Gegenstand der Erfindung ist eine Zubereitung von isolierten Langerhans ^\' sehen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98 %, bezogen auf das Volumen der gereinigten zellulären Partikel, Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitung sowie die diagnostische und/oder therapeutische Anwendung dieser Zubereitung am menschlichen oder tierischen Körper.

Seit der Einführung des Insulins in die Diabetestherapie durch Banting und Best im Jahre 1922 ist das ketoazidotische Koma mit letalem Ausgang bei Diabetikern selten geworden. Die Behandlung mit Insulin hat bei der überwiegenden Mehrzahl der Erkrankten das Auftreten von diabetogenen Sekundärkomplikationen in Form von Mikroangiopathie u.a. an Auge, Nieren, und Nerven nicht verhindern können.

Seit 1966 wird versucht, die allseits bekannten Limitierungen der Insulintherapie durch Transplantation mit einer gesunden Bauchspeicheldrüse zu beheben. Die Risiken des chirurgischen Eingriffs und insbesondere die zur Vermeidung einer Abstoßungsreaktion lebenslang erforderliche immunsuppressive Behandlung des Empfängers rechtfertigen eine Pankreastransplantation als Wahleingriff nach Meinung namhafter Diabetologen nicht.

Seit langem war man bemüht, statt der Transplantation eines vollständigen Organs aus dem Pankreas von einem hirntoten Organspender, z.B. einem Unfallopfer, die Insulin-produzierenden Langerhans \'sehen Inseln zu isolieren und nur diese zu transplantieren, wobei deren Verabreichung in die Vena portae (Pfortader der Leber) im Vordergrund steht. Aus zahlreichen Tierversuchen ist bekannt, daß intraportal transplantierte Inseln in den Endästen der Portalvene einwachsen, die Insulinproduktion abhängig vom Bedarf, d.h. von der Höhe des Blutzuckerspiegels, aufnehmen, den diabetischen Stoffwechsel korrigieren und das Auftreten lebensbedrohender Diabeteskomplikationen verhindern. Ferner weiß man aus zahlreichen Tierversuchen, daß - bei Verwendung wenig immunogener Inse l tra nsp l an ta te - Insel transplan ta tionen im Ge gensa tz zur Pankreastransplantation keine oder nur eine vorübergehende immunsuppressive Behandlung des diabetischen Empfängers erforderlich ist.

Es liegen auch Erfahrungen mit der Inseltransplantation bei diabetischen Menschen vor. Lediglich eine Patientin wurde bislang für die Dauer von fast zwei Jahren nach Inseltransplantation Insulin-unabhängig (Warnock G.L. et al., Diabetologia 35: 89- 95, 1992). Die Mißerfolge bei zahlreichen weiteren Versuchen werden mit der Transplantation von Inselsuspensionen mit unzureichender Reinheit erklärt, d.h. unzureichend erfolgter Abtrennung von Nicht-Inselgeweben wie exokrinen

ΞRSATZBLATT

Fragmenten, duktalen Elementen, Lymphknoten und Gefäßen Solche Inselsupensionen mit unzureichender Reinheit sind durch eine sehr hohe Immunogenität gekennzeichnet und nach Transplantation durch häufig auftretende Abstoßungsreaktionen bis hin zu vollständigen Transplantatverlust gefährdet. Trotz Verwendung immunsuppressiver Therapieprotokolle, welche sich bei der Transplantation von Herz, Leber und Niere bewährt haben, werden unreine Inselsuspensionen frühzeitig abgestoßen. Im Mittelpunkt des Interesses der Fachkreise stehen daher Reinigungsverfahren von transplantierfähigen Inselsuspensionen bzw. deren Präparation in besonders reiner Form aus Spenderorganen.

