CAÑAS PORTILLA, Ana Isabel (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
MARTÍNEZ FERRER, Ángel (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
PLOU GASCA, Francisco José (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
BALLESTEROS OLMO, Antonio (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
MARTÍNEZ HERNÁNDEZ, María Jesús (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
RECORD, Éric (L'institut National De La Recherche Agronomique, 147 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, F-75338, FR)
ASTHER, Marcel (L'institut National De La Recherche Agronomique, 147 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, F-75338, FR)
ALCALDE GALEOTE, Miguel (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
L'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) (10%) (147 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, Paris Cedex 07, F-75338, FR)
CAMARERO FERNÁNDEZ, Susana (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
CAÑAS PORTILLA, Ana Isabel (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
MARTÍNEZ FERRER, Ángel (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
PLOU GASCA, Francisco José (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
BALLESTEROS OLMO, Antonio (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
MARTÍNEZ HERNÁNDEZ, María Jesús (Centro De Investigaciones Biológicas, C/ Ramiro de Maeztu 9, Madrid, E-28040, ES)
RECORD, Éric (L'institut National De La Recherche Agronomique, 147 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, F-75338, FR)
ASTHER, Marcel (L'institut National De La Recherche Agronomique, 147 Rue de l'Université, Paris Cedex 07, F-75338, FR)
ALCALDE GALEOTE, Miguel (Instituto De Catálisis Y Petroleoquímica, Campus de Cantoblanco, Madrid, E-28049, ES)
| 54 REIVINDICACIONES 1. Polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29. 2. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17o la SEQ ID NO: 19. 3. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29. 4. Construcción genética de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 2, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar. 5. Construcción genética según Ia reivindicación 4 que además comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 3, 55 b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. Ia secuencia polinucleotídica de (a) ó (b) operativamente enlazada con un polinucleótido aislado según Ia reivindicación 1 , para su transcripción in vitro o in vivo. 6. Construcción genética según Ia reivindicación 5, en Ia que el polinucleótido que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 se encuentra operativamente enlazado con el polinucleótido que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 29. 7. Uso de los polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o de las construcciones genéticas según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para producir lacasas fúngicas de alto potencial redox. 8. Método para generar lacasas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, que comprende: a. diseñar una construcción genética que comprenda Ia SEQ ID NO: 31 operativamente enlazada a Ia SEQ ID NO:33, b. generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a), y crear las librerías de mutantes, c. seleccionar los mejores mutantes de expresión y actividad. 9. Método según Ia reivindicación anterior que además comprende Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde Ia construcción genética del paso a) es Ia construcción genética según Ia reivindicación 5. |
DIRIGIDA.
La invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular, Ia tecnología del ADN recombinante y Ia biotecnología. Específicamente se refiere a enzimas oxidasas de tipo lacasa mejoradas en su expresión funcional y actividad catalítica, sus usos y el procedimiento para su obtención. La expresión funcional y mejora de actividad de las lacasas se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dichas enzimas pueden emplearse como catalizadores en procesos industriales relacionados con Ia transformación de Ia biomasa lignocelulósica para Ia obtención de biocombustibles o Ia elaboración de productos de madera y papel con nuevas propiedades, para el sector alimentario, Ia producción textil y el sector químico, así como para Ia biorremediación de efluentes y contaminantes ambientales.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son un grupo de oxidasas ampliamente distribuido en plantas superiores y en hongos, aunque también se han descrito en algunas bacterias e incluso en cutículas de insectos (Alcalde, 2007. En: Industrial enzymes. Structure, function and applications. Ed. Polaina, J. y MacCabe, AP. Springer, Heidelberg (Alemania), pp. 459-474). Pertenecen a Ia familia de las oxidasas multicobre azul (junto con las ascorbato oxidasa y Ia ceruloplasmina), y se presentan generalmente como glicoproteínas monoméricas extracelulares.
Las lacasas, individualmente, catalizan Ia oxidación de un amplio espectro de sustancias orgánicas aromáticas. Entre ellas se encuentran los orto y para-difenoles, los fenoles metoxi-substituidos, los bencenotioles, los hidroxindoles, el 1-naftol y Ia siringaldazina (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3:1-25). Los radicales libres resultantes sufren diferentes reacciones dependiendo de su estructura y de las condiciones de reacción. El acoplamiento de radicales libres generando productos diméricos o poliméricos y las descarboxilaciones oxidativas son las reacciones más frecuentes. También son sustratos de lacasas los compuestos metálicos inorgánicos/orgánicos. El Mn 2+ es oxidado a Mn 3+ y también el Fe (EDTA) 2" es aceptado por Ia enzima (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140:19-26).
La oxidación de todos estos sustratos va acoplada a Ia reducción del oxígeno molecular a dos moléculas de agua. Esto significa que por cada molécula de oxígeno reducida, se oxidan 4 moléculas de sustrato sin producir peróxido de hidrógeno. Por estos motivos, las lacasas se consideran como los catalizadores "verdes" ideales ya que emplean O2 como co-sustrato generando únicamente H2O como subproducto.
Las lacasas contienen un cobre de tipo 1 (T1 ) donde tiene lugar Ia oxidación del sustrato reductor, y un centro o cluster trinuclear con tres cobres, un T2 y dos T3, donde tiene lugar Ia reducción del O2. El mecanismo de reacción debe funcionar como una batería, almacenando electrones de las reacciones de oxidación individuales para reducir el oxígeno molecular y producir agua (Davies, 2002. Lacease. En: Handbook of Metallproteins. (ed A. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368. John Wiley and Sons, LTD, New York).
El potencial redox formal (E 0 ' ) de las lacasas tiene una relación directa con Ia energía requerida para arrancar un electrón al sustrato reductor, constituyendo una de las características fundamentales de estas enzimas. De hecho, el comportamiento catalítico de las lacasas sobre Ia mayoría de los sustratos reductores depende del E° ' en el Cu T1 (aceptor de electrones). De este modo, las lacasas con un mayor E° ' n son de especial interés en biotecnología debido a que son capaces de oxidar sustratos con mayor E° ' como ciertos hidrocarburos aromáticos policíclicos o diversos colorantes orgánicos sintéticos. El E° ' de diferentes lacasas ha sido ampliamente estudiado mediante técnicas espectroelectroquímicas (principalmente voltamperometría cíclica y valoraciones redox) haciendo uso de diferentes tipos de electrodos y mediadores redox (Xu, F. et al., 1998. Biochem. J. 334:63-70; Shleev, S.V. et al. 2004. Biochimie 86:693-703).
El E° ' del Cu T1 de algunas lacasas fúngicas es mayor (E° ' τi cercano a +800 mV) que el de las lacasas de plantas o bacterianas (por ejemplo Ia lacasa de Rhus vernicifera tiene un E 0 Yi= +400 mV) y otras oxidasas multicobre azul (ascorbato oxidasa E 0 Y= +340 mV). Sin embargo, es importante señalar que también existen marcadas diferencias en los E°Y de las diferentes lacasas fúngicas, desde +465 mV de Ia lacasa del ascomiceto Myceliophtora thermophila hasta +790 mV de Ia lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. En este sentido, se ha realizado un enorme esfuerzo con Ia intención de dilucidar qué factores determinan estas diferencias en los E 0 Y, sobre todo si se tienen en cuenta las geometrías de coordinación de los sitios de Cu, prácticamente conservadas. La mayor parte de estos estudios físico-químicos se ha servido del conocimiento aportado por los modelos cristalográficos disponibles. En concreto se ha resuelto a fecha de hoy las estructuras en 3D de 5 lacasas de Coprínus cinereus, Melanocarpus albomyces, Bacillus subtillis, Trámeles versicolor y Pycnoporus cinnabarinus.
Las lacasas de alto potencial redox -procedentes de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca- poseen un enorme potencial biotecnológico debido a su amplia especificidad de sustrato (oxidan fenoles, aminas, tioles, antraceno, etc), y sus bajos requerimientos de aplicación (sólo requieren oxígeno, que es transformado en agua durante Ia reacción). Cuando actúan sobre el polímero de lignina (o compuestos de tipo fenólico) pueden catalizar tanto actividades de degradación como de polimerización. Además, su rango de sustratos puede ser ampliado a compuestos no fenólicos más difíciles de degradar utilizando mediadores redox, de origen natural o sintético, en los denominados sistemas lacasa-mediador (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71 :1775-1784).
La tecnología de las lacasas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente Ia totalidad de Ia cadena de producción de productos papeleros: Ia elaboración de Ia pasta de papel, el blanqueo libre de cloro de las pastas, Ia eliminación del pitch o el tratamiento de efluentes. En Ia industria de productos forestales dos áreas más de investigación emergentes son a) el diseño de materiales lignocelulósicos con nuevas propiedades de resistencia y estabilidad mediante el injerto de compuestos fenólicos catalizado por lacasa, en Ia denominada "funcionalización de las fibras de celulosa"; y b) el uso de lacasas para Ia mejora en Ia adhesión de tableros de madera (mediante el acoplamiento enzimático in situ de Ia lignina), sin necesidad de utilizar adhesivos tóxicos a base de formaldehído.
