物 P4~P8， 扩增出的 Up2片段为 542 bp， Down2片段为 527 bp， Up-Down2片段为 约 1069bp， 其中所用的引物序列如下；

P9： 5 ' -CGGGATCCTGCAGCTCAGTACTTGGAT-3 '

P10: 5 ' - AAAGTCTTCTAATTAC TTACTGCGTCGAACTCGACG-3 '

P11 : 5' -GTTCGACGCAGTAAGTAATTAGAAGACTTTTGAT-3 '

P12: 5' -TCCCCCGGGGAATACCGGGTCGGTGCG-3 '

然后将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-Down2片段和 pK18mob _SaC B质粒（可购自 美国典型微生物保藏中心 （ATCC) ) 分别用 Bam ffl/Sma l双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分 离纯化后连接， 获得缺失 acn 基因终止密码子前的 90 bp 碱基的重组载体 pK18mobsacB-Up-P-Down, 测序鉴定正确后， 将构建好的 pK18mobsacB-Up-Down2质粒 分别电转化入低产 L-赖氨酸的北京棒杆菌 AS1.299菌株、 低产 L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌

( Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032菌株 （可购自 ATCC)和高产 L-赖氨酸的北 京棒杆菌 AS1.563菌株（可购自中国普通微生物菌种保藏� �理中心） （后两者经测序确认 其染色体上均保留有北京棒杆菌 AS1.299的 acn基因， 其基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示）， 于 30 V、 120 rpm, 在 BHIS培养基中复苏 2 h， 然后选择出同源重组阳 性的单克隆， 经测序确认正确后， 分别得到 acn基因突变的 （低 /低 /高产 L-赖氨酸）棒状 杆菌， 分别被命名为 YP-14808 、 YP-14852和 YP-14837。 实施例 3用弱转录活性的启动子替换乌头酸酶基因的� �动子

( 1 ) 大肠杆菌的构建

通过对 E. coli K12 W3110中 acnA上游序列分析， 我们提供了弱转录启动子（序列如 SEQ ID No: 3所示：)，来替换 acnA基因 ORF上游野生型的启动子区域（序列如 SEQ ID No: 4所示）， 以减弱野生型 acnA基因的强度。

具体而言， 以抽提的野生型大肠杆菌 E. coli K12 W3110基因组染色体为模板， 以引 物 P13和 P14、 P15和 P16分别进行 PCR扩增,获得长度分别为 580 bp和 618 bp的两条 DNA片段 （分别命名为 Up3和 Down3片段）。 以含有上述弱转录启动子的质粒为模板， 以 P17和 P18进行 PCR扩增，获得长度为 161 bp的弱转录启动子片段（命名为 P片段）。 其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °〇延 伸 30 s (秒） （30个循环）。

将上述三条 D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， 再以上述 Up3和 P片段混合 为模板， 以 P13和 P18为引物， 通过 Overlap PCR扩增长约 716 bp的片段 (命名为 Up-P 片段)。 其中， PCR按如下方式进行： 94 °C变性 30s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 60 s (秒） （30个循环）。

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-P和 Down3片段为模板，以 P13和 P16为引物， 通过 Overlap PCR扩增长约 1334 bp的片段 (命名为 Up-P-down片段)。其中， PCR按如下 方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 60 s (秒） （30 个循环）。

上述所用的引物序列如下：

P13: 5 ' -CGCGGATCCGAAGAAATTGAGGTC ATGTT -3'

P14: 5'- GGTTTCTTAGACGTCGGATTCGTTTCGTTTCTGTTTCATT-3'

P15: 5'- ATCAGCAGGACGCACTGACCCATTAAGGAGGAGCTATGTCG -3'

P16: 5'- ATTGCGGCCGCTCCATTCACCGTCCTGCAATT -3' P18: 5'- CGACATAGCTCCTCCTTAATGGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT -3' 将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-P-down片段和 pKOV质粒（可购自 Addgene公 司） 分别用 Bam Hi/Not I双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于导入的 载体 pKOV-Up-P-Down， 并将载体 pKOV-Up-P-Down送测序公司进行测序鉴定， 表明其 含有正确的弱转录启动子序列， 保存备用。

将构建好的 pKOV-Up-P-Down 质粒分别电转化入低产 L-赖氨酸的 E. coli NRRL B-12185菌株和高产 L-赖氨酸的 E. coli K12 W3110 Δ3菌株（经测序确认这两个菌株染色 体上均保留有野生型的 acnA基因及其上下游元件 （其上游启动子如 Genbank 登录号 CP004009.1的第 2102518 至 2102713位）， 于 30 °C、 100 rpm, 在 LB培养基中复苏 2 h 后， 根据 Addgene公司的 pKOV质粒的商品指南， 挑选出同源重组阳性的单克隆， 经测 序确认其染色体上的野生型 acnA基因的上游启动子被替换为弱转录启动子� � 分别得到 acnA启动子突变的（低 /高产 L-赖氨酸）大肠杆菌，分别被命名为 YP-13627和 YP-13682。 经检测， 在不同培养基中， 这两个菌株的乌头酸酶的表达量均有 65~80%的下降。