In der publizierten PCT-Anmeldung WO88/09667 ist ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Zellsuspensionen aus Spenderorganen wie dem Pankreas beschrieben, indem man aus Gewebeverbänden herausgelöste Zellsuspensionen, wie Langerhans \'sehe Inseln enthaltende Suspensionen, der sogenannten Dichtegradientenzentrifugation unterwirft. In zahlreichen Publikationen, insbesondere in Übersichtsartikeln wie London N.J.M. et al.: Islet purification. In: Pancreatic Islet Cell Transplantation (Ricordi C, Editor), R.G. Landes, Austin, Texas, USA, pp 113-123, 1992, ist die spezielle Methodik der Dichtegradientenzentrifugation basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellen und/oder Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte (u.a. isopyknische Gradientenzentrifugation genannt) und deren Anwendung als Reinigungsverfahren für Suspensionen mit Zeil verbänden von Langerhans \'sehen Inseln beschrieben, wobei Reinheitsgrade bis zu 90 %, bezogen auf das Volumen der gereinigten zellulären Partikel, erzielt werden. Die Verunreinigung der nach Anwendung dieser Methodik erhältlichen Inselsuspensionen mit unerwünschten zellulären Partikeln wie exokrinen Fragmenten, duktalen Elementen, Lymphknoten und Gefäßen ist unter dem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung deutlich erkennbar.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Zubereitung von isolierten Langerhans \'sehen Inseln mit besonders hohem Reinheitsgrad herzustellen und die anhand eines Standardversuches in vitro nachweisbare Immunogenität zu mindern.

Diese Aufgabenstellung wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, welche eine Zubereitung von isolierten Langerhans \'sehen Inseln mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98 %, bezogen auf das Volumen des gereinigten Zellmaterials, und das Herstellungsverfahren dieser Zubereitung betrifft.

Die Zubereitung der isolierten Langerhans \'sehen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist durch folgende Merkmale gekennzeichnet:

Einen erhöhten Reinheitsgrad von Langerhans\'scher Inseln verglichen mit Inselsuspensionen nach Anwendung nur einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte.

Die Zubereitung der isolierten Langerhans ^\' sehen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist außerdem durch folgende zusätzliche Merkmale gekennzeichnet:

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Verlust von weniger als 3 % des Inselvolumens;

Durchmesser der Mehrzahl des gereinigten Zellmateriais größer als 100 μm;

Reduktion der Immunogenität um durchschnittlich mehr als 75 %;

Reduktion der potentiellen mikrobiologischen Kontamination;

Konstanz der mikrofluorometrischen Viabilitätsindizes;

Erhöhung der Glucose-stimulierten Insulinsekretionsindizes in-vitro um durchschnittlich mehr als 50 % sowie

Erhöhung der Wiederfindung des Inselvolumens nach einer oder mehreren immunmodulierenden Behandlungen.

Diese Merkmale ergeben sich im Vergleich mit vorgereinigten Inselsuspensionen nach Anwendung einer Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlicher Dichte, aber vor Anwendung einer anschließenden Trennmaßnahme vorwiegend basierend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser, welche als erfinderisches Verfahrensmerkmal im folgenden noch näher beschrieben wird.

Als weiteres Merkmal kann noch der Amylasegehalt von weniger als 0,05% verglichen mit der Inselsuspension nach Herauslösung aus dem Gewebeverband des distendierten Pankreas und vor Anwendung von anschließend durchzuführenden Trennmaßnahmen genannt werden. Die Zubereitung enthält außerdem physiologisch annehmbare Trägerflüssigkeit.

Die Reinheit der Zubereitung der isolierten Langerhans \'sehen Inseln gemäß vorliegender Erfindung ist unter dem Lichtmikroskop deutlich erkennbar.

Die weiter vorn und im folgenden verwendeten allgemeinen Definitionen und Begriffe haben im Rahmen der Beschreibung der Erfindung die folgenden Bedeutungen:

Der Begriff Zellmaterial umfaßt zelluläre Fragmente oder Partikel, ganze Zellen und Agglomerationen von ganzen Zellen bis hin zu Agglomerationen von Zellen, welche auch Zellcluster genannt werden.