Además las lacasas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1 :38-50): i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería. ii) La industria textil: degradación (detoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a Ia piedra de jeans). iii) Nanobiotecología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides en Ia elaboración de biosensores para análisis clínicos y medioambientales; y b) elaboración de biopilas de combustible que ofrecen energía eléctrica limpia (sin utilizar combustibles fósiles) mediante Ia inmovilización de lacasas en el cátodo. iv) Biorremediación: degradación de PAHs, compuestos AOX, etc. v) Síntesis química: a) producción de polímeros complejos (ej. policatecol para resinas de cromatografía); b) síntesis de agentes farmacológicos: antitumorales (ej. viblastina), nuevos derivados antibióticos (ej de Ia ciclosporina A), o colorantes (Suberasa® de Novozymes); c) cosméticos: tintes de cabello formulados con lacasa.
La aplicación de las lacasas a nivel industrial requiere de sistemas de expresión robustos que proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita Ia producción de lacasas de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así como de nuevas variantes con propiedades mejoradas con respecto a Ia enzima salvaje.
Por este motivo, se ha estudiado en profundidad Ia expresión heteróloga de lacasas fúngicas en hospedadores eucariotas (Kunameni et al. Microbial CeII Faetones. In press. 2008). Se ha realizado especial hincapié en sistemas de expresión basados en hongos filamentosos {Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae y Tríchoderma reseei); y levaduras (Saccaharomyces cerevisiae, Pichia pastorís, Pichia methalonica, Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis). Gracias a los avances obtenidos en el diseño de biorreactores y a Ia optimización de las condiciones de expresión en levaduras, se han alcanzado niveles de expresión de unos 20 mg de lacasa activa por litro de cultivo en Yarrowia lipolytica o Pichia pastorís. Estos niveles son significativamente inferiores a los 135 mg/L obtenidos en Aspergillus oryzae o los 920 mg/L en Tríchoderma. Sin embargo, Ia elección de levaduras como S. cerevisiae como hospedador ofrece Ia valiosa ventaja de poder mejorar las propiedades catalíticas de las lacasas recombinantes o su estabilidad en las condiciones de operación, mediante técnicas de evolución molecular dirigida.
Se ha estudiado Ia expresión en S. cerevisiae de lacasas de los hongos Coriolus hirsutus, Trametes versicolor, Melanocarpus albomyees, Trametes sp. strain C30, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus coccineus y Pleurotus eryngii, aunque los niveles de expresión funcional detectados han sido mínimos (Kunameni et al., 2008. Microbial CeII Faetones. In press). No obstante, Ia expresión funcional de lacasas fúngicas en S. cerevisiae puede ser incrementada significativamente mediante técnicas de evolución molecular dirigida, que permite el diseño de nuevas funciones enzimáticas no existentes en ambientes naturales o Ia mejora de ciertas propiedades de Ia enzima (Arnold, 2001. Nature 409:253-257). Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de Ia evolución natural (mutación, recombinación y selección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científico y tecnológico. De esta manera, sometiendo los genes seleccionados a ciclos sucesivos de evolución molecular, las diferentes mutaciones puntuales beneficiosas se irán acumulando y combinando hasta adquirir Ia propiedad deseada, que se ve mejorada de manera exponencial, generación tras generación. Utilizando este procedimiento se consiguió incrementar hasta 18 mg/L Ia producción de lacasa del ascomiceto Myceliophtora thermophila en S. cerevisiae (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
En Ia evolución in vitro, mediante mutagénesis aleatoria inducida y/o recombinaciones en el material genético que codifica para una o varias proteínas, se crea una diversidad genética que posteriormente se expresa y explora bajo las condiciones en las que se quiere mejorar Ia enzima (altas temperaturas o medios no convencionales, pHs extremos, etc.). La mayoría de las características enzimáticas -regioespecificidad, enantioespecificidad, termoestabilidad, estabilidad en disolventes orgánicos, expresión génica, incluso Ia búsqueda de actividades de novo en el caso de anticuerpos catalíticos- pueden ser sometidas a experimentos de evolución dirigida (Tao & Cornish, 2002. Curr. Opin. Chem. Biol. 6:858-864.).
Aunque considerando Ia eficiencia de transformación, Ia estabilidad del ADN plasmídico y Ia tasa de crecimiento, E. coli es el organismo hospedador más frecuentemente utilizado en Ia expresión funcional heteróloga de los genes que codifican Ia proteína de interés, el diferente uso de codones, y Ia imposibilidad de realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para Ia correcta secreción de Ia proteína madura (como el procesamiento proteolítico o las glicosilaciones) pueden causar un plegamiento inapropiado de Ia proteína que es acumulada en cuerpos de inclusión, impidiendo su expresión funcional. Esto es especialmente cierto para las lacasas fúngicas para las que no se ha logrado todavía su expresión funcional en E. coli. Algunos de estos problemas pueden evitarse si estos genes se expresan en hospedadores eucarióticos cuya maquinaría celular sea más próxima a Ia nativa, como es el caso de las levaduras. En especial, el uso de Saccharomyces cerevisiae es de gran interés ya que posee Ia habilidad de glicosilar y secretar las proteínas al medio extracelular (Io cual evita en muchos casos pasos intermedios de lisis celular) y tiene una elevada eficiencia de transformación. Además, haciendo uso de un vector episómico adecuado no integra el plásmido dentro de su genoma, facilitando así su posterior manipulación. Otra ventaja muy interesante desde un punto de vista evolutivo es su elevada frecuencia de recombinación de ADN, Ia cual a diferencia de E. coli permite Ia construcción de genotecas in vivo a través de Ia recombinación homologa de diferentes genes (conocido como in vivo ADN shuffling o "barajeo"). Por último, Ia ligación de los genes mutados en vectores de expresión es, en muchos casos, un paso laborioso que requiere un ajuste fino. En levaduras, el mecanismo reparador de huecos (in vivo gap repair) puede sustituir Ia ligación in vitro de una manera rápida y precisa (Bulter & Alcalde, 2003. Directed evolution: library creation. Methods and protocols. Ed. Arnold, F. H. y Georgiou, G. Humana Press, Totowa, New Jersey (EEUU), pp. 17-22.).
La evolución molecular dirigida de lacasas fúngicas presenta como requisito indispensable Ia expresión funcional de Ia enzima en Saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional en S. cerevisiae de lacasas de alto potencial redox -procedentes de basidiomicetos- no se ha descrito con éxito hasta el momento. Únicamente se ha reportado Ia mejora por evolución dirigida de lacasas de bajo potencial de oxido-reducción por nuestro grupo y colaboradores. Dichos trabajos se han centrado en Ia lacasa de bajo potencial redox (E° ' T1 = +475 mV) del ascomiceto Myceliophthora thermophila. En estos trabajos, los niveles de expresión funcional en S. cerevisiae se lograron beneficiándose de Ia similitud existente entre el microorganismo de partida (Myceliophthora thermophila) y S. cerevisiae, ambos ascomicetos. Con este sistema se ha conseguido mediante evolución dirigida: i) su expresión funcional en S. cerevisiae, (Bulter et al.., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995.); y ii) su estabilización en cosolventes orgánicos, (Zumarraga et al., 2007. Chem. Biol. 14: 1052-1064.; Zumarraga et al., 2008. Proteins 71 : 250-260.; Zumarraga et al., 2007 Biocatal. Biotrans. 25: 219-228; Alcalde et al., 2005. J. Biomol. Screen. 10: 624-631 ).
Dado que el rango de actuación de Ia lacasa evolucionada de Myceliophthora thermophila está limitado por su bajo potencial redox (E° ' τi = +475 mV) que Ie impide catalizar eficientemente Ia oxidación de moléculas con potenciales redox superiores al suyo, las lacasas de alto potencial redox producidas por hongos basidiomicetos de podredumbre de Ia madera suponen un punto de partida más adecuado para Ia mejora de las propiedades de Ia lacasa por evolución dirigida debido a su mayor aplicabilidad biotecnológica.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polipéptidos o proteínas generadas mediante varios métodos de evolución dirigida de las secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen de Ia lacasa de alto potencial redox (E° ' T1 = +790 mV) del hongo basidiomiceto Pycnoporus cinnabarínus, y Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal nativa del factor α, dando lugar a una expresión funcional mejorada en S. cerevisiae y/o a una actividad enzimática aumentada hacia uno o más sustratos.
Todos los polinucleótidos y polipéptidos descritos en Ia presente invención se resumen en Ia Tabla 1.
Tabla 1. Polinucleotidos y polipéptidos de Ia invención. Se indica con letra en superíndice aquellos mutantes que comparten idéntica secuencia aminoacídica, tanto para las secuencias nucleotídicas del factor alfa como para las secuencias nucleotídicas de las lacasas maduras.
Así, en un primer aspecto de esta invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29.
Los polinucleotidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 corresponden a variantes de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33), obtenidas mediante un proceso de evolución dirigida, cuya actividad catalítica y/o expresión funcional ha sido mejorada mediante un procedimiento de evolución molecular dirigida.
Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29 corresponden a variantes de Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal nativa del factor α (secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 ) con mutaciones introducidas mediante un proceso de evolución dirigida para mejorar Ia expresión de polipéptidos a los que se encuentran operativamente enlazados.