(2) 棒状杆菌的构建

通过对棒状杆菌中 acn上游序列分析，我们提供了弱转录启动子 (序列如 SEQ ID No: 5所示)，来替换棒状杆菌 acn基因 ORF上游 166 bp的野生型的启动子区域（序列如 SEQ ID No: 6所示）。 构建过程基本按照上述过程 （1 ) 相同的步骤， 所不同的是：

以北京棒杆菌 AS1.299 (可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心） 的基因组为模 板，以下引物 P19~P24分别对应于上述引物 P13~P18，扩增出的 Up3片段为 573 bp, Down3 片段为 581 bp， P片段为 130 bp， Up-P-down片段为约 1284 bp， 其中所用的引物序列如 下；

P19: 5 ' -CGGGATCCGCCA AAGC AACC AACCCC -3'

P20: 5 '-CTTTTTAGTTTTCAACGGTCGGATTTGCTCGAAAT-3 '

P21 : 5'- GCCGAAAC AAAGTAGCCGAAGCAGACGCCGTCG -3'

P22: 5' -CGG AATTCTG ACCTGGTGG ACGATAC-3 '

P23: 5' -CGAGCAAATCCGACCGTTGAAAACTAAAAAGCTGG-3 '

P24: 5' -GCGTCTGCTTCGGCTACTTTGTTTCGGCCACCC-3 '

然后将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-P-down片段和 pK18mob _SaC B质粒分别用 Bam ffl/Eco RI进行双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于启动子替换的 重 组 载 体 pK18mobsacB-Up-P-Down ， 测 序 鉴 定 正 确 后 ， 将 构 建好 的 pKl 8mobsacB-Up-P-Down质粒分别电转化入低产 L-赖氨酸的北京棒杆菌 AS1.299菌株、 低产 L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032菌株和高产 L-赖氨酸的北京棒杆菌 AS1.563 菌株 （后两者经测序确认其染色体上均保留有北京 棒杆菌 AS1.299的 acn基因及其上下 游元件）， 于 30 V、 120 rpm, 在 BHIS培养基中复苏 2 h， 然后选择出同源重组阳性的 单克隆， 经测序确认正确后， 分别得到 acn启动子突变的 （低 /低 /高产 L-赖氨酸）棒状杆 菌， 分别被命名为 YP-14755 、 YP-14732和 YP-14780。 实施例 4添加乌头酸酶基因转录阻遏蛋白编码基因 acnR的拷贝数 增加 acn转录阻遏蛋白编码基因 acnR的拷贝数， 以降低 acn基因的转录水平。 具体 而言， 以北京棒杆菌 AS1.299的基因组为模板， 以引物 P25和 P26、 P27和 P28分别进行 PCR扩增，获得长度分别为 715 bp和 797 bp的两条 DNA片段（分别命名为 Up4和 Down4 片段）； 以引物 P29和 P30进行 PCR扩增， 获得长度为 567 bp的 acnR片段 （命名为 R 片段，其核苷酸序列如 SEQ ID No: 7所示)。另夕卜，以表达质粒 pXMJ19 (可购自 Biovector Science Lab, Inc公司） 为模板， 由引物 P31和 P32进行 PCR扩增， 获得长度为 164 bp 的强启动子 P ^ (命名为 P _tac 片段， 其核苷酸序列如 SEQ ID No: 8所示)。 其中， PCR按 如下方式进行： 94 °C变性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 30 s (秒） ( 30个循环）。

上述所用的引物序列如下：

P25 : 5 ' -CGGGATCCTTCGCAACCGATAGAGCA-3 '

P26: 5 ' -CACGAATTATGCAGAATAAGCCTTTAAGTAACAA-3 '

P27: 5 ' -TAAACGCGACTAAGCGTGACCATTAAAAGGCT-3 '

P28: 5 ' -CGGAATTCAAAAGCCTATTAAGTGTC-3 '

P29: 5 ' -TTCACACAGGAAAGTGTCCGTAGCGGCAGGCGA-3 '

P30: 5 ' -TTTAATGGTC ACGC TTAGTCGCGTTTACGGACAG-3 '

P31： 5 ' -TTAAAGGCTTATTCTGCATAATTCGTGTCGCTC-3 '

P32: 5 ' -GCCGCTACGGACACTTTCCTGTGTGAAATTGTTA-3 '