Die Zubereitung von isolierten Langerhans \'sehen Inseln ist nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren aus dem tierischen oder menschlichen Spenderorgan Pankreas erhältlich und für diagnostische und /oder therapeutische Verfahren vorzugsweise am Menschen aber auch an Tieren applizierbar. Für therapeutische Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus, sowohl vom Typ I als auch II, ist die Zubereitung der isolierten Langerhans ^\' sehen Inseln aus dem menschlichen Pankreas bevorzugt. Wegen der begrenzten Verfügbarkeit von humanem Pankreas von Spendern und der hohen Prävalenz des Diabetes mellitus in der Bevölkerung wird auch tierisches Pankreas, insbesondere vom Schwein, bevorzugt. Für diagnostische Verfahren ist die Zubereitung von isolierten tierischen Langerhans \'sehen Inseln, insbesondere vom Schwein, bevorzugt. Die Zubereitung von isolierten Langerhans ^\' sehen Inseln aus dem menschlichen Pankreas für die diagnostische Anwendung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die Zubereitung liegt vorzugsweise in Form einer Suspension der isolierten Langerhans \'sehen Inseln in einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit

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ERSATZBLATT

vor, die vorzugsweise parenteral in die Vena portae (Pfortader der Leber), aber au in die Vena lienalis, in die Milzpulpa, unter die Nierenkapsel, in ei Omentumtasche, in das große Netz ("epiplpoic flap"), intraperitonea intramuskulär, subcutan, intracerabral oder intratesticulär injizierbar ist.

Der Begriff physiologisch annehmbare Trägerflüssigkeit definiert sämtliche wäßri Medien, die in der Literatur als geeignet für Reinigungs-, Diagnose- un Transplantationsverfahren von Langerhans \'sehen Inseln beschrieben sin Bevorzugt sind Medien, die unter Bezeichnungen wie Hank\'s Balanced Sali Solution (Hanksche Lösung), Minimum Essential Medium, Medium 199, RP 1640, CMRL 1066, University of Wisconsin Solution etc. geläufig sind.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Herstellungsverfahren f die weiter vorn beschriebene Zubereitung der isolierten Langerhans \'sehen Inse mit einem Reinheitsgrad von mehr als 98 % des Zellmaterials. Dieses Verfahren i durch folgende Verfahrensmerkmale gekennzeichnet, daß man a) das Pankreas mit einer physiologisch annehmbaren Trägerflüssigkeit, welc gegebenenfalls Collagenase und /oder weitere Proteasen enthält, distendie und aus dem Gewebe verband Langerhans \'sehe Inseln mit zusätzliche Zellmaterial durch Digestion herauslöst, b) die herausgelösten Langerhans ^\' sehen Inseln vom zusätzlichen Zellmateri durch mindestens eine Trennmaßnahme basierend vorwiegend a unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedliche Durchmesser abtrennt und gewünschtenfalls c) die erhältlichen Langerhans \'schen Inseln einer ihre potentiel Immunogenität/ Antigeni tat reduzierenden Behandlung unterwirft und /od die behandelnden Inseln konserviert.

Verfahrensschritt a)

Dieser Verfahrensschritt ist an sich bekannt und findet generell bei den bekannte Isolierungs- und Reinigungsverfahren von Langerhans \'scher Inseln Anwendung.

Der Begriff Distension bedeutet Aufdehnung. Zur Distension wird d Ausführungsgang des Pankreas, z.B. vom Mensch oder Schwein, über den i Körper die im exokrinen Anteil des Pankreas gebildeten Verdauungsenzyme in de Dünndarm abgegeben werden, kanüliert und über diese Kanüle werden meist 2 Hanksche Lösung mit ca. 0,1 - 1,0 % (w/v) Collagenase pro g Pankreas retrograd i den Pankreasgang injiziert. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise nach d von Lacy P.E. et al. in Diabetes 16: 35-39 (1967) und von Gray D.W.R. et al. i Diabetes 33: 1055-1061 (1984) beschriebenen Methodik durchgeführt.

Der Begriff Digestion bedeutet Verdauung. Während der Digestion wird d Pankreas unter enzymatischer und mechanischer Einwirkung in Langerhans \'se Inseln und Zellmaterial dissoziiert. Diese Maßnahme wird vorzugsweise nach d von Ricordi C. et al.: Diabetes 37: 413-420, 1988 sowie in der PCT-Anmeldung W 88/09667 beschriebenen Methode durchgeführt.