Por tanto, los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 podrán dar lugar a lacasas cuya actividad catalítica y/o expresión funcional ha sido mejorada, mientras que los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29, mejoraran Ia expresión de los polipéptidos a los que se encuentran operativamente enlazados, particularmente lacasas.
Así, en otro aspecto de esta invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante primer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 1.
El primer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 , secuencia que presentan los mutantes 1 D12 y 3D3 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 2 ó Ia SEQ ID NO: 43, o en sus cadenas complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante segundo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 3.
El segundo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 3, secuencia que presenta el muíante 3G10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 4, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante tercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 5.
El tercer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 5, secuencia que presentan los mutantes 20C7, 5D3 y 9C3 de los ejemplos de Ia invención y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 6, Ia SEQ ID NO: 44 o Ia SEQ ID NO: 45, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante cuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 7.
El cuarto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 7, secuencia que presenta el mutante 10A7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 8, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante quinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 9.
El quinto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 9, secuencia que presenta el mutante 1 F10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 10, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante sexto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 11.
El sexto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarinus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 11 , secuencia que presenta el mutante 1C9 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 12, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante séptimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 13.
El séptimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarinus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 13, secuencia que presenta el mutante 19C8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 14, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante octavo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 15.
El octavo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 15, secuencia que presenta el mutante 7A9 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 16, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante noveno polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 17.
El noveno polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 17, secuencia que presentan los mutantes 5F7 y 2D8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 18 o Ia SEQ ID NO: 46, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante décimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 19.
El décimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 19, secuencia que presenta el muíante 17B7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 20, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Se reportan, por tanto, las secuencias polinucleotídicas de los mutantes obtenidos por evolución dirigida que codifican para variantes de lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad mejorada.
El organismo Pycnoporus cinnabarínus pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungí, Subreino Dikarya, Phylum Basidiomycota, Clase Agarícomycetes, Orden Polyporales, Familia Polyporaceae y Género Pycnoporus.
En otro aspecto de Ia invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante undécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 21.
El undécimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 21 , secuencia que presentan los mutantes 3D3, 19C8 y 2D8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO 47 o Ia SEQ ID NO: 48, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante duodécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 23. El duodécimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 23, secuencia que presenta el muíante 20C7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 24, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimotercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 25.
El decimotercer polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 25, secuencia que presentan los mutantes 5F7 y 3G10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 26 o Ia SEQ ID NO: 49, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético. Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimocuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 27.
El decimocuarto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 27, secuencia que presentan los mutantes 1C9, 1 F10 y 1 D12 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 28 Ia SEQ ID NO: 50 ó Ia SEQ ID NO: 51 , o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimoquinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 29.
El decimoquinto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 29, secuencia que presentan los mutantes 7A9, 17B7, 9C3, 5D3 y 10A7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 52, Ia SEQ ID NO: 53, Ia SEQ ID NO: 54 ó Ia SEQ ID NO: 55, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otro aspecto se refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de Ia invención, que comprende, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), preferiblemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.. Esta construcción genética incluye los vectores de clonación y expresión que comprenden los polinucleótidos aislados de Ia invención. Tales vectores de expresión incluyen secuencias de control, tales como, por ejemplo, elementos de control de Ia traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de Ia transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a Ia invención pueden incluir plásmidos y virus, y otros vectores de acuerdo con procedimientos bien conocidos y documentados en Ia técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados en Ia técnica.
Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas (células hospedantes) para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en Ia bibliografía.
Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar Ia replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura libre" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de Ia secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de Ia traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia construcción genética de Ia invención comprende, además, uno de los siguientes tipos de secuencias; a) un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29, ó b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de a), operativamente enlazado con un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, para su transcripción in vitro o in vivo.
Según se muestra en los ejemplos, el muíante 79A presentaría una actividad catalítica y/o expresión funcional superior al resto de los mutantes obtenidos. La secuencia señal del factor α del muíante 79A se recoge en Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 29, y Ia secuencia de Ia enzima lacasa correspondiente al muíaníe 79A se recoge en Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15.
Por íanío, en una realización más preferida de esíe aspecío de Ia invención, el polinucleóíido aislado que codifica el polipépíido de Ia SEQ ID NO: 29 se encueníra operaíivameníe enlazado con el polinucleóíido aislado que codifica el polipépíido de Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15.
La preseníe invención permiíe producir, en caníidades hasía ahora no disponibles, lacasas fúngicas de alio poíencial redox que presenían una mayor expresión funcional así como una mayor acíividad caíalííica.
Así, oíro aspecío se refiere al uso de los polinucleóíidos aislados de Ia invención y/o de Ia consírucción genéíica de Ia invención para producir lacasas fúngicas de alio poíencial redox con mayor expresión funcional y/o mayor acíividad caíalííica
Los polinucleóíidos aislados de Ia invención y/o Ia consírucción genéíica de Ia invención pueden iníroducirse (o íransfecíarse) en una célula hospedadora. Dicha célula hospedadora puede crecerse en un medio de culíivo adecuado, expresándose Ia lacasa codificada por los polinucleóíidos o consírucciones genéíicas de Ia invención. Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a Ia introducción o transferencia de una molécula de ácido nucleico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucleico o desoxiribonucleico (por ejemplo, ARN ó ADN desnudo).
Medios de cultivos adecuados son conocidos en el estado de Ia técnica. Un "hospedador" o "célula hospedadora" o "célula hospedante", como se emplea en esta memoria, se refiere a un organismo, célula o tejido que sirve como diana o recipiente del polinucleótido que codifica una proteína recombinante de interés, donde Ia célula hospedadora se transforma con un vector de expresión conteniendo el polinucleótido de interés. En esta memoria, Ia proteína recombinante de interés es una enzima lacasa de origen fúngico, de alto potencial redox, que presenta una mayor expresión funcional y una mayor actividad catalítica.
Preferiblemente, el hospedador es Saccharomyces cerevissiae. La levadura de cerveza Saccharomyces cerevissiae es un hongo unicelular que pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungí, Subreino Dikarya, Phylum Ascomycota, Subphylum Saccharomycotina, Clase Saccharomycetes, Orden Saccharomycetales, Familia Saccharomycetaceae y Género Saccharomyces.
La presente invención comprende, por tanto, variantes de genes y enzimas del grupo de las lacasas fúngicas de alto potencial redox que presentan una mayor expresión funcional en Saccharomyces cerevisiae así como una mayor actividad catalítica.
Asimismo, Ia invención incluye el procedimiento para producir dichos polinucleótidos y enzimas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, mediante Ia metodología de evolución molecular dirigida. Para ello, se generan miles de mutantes a través de protocolos de creación de diversidad in vitro o in vivo que contienen mutaciones que pueden ser beneficiosas para Ia propiedad a potenciar. Los mutantes creados de esta manera pueden ser producidos de manera sencilla en S. cerevisiae. Para determinar si Ia lacasa de interés sintetizada por el sistema de expresión tiene mejoras en su expresión y en sus propiedades funcionales, se emplean test convencionales. Por ejemplo, para determinar si el polinucleótido sometido a evolución dirigida y expresado en un hospedador foráneo produce lacasas con actividad mejorada, se pueden diseñar experimentos para determinar Ia actividad funcional de Ia proteína. Se pueden analizar una gran cantidad de mutantes de manera precisa y simultánea (high-throughput) mediante el diseño de métodos de exploración o screening, tras los cuales los mejores mutantes pueden ser aislados, purificados y caracterizados. Los mejores mutantes de cada ciclo evolutivo se emplean como parentales o puntos de partida para el siguiente ciclo evolutivo obteniendo de esta manera mejoras exponenciales sobre el parental inicial debidas a Ia acumulación de mutaciones beneficiosas de un ciclo a otro.
Por tanto, en otro aspecto de Ia invención se proporciona un método para generar lacasas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, de ahora en adelante método de Ia invención, que comprende: a) diseñar una construcción genética que comprenda el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 operativamente enlazada con el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33. b) generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a), y crear las librerías de mutantes, d) seleccionar los mejores mutantes de expresión y actividad.
En Ia construcción genética del procedimiento de Ia invención se sustituye Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (de ahora en adelante, n-PcL) por Ia secuencia señal del factor α para favorecer Ia expresión funcional de Ia lacasa madura (PcL) en S. cerevisiae. La secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) se corresponde con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 41 , y Ia secuencia señal del factor α con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31.
En el contexto de Ia presente invención, Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 41 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 42, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
En el contexto de Ia presente invención, Ia secuencia señal nativa del factor α se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 32, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético. En el contexto de Ia presente invención, Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarinus se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 34, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
La secuencia señal del factor α se emplea habitualmente para favorecer Ia secreción de proteínas heterólogas en S. cerevisiae. Dicha secuencia señal se escinde durante Ia maduración de Ia proteína y secreción al medio extracelular, por Io que no forma parte de Ia enzima madura. La nueva construcción (Ia secuencia señal del factor α fusionada con el gen que codifica Ia proteína madura, desde este momento α-PcL) se somete al proceso de evolución dirigida con el fin de aumentar Ia expresión funcional y los valores de actividad total de PcL. Por Io tanto, Ia acumulación de mutaciones beneficiosas tiene lugar tanto en Ia secuencia señal del factor α como en Ia secuencia de Ia lacasa madura (PcL).
