COMPLEXES DE LANTHANIDE POUR LA CRISTALLISATION DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES ET LA DETERMINATION DE LEUR STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE

La présente invention concerne les domaines techniques de la cristallisation et de la cristallographie. Plus précisément, l'invention concerne de nouveaux complexes de lanthanide qui peuvent être utilisés en tant qu'agents phasants pour la détermination de structure cristalline de macromolécules biologiques, mais également en tant qu'aide pour leur cristallisation. L'invention a également pour objet leur utilisation dans ces domaines et les procédés de cristallisation et de détermination de données structurales qui les mettent en œuvre.

Le succès retentissant de la détermination complète du génome humain en 2000 a ouvert la voie à un domaine de recherche plus vaste encore : la génomique structurale qui consiste à déterminer la structure des protéines pour comprendre les relations entre leur structure et leurs fonctions. De par le nombre et la variété de protéines existantes, il s'agit d'un chantier énorme dont la portée en termes de retombées scientifiques et médicales est inestimée. Aujourd'hui, les deux outils pour cette résolution structurale sont la cristallographie et la résonance magnétique nucléaire (RM ). Il s'agit de deux techniques complémentaires qui présentent des avantages et des limites : (i) la RMN permet l'analyse en solution de protéines, mais requiert un enrichissement isotopique; (ii) la cristallographie permet une détermination plus rapide de structures mais reste tributaire de la préparation de cristaux de bonne qualité. Actuellement, l'effort de recherche est focalisé sur le développement de très grands instruments au détriment de la recherche de nouvelles méthodologies,

Dans ce domaine, plusieurs difficultés successives doivent être surmontées. La première difficulté relève du domaine de la biologie et concerne la préparation et la purification de protéines d'intérêt et seulement 18% des protéines clonées franchissent cette étape. La seconde difficulté concerne l'étape de cristallisation puisque là encore, seulement 20% des protéines purifiées peuvent être cristallisées et seulement la moitié de ces cristaux permettront la détermination de la structure par diffraction des rayons X. Au bilan, seulement 1,8% des protéines clonées sont structuralement caractérisées et ceci, au prix d'investissements en termes de temps et de moyens humains et financiers considérables.

Un cristal d'une protéine, ou plus généralement d'une macromolécule biologique, est constitué d'un empilement régulier et périodique des molécules qui le composent. L'empilement est maintenu par des contacts au sein du cristal (liaisons hydrogène, ponts salin, contacts hydrophobes). L'obtention d'un cristal d'une macromolécule biologique est une étape clef dans la détermination de sa structure par cristallographie aux rayons X.

Il convient de souligner que les processus de cristallisation des macromolécules biologiques sont encore loin d'être compris et que les approches actuelles sont basées sur une approche empirique, de type essais/erreurs.

Une des notions importantes à considérer dans la cristallogenèse est la notion de solubilité. En solution, une macromoiécule est entourée d'une couche de solvatation qui présente un effet répulsif et isolant et permet d'éviter l'auto- agrégation et la précipitation. La cristallisation va contre cet effet, puisqu'il s'agit de s'éloigner des conditions de solubilité de la macromolécule biologique par l'ajout d'un agent précipitant, également nommé agent cristallisant. Dans le cadre de la présente description, « agent précipitant » et « agent cristallisant » sont utilisés indifféremment. On entend par agent cristallisant/précipitant, une molécule ou un mélange de molécules aidant à la formation d'un cristal de macromolécules biologiques, dans certaines conditions.

Le principe général de la cristallisation repose sur le diagramme présenté en Figure 1 qui correspond au schéma réalisé par Mirjam Leunissen et figurant sur http://people.ds.cam.ac.uk/ml527/publications/assets/leuniss en-literature- research.pdf.

Les deux étapes principales qui surviennent dans le processus de cristallisation sont : la nucléation et la croissance cristalline.

L'agent cristallisant induit une modification de la solubilité et donc de la position sur Se diagramme en fonction du temps. Il existe différentes méthodes de cristallisation mettant en œuvre un agent cristallisant.

Le but lors d'une cristallisation est de jouer sur les concentrations en macromolécule biologique et en agent cristallisant pour parvenir à atteindre la zone de nucléation représentée sur le diagramme de la Figure 1. Lorsque cette zone est atteinte, il peut se former des nucleii (points de nucléation). Ces nucleii sont des agrégats plus ou moins organisés d'une centaine de macromolécules. La formation de ces départs « cristallins » fait diminuer la concentration en macromolécule soluble. C'est le commencement de la croissance cristalline. D'autres macromolécules viennent s'agencer sur ce nucleii et forment des micro-cristaux qui vont grandir avec le temps.

Il existe trois grandes classes majeures d'agents cristallisants :

- les sels,

- les solvants organiques (éthanol, dioxane, MPD pour méthylpentanediol etc..)

- les polymères (PEG (Poly-Ethylène Glycol) de poids moléculaires allant jusqu'à 20000 g/mol, Jeffamine T etc..)

Ces agents ont pour effet :

- d'entrer en compétition avec la macromolécule biologique pour l'eau, ou plus généralement le solvant dans lequel la macromolécule est initialement en solution, et ainsi diminuer la solubilité de la macromolécule, induisant sa cristallisation,

- d'écranter des charges à la surface de la macromolécule permettant le rapprochement de plusieurs macromolécules,

- de modifier la constante diélectrique du solvant et par conséquent les forces entre macromolécules

- de favoriser des phénomènes de type volume exclu (exclusion hydrophobe). Pour obtenir la cristallisation d'une protéine, ou plus généralement d'une macromolécule biologique, une approche automatisée permettant un criblage de différentes conditions de cristallisations commercialement disponibles (kits de la société Hampton Research, par exemple). Les expériences de cristallisation sont préparées par des robots et la phase de cristallisation est suivie régulièrement par des robots microscopes qui scrutent l'apparition des cristaux. Cette approche à haut débit a fait passer au second plan la recherche de méthodologies alternatives permettant de favoriser la cristallisation, consistant à trouver des agents qui favorisent la cristallisation sans dénaturer la protéine. Quelques travaux existent sur ce sujet dans la littérature, comme l'utilisation de composés naturels : solides minéraux (Falini G., Fermani S., Conforti G., Ripamonti A. (2002) ; Acta Crystallogr D Bîol Crystaliogr. 58, 1649-1652, cPherson, A. & Shlichta, P. (1988), Science, 239, 385-387), substrat d'origine biologique comme les cheveux, les crins de chevaux, les moustaches de rat ou les algues séchées (D'Arcy A., Mac Sweeney A. & Haber, A. (2003), Acta Crystaliogr D Biol Crystaliogr, 59, 1343-1346), mais également des produits de synthèse (Bijelic A., Molitor G, Mauracher S., G. Al-Oweini, R., Kortz U. & Rompel, A. (2014), ChemBioChem. 16, 233-241, Pechkova, E. & Nicolini, G (2002), 1 Ceil. Biochem. 85, 243-251, Sugahara, M. Asada, Y. Morikawa, Y. Kageyama, Y. & Kunishima, N. (2008), Acta Crystaliogr D Biol Crystaliogr. 64, 686-695, Matar- Merheb, R. Rhimi, M. Leydier, A. Huché, F. Galiân, G Desuzinges-Mandon, E, Ficheux, D. Flot, D. Aghajari, N. Kahn, R, et ai. (2011), PLoS ONE. 6, el8036).

Dans tous ces cas, la croissance cristalline se produit au contact de ces « impuretés ». Les travaux les plus aboutis dans ce domaine sont ceux de l'équipe de Naomi E. Chayen qui propose l'utilisation de matériaux mésoporeux, capable d'induire la nucléation dans les pores après une étape de concentration/agrégation au sein de ces mêmes pores (WO 02/088435). Le même groupe décrit également l'utilisation de MIP « molecular imprinted polymers » basés sur le même principe. Il s'agit de polymères préalablement imprimé par la protéine à cristalliser et qui en contiennent donc la trace. Ajoutés ensuite à la goutte de cristallisation, une interaction de forme peut se produire favorisant la nucléation (Saridakis, PNAS, 2001, 108,11081). Tous ces agents d'aide à la cristallisation sont des solides formant une phase hétérogène dans le milieu de cristallisation, chacun d'eux devant donc être ajouté manuellement dans la goutte de cristallisation, ce qui est inconciliable avec l'utilisation des plateformes de criblage robotisées, à l'exception des MIP.

Par ailleurs, de par la taille gigantesque des macromolécules biologiques, comme les protéines, la détermination de leur structure par diffraction des rayons X implique de résoudre le problème des phases en cristallographie. Cela implique de posséder un cristal natif (protéine pure) et/ou un cristal dérivé contenant un atome lourd facilement repérable et permettant de lever le problème des phases, on parle d'agent de phasage. La méthode la plus classique, basée sur la diffraction anomale à plusieurs longueurs d'onde (MAD) est fondée sur le remplacement du soufre des acides aminées méthionines de la protéine par un atome de sélénium. Utilisée depuis les années 90, cette méthode a révolutionné la cristallographie macromolécuiaire, mais elie implique la synthèse, la purification, la cristallisation et la résolution de la structure de protéines séléniées analogues. C'est une méthode très coûteuse en temps. D'autres agents phasants exogènes peuvent être utilisés et sont d'ailleurs commercialisés, On peut citer le brome, les métaux lourds (Pt, Au, Hg). Dans ce contexte, R. Kahn a montré au début des années 2000 que les lanthanides, qui présentent des effets anomaux parmi les plus intenses, peuvent être inclus sous forme de complexes dans des cristaux de protéines, ce qui permet de résoudre rapidement la structure de la macromolécule si ie lanthanide est fixé (E. Girard, M. Stelter, P. L Anelli, 1 Vicat, R. Kahn, Acta. Cristaliogr. D, 2003, D59, 118; E. Girard, P.L. Anelli, 1 Vicat, R. Kahn, Acta. Cristallogr. D, 2003, D59, 1877). A ce jour, cinq complexes de lanthanide sont commercialisés, en tant qu'agent phasant par la société NatX-ra .