Der Begriff Protease umfaßt neben reinen Collagenasen die unter Bezeichnung w Neutral Protease, Clostripain, Trypsin, Elastase, Dispase etc. bekannten Enzyme.

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ERSATZBLATT

Nach Durchführung des Verfahrensschrittes a) erhält man eine Suspension d herausgelösten Langerhans \'sehen Inseln in den weiter vorn definierten Medie die noch durch zusätzliches Zellmaterial verunreinigt ist.

Verfahrensschritt b)

Der Begriff Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf unterschiedlich Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser definiert e Trennverfahren, das an sich bekannt ist, dessen Anwendung zur Isolierung u Reinigung von Langerhans \'sehen Inseln noch neu und daher Gegenstand d vorliegenden Erfindung ist. Diese Trennmaßnahme wird in internationale Publikationen mit dem Begriff velocity Sedimentation bezeichnet, die u.a. folgen Verfahrensvarianten umfaßt: Sedimentation bei 1 g, Gegenstromzentrifugati (Elutriation), Zentrifugation in reorientierenden Zonalrotoren und isokinetisc Gradientenzentrifugation. Bevorzugt ist die unter der üblichen Bezeichnu "isokinetische Gradientenzentrifugation" bekannte Verfahrensvariante.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird d isokinetische Gradientenzentrifugation mit einer weiteren Trennmaßnah basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden m unterschiedlicher Dichte kombiniert.

Der Begriff Trennmaßnahme basierend vorwiegend auf Sedimentation vo Zellverbänden mit unterschiedlicher Dichte definiert ein weiteres Trennverfahre das an sich bekannt ist und auch bei der Isolierung und Reinigung vo Langerhans \'sehen Inseln angewendet worden ist, siehe Publikation von Londo N.J.M., loc. cit., Seite 5. Diese Trennmaßnahme ist in internationalen Publikatione auch unter dem Begriff isopyknische Gradientenzentrifugation beschrieben. D bevorzugt anzuwendende Methodik wird im Beispiel näher erläutert.

Die besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurc gekennzeichnet, daß man b) die herausgelösten Langerhans ^\' sehen Inseln von zusätzlichem Zellmateri durch aufeinander folgende Trennmaßnahmen basierend vorwiegend a unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedlich Dichte und unterschiedlichem Durchmesser abtrennt.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann man umgekeh vorgehen, indem man die Trennmaßnahmen basierend vorwiegend a unterschiedlicher Sedimentation von Zellverbänden mit unterschiedliche Durchmesser und unterschiedlicher Dichte miteinander kombiniert. Ebenfal kann man beide Trennmaßnahmen in kontinuierlichen Verfahren miteinand kombinieren.

Die isokinetische Gradientenzentrifugation wird bevorzugt nach der von Pretlow G. in Anal Biochem 41: 248-255, 1971 und in der von Pretlow T. G. II und Pretlow P. in Cell Separation: Methods and Selected Applications, Vol. 5, Academic Press, p 281-309, 1957 beschriebenen Methotik in einem physiologisch annehmbare

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wäßrigen Medium mit linearem Dichtegradienten durchgeführt. Ein solches Medium wird in Publikationen mit der Bezeichnung "Gradient: ^\' \' versehen und wird z.B. in einem sogenannten Gradientenmischer geformt oder bei der Zentrifugation selbst gebildet. Der Gradient hat am Boden des Zentrifugenröhrchens die größte Dichte und nimmt mit der Höhe an Dichte ab. Geeignete Medien zur Bildung von Gradienten sind z.B. unter der Bezeichnung Ficoll ^R , Percoll ^R (Pharmacia, Freiburg) bekannt und können Hilfsstoffe wie Polysucrose, Polyvinylpyrrolidon, Albumin oder Dextran enthalten. Für Trennmaßnahmen basierend vorwiegend auf unterschiedlicher Sedimentation von Zellmaterial mit unterschiedlichem Durchmesser ist die Migration des sedimentierenden Zellmaterials durch einen Gradienten charakteristisch, dessen maximale Dichte nicht größer ist als die des am wenigsten dichten sedimentierenden Materials. Während der Zentrifugation bewegt sich das sedimentierende Zellmaterial mit einer weitgehend konstanten Geschwindigkeit durch den Gradienten. Die Trennmaßnahme ist beendet, wenn die ersten zellulären Partikel den Boden des Zentrifugenröhrchens erreichen. Diese Methodik ist für Trennmaßnahmen von Zellmaterialien geeignet, die sich im wesentlichen durch ihren Durchmesser, aber weniger durch ihre Dichte unterscheiden.

