本发明涉及一种唾液乳杆菌 iLactobacill salivarius )及其代谢物的制 备方法和组合物以及治疗和 /或预防癌症的方法， 具体地， 涉及一种唾液乳 杆菌、 一种唾液乳杆菌的代谢物的制备方法、 一种组合物和所述的唾液乳 杆菌的应用。 背景技术

唾液乳杆菌为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌， 广泛分布于含有碳水化 合物的动植物发酵产品中， 也见于温血动物的口腔、 阴道和肠道内， 在植 物体表、 乳制品、 肉制品、 啤酒、 葡萄酒、 果汁、 麦芽汁、 发酵面团、 污 水以及人畜粪便中， 均可分离到。 该菌分解糖的能力较强， 分解蛋白质类 的能力较低。 一些如泡菜、 腌菜、 酒和酸奶食品生产过程中广泛用到该菌。

CN 101538545A公开了唾液乳杆菌的一种菌株， 以及包含该菌株的食 品组合物， 并且公开了该菌株能够刺激免疫并具有 92.91%的体外脱除 4-硝 基喹啉 -1-氧化物 （4-NQO ) 的基因毒性的能力。 但实验证明， 该菌株在体 内脱除 4-NQO的基因毒性较低。 发明内容

为了进一步在体内脱除 4-NQO的基因毒性， 本发明的发明人筛选到特 定的一株唾液乳杆菌的菌株， 实验证明该菌株具有较高的体内脱除 4-NQO 的基因毒性的能力， 由此得到本发明。

本发明提供了一种唾液乳杆菌， 该唾液乳杆菌属于唾液乳杆菌唾液亚 禾中 (Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius ) , 于 2010年 1月 22曰保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏号为 CGMCC No. 3606。

本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物 。

本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物 的制备方法， 所述唾液 乳杆菌为如上所述的唾液乳杆菌， 该方法包括： 在能使所述唾液乳杆菌存 活的条件下， 使所述唾液乳杆菌的活菌体与液相介质接触， 得到接触后的 产物， 并且分离接触后的产物中的液相产物。

本发明进一步提供了一种组合物， 该组合物含有如上所述的唾液乳杆 菌的活菌体和 /或如上所述的方法制备的唾液乳杆菌的代谢� �作为活性成 分。

本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌在制备用 于预防和 /或治疗癌症的 药物或功能食品中的应用， 所述药物或功能食品含有如上所述的唾液乳杆 菌的活菌体和 /或如上所述的唾液乳杆菌的代谢物作为活性� �分。

本发明还提供了一种治疗和 /或预防癌症的方法， 该方法包括： 使用如 上所述的组合物制备预防和 /或治疗癌症的制剂， 并将所述制剂施用于有需 要的对象。

本发明提供的唾液乳杆菌能够经过培养产生大 量活菌体， 也能够通过 新陈代谢活动产生代谢物。 所述唾液乳杆菌的活菌体和所述唾液乳杆菌的 代谢物均能在体内脱除 4-NQO的基因毒性。并且含有唾液乳杆菌的活菌� �� 和 /或所述唾液乳杆菌的代谢物的组合物能够有� �地起到预防和 /或治疗癌 症的作用， 特别是能够有效地起到预防和 /或治疗消化道癌症的作用。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施 方式部分予以详细说 明。 具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所 描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明 ， 并不用于限制本发明。 为了进一步在体内脱除 4-NQO的基因毒性， 本发明提供了一种唾液乳 杆菌， 该唾液乳杆菌是该唾液乳杆菌属于唾液乳杆菌 唾液亚种 (Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius) , 于 2010年 1月 22日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ， 保藏号为 CGMCC No. 3606。

本发明提供的唾液乳杆菌能够经过培养产生大 量唾液乳杆菌的活菌 体， 所述培养的方法没有特别的要求， 只要是能使所述唾液乳杆菌增殖即 可，例如可以将 10 ⁷ 量级的菌株接种于乳杆菌培养基， 并且在厌氧或好氧条 件下， 在 15-38 °C的温度下培养 8-72小时后， 得到培养液。 所述乳杆菌培 养基可以为公知的各种适合乳杆菌培养的培养 基，例如可以为乳汁和 /或《乳 酸菌——生物学基础及应用》（杨洁彬， 轻工业出版社， 1996年出版） 中所 述的乳酸菌 （MRS ) 培养基。

