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Patent Searching and Data


Title:
LACTOCOCCUS LACTIS STRAIN AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/028100
Kind Code:
A1
Abstract:
A Lactococcus lactis strain and use thereof, belonging to the field of food biotechnology. A separated strain is named as Lactococcus lactis WH101. The OD600 value at pH 4.5 reaches 0.527 and increases, as compared to that before mutagenesis, by 4.5 times; and after being stressed in lactic acid at pH 4 for 3 h, the survival rate is 22.4 times more than that of the strain before mutagenesis under same treatment conditions. After being stressed with 15% ethanol for 4 h, 15% NaCl for 6 h and 1mmol/L H2O2 for 3 h respectively, the survival rates are 5.2, 2.0 and 1.9 times more than those of the original strain under the same treatment conditions respectively. The Lactococcus lactis strain has a higher tolerance to acid stress, to ethanol stress, to osmotic stress and to oxygen stress, and has great application value in the fields of food, fermentation and the like.

Inventors:
ZHANG JUAN (CN)
ZHU ZHENGMING (CN)
YANG PEISHAN (CN)
CHEN JIAN (CN)
DU GUOCHENG (CN)
Application Number:
PCT/CN2016/108476
Publication Date:
February 15, 2018
Filing Date:
December 05, 2016
Export Citation:
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Assignee:
UNIV JIANGNAN (CN)
International Classes:
C12N1/20; A23L19/20
Foreign References:
CN106047773A2016-10-26
CN105063077A2015-11-18
CN101451117A2009-06-10
CN104593311A2015-05-06
JP2011010594A2011-01-20
Other References:
ZULJAN, F.A.: "alpha -Acetolactate synthase of Lactococcus lactis contributes to pH homeostasis in acid stress conditions", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 188, 27 July 2014 (2014-07-27), pages 99 - 107
BUDIN-VERNEUIL, A.: "Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG 1363", PROTEOMICS, vol. 5, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 4794 - 4807, XP055603862
Attorney, Agent or Firm:
HARBIN SHINEIP INTELLECTUAL PROPERTY AGENCY CO., LTD. (CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1、 一株乳酸乳球菌 iLactococc lactis WH101 , 其特征在于, 于 2016年 4月 29日保 藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO: M 2016233,保藏地址为中国武汉 武 汉大学。

2、 权利要求 1所述的乳酸乳球菌 iLactococc lactis) WH101在制备发酵食品中的应用。

3、 根据权利要求 2所述的应用, 其特征在于, 所述发酵食品是泡菜。

4、 根据权利要求 2所述的应用, 其特征在于, 所述发酵食品是酸奶。

1

Description:
一株乳酸乳球菌及其应用 技术领域

本发明涉及一株乳酸乳球菌及其应用, 属于食品生物技术领域。

背景技术

作为工业化的微生物细胞工厂, 乳酸乳球菌已广泛应用于食品, 发酵等领域。 在开展上 述领域中所需工业产品的发酵法生产过程中, 产酸特性成为微生物必不可少的组成部分。 一 方面代谢产酸可帮助促进细胞能量转化、维持 细胞内外渗透压平衡、 增强本体细胞的环境竞 争性。 另一方面, 随着胞内产酸的积累, 导致微生物菌体细胞内的 pH持续下降, 胞内维持 细胞正常生理功能的相关酶类活性受到抑制, 进而影响细胞的代谢活性及其生产效率, 并为 生产成本、 下游加工及后续工业排放物环境治理埋下诸多 隐患。 同时, 作为益生菌中的一种, 在人体胃肠道中也会遭受酸胁迫、 胆盐胁迫等环境胁迫。 因此, 提高微生物菌株的酸胁迫耐 受性, 成为学术界和产业界亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株乳酸乳 球菌 (Jactococc^ lactis) WH101,其于 2016 年 4月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心, 保藏编号为 CCTCC NO: M 2016233, 地址: 中国, 武汉, 武汉大学 。

所述乳酸乳球菌 CCTCC NO: M 2016233是以乳酸乳球菌 Lactococcus lactis NZ9000 为出发菌株, 以硫酸二乙酯为诱变剂诱变得到, 在 pH 4.5的条件下, OD6QQ值达到 0.527, 相 比较诱变前提高了 4.5倍; 在 pH 4.0的乳酸中胁迫 2h, 存活率为 4.04%; 在 pH 4.0的乳酸中 胁迫 3h, 存活率是同等处理条件下诱变前菌株的 22.4倍; 可见, 乳酸乳球菌 CCTCC NO: M 2016233具有更好的生长性能和酸耐受性。 分别用 15%乙醇胁迫 4 h, 15% NaCl胁迫 6 h和 lmmol/L H 2 0 2 胁迫 3 h后, 其存活率分别是同等处理条件下原始菌株的 5.2, 2.0禾卩 1.9倍。 可见, 乳酸乳球菌 CCTCC NO: M 2016233具有较好的酸胁迫、 乙醇胁迫、渗透压胁迫和氧胁 迫耐受性, 在食品、 发酵等领域具有巨大的应用价值。

生物材料保藏

乳酸乳球菌 (Jactococc^ /acfc) WH101,已于 2016年 4月 29日保藏于中国典型培养物保 藏中心, 保藏地址为中国武汉 武汉大学, 保藏编号为 CCTCC NO: M 2016233。