Verfahrensschritt c)

Eine die potentielle Immunogenität /Antigenität reduzierende Behandlung, z.B. Kultivierung, UV-Bestrahlung, Gamma-Bestrahlung, Inkubation mit Antikörpern oder Verkapselung, betrifft übliche Aufarbeitungsverfahren von Zellmaterial in Kulturen für die weiter vorn beschriebenen Anwendungen, welche ebenfalls in den in dieser Anmeldung zitierten Publikationen beschrieben werden. Die Kryopräservierung kann sich bevorzugt als Konservierungsmaßnahme anschließen. Aufgrund der besonderen Reinheit der erhältlichen Inseln erzielt man nach Anwendung bei allen Maßnahmen, die sich an die Trennmaßnahmen anschließen, ein verbessertes Resultat, welches die therapeutischen und/oder diagnostischen Befunde verbessert.

Das folgende Beispiel illustriert die Erfindung, ohne dadurch diese zu limitieren (Temperaturangaben in Grad Celsius, die Ortsangaben der Hersteller bzw. der Herausgeber und Verlage von Publikationen beziehen sich auf in der Bundesrepublik Deutschland gelegene Orte):

ERSATZBLÄΓT

Beispiel:

1. Pankreasgewebe.

Das Pankreas wird in einem Schlachthaus bei einer Zuchtsau (Deutsche Bundeshybridzuchtprogramm, 240 kg, 34 Monate) nach Bolzenschu Entblutung und Entnahme des Darmsitus unter Schonung der Organkaps aus dem umgebenden Fettgewebe unter sterilen Kautelen freipräpariert. D Schlachtvorgang bedingt eine warme Ischämiezeit von 10 min. Da entnommene Organ wird in 4° kalter Eurocollins ^R -Lösung (Fresenius, Ba Homburg) in das Insellabor transportiert. Die kalte Ischämiezeit vor Begin der Inselisolierung beträgt 30 min.

2. Pankreaspräparation und Pankreasdistension.

Alle weiteren Schritte der Inselpräparation werden unter sterilen Kautele ausgeführt. Nur der milznahe Schenkel des Pankreas wird für di Inselisolierung benutzt. Das Gewicht des präparierten Organsegmentes beträ 120 g. Der Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse (Ductus pancreaticus wird an der Schnittfläche zwischen milznahem und rechtem Schenk aufgesucht, mit einer 19G-Kanüle kanüliert und die Kanüle mit eine chirurgischen Faden fixiert.

Das Gewicht des verwendeten milznahen Pankreasschenkels determiniert da Volumen der Distensionslösung. Pro Gramm Pankreas werden über di liegende Kanüle 2 ml Distensionslösung, d.h. insgesamt 240 ml, retrograd i den Ductus pancreaticus injiziert. Zur Distension wird University o Wisconsin (UW)-Lösung (DuPont, Bad Homburg) mit 0,4 % (wt/vol Collagenase (Serva, Heidelberg, Katalog-Nr. 17449) benutzt, die Temperatur de Distensionslösung beträgt 22°.

Nach erfolgter Distension werden die Kanüle, weiteres umgebendes Fett- un Bindegewebe, die Organkapsel, und nicht distendiertes Parenchym entfern (insgesamt 15 g ohne Kanüle, d.h. das Gewicht des weiter verwendete Pankreas beträgt 105 g).