La generación de diversidad se lleva a cabo empleando dos herramientas diferentes i) introducción aleatoria de mutaciones puntuales en α-PcL mediante Ia reacción de amplificación del ADN (polymerase chain reaction, PCR) sometida a error y denominada desde este momento PCR mutagénica; y ii) recombinación de ADN de diferentes genes mutados de α- PcL para facilitar Ia acumulación de mutaciones beneficiosas y Ia eliminación de aquellas que se presentan como deletéreas o neutrales, a través de: a) el barajeo in vivo de ADN mutagenizado o b) Ia recombinación in vivo por ensamblaje en Ia levadura.
Las librerías de mutantes se constituyen a través del clonaje in vivo de los genes mutagenizados con el vector de expresión así como de Ia recombinación de las mejores variantes y su transformación en células de S. cerevisiae.
La exploración de alta capacidad o high-throughput para Ia selección de los mejores mutantes de expresión y actividad comprende i) Ia micro- fermentación de los clones que contienen los genes mutados y/o recombinados para Ia expresión funcional de los mejores mutantes de α-PcL en formato placas de 96 pocilios; ii) El screening de las actividades de las enzimas recombinantes secretadas, mediante métodos colorimétricos basados en Ia oxidación de sustratos fenólicos y no fenólicos; iii) re- screenings adicionales para garantizar Ia selección de los genes que expresan mayor proteína y/o actividad lacasa a través del aislamiento, purificación y nuevamente transformación y expresión de los genes previamente seleccionados en S. cerevisiae.
En una realización preferida, el método de Ia invención comprendería Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas.
La identificación y mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas mediante Ia secuenciación del ADN de los mutantes del gen α-PcL obtenidos y localización de dichas mutaciones en el plegamiento global de Ia proteína en base a Ia estructura cristalográfica de Ia lacasa salvaje de Pycnoporus cinnabarínus (Antorini et al., 2002. Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol 1594: 109-11 A).
La obtención de los polinucleótidos y enzimas mejoradas descritas en Ia presente invención podría también llevarse a cabo mediante un método denominado "mutagénesis dirigida" basándose en Ia información de las mutaciones reportadas en Ia presente patente. Esto se debe a que para llevar a cabo este procedimiento es necesario conocer Ia posición exacta y el cambio aminoacídico que se debe incluir en Ia nueva proteína. Este proceso consiste en Ia introducción de cambios puntuales en Ia secuencia de ADN que codifica dicha enzima. Estos cambios se introducen en el ADN codificante (ADNc) complementario del ARN mensajero (ARNm) que codifica Ia α-PcL (y que carece de las secuencias no codificantes, "intrones", presentes en el ADN genómico eucariota), clonado en un vector de expresión. El vector resultante se usa como molde en reacciones en cadena de ADN polimerasa (PCR) en las que se emplea una polimerasa de alta fidelidad con objeto de que los cambios en el ADN se limiten a los deseados. Para cada mutación se diseñan al menos dos oligonucleótidos "cebadores" de Ia reacción de PCR, cuyas secuencias incorporan el cambio adecuado y son complementarias a hebras opuestas de Ia misma región de ADN. La comprobación de que las cadenas de ADN resultantes de Ia PCR portan únicamente las mutaciones deseadas puede lograrse mediante su secuenciación.
En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia construcción genética del paso a) del método de Ia invención comprende un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de entre Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 y Ia SEQ ID NO: 31 operativamente enlazado con un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de entre Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 y Ia SEQ ID NO: 33.
En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un primer ciclo de evolución dirigida del gen parental α-PcL. La fase 1 del procedimiento se lleva a cabo empleando como molde el vector pGAPZα de Invitrogen™ y el ADNc lad de Pycnoporus cinnabarínus, cuya secuencia se encuentra depositada en Ia base de datos de secuencias de ADN GenBank (Gen Bank accession number: AF170093). El fragmento amplificado de α-PcL es subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes) para facilitar Ia expresión funcional en S. cerevisiae y Ia sobreproducción plasmídica en Escherichia coli, (Fig. 1 ). La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo a través de Ia construcción de dos librerías de mutantes con diferente tasa mutacional (promedio de mutaciones puntuales introducidas al azar en el gen parental α-PcL) creadas mediante PCR mutagénica. En Ia Fig. 2 se muestran los paisajes de evolución dirigida de ambas librerías. La primera librería se construyó de forma que el 20 % de los clones explorados tuvieran menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental (librería de índice de mutación medio, LMM). La segunda librería se construyó de forma que el 6 % de los clones explorados tuvieran menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental (librería de índice de mutación bajo, LMB). Tanto LMM como LMB fueron librerías apropiadas para Ia selección de mutantes con mejoras en los niveles de expresión y actividad.
El clonaje de las librerías mutantes con el vector de expresión se lleva a cabo in vivo haciendo uso de Ia maquinaría celular eucariota de S. cerevisiae. Para ello, se co-transforma Ia librería en cuestión con el plásmido de expresión linearizado. Los productos de PCR generados poseen extensiones solapantes de no menos de 50 pares de bases que facilitan el clonaje in vivo y Ia reparación del vector de expresión mediante un proceso de recombinación homologa. Los extremos solapantes se generan gracias al diseño de oligonucleótidos cebadores de Ia reacción de PCR mutagénica que confieran dicha homología con los extremos del vector linearizado.
Para Ia fase 3 del procedimiento se realiza un screening doble empleando ensayos de actividad en modo de punto final con sustratos fenólicos y no fenólicos con Ia finalidad de eludir Ia dependencia de los mutantes seleccionados hacia el sustrato escogido. Los protocolos de re-screenings (en especial el segundo re-screening) se llevan a cabo a partir de células transformantes nuevas para promover Ia sincronización celular y evitar Ia selección de falsos positivos. Los detalles citados para esta fase son también aplicables en todas las realizaciones particulares que se describen a continuación referentes a ciclos evolutivos. De Ia presente realización se seleccionan 4 genes de lacasas mutantes denominados: 1 D12, 5F7, 3D3 y 3G10 con mejoras que van desde 12,6 a 2,3 veces mejor actividad total que el parental α-PcL expresado en S. cerevisiae (Tabla 2, Fig. 3). Desde este momento, se define como actividad total aquella que se deriva de Ia mejora en el nivel de expresión y Ia actividad catalítica de Ia enzima.
En otra realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un segundo ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia primera generación: 1 D12, 5F7, 3D3 y 3G10. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una única librería mutagénica a través de un barajeo in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados. Este enfoque facilita el empuje evolutivo hacia mejoras en Ia actividad total mediante: i) Ia recombinación de las mejores mutaciones de los genes parentales, ii) Ia introducción de nuevas mutaciones puntuales beneficiosas. La recombinación in vivo de los mejores parentales se lleva a cabo mediante una co-transformación de los productos de PCR mutagénica de dichos genes con el vector linearizado en S. cerevisiae. Los extremos solapantes facilitan el clonaje in vivo al tiempo que Ia elevada tasa de recombinación homologa de S. cerevisae favorece Ia recombinación de las mutaciones acumuladas para generar genes quimera.
Tabla 2. Mutaciones del proceso de evolución dirigida. λ Mutación introducida i Mutación acumulada
X(αn)X Mutación en el péptido señal (pre-prolíder del factor α). Se subrayan las mutaciones silenciosas.
Tabla 2 (continuación). Mutaciones del proceso de evolución dirigida.
La fase 3 se lleva a cabo mediante protocolos de ensayo de actividad en modo de punto final. En Ia Fig. 4 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 62 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 6 genes de lacasas mutantes denominados: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8 con mejoras que van desde 17 a 8,7 veces Ia actividad total del mejor gen parental de Ia anterior generación, 1 D12 (Tabla 2, Fig. 3).
En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un tercer ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia segunda generación: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una única librería mutagénica a través de un barajeo in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados, de igual manera que se describe en Ia realización anterior. La fase 3 se realiza mediante protocolos de ensayo de actividad en modo cinético, debido a Ia mayor actividad de partida del tipo parental 10A7. En Ia Fig. 5 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 36 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 4 genes de lacasas mutantes denominados: 7A9, 5D3, 9C3, 17B7 con mejoras que van desde 3,7 a 1 ,3 veces Ia actividad total del mejor gen parental de Ia anterior generación, 10A7 (Tabla 2, Fig. 3).
En una realización particular de Ia presente invención, se determinan las mutaciones introducidas en las distintas variantes generadas durante los tres ciclos de evolución dirigida mediante secuenciación de los genes mutados correspondientes (Tabla 2, Fig. 6, 7). Para Ia interpretación de las mutaciones obtenidas, y si no se indica de otra manera, el número determina Ia posición del residuo mutado en Ia secuencia de aminoácidos original de PcL madura, el primer aminoácido (a Ia izquierda del número) es el original en Ia secuencia de PcL madura y el segundo es aquel por el que se muta. Para el caso de mutaciones en Ia secuencia señal del factor α, el número va acompañado de Ia letra "α". G indica Glicina, V indica Valina, L indica Leucina, I indica Isoleucina, F indica Fenil Alanina, Y indica Tirosina, W indica Triptófano, S indica Serina, T indica Treonina, C indica Cisteína, M indica Metionina, N indica Asparagina, Q indica Glutamina, D indica Ácido Aspártico, E indica Ácido Glutámico, K indica Lisina, R indica Arginina, H indica Histidina y P indica Prolina.