附图说明

图 1 不同环境胁迫条件下菌株的存活率实验

具体实施方式 GM17培养基:葡萄糖 5.0 g丄 - 1 , 胰蛋白胨 5.0 g丄 - 1 ,大豆蛋白胨 5.0 gl 1 ,牛肉浸膏 5.0 g.L- 1 ,酵母提取物 2.5 g.L- 1 ,维生素 C 0.5 g丄 - 1 , 硫酸镁 0.25 g丄 - 1 ,甘油磷酸二钠 19.0 g丄 - 1

pH 4.5的 GM17培养基为 25%的乳酸调节的 pH值为 4.5 的 GM17培养基。 其他 pH的

GM17培养基以同样方法得到。

实施例 1 乳酸乳球菌 (CCTCC NO: M 2016233)的选育方法

以乳酸乳球菌 actococc lactis Ζ9000 为出发菌株, 将其在 GM17培养基中培养至 对数生长期, 调整菌液浓度 1 * 10 7 个 /CFU, 取样离心(5000rpm; lOmin)后去上清, 用 0.85% 的生理盐水洗涤重悬, 重复两次。 加入含 0.5%v/v硫酸二乙酯 (DES ) 的 GM17培养基等体 积重悬, lOOrpm, 30。C处理 30min后立即用 0.85%的生理盐水洗涤重悬, 重复 5次, 加入等 体积的 GM17培养基重悬后在 30°C下静置培养 1.5h。

在 2.2ml的 96深孔板中加入 1ml的 GM17 ( pH 5.0 ) 培养基, 取上述后培养的培养液以 2%的接种量转接到 96深孔板中, 30°C下静置培养 48h, 考察诱变菌株在酸性培养基中的生 长情况, 根据生物量的大小筛选出突变混合菌株, 然后将混合菌株经适当稀释涂布 pH 5.0的 平板, 挑选单菌落, 将单菌落于 pH 5.0条件下发酵, 根据生物量大小筛选出突变菌株, 出发 菌株 OD 6 QQ达到 0.076, 突变菌株 WH101 ODeoo达到 0.612 ), 命名为乳酸乳球菌 WH101 (Lactococcus lactis WHl 01) ,于 2016年 4月 29日保藏于中国典型培养物保藏中心,保 藏编号为 CCTCC NO: M 2016233。

实施例 2 乳酸乳球菌 (CCTCC NO: M 2016233)酸胁迫条件下的生长性能

将保藏于 -80°C甘油管中的出发菌株乳酸乳球菌 Lactococcus lactis Z9mi)及选育到的 乳酸乳球菌 Lactococcus /acfe WHIOl ) 以 2%的接种量接入 GM17培养基, 在 30°C静置培 养 12ho

以 2%的接种量分别取活化好的乳酸乳球菌 NZ9000和乳酸乳球菌 WH101转接到 pH 4.5 的 GM17培养基中, 于 30°C下静置培养 48h, 发酵结束后测定发酵液的菌浓。在 pH 4.5的条 件下, 突变菌株 OD,值达到 0.527, 相比较选育前提高了 4.5倍。 结果如表 1所示。

表 1 酸胁迫条件下菌体生长性能

实施例 3 酸耐受性实验

将保藏于 -80°C甘油管中的出发菌株乳酸乳球菌 Lactococcus lactis Z9mi)及选育到的 乳酸乳球菌 Lactococcus /acfe WHIOl ) 以 2%的接种量接入 GM17培养基, 在 30。C静置培 以 2%的接种量分别取活化好的乳酸乳球菌 NZ9000和乳酸乳球菌 WH101到 GM17培养 基中, 30°C静置培养至对数生长期。

取对数生长期的细胞, 经 5000rpm离心 lOmin收集菌体, 菌体经 0.85%的生理盐水洗涤 离心 2次后, 等体积重悬于 GM17(pH 4.0)培养基中胁迫不同的时间取样, 重新用相同的生理 盐水离心洗涤细胞 2次, 并重悬于等体积的生理盐水中, 取 ΙΟΟμΙ的菌液经适当稀释后涂布 平板,于 30°C静置培养 24h,分别计算存活率大小(如表 2所示)。突变菌株 WH101在 pH 4.0 的乳酸中分别胁迫 lh, 2h, 3h, 存活率分别是同等处理条件下下选育前菌株的 1.2倍, 4.1倍, 22.4倍。

表 2 酸耐受性实验

实施例 4 其它环境耐受性实验

将保藏于 -80°C甘油管中的出发菌株乳酸乳球菌 Lactococcus lactis Z9mi)及选育到的 乳酸乳球菌 Lactococcus /acfe WHIOl ) 以 2%的接种量接入 GM17培养基, 在 30。C静置培 养 12ho

以 2%的接种量分别取活化好的乳酸乳球菌 NZ9000和乳酸乳球菌 WH101到 GM17培养 基中, 30°C静置培养至对数生长期。取对数生长期的 胞,经 5000rpm离心 lOmin收集菌体, 菌体经 0.85%的生理盐水洗涤离心 2次后, 分别等体积重悬于含 15% (v/v) 乙醇, 15% (v/v) NaCl和 lmmol/L H 2 0 2 的 GM17培养基中胁迫不同的时间取样, 重新用相同的生理盐水离心洗 涤细胞 2次,并重悬于等体积的生理盐水中,取 ΙΟΟμΙ的菌液经适当稀释后涂布平板,于 30。C 静置培养 24h,分别计算存活率大小(如图 1所示)。突变菌株 WH101在含 15%乙醇的 GM17 培养基中胁迫 4 h后,存活率是同等处理条件下原始菌株的 5.2倍。其在含 15% NaCl的 GM17 培养基中胁迫 6 h后, 存活率是同等处理条件下原始菌株的 2.0倍。 而在含 lmm 0 l/L H 2 0 2 的 GM17培养基中胁迫 3 h后, 存活率是同等处理条件下原始菌株的 1.9倍。