本发明可以进一步分离上述培养液中的唾液乳 杆菌的活菌体， 所述分 离的方法没有特别的限制， 只要是能从培养液中富集菌体即可， 例如可以 通过离心和 /或过滤的方法实现， 所述离心和所述过滤的条件可以为公知的 条件， 本发明在此不再赘述。

本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物 。 其中， 所述的 "代谢 物" 的概念是指所述唾液乳杆菌通过新陈代谢活动 产生的物质。

本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物 的制备方法， 所述唾液 乳杆菌可以为如上所述的唾液乳杆菌， 该方法可以包括： 在能使所述唾液 乳杆菌存活的条件下， 使所述唾液乳杆菌的活菌体与液相介质接触， 得到 接触后的产物， 并且分离接触后的产物中的液相产物。

其中， 能使所述唾液乳杆菌存活的条件没有特别的要 求， 只要是能使 所述唾液乳杆菌维持生命活动即可， 例如《乳酸菌 生物学基础及应用》 (杨洁彬， 轻工业出版社， 1996年出版） 中所述的条件。 其中， 所述唾液乳杆菌的活菌体与所述液相介质之间 的用量比没有特 别的要求， 可以是获得活菌体代谢物常用的选择， 为了获得较多的代谢物， 优选情况下， 相对于 10 ⁶ CFU的所述唾液乳杆菌的活菌体， 液相介质的用 量为 0.5-100ml， 进一步优选为 l-10ml。

其中， 所述接触的接触时间没有特别的要求， 只要是能让活菌体的代 谢物分散于所述液相介质中即可， 为了获得较多的代谢物， 优选情况下， 所述接触的接触时间为 0.3-10小时， 进一步优选为 1-5小时。

其中， 所述液相介质选择没有特殊要求， 只要是能使得活菌体维持产 生代谢物的活动并能分散代谢物即可， 为了获得较多的代谢物， 优选情况 下所述液相介质为水、生理盐水和磷酸盐缓冲 溶液（PBS )中的一种或多种。 为了避免盐离子对代谢物的生物活性的影响， 进一歩优选所述液相介质为 水。

所述生理盐水和磷酸盐缓冲溶液的组成已为本 领域公知， 本发明在此 不再赘述。

所述液相产物可以直接作为唾液乳杆菌的代谢 物， 也可以将所述液相 产物浓缩或干燥后得到的产物作为唾液乳杆菌 的代谢物。

本发明进一步提供了一种组合物， 该组合物含有如上所述的唾液乳杆 菌的活菌体和 /或如上所述的方法制备的唾液乳杆菌的代谢� �作为活性成 分。

其中， 以所组合物的总重量为基准， 所述唾液乳杆菌的活菌体的含量 可以为 10 ⁵ -10 ^1Q CFU/g， 进一歩优选为 10 ⁶ -10 ⁹ CFU/g。

其中， 以所组合物的总重量为基准， 所述唾液乳杆菌的代谢物中的干 物质的重量计算， 所述唾液乳杆菌的代谢物的含量为 0.1-99.9重量％， 进一 步优选为 1-99重量％， 更进一步优选为 10-90重量％。

本发明中， 干物质是指有机体在 10°C-90°C的恒温下， 充分干燥， 余下 的物质的重量。 符合上述要求的组合物可以包括所述唾液乳杆 菌的培养液 （例如经该 唾液乳杆菌发酵制得的发酵乳制品）、 分离的所述唾液乳杆菌的活菌体、 使 所述唾液乳杆菌的活菌体与所述液相介质接触 后的产物、 去除接触后的产 物中的固相物质得到的液相产物以及将所述液 相产物进一歩浓缩或干燥后 得到的浓缩产物或干燥产物中的一种或多种。

所述组合物可以为功能食品组合物， 该功能食品组合物含有作为活性 成分的所述唾液乳杆菌的活菌体和 /或所述唾液乳杆菌的代谢物和食物。 一 般地， 以所组合物的总重量为基准， 所述唾液乳杆菌的活菌体的含量可以 为 10 ⁵ -10 ¹⁽⁾ CFU/g， 进一步优选为 10 ⁶ -10 ⁹ CFU/g; 和 /或， 以所述组合物的总 重量为基准， 所述唾液乳杆菌的代谢物中的干物质的重量计 算， 所述唾液 乳杆菌的代谢物的含量为 0.1-99.9重量％，进一步优选为 1-99重量％，更进 一歩优选为 10-90重量％。