DOTA HPD03A DTPA-B A DPA

Ln = Eu, Yb, (eiGd poour HPD03A) II existe dans la littérature quelques agents phasants luminescents, comme des dérivés fonctionnels du DPA ₃ (FR 2 991 322 et ACIE 2008) ou des complexes de lanthanide directement greffés à la structure des protéines (X. C. Su, H. B. Liang, K. V. Loscha and G. Otting, 1 Am. Chem. Soc, 2009, 131, 10352-10353).

Parmi tous ces dérivés, ies complexes tri-anioniques [(DPA) ₃ Ln] ^3~ semblaient très prometteurs car des interactions spécifiques avec des acides aminés cationiques et en particulier, avec i'arginine ont été mises en évidence par certains des inventeurs de la présente demande de brevet (E. Dumont, G. Pompidor, A. D'Aléo, J. Vicat, L. Toupet, R. Kahn, E. Girard, O. Maury, N. Giraud, PhysChemChemPhys 2013, 15, 18235-18242), et confirmées par des mesures de RMN (X. C. Su, H. B. Liang, K. V. Loscha, G. Otting, 1 Am. Chem. Soc, 2009, 131, 10352-10353). Malheureusement, ce composé s'est avéré instable dans un grand nombre de formulation composant les kits de cristallisation commerciaux ; (i) la présence de métaux de transition (Zn(II), Cu(II), Fe(II)) induit la déstructuration du complexe, (ii) la présence de sels alcalino-terreux divalents (Ba(II), Ca(IÎ), Mg(II)) provoque l'auto-cristallisation immédiate du complexe donnant lieu à une détection de faux- positifs (cristaux de complexes et non de cristaux dérivés de protéines) (Thèse de doctorat de R. Talon soutenue à Grenoble le 6 Juin 2012).

D'autres solutions ont proposé d'introduire des lanthanides dans les cristaux de protéines, pour obtenir un effet phasant. Nagem et al. (Nagem, R, A., Dauter, Z. & Polikarpov I, Acta Crystallogr. D, 2001, D57, 996-1002) ont proposé d'utiliser les sels de lanthanide et la méthode du trempage rapide (Dauter Z., Dauter, M. & Rajashankar, K. R. Acta Crystallogr. D, 2000, D56, 232-237). Cette méthode développée initialement pour les sels d'haiogénure (NaCI, Nal, NaBr) consiste à tremper, pendant un temps inférieur à la minute, les cristaux dans une solution saline très concentrée (> 1 mol L ). Dans le cas du sel de lanthanide, cette méthode a conduit à une dégradation rapide des cristaux. Purdy et al. (Purdy M. D., Ge P., Chen 1, Selvin P. R., & Wiener, M. C. Acta Crystallogr. D, 2002, D58, 1111-1117) ont proposé d'utiliser une liaison covalente reliant des complexes de lanthanide (où le ligand assure une coordination complète du lanthanide) à la protéine. La liaison est constituée par un pont disulfure formé entre des cystéines libres de la protéine et une fonction réactive thiol portée par le complexe. Enfin, Silvaggi et al. (Silvaggi, N. R., Martin, L. 1, Schwalbe, H., Imperiali, B., Allen, K. N. 1, Am. Chem. Soc, 2007 129, 7114-7120) ont proposé l'utilisation d'un « tag » fixant un ou deux lanthanides (LBT pour Lanthanide-Binding Tag). Le LBT est fondé sur une séquence peptidique dérivée des boucles à calcium qui peut être introduite dans les protéines par les techniques de biologie moléculaire classiques (Allen, K. N. Imperiali B., Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14, 247-254).

Il existe donc un besoin de disposer de nouveaux agents phasants qui ne nécessitent pas de modifier la structure des macromolécules biologiques, dont on souhaite déterminer la structure. De manière additionnelle, l'invention se propose de fournir des agents phasants qui soient suffisamment stables dans la plupart des conditions de cristallisation des macromolécules biologiques et qui permettent également d'élargir les possibilités d'obtention de cristaux permettant d'obtenir des informations structurales sur la macromolécule biologique d'intérêt.

Dans ce contexte, l'invention concerne des complexes cationiques formés d'un ton lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I) :

dans laquelle :

- X et Y, identiques ou différents, représentent, chacun indépendamment, -CH ₂ -(CH ₂ ) _n -, -CH ₂ -(CH ₂ )n-A-CH ₂ CH ₂ - ou -CH ₂ -CR ₃ RVCH ₂ -, X se lisant sur la formule générale (I) de la gauche vers la droite et Y se lisant sur la formule générale (I) de la droite vers la gauche, avec :

o n qui est égal à 1, 2 ou 3 ;

o A qui représente -NR ₂ -, -0(CH ₂ ) ₂ 0- ou -0-, avec R ₂ qui est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH ₂ R ₅ , Rs représentant un groupe phényie, pyridinyle ou picolinyle ;

o R ₃ qui représente un groupe méthyle ; et

o R' ₄ qui représente -NHR4 avec R ₄ qui représente -H, -CH ₃ , -CH ₂ Re ; Re représentant un groupe phényie ou pyridinyle ;

- Ri représente :

avec : o R ₇ qui représente -COO , -CONH2, -CONHRg, -PRgOO , ou un groupe choisi

parmi :

avec R ₉ qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle ; et

o Rs qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH ₂ ;

étant entendu qu'au moins un des enchaînements X et Y est différent de -CH ₂ -(CH ₂ ) _n -,

et leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates ;

à l'exception des complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand répondant à l'une des formules (1.1) à (1.5) suivantes, et de leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates :

(1.2) ooc

Les ligands de formule (I) comprennent au moins 7 sites de coordination pour un ion lanthanide Ln ³⁺ , voire plus, en fonction des structures de X et Y. Ces sites de coordination se trouvent sur les deux atomes d'azote représentés sur la formule (I), sur les deux pyridines des groupements Ri, sur les deux groupes R _7i au moins un site de coordination se trouvant sur X et/ou Y. Les complexes selon l'invention, ainsi que les complexes de lanthanide formés avec les ligands de formules (1.1) à (1.5), sont cationiques et présentent une charge positive supérieure ou égale à 1. Ils comportent un ligand macrocyclique incorporant plusieurs groupements aromatiques formant une sphère de coordination ouverte pour l'ion lanthanide. Ces groupes aromatiques, lorsque l'ion Ln ³⁺ est Eu ³⁺ ou Tb ³⁺ , agissent également comme antennes pour sensibiliser la luminescence du lanthanide dans le visible.

Par ailleurs, les complexes selon l'invention, présentent l'avantage d'être solubles dans l'eau et stables dans la plupart des milieux de cristallisation commerciaux. Dans le cadre de l'invention, il a été démontré que ces complexes présentaient un intérêt, non seulement en tant qu'agent phasant, lors de l'obtention de données structurales, mais également en tant qu'aide à la cristallisation. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolécule biologique. De telles applications n'avaient jamais été décrites ou envisagées pour les complexes de lanthanide formés avec les ligands de formules (1.1) à (1.5) déjà décrits dans la littérature (M. Mato-Iglesias et al., inorg. Chem. 2008, 47, 7840-7851 ; Z. Palinkas et al., Inorg. Chem. 2009, 48, 8878-8889 ; A. Roca-Sabio et al., Dalton Trans, 2011, 40, 384-392 et M. Regueiro-Figueroa et al., Inorg. Chem. 2015, 54, 4940-4952 pour les complexes des ligands (1.1) à (1.3) et A. Rodrigues-Rodrigues et al., Inorg. Chem. 2012, 51, 2509-2521, pour les complexes des ligands (1.4) et (1.5)). En effet, ces complexes ont été préparés pour des études fondamentales de chimie de coordination des lanthanides (étude de la stabilité des complexes formés avec différents lanthanides) et dans le cas du Gd, seules des applications en tant qu'agent de contraste IRM ont été envisagées.

De manière avantageuse, les complexes selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates, sont formés avec un ligand répondant à l'une des formules suivantes :

avec Ri, R ₂ , n et R ₄ qui sont tels que définis pour la formule (I).

A titre d'exemple de sels, des complexes selon l'invention ou des complexes formés avec l'un des ligands (Ll) à (1.5) qui trouvent application dans le cadre de l'invention, on peut citer les sels d'un complexe cationique avec un anion (ou plusieurs anions, en fonction de la charge du complexe) choisi parmi : CI ^" , Bf , Γ, OH ^" , N0 ₃ ^" , triflate, PF ₆ ^~ , SbF ₆ ^~ , B(Ph} ₄ ^~ , BF ₄ ^" , les sulfates, sulfonates, carbonates, phosphates, phosphonates et carboxylates. Les sulfates et sulfonates pourront correspondre à S0 ₄ ^2" , HS0 ₃ ^" ou R'SCV, les carbonates à C0 ₃ ^2" , HC0 ₂ ^" ou R'C0 ₂ ^~ , les phosphates et phosphonates à R'OP0 ₃ ^2~ et R'P0 ₃ ^2" et les carboxylates à R'C0 ₂ ^~ , avec R' qui peut être, notamment, un groupe alkyle ou aryle, notamment un groupe alkyie comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe phényle. Sous la forme de sels, les complexes, selon l'invention, pourront également se trouver sous la forme d'hydrate ou solvats, c'est-à-dire avec au moins une molécule d'eau ou de solvant dans la sphère de coordination du lanthanide.

De manière préférée, les complexes selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion, leurs solvats et hydrates, sont formés avec un Sigand répondant à la formule (IA) :

dans laquelle n= l et R2=H, et i est tel que défini pour les composés de formule (I)-

De manière avantageuse, dans les ligands de formule (I), (ÎA) à (IF), Ri représente ;

avec :

- 7 qui représente -COO ou -PR9OO avec Rg qui représente un groupe

méthyle ou éthyle ; ou bien R ₇ qui représente un groupe:

- Re qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode. Dans le cadre de l'invention, lorsqu'un substituant représente un groupe picolinyle, il représente :

De manière préférée, les complexes selon l'invention sont choisis parmi les complexes de formule :

+ ainsi que leurs sels avec un anion, en particulier, leur sel chlorhydrate, leurs solvats et hydrates.