El mejor muíante de Ia última generación, 7A9, acumula 8 mutaciones tras 3 ciclos evolutivos y 6000 clones explorados (Tabla 2, Fig. 6, 7). Cuatro mutaciones se encuentran en Ia secuencia señal del factor α, atribuyéndoles Ia mejora en Ia secreción de Ia enzima. La secuencia señal del factor α comprende 83 aminoácidos, de los cuales 19 constituyen el pre-péptido y 64 el pro-péptido. El pre-péptido es el responsable de Ia inserción de Ia cadena polipéptidica en maduración en el retículo endoplasmático, tras Io cual es escindido por Ia acción de una endo-peptidasa entre los aminoácidos 19 y 20. El pro-péptido interviene en el plegamiento de Ia cadena polipéptidica durante su transición y estancia del retículo endoplasmático al aparato de Golgi. El pro-péptido es escindido en el Golgi antes de que Ia enzima madura sea secretada al exterior mediante Ia actuación de tres proteasas específicas {KEXλ , KEX2 y STE13). De las mutaciones introducidas en Ia secuencia señal del factor α, A(α9)D se localiza en Ia región del pre-péptido y proviene del muíante 1 D12 de Ia primera generación (con mejora de hasta 12,6 veces Ia actividad total de α-PcL) conservándose durante las siguientes recombinaciones en el proceso evolutivo (Fig. 6, 7). La mutación S(α58)G se localiza en Ia región del pro-péptido y proviene del muíante 3D3 del primer ciclo. Se conserva en varios de los mutaníes seleccionados del 2 o ciclo y en los 4 muíaníes seleccionados de Ia 3 a generación. Las muíaciones F(α48)S y E(α86)G, localizadas en el pro-pépíido y en Ia zona de procesamienío del pro-pépíido, respecíivameníe, aparecen en el muíaníe 10A7 de Ia segunda generación como consecuencia de Ia PCR muíagénica, y se conservan en iodos los mutantes selccionados de Ia 3 a generación. Las mutaciones descritas para Ia secuencia señal del factor α (Tabla 2) pueden ser aplicables en Ia expresión heteróloga de cualquier otro gen eucariótico susceptible o deseable de ser expresado en S. cerevisiae (como ejemplos no limitativos se pueden aplicar a genes de lacasas, peroxidasas, glucosas oxidasas, P450 monooxigenasas, galactosas oxidasas, glucosidasas, amilasas, amiloglucosidasas, galactosidasas, celulasas, invertasas, glicosiltransferasas, lipasas, dehalogenasas).
De las 4 mutaciones que aparecen en Ia proteína madura (Tabla 2, Fig. 6, 7), una de ellas es silenciosa (no supone ningún cambio aminoácidico, L457L). Las 3 restantes forman parte de Ia proteína madura apareciendo en zonas conservadas de Ia enzima, en los alrededores del cobre catalítico del sitio T1 y se les atribuye Ia mejora en Ia actividad catalítica de Ia enzima (Fig. 8). La mutación N208S es consecuencia de Ia PCR mutagénica de Ia tercera generación. La mutación D341 N proviene del muíante 19C8 de Ia segunda generación, que muestra una mejora de 11 ,7 veces de acíividad total (respecto al parental) frente a los 8,7 del mutante 2D8 del que sólo se diferencia en Ia mencionada mutación. La mutación P394H es responsable de una mejora de 4,5 veces de Ia actividad total en el mutante 5F7 de Ia primera generación. Esta mutación se conserva durante las siguientes recombinaciones en todo el proceso evolutivo.
La evaluación de Ia mejora de las lacasas mutantes se estima determinando su actividad total a partir de los sobrenadantes de los fermentados celulares a escala de microcultivo (formato 96 pocilios) o por litro de fermentado. En una realización particular de Ia presente invención se evalúa Ia actividad total del mejor mutante de Ia última generación, 7A9, y se cuantifica una actividad de 40 U/L de fermentado, Io que supone una mejora de aproximadamente 3x10 6 veces Ia actividad total del parental inicial α-PcL en S. cerevisiae. La Unidad de actividad catalítica (U) se define como Ia cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de sustrato por minuto bajo las condiciones de reacción.
En una realización particular de Ia presente invención se purifica a homogeneidad y se caracteriza bioquímicamente Ia variante 7A9 y se compara con PcL salvaje (proteína madura expresada en Pycnoporus cinnabarínus y purificada) (Fig. 9). Se determinan los perfiles de actividad frente al pH, Ia termoestabilidad, el grado de glicosilación, y se evalúa Ia eficiencia catalítica en Ia oxidación de diversos sustratos fenólicos y no fenólicos.
La masa molecular de PcL salvaje se estima entorno a los 65 kDa. La masa molecular de 7A9 expresado en S. cerevisiae es aproximadamente 120 kDa. La N-desglicosilación de 7A9 reduce Ia masa molecular hasta ~ 60 kDa, (Fig. 9A). De estos datos se deduce que 7A9 se encuentra hiperglicosilada: aproximadamente el 50 % de Ia masa molecular total son carbohidratos covalentemente unidos a residuos de asparagina de Ia cadena polipeptídica debido a las modificaciones postraduccionales en el organismo hospedador S. cerevisiae. Empleando el servidor Expasy, www.Expasy.org, se calcula Ia masa molecular teórica en 54249,55 Da, un 9.5 % menos de Io observado experimentalmente para 7A9 N-desglicosilada. Esta diferencia en Ia masa molecular puede ser debida a las O-glicosilaciones durante el procesamiento de Ia enzima en el aparato de Golgi.
El perfil de actividad frente al pH se ve desplazado en 7A9, como efecto lateral del proceso de evolución y expresión funcional en S. cerevisiae (Fig. 9B). Así, el pH óptimo de actividad de PcL salvaje se sitúa en 3 mientras que en 7A9 se detecta en 4. Notoriamente, 7A9 retiene el 74 % de su actividad a pH 5.0 (PcL nativa retiene un 52 % al mismo pH).
La termoestabilidad en medio acuoso de 7A9 varia notablemente con respecto a PcL salvaje como consecuencia de Ia expresión funcional y del proceso evolutivo en S. cerevisiae {ej. 7A9 mantiene el 85 % de su actividad tras 24 h de incubación a 40 0 C frente al 57 % retenido por Ia PcL salvaje, Fig. 9C). Se ha sugerido que Ia hiperglicosilación puede aumentar Ia estabilidad enzimática (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987- 995).
La eficiencia catalítica es Ia relación entre Ia K ca t (constante catalítica o número de recambio, que indica Ia velocidad con Ia que un sustrato se convierte en producto) y Ia K m (constante de Michaelis, que indica Ia afinidad de Ia enzima por un sustrato dado) y revela Ia capacidad de una enzima para catalizar Ia modificación de un sustrato dado. El muíante 7A9 es activo frente a una amplia gama de sustratos de diferente naturaleza, con eficiencias catalíticas en el intervalo 100-1500 mM "1 sg "1 Io que pone de manifiesto que el método de screening que se emplea en Ia fase 3 facilita Ia selección de variantes funcionales frente a diferentes compuestos (Tabla 3).
Tabla 3. Constantes cinéticas para ABTS y DMP de PcL salvaje y el muíante 7A9 expresado en S. cerevisiae
El mutaníe 7A9 alcanza unos niveles de expresión funcional en S. cerevisiae deíecíables en modo cinéíico iras 24 h de inducción en medio de expresión (0.72 U/L) en microfermentaciones en formato placa de 96 pocilios (200 μL de volumen final). Estos valores garantizan Ia posible explotación de 7A9 así como de cualquiera de los mutantes generados durante el proceso evolutivo, o de sus mutaciones individuales, para futuras mejoras por evolución dirigida. El disponer de una lacasa fúngica de alto potencial redox del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus expresada funcionalmente y evolucionada en S. cerevisiae confiere las siguientes ventajas: i) La lacasa evolucionada y sus variantes objeto de Ia presente patente constituyen las primeras lacasas de alto potencial redox que han sido sometidas a evolución para su expresión funcional en S. cerevisiae siendo un vehículo idóneo para futuras aplicaciones en diversos sectores (industria de productos forestales -papel y madera-, biorremediación, industria textil, industria alimentaria, industria farmacéutica, industria química), ii) La lacasa evolucionada y sus variantes pueden ser evolucionadas en S. cerevisiae para mejorar diferentes propiedades (termoestabilidad, actividad a pHs básicos, oxidación de sustratos no naturales, resistencia a haluros) para después ser sobre- expresadas en otros huéspedes fúngicos heterólogos (Aspergillus niger) u homólogos (Pycnoporus cinnabarínus) a escala de mg-g/L tal y como se ha descrito para Ia lacasa salvaje de P. cinnabarinus, Io que supone una garantía en Ia transferencia del producto en diversas aplicaciones (Alves et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70:6379-6384; Record E., 2002. Eur. J. Biochem. 269:602-609). iii) La lacasa salvaje de P. cinnabarinus (y también Ia recombinante expresada en Aspergillus niger), ha sido utilizada con éxito en diferentes aplicaciones biotecnológicas (blanqueo y control del pitch de pastas de papel, degradación de contaminantes aromáticos, estabilización de bebidas). La evolución de su actividad catalítica hacia ciertos sustratos o el aumento de Ia estabilidad de Ia proteína en condiciones industriales, aumentará su potencial utilidad biotecnológica. (Patente ES2189683; Georis et al., 2003. Pycnoporus cinnabarinus laceases: an interesting tool for food or non-food applications. Proc. FAB2003, Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschapen, 2003; Ibarra et al., 2006. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81 :1159-1165; Sigoillot et al., 2005. J. Biotechnol. 115:333-343; Gutiérrez et al., 2006. Environ. Sci. Technol. 40: 3416-3422).