3. Pankreasdigestion.

Langerhans \'sehe Inseln (Inseln) werden nach einer von Ricordi C. et al. Diabetes 37: 413-420, 1988 und ebenfalls in der publizierten PCT-Anmeldun WO 88/09667 für die Isolierung von humanen Langerhans \'sehen Insel beschriebenen Methodik aus dem Gewebeverband zusammen mit exokrine Fragmenten, Ductuselementen, Gefäßbruchstücken, Lymphknoten etc herausgelöst.

Zu diesem Zweck wird das distendierte Pankreassegement in den unteren Tei einer 450 ml Digestions-Kammer, deren Anordnung in der PCT-Anmeldun WO 88/09667 beschrieben ist, zusammen mit sieben Glaskugeln gegeben Anschließend werden der untere Teil der Kammer, ein Sieb mit eine

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ΞRSATZBLATT

Porengröße von 400 μm, der Deckel der Kammer sowie ein Schlauchsystem zur Rezirkulation der Collagenselösung wie in Aob. 2 der PCT-Anmeldung WO 88/09667 beschrieben, zusammengefügt.

Man füllt das Schlauchsystem mit zusätzlicher Hankschen Lösung, schaltet die Pumpe zur Rezirkulation der Lösung ein und stellt die Durchflußgeschwindigkeit (flow rate) auf 200 ml/min. Man bewegt die Digestions-Kammer mit dem distendierten Pankreas und den Glaskugeln in der vertikalen Achse mit einer Frequenz von 300 Oszillationen pro min. und einer Amplitude von 10 mm. Man erhöht die in der Digestionskammer gemessene Temperatur mittels eines Wärmetauschers um 3°/min. auf 32-34° und hält die Temperatur während der Rezirkulationsphase (Phase I) bei diesem Wert konstant.

Anhand mikroskopischer Beobachtung von Proben, welche im Abstand von 1-2 min. aus dem Schlauchsystem entnommenen werden, läßt sich der Fortgang der Pankreasdigestion verfolgen. Nach 14 min. wird erstmals eine große Zahl freier Inseln in einer entnommenen Probe identifiziert. Man stoppt die Rezirkulation der Collagenase-haltigen Hankschen Lösung zu diesem Zeitpunkt und spült die Kammer 15 min. mit frischer, enzymfreier Hankschen Lösung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 250 ml /min, bis in den Proben keine Inseln sichtbar sind (Phase II). Die Temperatur während Phase II nimmt von 32-34° innerhalb von 15 min auf 15° ab. Um die freiwerdenden Inseln vor der Einwirkung der Collagenase und weiterer, aus dem Pankreas freigesetzter proteolytischer Enzyme zu schützen, nimmt man die Gewebesuspension in gekühlten (8°) 250 ml Zentrifugenbechern mit konischem Boden auf, in die 35 ml Hanksche Lösung vorlegt.

Man zentrifugiert diese mit Gewebesuspension gefüllten Zentrifugenbecher 2 min. lang bei 4° in einem Schwerefeld von 120 x g, verwirft den Überstand, füllt das Gesamtpellet auf 200 ml mit UW-Lösung (4°) auf, resuspendiert und lagert bei 8°C.

Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehaltes, der Insulin-Konzentration und der Amylaseaktivität werden repräsentative Proben entnommen.

4. Isopyknische Dichtegradientenzentrifugation

Nach nochmaliger Zentrifugation (2 min. bei 4° in einem Schwerefeld von 120 x g) verwirft man denÜberstand, resuspendiert das Pellet mit einem Volumen von 32 ml in 15 ml hitzeinaktiviertem Newborn Calf Serum (NCS, Biochrom, Berlin) und überführt in ein 600 ml Becherglas, welches man mit 400 ml Ficoll-Natriumdiatrizoat-Lösung auffüllt. Man stellt diese Lösung durch Zusammengeben von 500 ml Seromed ^R -Ficolltrennmittel (1,090 g/cm-3, Biochrom, Berlin), 12 ml HEPES IM (Gibco, Eggenstein), 5ml Penicillin- Streptomycin (10.000 lU/ml P., 10.000 μg/ml S., Flow, Irvine, GB), 1 ml 1 N NaOH und 50 ml Medium 199 (lx, Biochrom, Berlin) her. Man überführt den Inhalt des Becherglases (Bodenschicht) in einen 500 ml-Bluttransportbeutel (Modell Biopack, Biotrans, Dreieich), verbindet diesen Bluttransportbeutel mit einem zuvor in das Blutzellwaschgerät 2991 (Cobe, Kirchheim /München)