De manière avantageuse, les complexes selon l'invention ou les complexes formés avec l'un des ligands (1.1) à (1.5) qui trouvent application dans le cadre de l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion, en particulier leur sel chlorhydrate, leurs solvats et hydrates, sont formés avec un ion lanthanide Ln ⁺ , Ln étant Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb ou Lu, avec Eu, Tb, Yb et Lu qui sont préférés.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe selon l'invention, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formules (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolécule biologique.

Tous les complexes de lanthanide selon l'invention, ou formés avec un ligand de formule (1.1) à (1.5), présentent un intérêt pour leur effet nucléant ou cristallisant. Cependant, seuls les complexes de terbium ou d'europium présenteront des propriétés de luminescence dans le visible. Aussi, si dans le complexe, Ln =Eu ou Tb, le complexe pourra également être utilisé en tant qu'agent luminescent pour la détection de cristaux.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe selon l'invention, ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (Ll) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates, en tant qu'aide à l'obtention de données structurales d'une macromolécule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent phasant lors de la détermination structurale par diffraction des rayons X. Là encore, si dans le complexe, Ln =Eu ou Tb, le complexe pourra également être utilisé en tant qu'aide au positionnement du cristal dans un faisceau de rayons X.

En particulier, dans le cadre de l'invention, par « macromolécule biologique », on entend en particulier les peptides (enchainement de moins de 100 acides aminés), les protéines (enchainement d'au moins 100 acides aminés) et les acides nucléiques, notamment les ADN ou A N. De telles macromolécules biologiques présenteront notamment une masse moléculaire moyenne supérieure à 1 kDa.

L'invention a également pour objet les cristaux d'une macromolécule biologique comprenant un complexe selon l'invention ou un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (Ll) à (1.5) telle que précédemment définie, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate, nommés cristaux dérivés.

L'invention a également pour objet un procédé de cristallisation d'une macromolécule biologique, de préférence choisie parmi les peptides, les protéines et les acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN, comprenant les étapes suivantes :

- disposer d'une solution comprenant ladite macromolécule biologique et un complexe selon l'invention, ou un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou un de ses sels avec un anion, solvat ou hydrate,

- obtenir des cristaux de la macromolécule à partir de ladite solution.

La solution utilisée pourra comprendre, en outre, un agent précipitant, autre que le complexe, notamment choisi parmi ceux utilisés dans les kits de cristallisation commerciaux, en particulier parmi ceux présents dans les tableaux présentés en Annexes 2A ou 2B, comme par exemple, les sels tels que les sels d'ammonium, les sulfates (notamment le sulfate d'ammonium), acétates, phosphates, citrates (notamment le citrate de sodium), formiates, tartrates tels que le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, les chlorures, iodures et fluorures, par exemple NaCI ; les polymères tels que les polyéthylèneglycols et la Jeffamine T ; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol, le glycérol, l'isopropanol, 2- méthyl-2,4-pentanediol.

De manière avantageuse, dans la solution, le complexe est présent à une concentration de 1 à 100 m , préférentieilement à une concentration de 1 à 25 mM, et de manière encore plus préférée à une concentration de 10 mM ± 10%.

En particulier, l'obtention de cristaux est réalisée par cristallisation par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides.

Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être intégré à un criblage ou à une optimisation de conditions de cristallisation d'une macromolécule biologique. Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être mis en œuvre de manière automatisée.

L'invention a également pour objet un procédé d'analyse ou de détermination de la structure d'une macromolécule biologique comprenant les étapes suivantes : a) disposer d'un cristal dérivé de la macromolécule biologique tel que défini dans le cadre de l'invention,

b) analyser la structure cristalline de la macromolécule biologique à partir dudit cristal dérivé.

Le cristal dérivé pourra être obtenu selon un procédé de cristallisation tel que décrit dans le cadre de l'invention ou encore par trempage d'un cristal de la macromolécule biologique dans une solution d'un complexe selon l'invention ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates. Le cristal dérivé peut également être obtenu par trempage d'un cristal dérivé de la macromolécule biologique obtenu selon un procédé de cristallisation tel que décrit dans le cadre de l'invention, dans une solution d'un complexe selon l'invention ou d'un complexe cationique formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (1.1) à (1.5) telle que précédemment définie, ou d'un de leurs sels avec un anion, leurs solvats ou hydrates.

En particulier, l'analyse de la structure cristalline de la macromolecule biologique à partir dudit cristal dérivé correspond à la détermination de la structure de la macromolécule biologique et est réalisée par diffraction des Rayons X (RX). Il est également possible qu'elle corresponde à l'obtention de données structurales par une méthode haute résolution, telle que la diffraction des Rayons X (RX) ou par une méthode à basse résolution par les méthodes SAXS (Smali-Angle X-ray Scattering) ou M ASC (Multiwavelength-Anomalous Solvent Contrast).

La description détaillée ci-après permet de mieux comprendre l'invention.

Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln ^3÷ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF) sont des complexes cationiques, et en particulier mono-cationiques. Ils sont donc capables de conduire à la formation de cristaux dérivés d'une macromolécule biologique. De tels cristaux dérivés peuvent être obtenus par trempage ou par co-cristallisation, comme détaillé plus loin. L'effet anomal dû à la présence des lanthanides dans les cristaux dérivés obtenus, conduit à un effet phasant et facilite la détermination de la structure de la macromolécule biologique concernée, notamment par diffraction des rayons X. Les complexes selon l'invention peuvent donc être utilisés en tant qu'aide à la détermination ou à l'analyse de la structure cristalline d'une macromolécule biologique.

Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates peuvent également être utilisés en tant qu'aide à la cristallisation de macromolécules biologiques. En effet, en fonction de leur structure, et en fonction des conditions de cristallisation mises en œuvre, les complexes selon l'invention présentent au moins Tune des propriétés suivantes :

- effet nucléant : la présence dudit complexe de lanthanide lors de la cristallisation provoque la croissance de cristaux dans des conditions (tampon et/ou additifs et/ou température et/ou concentration et/ou durée...) qui ne permettent pas la formation de cristaux en l'absence du complexe selon l'invention.

- effet cristallisant : la présence dudit complexe de lanthanide lors de tests d'une série de conditions de cristallisation (nombre de cristaux et/ou taille des cristaux et/ou amélioration de la diffraction des cristaux obtenus...) permet d'améliorer la cristallisation obtenue, par rapport à une série de conditions différant par l'absence de complexe. En l'absence de complexe, des cristaux apparaissent mais sont de moins bonne qualité.

En particulier, les complexes de lanthanide formés avec les ligands de formule (I) formés d'un ion lanthanide Ln ⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates, soit permettent d'augmenter le nombre de conditions dans lesquelles l'obtention de cristaux d'une macromolécule biologique est possible, soit de travailler dans des conditions plus faibles en macromolécule biologique et/ou en autre agent précipitant classiquement utilisé, soit d'améliorer la qualité ou le nombre de cristaux favorisant ainsi l'obtention de données structurales ultérieures, soit d'obtenir plusieurs de ces avantages,

Les complexes d'Europium et de Terbium présentent également l'avantage d'être luminescents sous irradiation UV. Ainsi, leur utilisation permet une mise en évidence aisée des cristaux dérivés lors des essais de cristallisation. Cette propriété peut être utilisée comme méthode de détection rapide pour les plateformes de cristallisation équipées d'imageur automatique sous irradiation UV. De plus, cette propriété peut être utilisée comme une aide au centrage dans un faisceau de rayons X lors d'une caractérisation par diffraction notamment.

Les complexes selon l'invention pourront être préparés selon des techniques adaptées par l'homme du métier, techniques décrites dans les exemples ou dans la demande WO 2014/162105. La synthèse des complexes selon l'invention est généralement réalisée dans l'eau. Les complexes ainsi formés seront donc plutôt sous la forme d'hydrate, mais Se complexe peut ensuite être mis dans un solvant autre, du type alcool ou DMSO et donner lieu à un solvat ou encore être déshydraté. Sous forme hydratée, un complexe selon l'invention comportera, notamment jusqu'à 3 molécules d'eau par complexe. En moyenne, le nombre de molécules d'eau par complexe, pourra, par contre, être différent d'un nombre entier, et être par exemple égal à 0,5. Pour les applications envisagées dans le cadre de l'invention, les complexes de lanthanide selon l'invention pourront être utilisés sous forme hydratée, ou déshydratée, solvatée ou non, sous la forme de poudre ou en solution.

La qualité et la pureté d'un agent cristallisant sont essentielles au bon déroulement de la cristallisation d'une macromolécule, lorsque ces derniers sont utilisés en tant qu'agent de cristallisation. Aussi, au final, les complexes de lanthanide selon l'invention seront soumis à une étape de purification adaptée, notamment par chromatographie d'exclusion stérique.

Les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates, pourront être utilisés en tant qu'agent cristallisant dans toute technique adaptée à la cristallisation de macromolécules biologiques.

Pour une description détaillée de telles techniques, on pourra se référer aux ouvrages de référence suivants : « Protein Crystallization, Second Edition (IUL Biotechnology Séries) » édité par Thérèse Bergfors ou « Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach » édité par Arnaud Ducruix et Richard Giegé.

En particulier, les complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates pourront être utilisés en tant qu'agent cristallisant dans un procédé de cristallisation de macromolécules biologiques par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides.

Ces différentes techniques vont chacune être décrites succinctement, l'agent cristallisant s'entendant d'un complexe de lanthanide ou mélange d'agents cristallisants contenant au moins un complexe de lanthanide avec un ligand de formule (I), sous forme de sels, solvats ou hydrates ;

- La cristallisation par diffusion de vapeur est la plus utilisée actuellement. C'est la méthode généralement mise en œuvre au niveau des plateformes de cristallisation automatisée. Il existe trois approches différentes schématisées sur la Figure 2 : les techniques de la goutte assise (« Sitting drop » en anglais), de la goutte suspendue (« Hanging drop » en anglais) et de la goutte en sandwich (« Sandwich drop » en anglais). Ces trois techniques sont représentées schématiquement sur la Figure 2.