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 (Fig.1). Construcción de pJRoC30-α-PcL.
Figura 2 (Fig.2). Paisajes del ensayo de screening frente a 2,6 dimetoxifenol (DMP) de Ia librería de índice de mutación medio (LMM) y Ia librería de índice de mutación bajo (LMB) en Ia primera generación. Las actividades de los clones de las bibliotecas de mutantes se representan en orden descendente. Las líneas discontinuas indican Ia actividad del tipo parental α- PcL.
Figura 3 (Fig.3). Esquema general del proceso de evolución artificial. No se incluye en el diagrama las mutaciones silenciosas introducidas. Las mejoras se calculan con respecto al correspondiente parental empleado como referencia durante el screening del ciclo evolutivo. El parental referente de Ia primera generación es α-PcL, el de Ia segunda generación es 1 D12 y el de Ia tercera generación 10A7.
Figura 4 (Fig.4). Paisaje del ensayo de screening frente a 2,2 ' azino-bis(3- etil-benzotiazolin-6-sulfonato (ABTS) de Ia segunda generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 1 D12). Figura 5 (Fig.5). Paisajes de los ensayos de screening de Ia tercera generación con DMP y ABTS. Las actividades de los clones de las bibliotecas de mutantes se representan en orden descendente. Las líneas discontinuas indican Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 10A7). Los mutaníes con mejor acíividad freníe a ambos susíraíos se eligieron para los siguieníes re-screenings (resallado en circulo Ia variante 7A9). Figura 6 (Fig.6). Recombinación de mutaciones durante el proceso de evolución. Se resaltan en diferentes colores las mutaciones introducidas para apreciar los eventos de entrecruzamiento.
Figura 7 (Fig.7). Comparación entre los mejores mutantes de los tres ciclos evolutivos y Ia acumulación de mutaciones.
Figura 8 (Fig.8). Mutaciones introducidas en Ia lacasa madura durante el proceso evolutivo. A) parental α-PcL; B) muíante 7A9. Las esferas representan los cobres catalíticos. En azul se resaltan los ligandos de los cobres T1 y del cluster trinuclear 12/13. 7A9, acumula además de las tres mutaciones indicadas en esta figura, cuatro mutaciones en el péptido señal y una mutación silenciosa. Se agradece al Prof. Piontek por haber facilitado el acceso al fichero PDB de Ia estructura cristalográfica. Figura 9 (Fig.1). Caracterización bioquímica del muíante 7A9. A) Electroforesis (SDS-PAGE) de los disíiníos pasos de purificación de Ia varianíe 7A9. GeI de poliacrilamida al 7,5 % íeñido con Azul de Coomasie 1 ) Paírón de peso molecular; 2) Concenírado después de ulírafilíración bajo presión con N 2 (membrana de 10 KDa, Amicon YM3, Millipore); 3) Después de Cromaíografía de baja resolución en columna de iníercambio aniónico débil (HiTrap-Q de Amersham Bioscience); 4) Después de cromaíografía de alia resolución en columna de iníercambio aniónico fuerte (Resource Q, Amersham Biosciences); 5) Misma fracción que 4 iras desglicosilación con Ia N-desglicosilasa PNGasaF; 6) Lacasa salvaje de P. cinnabarínus (PcL). B) Termoesíabilidad del muíaníe 7A9 y PcL salvaje. Las acíividades se midieron con ABTS 3 mM en aceíaío sódico 100 mM, pH 5. Las acíividades se normalizaron con Ia acíividad inicial a íemperaíura ambieníe aníes de Ia incubación. Cada punió represenía el valor medio de íres experimeníos independieníes. C) Perfiles de acíividad a difereníes pHs de 7A9 y PcL salvaje. Las acíividades se midieron con ABTS 3 mM en íampón Briííon y Robinson 100 mM ajusíado a los difereníes pHs de Ia medida. La acíividad lacasa se represenía normalizada con respecío a su valor ópíimo de acíividad. Cada punió represenía el valor medio de tres experimentos independieníes. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
EJEMPLO 1 : CONSTRUCCIÓN DE α-PcL
La sustitución de Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) por Ia secuencia señal del factor α genera una proteína de fusión, α-PcL, constituida por Ia secuencia señal fusionada del factor α con el gen que codifica para Ia proteína madura. Para reemplazar Ia secuencia señal de n-PcL por Ia del factor α, se tomó como molde el vector de Stratagene™ pGAPZα, utilizado para expresión de proteínas en Pichia pastorís, que contiene el pre-pro péptido señal del factor α. En primer lugar, se linearizó pGAPZα con las enzimas de restricción EcoRI y Notl. El cADN lad de P. cinnabarínus (n-PcL, 1494 pb, Gen Bank accession n°: AF170093), fue amplificado con los oligonucleótidos cebadores NecoRI- directo (SEQ ID NO: 35) y CNotl-reverse (SEQ ID NO: 36) que incluyen dianas de restricción para EcoRI y Notl (GAATTC y GCGGCCGC respectivamente, subrayadas y en negrita), generando un molde de Ia lacasa madura (PcL) que excluye Ia secuencia señal nativa. Las condiciones de Ia reacción de amplificación fueron las siguientes: 400 nM del oligonucleótido N eco R I -di recto, 400 nM oligonucleótido CNotl-reverse, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,5 ng/μL de n-PcL en tampón Tris- HCI 20 mM, pH 8,4 y 4 mM de MgCI 2 en un volumen final de 50 μL. El programa de PCR empleado fue: 94 0 C durante 5 min, 55 0 C durante 5 min, 72 0 C durante 5 min (1 ciclo), 95 0 C durante 0.35 min, 50 0 C durante 2 min, 72 0 C durante 4 min (25 ciclos), y 72 0 C durante 10 min (1 ciclo).
PcL fue digerido con EcoRI y Notl y ligado el vector linearizado pGAPZα generando Ia construcción pGAPZα-PcL. Dicho vector se transformó en células competentes de E. coli DH5α por choque térmico para sobre-producir y purificar el plásmido.
α-PcL se amplificó a partir de pGAPZα-PcL mediante PCR con ayuda de los oligonucleótidos NtpJRBgll I-directo (SEQ ID NO: 37) y CtpGAPZIac-reverso (SEQ ID NO: 38) los cuales incluyen dianas de restricción para BgIII - compatible con BamHI- y Notl (AGATCT y GCGGCCGC, respectivamente, subrayadas y en negrita). La reacción de PCR se llevo a cabo en 50 μl conteniendo 400 nM del oligonucleótido NtpJRBgll I-directo, 400 nM oligonucleótido CtpGAPZIac-reverso, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,4 ng/μL de pGAPZα-PcL en tampón Tris-HCI 20 mM, pH 8,4 y 4 mM de MgCl2.EI programa de PCR empleado fue: 94 0 C durante 5 min, 55 0 C durante 5 min, 72 0 C durante 5 min (1 ciclo), 95 0 C durante 0.35 min, 50 0 C durante 2 min, 72 0 C durante 4 min (25 ciclos), y 72 0 C durante 10 min (1 ciclo).
α-PcL fue subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes, USA). pJRoC30 es un vector episómico bifuncional de 10477 pb que contiene el promotor GAL1 (inducible por galactosa), el gen de resistencia a ampicilina para Ia selección en E. coli y el gen URA3 que confiere auxotrofía para uracilo (las células de S. cerevisiae crecidas con este vector pueden cultivarse en medio selectivo -sin uracilo-). Se llevo a cabo Ia digestión de pJRoC30 con las enzimas BamHI y Notl, así como Ia digestión de α-PcL con BgIII y Notl. Se ligó α-PcL digerido y el plásmido pJRoC30 linearizado dando lugar a Ia construcción pJRoC30-α-PcL, (Figura 1 ). Debido a Ia estrategia de clonación utilizada, en el extremo amino terminal de Ia proteína aparecen dos aminoácidos extras (E-F) tras el procesamiento del péptido señal. Las mutaciones introducidas en Ia proteína madura durante el proceso evolutivo mantienen Ia numeración descrita para Ia lacasa madura de Pycnoporus cinnabarinus nativa. EJEMPLO 2. EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE α-PcL
1. ELABORACIÓN DE PROTOCOLOS PARA GENERAR DIVERSIDAD Y
CREACIÓN DE LAS LIBRERÍAS DE MUTANTES.