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ERSATZBLATT

gemäß Vorschrift eingelegten Einmalsystem (Blocd Call Proceεsor Processin Set, Cobe, Katalog-Nr. 912-647-819) und füllt den Inhalt de Bluttransportbeutels in das Einmalsystem ein. Man beschleunigt di Zentrifuge des Blutzellwaschgerätes 2 min. lang auf 2000 rpm (rotations pe minute). Man schichtet 200 ml Medium 199 auf die Bodenschicht mit eine Schlauchpumpe bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 60 ml/min. auf während man die Zentrifuge auf 2400 rpm beschleunigt. Anschließen entlüftet man das Einmalsystem und verschließt den Zuführungsschlauch Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 2400 rpm und Raumtemperatur werde bei derselben Umdrehungszahl mit einem integrierten "Gradientenunloader nacheinander folgende Fraktionen aus dem "Processing Set" i Zentrifugenbecher überführt:

Nach Abstellen der Zentrifuge entnimmt man das "Processing Set" un überführt die

Fraktion IV: 50 ml in ein Becherglas.

Die Fraktionen werden in Medium 199 mit 10%-igem NCS suspendiert und 5 min. lang bei 250 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Man verwirft den Überstand, resuspendiert das Pellet der Fraktionen separat in Leibovitz- Medium (Biochrom, Berlin) mit 10%-igem fetalem Kälberserum (FCS, Biochrom, Berlin), 1%-iger Penicillin-Streptomycin Lösung und 2 mM Glucyl- Glutamin (Biochrom, Berlin), überführt die Suspensionen in Kulturflaschen und beurteilt die Suspensionen hinsichtlich ihrer Inselreinheit (prozentualer Anteil der mit Inselgewebe bedeckten Oberfläche). Die Fraktionen, die die Masse des Volumens der Inseln enthalten, sind nahezu ohne exokrine Kontamination und werden anschließend der isokinetischen Gradientenzentrifugation zugeführt.

Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehaltes, der Insulin-Konzentration, der Amylase-Aktivität, der Glukose-abhängigen Insulinsekretion in-vitro sowie der Immunogenität werden repräsentative Proben entnommen.

5. Isokinetische Gradientenzentrifugation

In 100 ml-Rundboden-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit einer Höhe von 166 mm und einem Durchmesser von 31,5 mm (Nalge, Braunschweig) werden eine Bodenschicht (Kissen) mit einem Volumen von 4 ml, einer Höhe

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ERSATZBLATT

von 15 mm, einer Dichte von 1,026 g/cm ³ und einer Viskosität von 3,5 cP be 16° bestehend aus FICOLL und Leibovitz-Medium pipettiert.

Auf die Bodenschicht (das Kissen) wird mit Hilfe eines Zweikammer Gradientenformers ein kontinuierlicher Gradient mit einem Volumen von 7 ml und einer Höhe von 120 mm, einem Dichtebereich von 1,026 bis 1,01 g/cm ³ und einem Viskositätsbereich von 3,5 cP bis 2,0 cP bei 16° bestehend au FICOLL und Leibovitz-Medium aufgeschichtet.

Auf den kontinuierlichen Gradienten wird eine 5 ml Probe entsprechen einer Höhe von 8 mm und bis zu 50.000 Inseläquivalenten (ei Inseläquivalent ist eine volumenkorrigierte Inselzahl, ein Inseläquivalen repräsentiert eine Insel mit einem Durchmesser von 150 μm, siehe Ricordi et al. Acta Diabetol Lat 27: 185-195, 1990) und zellulärer Restmasse in Leibovit Medium hinzugefügt.