Dans ces trois approches, une solution de l'agent cristallisant est placée dans un puits (solution en gris clair). La solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt est mélangée avec l'agent cristallisant et déposée sous forme de goutte (soit suspendue, soit assise ou encore en sandwich). Le puits de cristallisation est fermé hermétiquement par une lamelle de verre ou un film plastique. Au démarrage de la cristallisation, la concentration en agent cristallisant dans la goutte est deux fois plus faible que dans le puits. Le système étant clos, il se met en place une cinétique de diffusion du solvant de la goutte (généralement de l'eau) vers le puits. Le volume de la goutte va donc diminuer (perte de solvant ie. d'eau) et les concentrations en macromolécule biologique et en agent cristallisant vont ainsi augmenter permettant, dans les cas favorables, d'atteindre la phase de nucléation. Dans cette méthode, la concentration en agent cristallisant est extrêmement importante. En effet, un excès d'agent cristallisant pourrait entraîner une cinétique de diffusion du solvant trop rapide et donc entraîner la précipitation de la macromolécule biologique. A l'inverse, une concentration trop faible ne permettra pas d'atteindre la zone de nucléation. La concentration adaptée en agent cristallisant sera donc déterminée, par des tests de routine, par l'homme du métier. A partir de la nucléation, la croissance cristalline va ensuite faire diminuer la concentration en macromolécule soluble jusqu'à atteindre un état stationnaire.

- La dialyse est une autre méthode de cristallisation qui reste cependant moins utilisée que la diffusion de vapeur. Cette technique est représentée schématiquement sur la Figure 3.

Le principe général consiste à faire croître, de manière lente, la concentration en agent cristallisant. Pour cela, une solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt est placée dans un contenant de dialyse, par exemple du type capillaire ou bouton de dialyse fermé par une membrane semi-perméable laissant passer les molécules d'agent cristallisant (mais pas la macromolécule). Ce contenant est alors placé dans une solution d'agent cristallisant. Un équilibre entre la solution contenant la macromolécule biologique d'intérêt (qui ne contient pas d'agent cristallisant) et la solution extérieure contenant l'agent cristallisant va se mettre en place. Ainsi, la concentration en agent cristallisant dans le contenant de dialyse va augmenter et modifier la solubilité de la macromolécule. Cette technique présente l'avantage d'être plus précise que la diffusion de vapeur en ce qui concerne le maintien du pH et des volumes. Cependant, la manipulation des cristaux reste beaucoup plus délicate.

- La cristallisation en batch est la dernière technique utilisée pour cristalliser les macromolécules biologiques. Cette technique, tout comme la dialyse, nécessite un volume important de solution.

Le principe de cette technique, représenté schématiquement sur la Figure 4, est simple : la macromolécule très concentrée est mélangée à l'agent cristallisant. La solution sursaturée en macromolécule va, avec le temps, induire la formation de nucléii qui va induire la diminution de la concentration de la macromolécule en solution, vers la formation de cristaux.

Les techniques de cristallisation par diffusion de vapeur, de cristallisation par dialyse ou de cristallisation en batch fonctionnent sur tous les types de protéines qu'elles soient solubles dans l'eau ou qu'elles soient membranaires, alors solubles en détergent, ainsi que sur les autres macromolécules biologiques (ADN, ARN, complexes protéiques, complexes protéine-ADN ou ARN...).

Pour la cristallisation des protéines membranaires, il est également possible d'utiliser un complexe de lanthanide, en tant qu'agent cristallisant dans une technique de cristallisation en phase cubique de lipides. La cristallisation en phase cubique de lipides des protéines membranaires est décrite dans les publications suivantes : Landau et al. Lipidic cubic phase: A novel concept for the crystallization of membrane proteins, PNAS Vol. 93 no. 25 14532- 14535 (1996), Caffrey et al. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc 4 (5) 706-31 (2009), Cherezov V., Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr. Opin Struct Biol Vol 21 559-566 (2011).

Les complexes de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), ainsi que leurs sels, solvats et hydrates sont compatibles avec toutes les méthodes de cristallisation qui viennent d'être détaillées. En particulier, une solution contenant une concentration de 1 à 100 mM, préférentieliement 1 à 25 mM d'un complexe de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, et de manière encore plus préférée de 10 mM ± 10% sera utilisée.

Dans les cristallisations, en particulier, en phase vapeur ou en batch, une solution de la macromolécule biologique à cristalliser et d'un complexe de lanthanide formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate (qui sera, par souci de simplification, dans le reste de la description, nommé complexe de lanthanide), sera préparée, avec de préférence une concentration de 1 à 100 mM, préférentieliement 1 à 25 mM, et de manière encore plus préférée de 10 mM ± 10%, en complexe de lanthanide. Le complexe de lanthanide formé d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, peut être directement solubilisé par la solution contenant la macromolécule biologique pour atteindre une concentration finale en complexe de 1 à 100 mM, de préférence de 1 à 25 mM, et préférentieliement de 10 mM ± 10% qui correspond à la concentration à laquelle l'effet nucléant est prépondérant. Le complexe de lanthanide peut aussi être introduit à partir d'une solution à une concentration préférentielle de 10 à 30 mM, lors de la fabrication d'une goutte de cristallisation : sont alors ajoutés successivement un volume de la solution de macromolécules, un volume identique de la solution de complexe de lanthanide et un volume identique de solution de puits utilisé pour la cristallisation.

Dans ces techniques de cristallisation, le complexe de lanthanide et la macromolécule biologique à cristalliser seront mis en solution généralement dans de l'eau ou dans une solution aqueuse tamponnée (voir exemples dans la description des kits de cristallisation figurant dans les Annexes 2A et 2B), par exemple, dans une solution tampon acétate, cacodylate, citrate, Bis tris propane, TRIS, HEPES, phosphate. Les solutions contenant une macromolécule biologique sont généralement tamponnées. Si une solution du complexe de lanthanide est formée, elle ne sera pas forcément tamponnée. La solution contenant le complexe, la solution contenant la macromoiécule biologique et/ou la solution contenant la macromolécule biologique et le complexe, en fonction de la technique de cristallisation utilisée présenteront, de préférence, un pH dans la gamme allant de 3 à 9.

Des additifs tels que des additifs déjà connus pour jouer le rôle d'agent précipitant/cristallisant ou des additifs permettant de favoriser au départ la dissolution de la macromolécule biologique à cristalliser pourront être ajoutés. A titre d'exemples, on peut citer ceux présents dans les tableaux présentés en Annexe 2A ou 2B, comme par exemple, les sels tels que les sels d'ammonium, les sulfates (notamment le sulfate d'ammonium), acétates, phosphates, citrates (notamment le citrate de sodium), formiates, tartrates tels que le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, les chlorures, iodures et fluorures, par exemple NaCI ; les polymères tels que les polyéthylèneglycols et la Jeffamine T ; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol, le glycérol, l'isopropanol, 2- méthyl-2,4-pentanediol. En particulier, il est possible d'utiliser le complexe de lanthanide dans toute solution de cristallisation déjà commercialisée.

La concentration en macromolécule dans la solution sera en théorie proche de sa limite de solubilité dans ladite solution, mais pourra être plus diluée, en fonction de la solution utilisée.

Les complexes de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln ³⁺ et d'un iigand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, pourront également être utilisés pour obtenir des cristaux dérivés de macromolécules biologiques, c'est-à-dire des cristaux contenant ledit complexe de lanthanide. En particulier, ledit complexe de lanthanide sera fixé sur une position spécifique de la macromolécule biologique à étudier permettant la détermination de la structure de ladite macromolécule biologique étudiée. La détermination des phases peut être faite avec des cristaux dérivés obtenus dans une solution contenant de 1 à 100 mM de complexe, préférentiellement de 10 à 100 mM, et de manière encore plus préférée de 100 mM ± 10% au dit complexe de lanthanide. Cependant, pour améliorer la qualité du phasage, un trempage dans une solution d'un complexe de lanthanide, en particulier, avec une concentration élevée en complexe, peut également être réalisé. Cela permet d'augmenter le taux d'occupation des sites occupés par le complexe.

La co-cristallisation consiste donc à ajouter le complexe de lanthanide pendant le processus de cristallisation. Ainsi, lors de la cristallisation, le complexe de lanthanide peut s'insérer dans des sites cristallins spécifiques conduisant à l'obtention de cristaux dérivés.

Par ailleurs, pour obtenir un cristal dérivé ou augmenter l'occupation par un complexe de lanthanide de sites dans le cristal dérivé, un trempage d'un cristal d'une macromolécule biologique dans une solution de complexe de lanthanide peut être effectué. Il est possible de réaliser un trempage rapide ou un trempage long.

Le trempage rapide consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière brève (notamment de 45 secondes à 2 minutes) dans une solution du complexe de lanthanide. De manière avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration en complexe de lanthanide, typiquement une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10%.

En particulier, un trempage rapide lors d'une phase de congélation d'un ou plusieurs cristaux peut être réalisé. Un trempage rapide lors d'une phase de congélation se déroule typiquement en trois étapes : des cristaux sont prélevés de leur goutte d'origine et trempés dans une goutte de trempage, correspondant à une solution équivalente à la solution d'origine utilisée pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux) à laquelle est ajoutée une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10% de complexe de lanthanide, ainsi qu'un cryoprotectant tel qu'utilisé par l'homme de l'art. Après une durée de 45 secondes à 2 minutes, le cristal est trempé dans une solution de cryoprotection sans complexe de lanthanide, afin d'en éliminer l'excès. Enfin, le cristal est plongé dans l'azote liquide et stocké à basse température, par exemple à 100K. Cette méthode de trempage est très efficace et permet d'augmenter les taux d'occupation et d'améliorer la qualité du phasage. A titre d'exemple, dans le cas de la protéine PhPl un trempage de 45 secondes dans une solution à 100 m de complexe 10 a augmenté le taux d'occupation du complexe par 3. Un trempage court permet d'éviter que le cristal ne se dégrade et de préserver les qualités de diffraction de ce dernier.