1.1 Ajuste de las condiciones de PCR mutagénica.
La generación de diversidad mediante PCR-mutagénica se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Thermocycler Mycycler, Biorad, EEUU) bajo los siguientes parámetros de reacción: 95 0 C durante 2 min (1 ciclo); 94 0 C durante 0.45 min, 53 0 C durante 0.45 min, 74 0 C durante 3 min (28 ciclos); y 74 0 C durante 10 min (1 ciclo). Los oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación mutagénica fueron RMLN directo (SEQ ID NO: 39; con sitio de unión a pJRoC30 en Ia posición pb 5'-160-181-3') y RMLC inverso (SEQ ID NO: 40; con sitio de unión a pJRoC30 en Ia posición pb 5'-2139-2158-3'). Para promover Ia ligación in vivo, los productos de PCR se diseñaron conteniendo extensiones con una homología de 40 pb y 66 pb para los extremos digeridos con Bam\λ\ y Xhol del vector linearizado, respectivamente.
En cada una de las generaciones, los correspondientes productos de PCR fueron concentrados (DNA clean concentrador TM-5 kit, Zymo Research, EEUU), cargados en un gel semipreparativo de agarosa de bajo punto de fusión y purificados con el kit Zymoclean gel DNA recovery (ZymoResearch, USAJ. Los productos de PCR fueron posteriormente clonados in vivo al transformar las células de S. cerevisiae, tras el promotor GAL1 del vector pJRoC30 previamente linearizado com Bam\λ\ y Xhol.
Para estimar el índice de mutación y evaluar los diferentes paisajes de evolución, se construyeron pequeñas genotecas de 174 clones (2 placas de 96 pocilios) empleando polimerasas con diferente espectro mutacional. A) Genotecas Mutazima-ll:
El índice de mutación se moduló variando Ia cantidad de ADN molde en Ia reacción de PCR. La concentración de cada uno de los reactivos, en un volumen final de 50 μL, fue Ia siguiente: 370 nM de oligonucleótido RMLN, 370 nM de oligonucleótido RMLC, 0,8 mM dNTPs, 3 % (v/v) DMSO, 0,05
U/μL de Mutazima ADN polimerasa (Genemorph Il Random Mutagenesis kit,
Stratagene), 93 ng/μL de pJRoC30-α-PcL para las genotecas de bajo índice de mutación y 40 ng/μL de pJRoC30-α-PcL para las de medio índice de mutación.
B) Genotecas Tao polimerasa/MnCI?:
En este caso, Ia tasa de mutación se controló variando Ia concentración de MnCl2 Adicionalmente también se analizó el efecto de concentraciones equilibradas/desequilibradas de dNTPs y de Ia concentración del ADN molde en Ia reacción de PCR mutagénica (Tabla 4).
1.2 Primera generación: PCR mutagénica con Mutazima-ll.
Se diseñaron y exploraron dos genotecas independientes, cada una de -1000 clones, usando como parental α-PcL. Las condiciones elegidas para Ia construcción de las genotecas de bajo índice de mutación (0-4,5 mutaciones/1000 pb) y medio índice de mutación (4,5-9 mutaciones/1000 pb) se recogen en el apartado 1.1. A. Las mezclas de transformación de cada una de las genotecas contenían una relación vector linearizado:productos de PCR 1 :4 (100 ng de vector y 400 ng de productos de PCR). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos.
1.3 Segunda generación: barajeo in vivo de ADN mutagenizado.
Las mejores variantes de Ia primera generación (mutantes 1 D12, 3D3, 5F7 y 3G10) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnC^, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajeo in vivo; se exploraron -2000 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnC^ de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 4. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (400 ng totales, 100 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vectoπproducto PCR 1 :4). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos.
1.4 Tercera generación: barajeo in vivo de ADN mutagenizado.
Las mejores variantes de Ia segunda generación (mutantes 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, y 2D8) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnC^, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajeo in vivo; se exploraron -2000 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnC^ de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 4. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (400 ng totales, 100 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vectorproducto PCR 1 :4). El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos. En esta generación en particular, el screening pudo llevarse a cabo en modo cinético debido a Ia mejora de actividad tras tres ciclos evolutivos. TIPOS DE GENOTECAS 7aq/MnCI 2 dNTPs dNTPs desequilibrados equilibrados
Componente
Concentración de Concentración ADN alta de ADN baja
Oligonucleótidos
9OnM 9OnM 9OnM (RMLN y RMLC) pJRoC30- α-PcL 1,5 ng/μL 0,1 ng/μL 0,1 ng/μL
0,2 mM dATP; 0,2 0,04 mM dATP;
0.3 mM (0.075 mM dGTP 0,6 mM 0,04 dGTP 0,1 dNTPs mM de dCTP; 0,6 mM mM dCTP; 0,1 cada uno ) dTTP mM dTTP
DMSO 3% (v/v) 3% (v/v) 3% (v/v) MgCI 2 0,75 mg/mL 1,5 mg/mL 1,5 mg/mL Taq polimerasa 0,05 U/μL 0,05 U/μL 0,05 U/μL
0/ 0,002 mM/
0 mM / 0,05 mM / OmM/ 0,05 mM/ 0,005mM
MnCI 2 1 0,1 mM/ 0,.1 mM/ /0,01mM /0,02
0,2 mM 0,2 mM mM/0,05mM/
0,1 mM/0,2mM
Tabla 4. Ajuste de las condiciones de las genotecas Tag/MnCI 2 con las diferentes variables.
2. PROTOCOLO DE SCREENING DE ALTA CAPACIDAD
2.1 Transformación de células de S. cerevisiae.
Los medios YPD, medio mínimo líquido, las placas SC y el medio de expresión se prepararon tal como se indica en Zumarraga, M. et al. 2008{Proteins 71: 250-260.) con Ia salvedad de que en el medio de expresión se incluyó etanol 25 g/L para favorecer Ia secreción de Ia lacasa y CuSO 4 en concentraciones finales de 2 mM para fermentaciones en microplaca y 4 mM para escala de producción. Las genotecas de cada ciclo evolutivo generadas mediante diferentes estrategias se transformaron en células de S. cerevisiae {Yeast transformation Kit, Sigma) para una expresión funcional de los correspondientes clones. Se incubaron colonias aisladas de células silvestres de S. cerevisiae en 20 ml_ de medio YPD líquido a 30 0 C y 210 rpm en un agitador (Edmund Bühler GmbH SM-30, Alemania) durante toda Ia noche (DO600 > 2). Una cantidad adecuada del cultivo se inoculó en un volumen total de 120 ml_ de YPD atemperado para alcanzar una DO600 de 0,3. Se incubó de nuevo durante 4-6 h, hasta completar dos ciclos de crecimiento y alcanzar una DO 6 oo de 1 ,2. Las células se transformaron con las correspondientes genotecas en presencia del plásmido linearizado, con el kit de transformación de levadura. Inmediatamente antes del choque térmico (42 0 C durante 15 min), se añadió DMSO a Ia mezcla de transformación con una concentración final de 10% (v/v) para aumentar Ia eficiencia de transformación (aproximadamente 20000 clones por reacción de transformación).
2.2 Preparación de las librerías para el screening de alta capacidad.
Las células de S. cerevisiae transformadas con Ia correspondiente genoteca y el vector pJRoC30 linearizado se sembraron en placas SC y se incubaron a 30 0 C. Trascurridos 3-4 días se picaron colonias individuales y se inocularon en microplacas de 96 pocilios (Sero-well, Reino Unido) que contenían 50 μL de medio mínimo por pocilio. La columna completa número 6 de cada placa se inoculó con el tipo parental seleccionado del ciclo previo (columna de referencia) y uno de los pocilios (H1 ) no se inoculó (control). Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 30 0 C, 210 rpm y 80% de humedad relativa en un incubador con sistema de humidificación Minitron-INFORS (Biogen, España). Tras 48 h, se añadieron 160 μL de medio de expresión a cada pocilio y se volvieron a incubar a 30 0 C y 210 rpm. Después de 24 h, se midió Ia DO600 para determinar Ia densidad celular de cada pocilio con un lector de microplacas Versa Max (Molecular Devices, EEUU). Se centrifugaron las placas (placas maestras) durante 5 min a 3200 g y 4 0 C en una centrífuga Eppendorf 5810R (Alemania). 40 μl_ del sobrenadante de cada pocilio fueron transferidos desde Ia placa maestra a dos placas réplica (20 μl_ del sobrenadante en cada una), mediante un robot manipulador de líquidos Quadra 96-320 (Tomtec, EEUU). Con estas dos placas réplica se llevaron a cabo los screenings de actividad frente al sustrato fenólico DMP (2,6 Dimetoxifenol) y el sustrato no fenólico ABTS (2,2 ' azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato)).