所述食物可以是任意类型的食物， 例如果汁制品、 乳制品、 豆制品等。 所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加 剂， 例如香料、 矿物质、 维 生素、 稳定剂、 增稠剂、 防腐剂等。

所述组合物可以为药物， 该药物含有作为活性成分的所述唾液乳杆菌 的活菌体和 /或所述唾液乳杆菌的代谢物和药学可接受的� �剂。 该药物可以 为常规的各种剂型， 例如普通片剂或糖包衣片剂、 丸剂、 锭剂、 胶囊剂、 滴剂、 颗粒剂、 软膏剂、 乳膏或凝胶剂。 可以根据所要配制的剂型， 选择 合适的佐剂的种类。 可以根据所述唾液乳杆菌的活菌体和 /或所述唾液乳杆 菌的代谢物的有效量来设定其在药品中的含量 。 所述唾液乳杆菌的活菌体 和 /或所述唾液乳杆菌的代谢物的有效量根据服� �者的年龄和身体状况而不 同， 优选的范围包括： 对所述唾液乳杆菌的活菌体而言， 为 10 ⁵ -10 ¹² CFU/ 千克体重.天； 对所述唾液乳杆菌的代谢物的有效量而言， 以所述唾液乳杆 菌的代谢物的干物质的量计， 为 10-10000mg/千克体重.天。一般地， 以所组 合物的总重量为基准， 所述唾液乳杆菌的活菌体的含量可以为 10 ⁵ -10 ¹⁰ CFU/g, 进一歩优选为 10 ⁶ -10 ⁹ CFU/g; 和 /或， 以所述组合物的总重 量为基准， 所述唾液乳杆菌的代谢物中的干物质的重量计 算， 所述唾液乳 杆菌的代谢物的含量为 0.1-99.9重量％，进一步优选为 1-99重量％，更进一 歩优选为 10-90重量％。

本发明提供的上述组合物可以用于制备用于预 防和 /或治疗癌症的药物 或功能食品。本发明提供的上述组合物可以用 于制备预防癌症的功能食品， 也可以用于制备预防和 /或治疗癌症的药物。

其中， 所述药物或功能食品含有如上所述的唾液乳杆 菌的活菌体和 /或 如上所述的唾液乳杆菌的代谢物作为活性成分

本发明还提供了一种治疗和 /或预防癌症的方法， 该方法包括： 使用如 上所述的组合物制备预防和 /或治疗癌症的制剂， 并将所述制剂施用于有需 要的对象。

其中， 所述癌症可以为消化道癌， 例如口腔癌、 食管癌、 胃癌和肠癌 等。

其中， 所述施用的方法可以为口服或经肛门给予。

本发明中， 液体和气体的体积均为标准状态下的体积。

以下通过实施例进一歩说明本发明。 实施例 1

本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌的活菌 体。

将唾液乳杆菌菌株 CGMCC 3606用无菌接种环接种于 10L乳杆菌培养 基 （MRS培养基， 购自上海沪峰生物科技有限公司）， 并且在厌氧条件下， 在 37°C的温度下培养 12小时后，得到培养液。将得到的培养液在 4000g的 速度下离心 10分钟后弃去上清， 得到唾液乳杆菌的活菌体。 实施例 2 本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌的代谢 物的制备方法。

将实施例 1得到的唾液乳杆菌的活菌体 10 ¹³ CFU分散于 2L去离子水 寸 ^

中，在 37°C下保持 2小时后在 4000g的速度下离心 10分钟， 分离得到的离

Q 〇

心后的产物中的上清液。 该上清液即为唾液乳杆菌的代谢物 （干物质的含 量为 0.1%)。 对比例 1

按照实施例 1相同的方法制备唾液乳杆菌的活菌体， 不同的是所用的 菌株为 CN 101538545A公开的菌株 CGMCC 2263。

测试例 1

本测试例测试实施例 1和对比例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代 谢物在体内的脱除 4-NQO的基因毒性的能力。

将 FD334大鼠（体重 180-220g，购自北京维通利华公司）分为 6组（每 组 15只）， 按表 1所示的方案配制的饮用水喂养 7周， 其中， 4-NQO购自 西格玛公司， 然后继续正常饲养 25 周后观察口腔癌的发生率 （按 WHO Collaborating Centre for Oral Precancerous Lesions, Definition of leukoplakia and related lesions: An aid to studies on oral precancer. Leukoplakia and related lesions. 46(4): 518-539. 1976.中描述的方法判断是否发生口腔癌）， 结果列于 表 1。