Le trempage long consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière prolongée (notamment de 10 minutes à 24 heures) dans une solution du complexe de lanthanide, De manière avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration en complexe de lanthanide, typiquement une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10%.

A l'exception de la durée, le trempage long peut se dérouler selon le même protocole que celui décrit pour le trempage rapide, notamment lors d'une phase de congélation. Cependant, la goutte de trempage est placée en équilibre avec un puits contenant de la solution d'origine utilisée pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux), afin d'éviter une déshydratation de la goutte.

Quel que soit le type de trempage, il est possible de tremper aussi bien des cristaux obtenus par co-cristallisation, en présence d'un complexe de lanthanide, que des cristaux obtenus en l'absence d'un tel complexe (nommés cristaux natifs dans le cadre de la présente demande de brevet). Le trempage n'entraîne aucune destruction ou modification de la macromolécule biologique.

Les complexes de lanthanide permettent de former des cristaux dérivés d'une macromolécule biologique permettant l'obtention de données structurales pour ladite macromoiécule biologique. En particulier, l'obtention de données structurales sera obtenue à partir d'un cristal dérivé d'une macromolécule biologique intégrant un complexe de lanthanide qui joue le rôle d'agent phasant. Ces données structurales pourront être obtenues par une méthode haute résolution, telle que la diffraction des

Rayons X (RX) ou par une méthode basse résolution, telles que les méthodes SAXS et MASC. Les complexes de lanthanide pourront être utilisés en tant qu'agent phasant en diffraction des RX (cristallisation et analyse de structure) ou en diffusion des RX, ou encore en tant qu'agent de contraste en SAXS ou MASC, en mtcroscopie électronique.

L'utilisation des complexes de lanthanide formés d'un ion lanthanide Ln ⁺ et d'un ligand de formule (I), correspondant aux complexes selon l'invention ou aux complexes formés avec un ligand de formule (IA) à (IF), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, en tant qu'agent phasant notamment, présente l'avantage de ne pas nécessiter une modification de la macromolécule biologique par génie génétique, comme dans le cas de l'obtention de protéines séléniés. Aucune liaison covalente n'intervient entre le complexe de lanthanide et la macromolécule biologique d'intérêt.

Les exemples ci-après, en référence aux figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais ne présentent aucun caractère limitatif.

La Figure 1 représente un diagramme de phase illustrant le processus de cristallisation (Extrait de http://people.ds.cam.ac.uk/ml527/publications/assets/leuniss en-literature- research.pdf)

La Figure 2 représente trois approches différentes : les techniques de la goutte assise (« Sitting drop » en anglais), de la goutte suspendue (« Hanging drop » en anglais) et de la goutte en sandwich (« Sandwich drop » en anglais).

La Figure 3 représente la technique de dialyse : autre méthode de cristallisation qui reste cependant moins utilisée que la diffusion de vapeur.

La Figure 4 représente schématiquement une technique de cristallisation en batch utilisée pour cristalliser les macromolécules biologiques.

La Figure 5 représente des diagrammes de phase de la protéine lysozyme en absence (à droite) et en présence de complexe 10 ou 17 déterminés à différents temps de cristallisation : les conditions, ayant donné des cristaux, sont illustrées par des points noirs, les points blancs étant des gouttes claires.

La Figure 6 représente des diagrammes de phase du lysozyme de blanc d'ceuf de poule en absence et en présence de lOmM de complexe 11 déterminés après 4 jours de cristallisation. Les conditions donnant des cristaux sont illustrées par des points noirs, les points blancs sont des gouttes claires et les triangles des précipités. ^

La Figure 7 représente des diagrammes de phase de la protéine PB6 en absence et en présence de lOmM de complexe 10 déterminés après un jour de cristallisation. Les conditions donnant des cristaux sont illustrées par des points noirs, les points blancs sont des gouttes claires et les triangles des précipités.

La Figure 8 représente des cristaux de pb6 (condition pb6-l) en présence de

10 mM de complexe 10 à droite (13% PEG - 10 mg/ml) et sans complexe 10 à gauche (15 % PEG - 20 mg/ml).

La Figure 9 représente la mise en évidence de la luminescence induite dans les cristaux par les complexes de lanthanide.

La Figure 10 représente un spectre de fluorescence X mesuré sur une solution de 10 mM de complexe 10 (à gauche) et traitement par le logiciel CHOOCH (à droite). Les longueurs d'onde pour les enregistrements permettant d'exploiter de manière optimale la diffusion anomale du lanthanide (ici le terbium) sont indiquées par une flèche.

La Figure 11 représente des exemples de cartes de densité électronique expérimentale.

La Figure 12 représente des images obtenues au robot de cristallisation HTXIab.

Exemples de réalisation

Partie∑ : Synthèse et caractérîsatîon des complexes

Les abréviations ci-après sont utilisées :

Me = méthyle

Moz = méthoxybenzyloxycarbonyle

Boc = tert-butoxycarbonyle

Ms = mésyle

Et = éthyle

TA = température ambiante

Ac = acétyle

DCM = dichlorométhane

TACN = triazacyclononane

DMF = diméthylformamide

TFA = acide trifluoroacétique

ACN = acétonitrile

CCM = chromatographie sur couche mince

Produits de départ et caractérisation

Tous les produits de départ, solvants et sels de lanthanide ont été achetés chez Sigma-AIdrich®, Acros Organics® et TCI® avec des puretés supérieures à 98% pour les composés organiques et supérieures à 99,99% pour les sels de lanthanide. Ces produits ont été utilisés directement sans purification supplémentaire.

Les chromatographies ont été effectuées, d'une part, sur alumine neutre activité III obtenue par hydratation d'alumine Acros Organics® d'activité I (60Â), et d'autre part, sur gel de silice Acros Organics® (60Â). Les complexes formés ont tous été purifiés par colonne d'exclusion stérique LH20 de chez Sephadex®.

Les spectres RMN ( H, ¹³ C) ont été enregistrés sur deux appareils Bruker® Avance opérant respectivement à 500.10 MHz et 125.75 MHz pour *H et ¹³ C pour l'un, et à 300 MHz pour H pour le second. Les déplacements chimiques sont reportés en partie par million (ppm) relativement au signai du tetraméthylsilane (H ¹³ C), les pics résiduels des solvants étant utilisés comme référence interne.

Les mesures de masses exactes ont été effectuées au Centre Commun de spectrométrie de Masse (Villeurbanne, France). A) Préparation d'une première série de lïgands/complexes à base de triazacyclononane (TACN)

4 5 a) HCI (cat.) dans MeOH b) NaBH ₄ dans DCM/MeOH c) MsCi, Et ₃ N dans DCM d) Moz- on, Et3N dans ACN e) Boc-O-succinimide dans DCM H ₂ , Pd/C dans MeOH g) Na ₂ CO ₃ dans MeOH/H ₂ O h) TFA dans DCM i) Na ₂ CO ₃ dans ACN j) Na ₂ CO ₃ dans H ₂ O puis LnCI ₃ ,6(H ₂ O) avec Ln=Tb ou Eu Le composé 6 a été préparé selon la procédure précédemment décrite dans la demande de brevet WO2013/011236A1.

Al) Préparation du composé 1

A une suspension de 20 g d'acide dipicolinique (0,12 mol, léq.) dans 120 mL de méthanol, on ajoute 1 mL d'acide sulfurique concentré. Le mélange est porté à reflux pendant 24h. Après refroidissement, le produit cristallisé est filtré et rincé au méthanol froid pour donner, après séchage, 18 g de poudre cristalline blanche du composé 1 (R = 78%).

^- MR (300 MHz, CDCÎ ₃ ) δ (ppm) = 8.26 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.99 (t, J = 8 Hz, 1H), 3.98 (s, 6H).

A2^ Préparation du composé 2

18 g de composé 1 (92 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 450 ml de méthanol et refroidis à 0°C. 3,8 g de NaBH ₄ (101,2 mmol, 1,1 éq.) sont alors ajoutés. Le mélange est ensuite agité 30 min à 0°C et 30 min supplémentaires en laissant la température remontée lentement jusqu'à TA. La réaction est stoppée par ajout de 50 mL de HCI (1M dans H ₂ O), puis, la phase organique est extraite avec 100 mL de dichlorométhane. Après, lavage de la phase organique avec de la saumure (jusqu'à pH = 7), séchage avec Na ₂ S04 et évaporation, le produit obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant: DCM/AcOEt 9/1 v/v jusqu'à AcOEt pur). On obtient 6 g d'un solide blanc du composé 2 (R = 40%).

lH-iMMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.01 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 3 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.69 (bs, 1H). A3) Préparation du composé 3

A une solution de 1,2 g de l'alcool 2 dans 50 mL de dichlorométhane à 0°C, on ajoute 3mL de Et ₃ N (22 mmoî, 3,2 éq.) puis, rapidement, 0,79 mL de chlorure de mésyle (10,2 mmol, l,5éq.). On laisse ensuite le mélange revenir à température ambiante avant de le chauffer pendant lh à 50°C. On ajoute ensuite 40 mL d'eau et on extrait le mélange au dichlorométhane (3x20 mL). Le résidu huileux obtenu, après séchage et évaporation des phases organiques, est finalement purifié sur gel de silice (éiuant : CH2CI2) pour obtenir une huile incolore du composé 3 qui cristallise au congélateur.

lH NMR (500 MHz, CDCI ₃ ) δ 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.93 (t, J = 7.8 Hz, 1H, H10), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H, H7), 4.01 (s, 3H, OMe), 3.15 (s, 3H, OMs). ¹³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) δ 165.33 (C13), 154.59 (s), 147.92 (s), 138.45 (C10), 125.41 (s), 125.13 (s), 71.11 (C7), 53.23 (OMe), 38.24 (OMs).