2.3 Ensayos colorimétricos.
El screening de actividad frente a ABTS se realizó añadiendo a Ia primera placa réplica 180 μl_ de tampón acetato 100 mM, pH 5,0 conteniendo ABTS 3mM, se agitaron las placas brevemente y se midió Ia absorbancia en el lector de placas a 418 nm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color verde del radical catiónico ABTS #+ y se midió nuevamente Ia absorbancia (£413 = 36000 M "1 cm "1 ). El screening de actividad frente a DMP se realizó añadiendo a Ia segunda placa réplica 180 μl_ de tampón acetato 100 mM, pH 5,0 conteniendo DMP 3mM, se agitaron las placas brevemente y se midió Ia absorbancia en el lector de placas a 469 nm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color amarillo del DMP oxidado y se midió nuevamente Ia absorbancia (ε 4 69 = 27500 M "1 cm "1 ). Las actividades con respecto a cada sustrato se calcularon a partir de Ia diferencia de Ia absorbancia final e inicial. Las actividades relativas se normalizaron con Ia actividad del tipo parental de Ia correspondiente placa.
2.4 Re-screenings
Aquellos mutantes seleccionados que mostraron mayor actividad tanto frente a ABTS como DMP fueron sometidos a dos re-screenings consecutivos: Primer re-screening: alícuotas de 5 μl_ de los clones seleccionados se inocularon en placas multipocillo con 50 μl_ de medio mínimo. Las columnas y filas de los extremos de Ia placa (columnas 1 y 12, filas A y H) no se utilizaron. Tras 24 h de incubación a 30 0 C y 210 rpm, se transfirieron 5 μl_ a los pocilios adyacentes, incubándose durante 24 h más. Finalmente se adicionaron 160 μl_ de medio de expresión y se incubaron durante 24 h. De esta manera cada clon fue crecido en 4 pocilios y el parental (estándar interno) se trató del mismo modo (fila D, pocilios 7-11 ). Las placas se sometieron al mismo protocolo de screening, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 4 microcultivos por clon.
Segundo re-screening: alícuotas de 100 μL de los clones más activos del primer re-screening se crecieron en 3 mL de medio YPD a 30 0 C y 210 rpm durante 24 h. Se extrajeron los plásmidos de estos cultivos (Zymoprep yeast plasmid miniprep kit, Zymo Research). Como el producto de las zymoprep no era puro y Ia concentración del ADN extraído fue muy baja, se transformaron los plásmidos en células de E. coli supercompetentes XL2- blue según el protocolo correspondiente (Stratagene) y se seleccionaron en placas LB/amp. Colonias aisladas se inocularon en 5 mL de medio LB/amp y se crecieron durante toda Ia noche a 37 0 C. Se extrajeron los plásmidos (NucleoSpin® Plasmid kit, Macherey-Nagel). Las células de S. cerevisiae se transformaron con los plásmidos de los mejores mutantes así como con el correspondiente tipo parental, y el screening se llevó a cabo de Ia misma manera, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 5 microcultivos por clon.
EJEMPLO 3: PRODUCCIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS MUTANTES
3.1 Producción de las lacasas en S. cerevisiae
Los clones de S. cerevisiae que contenían los genes de lacasas tanto del tipo nativo como de mutantes fueron cultivados en 3 mL de medio mínimo durante 48 h, a 30 0 C y 250 rpm (Micromagmix shaker, Ovan). Una alícuota de este precultivo se inoculó para alcanzar una densidad óptica (DO 6 oo) de 0.25 en un volumen total de 50 ml_ de medio mínimo en un matraz de 500 ml_ con tapón poroso. Cuando se completaron dos ciclos de crecimiento (DOβoo = 1 ; 6-8 h de incubación), se añadieron 450 ml_ de medio de expresión conteniendo CuSO 4 4 mM, etanol 25 g/L y se incubó a 20 0 C y 250 rpm en un matraz de 2 L de base ancha (20 cm 0 en Ia base). El cultivo se paró tras 5 días cuando tanto el crecimiento celular como Ia actividad lacasa se estacionaron (DO600 28-32; actividad lacasa 20-40 U/L).
3.2 Purificación de los mutantes
1. Se centrifugó el cultivo del aparatado 3.1. a 13000 rpm durante 15 minutos a 4 0 C. El sobrenadante se concentró por ultrafiltración tangencial. La muestra se hizo pasar a través de una membrana de 5 KDa de tamaño de poro (Minisette, Filtron) mediante un flujo proporcionado por una bomba peristáltica (Masterflex easy-load, Cole-Palmer). Se realizó un segundo paso de concentración mediante ultrafiltración bajo presión (ejercida con gas N 2 ) con membrana de 10 KDa de tamaño de poro (Amicon YM3, Millipore).
2. Cromatografía de intercambio aniónico de baja resolución. Se utilizó un cartucho HiTrap-Q (Amersham Biosciences) acoplado a un equipo EconoSystem (Bio-Rad). Tras equilibrar el cartucho con solución A (acetato 25 mM pH 5), se aplicó Ia muestra y se lavó Ia columna con Ia misma solución para eliminar toda Ia fracción no retenida, hasta que Ia absorbancia a 280 nm fuese constante. La fracción retenida se eluyó con un gradiente en dos fases de solución B (NaCI 1 M en tampón acetato sódico 25 mM, pH 5), de 0 a 20% en 45 min y de 20 a 100% en 10 min, a un flujo de 1 mL/min.
3. Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución. Se utilizó una columna Resource Q (Amersham Biosciences) acoplada a un equipo AKTApurifier (Amersham Biosciences). Se equilibró la columna con solución A (acetato sódico 25 mM pH 5). La fracción retenida se eluyó con un gradiente en dos fases con solución B (NaCI 1 M en acetato sódico 25 mM pH 5), de 0 a 20 % en 20 min y de 20 a 100 % en 10 min, a un flujo de 2 mL/min.
3.3 Caracterización bioquímica de los mutantes
A) Desglicosilación
Las proteínas purificadas se desglicosilaron con Ia péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) (Sigma), que hidroliza los oligosacáridos unidos a los residuos asparragina. Concretamente, 8 μg de lacasa pura se desnaturalizaron con SDS 0.2% (p/v) y β-mercaptoetanol 100 mM a 100 0 C durante 10 min. Posteriormente se añadieron 2.5 Unidades de PNGasa F y Ia mezcla de reacción se incubó toda Ia noche a 37 0 C. La reacción se paró a 100 0 C durante 10 min. Los productos se analizaron en un gel de electroforesis (SDS-PAGE) teñido con azul de Coomasie.
B) Medida de Ia estabilidad térmica
El estudio de termoestabilidad se realizó con ayuda del termociclador Mycycler equipado con un formador de gradientes (Bio-Rad, EEUU), el cual permite crear gradientes de temperatura a diferentes intervalos. Se prepararon diluciones de las proteínas en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5 de tal manera que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada para medir Ia actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Se incubaron 60 μL de lacasa por cada punto del gradiente. El gradiente de temperatura estudiado comprendió el intervalo 30-80 0 C con temperaturas intermedias de 30.0 0 C, 31.7 0 C, 34.8 0 C, 39.3 0 C, 45.3 0 C, 49.9 0 C, 53 0 C, 55 0 C, 56.8 0 C, 59.9 0 C, 64.3 0 C, 70.3 0 C, 75.0 0 C, 78.1 0 C y 80.0 0 C. A diferentes tiempos de incubación (2 h, 4 h y 24 h) se extrajeron alícuotas de 10 μL de lacasa y se mezclaron con 190 μL de de ABTS 3 mM en tampón acetato sódico 100 mM pH 5. La actividad se valoró en continuo (oxidación del ABTS a 418 nm). El tiempo 0 se determinó a partir de las correspondientes muestras incubadas a temperatura ambiente. Cada valor procedió de al menos tres medidas independientes.
C) Ensayos de actividad a diferentes pHs.
Los perfiles de pH de Ia actividad de las diferentes lacasas purificadas se realizaron en tampón ByR 100 mM a diferentes pHs (pH 2,0-9,0, ajustados con NaOH). Se prepararon diluciones de las enzimas en tampón acetato sódico 10OmM pH 5 para que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada en Ia medida de actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Las lacasas (10 μL) se añadieron por filas y el tampón a diferentes pHs (180 μL) por columnas. Finalmente, se añadieron 10 μL de ABTS 60 mM y se midieron las actividades de cada una de las condiciones por triplicado.
D) Determinación de los parámetros cinéticos
Los parámetros cinéticos (K m , V max , /c ca t y k c JK m ) de las enzimas nativa y de las mutantes se determinaron en un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices, USA). Se valoraron tanto sustratos no fenólicos (ABTS, ε 4 i 8 = 36000 M "1 cm "1 ) como fenólicos (2,6-dimetoxifenol, ε 46 g = 27500 M "1 cm "1 ) en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5 a 25 0 C. Los parámetros cinéticos se obtuvieron mediante un ajuste no lineal por mínimos cuadrados del modelo de Michaelis-Menten utilizando el programa informático Sigma Plot 7.101. Cada dato experimental se obtuvo a partir de Ia media de tres experimentos independientes. REIVINDICACIONES
1. Polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
2. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17o la SEQ ID NO: 19.
3. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
4. Construcción genética de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 2, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar.
5. Construcción genética según Ia reivindicación 4 que además comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 3,