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 R片段和 P _tac 片段混合为模板， 以 P31和 P30为引 物， 通过 Overlap PCR扩增长约 731 1¾)的片段(命名为1 ^-1 片段)； 将琼脂糖凝胶电泳分 离纯化后的 Up4和 P _tac -R片段混合为模板， 以 P25和 P30为引物， 通过 Overlap PCR扩 增长约 1446 bp 的片段 (命名为 Up4-P _tae -R 片段)； 将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up4-P _tac -R和 Down4片段混合为模板， 以 P25和 P28为引物， 通过 Overlap PCR扩增长 约 2243 bp的片段(命名为Up-P _tac -R-Do _W n片段)。 其中， PCR按如下方式进行： 94 °〇变 性 30 s (秒）， 52 °C退火 30 s (秒）， 以及 72 °C延伸 60 s (秒） （30个循环）。

然后将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-P _tae -R-D _0wn 和 pK18mob _SaC B质粒分别用 Bam HI/Eco RI进行双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于在染色体的非 编码区位点插入额外拷贝的 acnR的重组载体 pK18mobsacB-Up-P _tac -R-Down， 并将载体 pKl 8mobsacB-Up-P _tac -R-Down送测序公司进行测序鉴定，表明其� �有 P _tac -acnR基因片段， 保存备用。

将构建好的 pK18mobsacB-Up-P _tae -R-Do _W n质粒分别电转化入低产 L-赖氨酸的北京棒 杆菌 AS1.299菌株、 低产 L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032菌株和高产 L-赖氨酸的 北京棒杆菌 AS1.563菌株。 于 30 V、 120 rpm, 在 BHIS培养基中复苏 2 h， 然后选择出 同源重组阳性的单克隆， 经测序确认正确后， 分别得到染色体的非编码区位点插入了额 外拷贝的 acnR基因的 （低 /低 /高产 L-赖氨酸） 棒状杆菌， 分别被命名为 YP-14857 、 YP- 14896和 YP-14860。 实施例 5赖氨酸发酵魏

对于 E. coli的发酵， 将 E. coli K12 W3110 A3菌株、 E. coli NRRL B-12185菌株以及 实施例 1_3构建的 E. coli菌株分别接种在 25 mL表 1所述的种子培养基中， 于 37 。C、 220 rpm培养 9 h。 然后取 1 mL种子培养基的培养物接种在 25 mL表 1所述的发酵培养 基中， 于 37 V、 220 rpm培养培养 48 h。 当培养完成时， 通过 HPLC测定 L-赖氨酸的产 生。

表 1 E. coli培养基配方

种子培养基配方 发酵培养基配方

(成分） ( g/L) ( g/L)

葡萄糖 15 40

硫酸铵 4 10

磷酸二氢钾 3 1.6

七水硫酸镁 0.4 1

七水硫酸亚铁 0.01 0.03

一水硫酸锰 0.01 0.03

酵母提取物 2.0 4.0 碳酸钙 25

KOH pH 7.0 pH 7.0

L-酪氨酸 0.1

L-蛋氨酸 0.5

L-苏氨酸 0.1

L-异亮氨酸 0.05

对于棒状杆菌的发酵， 将棒状杆菌 AS1.299菌株、 ATCC13032菌株和 AS1.563菌株 以及实施例 2-4构建的棒状杆菌菌株分别接种在 30 mL表 2所述的种子培养基中， 于 30 V、 220 rpm培养 8 h。 然后取 1 mL种子培养基的培养物接种在 30 mL表 2所述的发 酵培养基中， 于 30°C、 220 rpm培养培养 48 h。 当培养完成时， 通过 HPLC测定 L-赖氨 酸的产生。 表 2棒状杆菌培养基配方

结果如表 3所示，无论对于大肠杆菌还是棒状杆菌，对� �应菌株的乌头酸酶本身结构 进行突变 （如， 缺失或替换） 以降低该酶的活性， 或者对相应菌株的乌头酸酶基因的调 控元件进行改造 （如， 替换和插入） 以降低该酶的表达量， 都有助于 L-赖氨酸产量的提 高。 表 3 各种菌株的 L-赖氨酸产量

菌株 L-赖氨酸产量 （g/L) 产量提高比率 （％)

E. coli NRRL B-12185 1.5 -

YP-13633 2.1 40

ΥΡ-13675 1.8 20

ΥΡ- 13627 2.0 33

Ε. coli K12 W3110 Δ3 10.2 -

ΥΡ- 13664 16.1 57.8

ΥΡ-13699 12.5 22.5

ΥΡ-13682 14.1 38.2 棒状杆菌 AS 1.299 1.2 -

ΥΡ-14808 1.6 33

ΥΡ-14755 1.9 58

ΥΡ-14857 1.4 17 棒状杆菌 ATCC 13032 1.1 -

ΥΡ-14852 1.5 36

ΥΡ-14732 2.0 82

ΥΡ-14896 1.3 18 棒状杆菌 AS1.563 23.5 -

ΥΡ-14837 27.4 16.6

ΥΡ-14780 31.2 32.8

ΥΡ-14860 25.6 8.9