A4) Préparation du composé 6

Le composé 6 est préparé par la méthode précédemment décrite, (a) WO2013011236A1 ; b) l.S. J. Butler, B. K. McMahon, R. Pal, D. Parker and 3. W. Walton, Chem. Eur. X, 2013, 19, 9511-9517.) A5) Préparation du composé 7

10b

360 mg de composé 6 (1,19 mmol) et 760 mg de carbonate de sodium (7,15 mmol, 6 éq.) sont séchés sous pression réduite dans un schienk avant d'ajouter 100 mL d'acétonitrile. Sous argon, 710 mg de composé 3 (2,74 mmol, 2,3 éq.) sont ajoutés à la suspension avant chauffage 12h à 70°C. Après retour à la température ambiante, le mélange est filtré sur fritté (porosité 4) et concentré sous pression réduite. Le produit est purifié par chromatographie sur alumine (activité III, éluant DCM puis DCM/MeOH 96/4 v/v) pour finalement obtenir une huile jaune du composé 7 (532 mg, Rendement : 80%).

H NMR (500 MHz, CDCI ₃ ) δ 7.99 (dd, J = 6 Hz, 2H, Hll), 7.86 - 7,65 (m, 4H, H9), 3.98 (s, 10H, H7+OMe), 3.39 (d, J = 30 Hz, 4H, H4H5), 3.11 (s, 2H, H3H6), 2.95 (s, 2H, Η3Ή6'), 2.66 (d, J = 31 Hz, 4H, H1H2), 1.44 (s, 9H, boc). i ³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) δ 166,01, 166.09 (C13), 161.43, 161.60 (C8), 155.88(CO(boc)) 147.45(C12), 137.42 (d,C10), (s), 126.19,126.46 (C9), 123.70 (Cil), 79.48 (C(boc)), 63.70 (d, C7), 57.21 (C1C2), 55.37 (s), 55.11 (s), 54.67 (s), 53.04 (OMe), 50.54, 49.95 (C4C5), 28.72 (CH ₃ (boc)).

A6 Préparation du composé 8

Dans 100 mL de dichlorométhane, 5 mL d'acide trifluoroacétique sont ajoutés sur une solution de 427 mg du composé 7. Après 5h d'agitation à la température ambiante, le mélange est évaporé en éliminant le TFA par entraînement avec plusieurs ajouts de toluène. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur alumine (activité III, éluant DCM/MeOH (gradient 1% jusqu'à 7%)). Le solide visqueux jaunâtre obtenu du composé 8 est conservé sous argon au congélateur (masse : 315 mg, rendement : 90%).

H NMR (500 MHz, CDC! ₃ ) δ 7.96 (dd, J - 7.7, 0.5 Hz, 2H, Hll), 7,71 (t, 3 = 8 Hz, 2H, MO), 7.42 (dd, j = 7.9, 0.5 Hz, 2H), 3.98 (d, 10H, H7+OMe), 3.40 (t, J = 5 Hz, 4H, H4H5), 3.03 (t, J = 5 Hz, 4H, H3H6), 2.71 (s, 4H, H1H2).

¹³ C NMR (126 MHz, CDCI ₃ ) δ 165.37 (C13), 159.43 (C8), 147.59 (C12), 137.87 (C10), 126.10 (C9), 124.02 (Ci l), 60.95 (C7), 54.60 (C1C2), 53.31 (OMe), 51.66 (C3C6), 46.52 (C4C5).

NB : la synthèse de ce composé a été précédemment décrite dans la référence suivante : A. Nonat, C, Gâteau, P. H. Fries, M. Mazzanti, Chem. Eur. 1, 2006, 12, 7133.

A7 Préparation du composé 9

Le ligand 9 est généré in situ par saponification du diester 8 en présence de carbonate de sodium Na ₂ C0 ₃ (2 éq.) dans un mélange MeOH/H ₂ 0 (1/1, v/v) agité 3h à 50°C,

^X H NMR (500 MHz, D ₂ 0) δ 7.77 (d, J = 7.1 Hz, 2H, H9), 7.69 (t, J = 7.7 Hz, 2H, H10), 7.29 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Hll), 3.86 (s, 4H, H7), 3.08 (t, J = 5.9 Hz, 4H, H4H5), 2.91 (t, J = 5.9 Hz, 4H, H3H6), 2,65 (s, 4H, H1H2).

¹³ C NMR (126 MHz, D ₂ 0) δ 173.22 (C13), 158,44 (C8), 153.01 (C12), 138.23 (CIO), 125,17 (Cil), 122.40 (C9), 60.27 (C7), 50.53 (C1,C2), 47.12 (C3,C6), 44.10 (C4,C5). A8 Préparation du complexe 10

Après réaction pendant 3h à 50°C de 110 mg de diester 8 (0,26 mmol) avec 83 mg de Na ₂ C03 (0,78 mmol, 3,0 éq.) et neutralisation par HCI (1M), la disparition de l'ester est vérifiée par RMN. 96 mg de chlorure de terbium (0,26 mmol, 1 éq.) sont ajoutés au composé 9, formé in situ, avant d'agiter le mélange pendant 12h à 50°C. Solubilisé dans un minimum de méthanol, le complexe 10 est ensuite séparé des différents sels par centrifugation. Les dernières traces de sels sont retirées par passage sur une colonne d'exclusion stérique (LH20, Sephadex®, éluant : eau).

MS (ESI-TOF) calculé M+ : 556.1003 ; mesuré : 556.0990

A9) Préparation du complexe 11

Un protocole identique à celui mis en œuvre pour la préparation du complexe 10 est utilisé avec 170 mg de diester 8 (0,4 mmol) et 219 mg de EuC^ôH O (0,6 mmol, 1,5 éq.).

MS (ESI-TOF) calculé M+ : 550.0962 ; mesuré : 550.0957. B) Préparation d'une deuxième série de iigands à base de tri zacyclononane (TACN)

Bl) Préparation du composé 12

eOOC

15 g d'acide chélidamique monohydrate (0,075mol, léq.) sont dissouts dans 120 mL de chlorure de thionyle sous argon. La suspension est refroidie à 0°C et 3 mL de DMF sont ajoutés. Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 12h à reflux. Les volatiles sont évaporés après plusieurs ajouts de toluène pour enlever les dernières traces de SOCI ₂ . Le solide jaunâtre obtenu est ensuite dissout dans du méthanol et le mélange est porté à reflux pendant 12h pour achever la réaction. Après, évaporation du solvant, le résidu est repris par du dichloromethane et lavé successivement par une solution saturée de NaHC0 ₃ , d'eau et de saumure. La phase organique est ensuite séchée sur Na ₂ S0 ₄ , filtrée et évaporée. Le composé 12 pur est obtenu par recristallisation dans le méthanol pour obtenir 8,3g de poudre cristalline blanche. (R = 44%).

1H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.29 (s, 2H), 4.03 (s, 6H).

2) Préparation du composé 13

6 g de composé 12 (0,026 mol, léq.) sont dissouts dans 250 mL d'un mélange DCM/ méthanol (150/100, v/v) et la solution est refroidie à 0°C. Puis, 1,09g de NaBH ₄ (0,029 mol, 1,1 éq.) sont ajoutés en une fois avant agitation du mélange pendant 30 min à 0°C et 30 minute à TA. La réaction est stoppée par l'ajout de 50 mL d'acide chlorhydrique (1M) et de 100 mL d'eau. La phase organique est ensuite lavée à l'eau jusqu'à atteindre un pH = 7, puis lavée à la saumure, séchée sur Na ₂ S0 ₄ et évaporée. Le brut réactionnel est ensuite purifié sur gel de silice (éluant : DCM/ AcOEt 1/1 v/v) pour obtenir après évaporation 1,5g d'une poudre blanche composé 13 (R = 30%).

^- MR (300 MHz, CDCI3) δ (ppm) = 8.00 (bd, 1H), 7.60 (bd, 1H), 4.85 (d, J = 7 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H) 3.48 (t, J = 7 Hz, 1H).

Β3Ί Préparation du composé 14

1,5 g de composé 13 (7,4 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 200 mL de dichlorométhane et 3 mL de triéthylamine sont ajoutés (22,2 mmol, 3 éq.). Puis, 0,87 mL de chlorure de mésyle sont ajoutés (11,1 mmol, 1,5 éq.) lentement et une coloration jaune progressive du mélange est observée. L'avancement de la réaction est suivie par CCM et stoppée après 30 min. 100 mL d'une solution saturée de NaHC0 ₄ sont ajoutés puis la phase organique est lavée à l'eau (jusqu'à pH = 7) et avec de la saumure. La solution organique est ensuite séchée sur Na ₂ S0 ₄ et évaporée pour donner 2 g d'une huile jaune du composé 14 utilisée sans purification supplémentaire (rendement quantitatif).

^-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.1 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.17 (s, 3H).

B4) Préparation du composé 15

200 mg of triazacyclononane mono-boc (0,7 mmol, léq.) sont mis en suspension dans 100 mL d'acétonitrile sec avec 420 mg de carbonate de sodium anhydre. 463 mg de composé 13 (1,75 mmol, 2,5 éq.) sont ensuite ajoutés. Après refroidissement, le mélange est passé sur fritté pour enlever le carbonate avant évaporation du solvant Le résidu est repris dans du dichlorométhane et purifié par chromatographie sur colonne d'alumine (activité III, éluant: dichlorométhane puis acétate d'éthyle). 250 mg d'un solide jaune du compose 15 (R = 63%).