Die Zentrifugenröhrchen mit Bodenschicht (Kissen), Gradienten und Prob werden so in eine Zentrifuge positioniert, daß der Abstand der Grenzschich zwischen Kissen und Gradienten 22,2 cm und der Abstand der Grenzschich zwischen Probe und Gradienten 10,2 cm vom Zentrum der Hettich Rotixa R Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen) beträgt, welche mit einem Ausschwingroto Typ 5094 und passenden Gehängen und Reduzierungen zur Aufnahme vo 100 ml-Zentrifugenröhrchen versehen ist. Gegenüberliegend werden weiter Zentrifugenröhrchen gleichen Inhaltes oder Balanceröhrchen positioniert.

Man beschleunigt die Zentrifugenröhrchen 30 sec. lang bis auf 490 rpm. Be dieser Drehzahl wirkt eine Zentrifugalkraft von 27,4 x g an der Grenzschich zwischen Probe und Gradienten und von 59,6 x g an der Grenzschich zwischen der Bodenschicht und Gradienten. Man zentrifugiert bei 16° 60 sec. lang und bremst in 30 sec. bis auf 0 rpm ab.

Man entnimmt die Zentrifugenröhrchen der Zentrifuge, aspiriert die erst Fraktion bestehend aus 80 ml und die zweite Fraktion bestehend aus 5 ml verdünnt mit Leibovitz Medium und wäscht durch erneute Zentrifugation min. bei 120 x g und 16 °. Man verwirft den Überstand und resuspendiert die verbleibende Zellsuspension mit Leibovitz Medium oder anderen Kultur Medien und konventionellen Zusätzen.

Zur Bestimmung der Inselzahl, des Inselvolumens, des DNA-Gehaltes, de Insulin-Konzentration der Amylaseaktivität, der Glukose-abhängigen Insulinsekretion in-vitro sowie der Immunogenität werden repräsentative Proben entnommen.

Die erhältliche Inselsuspension wird der weiteren Verwendung, z.B. Kultur, zugeführt.

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ERSATZBLATT

6. Prüfung

Die Inselzahl, das Inselvolumen, die Insulinkonzentation, der mikrofluorometrische Viabilitätstest, die Glucose-abhängige Insulinsekretion in- vitro werden in den einzelnen Proben nach internationalem Standard bestimmt (Ricordi C. et al. Acta Diabetol. Lat., loc. cit.). Die Bestimmung des DNA-Gehaltes erfolgt nach der Methode von Labarca C. und Paigen K., Anal Biochem 102: 344-352,

1980. Die Amylaseaktivität der einzelnen Proben wird mit dem α-Amylase EPS ^R - Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim) bestimmt. Zur Erfassung der Immunogenität wird eine gemischte Lymphozyten-Insel-Kultur durchgeführt, siehe Ulrichs K. et al.: Horm. Metabol. Res. 25/S: 123-127, 1990). 100 Schweineinseln werden zusammen mit 10-5 humanen Lymphozyten drei Tage lang bei 37° kultiviert, anschließend nach Zugabe von 10 μCi ^H-Thymidin kokulti viert man 20 h. lang Inseln und xenogene Lymphozyten. Die Lyphozytenproliferation korreliert mit dem ^H-Thymidin-Einbau und wird mit einem ß-Counter als "counts per minute" und unter Berücksichtigung von Kontrollwerten nach Umrechnung als Stimulationsindex ausgedrückt.

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ERSATZBLATT

Tab. 1 Ergebnisse einer Zubereitung Langerhansscher Inseln aus dem Pankreas eines Schweines mit Anwendung von zwei aufeinander folgenden R einigungsverf ahren ( is op yknisch e und isokine tische Gradientenzentrifugation)

Tab.2 Ergebnisse weiterer Inselzubereitungen aus dem Schweinepankreas (n=9) mit Anwendung von zwei aufeinander folgenden Reinigungsverfahren (isopyknische und isokinetische Gradientenzentrifugation)

IPGZ: isopyknische Zentrifugation

IKGZ: isokinetische Zentrifugation

PI: Perifusionsindex

* Unterschiede der Stimulationsindices hochsignifikant (p < 0,001)

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ERSATZBLATT