表 1

唾液乳杆菌

唾液乳杆菌的活菌体 口腔癌的发生 的代谢物

(实施例， CFU/g) 率 （％)

(体积％)

对照组 20 0 0 65 第一组 20 实施例 1， 5xl0 ⁶ 0 33 第二组 20 实施例 1， 5xl0 ⁸ 0 7 第三组 20 实施例 1， 5xl0 ¹⁰ 0 0 第四组 20 对比例 1， 5xl0 ¹⁰ 0 58 第五组 20 0 100 13 由表 1可以看出， 实施例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代谢物与 4-NQO同时施用时， 能够有效地降低 4-NQO导致口腔癌发生的能力， 即具 有较高的在体内的脱除 4-NQO的基因毒性的能力， 因而具有预防口腔癌的 效果。 测试例 2

本测试例测试实施例 1和对比例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代 谢物治疗 4-NQO所致的口腔癌的能力。

将 FD334大鼠（体重 180-220g，购自北京维通利华公司）分为 6组（每 组 15只），用含有 20ppm的 4-NQO的饮用水喂养 7周后，用按表 2的方案 配制的饮用水继续喂养 25 周， 然后观察口腔癌的出现率 （按 WHO Collaborating Centre for Oral Precancerous Lesions, Definition of leukoplakia and related lesions: An aid to studies on oral precancer. Leukoplakia and related lesions. 46(4): 518-539. 1976.中描述的方法判断是否发生口腔癌）， 结果列于 表 1。

表 2

唾液乳杆菌的活菌体 唾液乳杆菌的代 口腔癌的发生率

(实施例， CFU/g) 谢物 （体积％) ( ) 对照组 0 0 67 第一组 实施例 1， 5xl0 ⁶ 0 27 第二组 实施例 1， 5x10 ^s 0 20 第三组 实施例 1， 5xl0 ¹⁰ 0 7 第四组 对比例 1， 5xl0 ¹⁰ 0 58 第五组 0 100 13 由表 2可以看出， 实施例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代谢物在 施用于 4-NQO处理后的大鼠时， 能够有效地降低 4-NQO导致口腔癌发生 的能力， 因此具有治疗 4-NQO所致的口腔癌的能力。 测试例 3

本测试例测试实施例 1和对比例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代 谢物预防食管癌的能力。

按照文献 （李宁等， 肿瘤细胞悬液注射法制作兔食管癌移植瘤模型 ， 中国肿瘤临床， 2008 年 35卷 12期） 所述的方法制备患有食管癌的新西兰 兔 40只， 将其分为 4组 （每组 10只）， 按表 3所示的方案配制的饮用水喂 养 32周后观察食管癌的发生率（按上述文献规定� ��标准判断是否发生食管 癌）， 结果列于表 3。

表 3

由表 3可以看出， 实施例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代谢物具 有预防食管癌的效果。 试例 4 本测试例测试实施例 1和对比例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代 谢物预防胃癌的能力。

按照文献 （徐建国等， 甲基胆蒽诱发大、 小鼠胃癌的实验观察， 吉林 大学学报 (医学版)， 1992年 05期）制备患有胃癌的大鼠 40只， 将其分为 4 组（每组 10只）， 按表 4所示的方案配制的饮用水喂养 32周后观察胃癌的 发生率 （按上述文献规定的标准判断是否发生胃癌） ， 结果列于表 4。

表 4

由表 4可以看出， 实施例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代谢物具 有预防胃癌的效果。 测试例 5

本测试例测试实施例 1和对比例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代 谢物预防肠癌的能力。

按照文献 （聂春生等， 大肠癌动物模型的构建， 第四军医大学吉林军 医学院学报， 2001年 01期）制备患有肠癌的大鼠 40只，将其分为 4组（每 组 10只）， 按表 5所示的方案配制的饮用水喂养 32周后观察肠癌的发生率 (按上述文献规定的标准判断是否发生肠癌）� � 结果列于表 5。 表 5

由表 5可以看出， 实施例 1获得的活菌体和实施例 2获得的代谢物具 有预防肠癌的效果。