XH-ÎMMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.00 ppm (d, J = 1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 1 Hz, 1H), 7.89 (d, 3 = 1 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 1 Hz, 1H), 3.99 (m, 10 H), 3.39 (m, 4H), 3.03 (m, 4H), 2.67 (m, 4H), 1.48 (s, 9H). LC-MS: [M+H] ⁺ = 596.2 m/z. B5^ Pré aration du com osé 16

A une solution de 110 mg de composé 15 dans 60 mL de dichlométhane, on ajoute 3 mL d'acide trifluoroacétique. Le mélange est ensuite agité pendant 12h à température ambiante. Le solvant est ensuite évaporé ainsi que le TFA par plusieurs ajouts d'un méiange méthanol/toluène. Le résidu est ensuite repris par 50 mL de dichlorométhane et lavé à l'eau jusqu'à pH = 7. La phase organique est ensuite séchée sur Na ₂ S0 ₂ et évaporée pour obtenir 100 mg de poudre blanche du composé 16. (R - 95%).

1H-NMR (300 MHz, CDC! ₃ ) δ (ppm) = 7.97 (d, J = 1 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 1 Hz, 2H), 4.04 (s, 6H), 4.03 (s, 4H), 3.35 (m, 4H), 3.00 (m, 4H), 2.76 (s, 4H).

1 ³ C-NMR (75 MHz, CDCI ₃ ) 5 (ppm) = 163.91, 160 (q, 3 = 40 Hz), 147.58, 146.99, 126.49, 125.22, 60.37, 53.80, 53.56, 53.28, 45.39.

HR-MS: [M+H] ⁺ = 496.1501 m/z, théor. pour C ₂₂ H ₂₈ Ci ₂ N-,0-t is 496.1513 m/z.

B6) Préparation du complexe 17

17

100 mg de composé 16 (0,2 mmol, 1 eq) sont mis en suspension dans 30 mL d'eau et 32 mg d'hydroxyde de sodium (0,81 mmol, 4 eq) sont ajoutés. Le mélange est ensuite agité à 60°C pendant lh. L'hydrolyse complète des fonctions ester est confirmée par LC-MS. La solution est ensuite refroidie et son pH est ajusté à 5 avec un ajout progressif d'une solution d'acide chlorhydrique (1M). 5 mL de méthanol sont ensuite ajoutés avant d'introduire 42 mg de carbonate de sodium à la solution. 91 mg de TbCI ₃ , 6H ₂ 0 sont ajoutés avant d'agiter le mélange à 50°C pendant 12h. Après retour à température ambiante, les sels insolubles sont filtrés sur verre fritté avant évaporation des solvants pour obtenir 300 mg de produit brut. Le complexe est purifié par chromatographte d'exclusion stérique (Sephadex® LH2Q, éluant : eau) pour finalement obtenir 55 mg d'un produit cristallin incolore (rendement = 44%). ^J H-NMR (300 MHz, D ₂ 0) δ (ppm) = 121.1, 83.90, 69.15, 52.71, 46.23, 29.58, 26.06, -0.96, -11.39, -20.2, -33.57, -36.26, -44.20, -70.35, -91.19, -92.47, -120.84.

HR-MS: M ^÷ = 624.0213 m/z, théor. pour CzoHaiClzNgC^Tb 624.0219 m/z.

C) Préparation d'une troisième série de ligands à base de triazacyclononane (TACN)

Cl) Préparation du composé 19

8,3 g de composé 12 (36 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 200 mL d'acétonitrile et 54 g dlodure de sodium sont ajoutés (0,36 moi, 10 éq.) ainsi que 10 mL de chlorure d'acétyle (0,108 mol, 3 éq.). La suspension est ensuite placée dans un bain à ultrasons pendant 3h. Puis, 200 mL de dichlorométhane sont ajoutés et la phase organique est lavée avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est ensuite lavée à l'eau jusqu'à pH = 7, séchée sur sulfate de sodium et évaporée pour obtenir 10,7 g de solide blanc cassé du composé 19, utilisé sans autre purification (R = 92 %).

^X H-NMR (300 MHz, CDC! ₃ ) δ (ppm) = 8.65 (s, 2H), 4.02 (s, 6H).

C2 Préparation du composé 20

A une solution de 10,7 g (33,3 mmol, 1 éq.) de composé 19 dans 200 ml d'un mélange méthanol/dichlorométhane (140/60) et refroidie à 0°C, 1,39 g de borohydrure de sodium (36,6 mol, 1,1 éq.) est ajouté. Le mélange est ensuite agité pendant 30 min à 0°C et 30 min à la température ambiante. La réaction est ensuite stoppée par ajout de 50 mL d'une solution d'acide chlorhydrique (1M). La phase organique est ensuite lavée à l'eau jusqu'à pH = 7, séchée sur Na ₂ S04 et évaporée. Le produit brut est ensuite purifié sur gel de silice (éluant : dichlorométhane avec ajout progressif de méthanol (0 à 10%)) pour obtenir 5 g d'une poudre blanche du composé 20. (R = 51%).

H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.39 (bd, 1H), 7.97 (bd, 1H), 4.82 (d, J - 5 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H) 3.04 (t, J = 7 Hz, 1H).

C31 Pré aration du composé 21

A une solution de 1 g de composé 20 (3,4 mmol, 1 éq.) et de 1,4 mL de triéthylamine (10,2 mmol, 3 éq.) dans 120 mL de dichlorométhane sont ajoutés 0,4 mL de chlorure de mésyle (5,1 mmol, 1,5 éq.). Après 30 minutes d'agitation (réaction suivie par CCM), 100 mL d'une solution saturée de NaHC0 ₃ sont ajoutés. La phase organique est ensuite lavée à l'eau, séchée sur Na ₂ S0 ₄ et évaporée. 1,1 g d'huile jaune du composé 21 est obtenue et utilisée sans autre purification (R = 95%).

'H-NMR (300 MHz, CDC ) δ (ppm) = 8.46 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 5.36 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.16 (s, 3H).

C4 Préparation du composé 22

60 mg de triazacyclononane mono-boc 6 (0,2 mmol, 1 éq.) sont mis en suspension dans 50 mL d'acétonitrile sec sous argon avec 140 mg de Na ₂ C0 ₃ anhydre (1,2 mmol, 6 éq.). Une solution de 184 mg de composé 21 (0,5 mmol, 2,5 éq.) dans de l'acétonitrile sec est ensuite ajoutée et le mélange est agité pendant 12h à 60°C sous argon. Après refroidissement, le mélange est filtré sur fritte et évaporé. Le résidu est repris par du dichlorométhane et purifié sur colonne d'alumine (activité III ; éluant : dichlorométhane puis acétate d'éthyle).On obtient 110 mg de composé pur 22 sous forme de solide blanc pâteux (R = 71 %).

lH-NMR (300 MHz, CDCI3) δ (ppm) = 8.34 (s, 2H), 8.22 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 3.97 (s, 6H), 3.94 (s, 4H), 3.4-2.58 (m, 12 H), 1.47 (s, 9H).

¹³ C-NMR (75 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 164.6, 162 (d, J = 14 Hz), 155.61, 147.6 (d, 3 = 14 Hz), 135.3 (d, J = 14 Hz), 132.7, 106.6, 79.5, 63.1, 56.6, 54.9, 54.4, 53.1, 50.8, 50.2, 28.7. LC-MS: [M- H] ⁺ - 780.0 m/z.

CS) Préparation du composé 23

110 mg de composé 22 (0,14 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 50 mL de dichlorométhane, puis un excès d'acide trifluoroacétique est ajouté (3 mL). Le mélange est ensuite agité à température ambiante pendant 12 h. Le solvant est ensuite évaporé et un mélange de 20 mL de dichlorométhane et de 10 mL d'eau est ajouté. La phase aqueuse est neutralisée par ajout d'une solution saturée de NaH b et extraite avec du dichlorométhane. L'ensemble des phases organiques est séché sur sulfate de sodium et évaporé. On obtient 100 mg de solide blanc (rendement quantitatif) du composé 23 qui est utilisé sans autre purification.

^-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 8.23 (s, 2H), 7.83 (s, 2H), 3.92 (s, 10H), 3.27 (s, 4H), 2.92 (s, 4H), 2.67 (s, 4H). ^Î3 C-NMR (75 MHz, CDC! ₃ ) δ (ppm) = 164, 159.98, 147.81, 134.86, 133.14, 107.08, 59.85, 53.36, 52.65, 49.87, 45.33. HR-MS;

[M+H] ⁺ = 680 m/z, théor. pour C ₂₂ I ₂ H ₂ 8 ₂ O5 680.0225 m/z.

C6) Préparation du complexe 24

24

100 mg de composé 23 (0,15 mmol, 1 eq) sont mis en suspension dans 30 mL d'eau et 24 mg d'hydroxyde de sodium (0,81 mmol, 4 eq) sont ajoutés. Le mélange est ensuite agité à 60°C pendant lh. L'hydrolyse complète des fonctions ester est confirmée par LC-MS. La solution est ensuite refroidie et son pH est ajusté à 5 avec un ajout progressif d'une solution d'acide chlorhydrique (1M). 5 mL de méthanol sont ensuite ajoutés avant d'introduire 42 mg de carbonate de sodium à la solution. 66 mg de TbCl ₃ , 6H ₂ 0 (0,18 mmol, 1,2 eq) sont ajoutés avant d'agiter le mélange à 50°C pendant 12h, Après retour à température ambiante, les sels insolubles sont filtrés sur verre fritté avant évaporation des solvants pour obtenir 200 mg de produit brut. Le complexe est purifié par chromatographie d'exclusion stérique (Sephadex® LH20, éluant : eau) pour finalement obtenir 36 mg d'un produit cristallin incolore (rendement - 30%).

^X H-NMR (300 MHz, D ₂ 0) δ (ppm) = 122.8, 84.95, 82.17, 70.62, 49.22, 25.03, 20.8, - 0.89, -8.54, -19.41, -33.05, -41.19, -67.6, -88.49, -90.57, -125.1.

HR-MS: [M+H] ⁺ = 807.8921 m/z, théor. pour CzoHzifcNsCVTb 807.8931 m/z.

Préparation d'une quatrième série de ligands à base triazacyclononane (TACN)

Dl) Préparation du composé 25

1 g de composé 2 (6 mmol, 1 éq.) est dissout dans 100 mL de méthanol et 8 mL d'un solution aqueuse d'ammoniaque à 30% (60 mmol, 10 éq.). Ce mélange est agité à température ambiante pendant 12 h. Les solvants sont ensuite évaporés, jusqu'à obtenir 900 mg d'un solide blanc du composé 25 pur ( = quantitative). ^- MR (300 MHz, C ₂ D ₆ SO) δ (ppm) = 8.14 (bs, 1H), 7.96 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.61 (bd, J = 8 Hz, 2H), 4.64 (s, 2H).

LC-MS: [M+H] ⁺ = 153.2 m/z.

D2 Préparation du composé 26

A 1 g de composé 25 (6,6 mmol, 1 éq.) dans 20 mL de DMF à 0°C, 4 mL de chlorure de thionyle (53 mmol, 8 éq.) sont ajoutés. Le mélange est agité pendant 2h, avant de le laissé revenir à température ambiante en 15 min. 150 mL d'eau sont ensuite ajoutés, avant d'extraire le produit avec 30 mL de dichlorométhane, La phase organique est ensuite lavée à i'eau jusqu'à atteindre un pH = 7, puis iavée à la saumure, séchée sur Na ₂ SÛ4 et évaporée. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : dichlorométhane) et conduit à l'obtention de 720 mg d'un solide blanc du composé 26 (R - 55%).

^! H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 7.89 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.75 (d, 3 - 8 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.69 (s, 2H).

LC-MS: [M+H] ⁺ = 153.3.

120 mg de tnazayclononane protégé par un mono-Boc (0,4 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 50 mL d'acétonitrile sec sous argon avec 252 mg de Na ₂ CÛ3 anhydre (2,4 mmol, 6 éq.). Une solution de 151 mg de composé 26 (1 mmol, 2,5 éq.) dans de l'acétonitrile sec est ensuite ajoutée et le mélange est agité pendant 12h à 60°C sous argon. Après refroidissement, le mélange est filtré sur fritté et évaporé. Le résidu est repris par du dichlorométhane et purifié sur colonne d'alumine (activité III ; éluant : dichlorométhane puis acétate d'éthyle).On obtient 160 mg de composé 27 sous forme de solide blanc pâteux (R = 83 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI ₃ ) δ (ppm) = 7.79 (dt, ³ J = 8 Hz, ⁴ J = 1 Hz, 2H), 7.70 ( bd, J = 8 Hz, 2H), 7.57 (dt, ³ J = 8 Hz, ⁴ J = 1 Hz, 2H), 3.91 (s, 4H), 3.36 (m, 4H), 3.03 (m, 4H), 2.66 (m, 4H), 1.47 (s, 9H).

LC-MS: [M+H] ⁺ = 462.2 m/z.

4), Préparation du composé 28

A une solution de 160 mg du composé 27 (0,35 mmol, 1 éq.) dans 40 mL de DMF sec sous argon, 225 mg de NaN ₃ (3,5 mmol, 10 éq.) et 185 mg de NH ₄ CI sec sont ajoutés. Le mélange est agité à reflux à 120°C pendant 12 h. Après refroidissement, filtration sur fritté et évaporation des solvants, un résidu est obtenu, qui est repris par 50 mL d'acide chlorhydrique (1M) et mis dans un bain à ultrasons pendant 2h. HR-MS [M+H+] : 604.1439 th 604.1447

D5) Préparation du composé 29

29

155 mg de composé 28 (0.35 mmol, 1 eq) sont mis en suspension dans lOmL d'eau avec 220 mg de Na ₂ C0 ₃ (2.08 mmol, 6 eq). Après 10 min d'agitation, 155 mg de TbCl ₃ *6H ₂ 0 (0.42 mmol, 1.2 eq) sont ajoutés. La solution est ensuite agitée 12h à température ambiante. Après évaporation des solvants, le produit brut est purifié sur une colonne d'exclusion stérique. (Sephadex ® LH20 dans l'eau) pour finalement obtenir 40 mg de solide blanc cristallin (rendement = 20 %).

HR-MS: [M+H] ⁺ = 604.1439 m/z, théor pour C ₂ oH ₂ 3Ni ₃ Tb 604.1427 m/z.

E) Préparation d'une première série de ligands à base de l,7-dioxa-4,10- diazacyclododecane

Le composé 31 est préparé selon la méthode précédemment reportée (M. Mato- Iglesias, Adriân Roca-Sabio, Z. Pélinkas, D. Esteban-Gômez, C. Platas-Iglesias, E. Toth, A. de Blas, T. Rodriguez-Blas, Inorg. Chem., 2008, 47, 7840).

Partie II : Etudes cristallographiques

A) Protéines modèles étudiées

5 protéines, dont trois protéines commerciales ont été sélectionnées. La structure de ces cinq protéines était connue. Ces cinq protéines ont été choisies en raison de leurs différences physico-chimiques. En effet, elles appartiennent à des organismes variés, présentent des propriétés thermiques larges et un état oligomérique allant du monomère à l'hexamère. Des tests, avec des protéines dont la structure est inconnue, ont également été réalisés,

a. Protéines commerciales

Les trois protéines commerciales sélectionnées sont le lysozyme de blanc d'œuf de poule (HEWL), la Thaumatine de Thaumatococcus danielli et la Protéinase K de Tritirachium album. Ces trois protéines sont des protéines modèles en matière de cristallogenèse. Elles sont achetées sous forme lyophilisée. Elles ont été solubilisées dans de l'eau milliQ juste avant les expériences de cristallogenèse à la concentration souhaitée. Elles sont présentées dans le Tableau 1 ci-après.

Les conditions de cristallisation native (c'est-à-dire sans ajout de complexe selon l'invention) de ces protéines sont connues et décrites dans le Tableau 2 ci-après. Ces conditions ont été reprises pour caractériser l'effet des complexes de lanthanide selon l'invention, sur la cristallogenèse de ces protéines commerciales. Protéines Tampon Sel

HEWL 100 m M acétate de 0,5 à 2 M NaCI

sodium pH 4,6

Thaumatine 100 mM Bis tris 0,9 à 1,4 M Tartrate propane pH 6,5 double de Na+ et de

+

Protéïnase K 100 mM Cacodylate de 0,9 à 1,5 M sulfate sodium pH 6,5 d'ammonium

Tableau 2 : Conditions de cristallisation usuelles des protéines commerciales a. Protéines non-commerciales

Les deux protéines non-commerciales (structures connues) sont la Protéase 1 de Pyrococcus horikoshii et la Glyoxylate hydroxypyuvate réductase de Pyrococcus furiosus. Ces deux protéines ont été purifiées selon les protocoles décrits dans les références ci-dessous :

- Protocole de purification de la protéine Protéase 1 de P. horikoshii : Xinlin Du et al. Crystal structure of an intracellular protéase from Pyrococcus horikoshii at 2-A résolution. 2000. Vol97. N° 26. PNAS .

- Protocole de purification de la protéine Glyoxylate réductase de P. furiosus ;

Thèse de Louise Lassalle, soutenue le 19 Décembre 2014 à Grenoble : Bases molécuiaires de l'adaptation piézophile : études structurales et biochimiques d'enzymes clés du métabolisme provenant d'archées et de bactéries isolées dans les fonds marins. Lien : http://www.theses.fr/s98711.

Les détails techniques concernant ces protéines sont donnés dans le Tableau 3 ci-après : Nom Organisme Vecteur Taille Caractéristique Lien vers Unité

(Acides Physico-chimique séquence biologique

Aminés)

GRHPR P. furiosus pET41 336 Hyperthermophile 1 dimère

Protéase 1 P. horikoshii pET41c 166 Thermophiie 2 hexamère

Tableau 3 : Caractéristiques des protéines non commerciales utilisées

Séquence de ia GRHPR : SEQ ID N°4

Séquence de la Protéase 1 : SEQ ID N°5

Les conditions de cristallisation de ces deux protéines sont décrites dans le Tableau 4 ci-après. Ces conditions permettent de cristalliser les protéines sous leur forme native et sont extraites des mêmes références que les protocoles de purification.

Protéines Tampon Sel Précipitant

GRHPR 100 mM acétate de 100 mM NaCi 14 à 24 %

sodium pH 5,2 PEG 400

Protéase 1 Tris sodium citrate 200 mM K+ tartrate 1,9 à 2,4 M

dihydrate pH 5,6 tétrahydrate Sulfate d'ammonium

Tableau 4 : Conditions de cristallisation des protéines non commerciales utilisées Les cinq protéines décrites ci-dessus sont les protéines de référence pour caractériser les effets des complexes de lanthanide. c- Protéines inconnues

Les spécificités des trois protéines dont la structure est inconnue sont décrites dans le Tableau 5 ci-après. La structure de la protéine MDH-ANC80 a été déterminée grâce au complexe de lanthanide 17. Les différentes étapes seront décrites de manière individuelle dans un paragraphe dédié. Nom Organisme Vecteur Taille AA caractéristiques Lien vers Unité

séquence biologique pb6 Phage T5 pET41 464 Protéine virale 1 monomère

MDH- La séquence a pET41c 309 Halophile 2 Tétramère

ANC80 été générée

bioinformati- quement

Tableau 5 : Caractéristiques des protéines de structure inconnue sur lesquelles les complexes de lanthanide selon l'invention ont été testés

Séquence de la Pb6 : SEQ ID N°6

Séquence de la MDH : SEQ ID N°7

Aucune condition de cristallisation n'était publiée concernant ces deux protéines.

Les séquences SEQ IN N°l à 7 sont présentées en ANNEXE1.

Le protocole de purification de la malate déshydrogénase (MDH) de l'ANCSO est décrit dans la littérature (Madern et al. 1995 230(3): 1088-95 Eur. 1 Biochem).

Le protocole de purification de pb6 a été établi par l'équipe de Cécile Breyton du groupe M&P de l'Institut de Biologie Structurale et est le suivant :

Protocole de purification de pb6 :

Système d'expression = E. coli BL21(DE3) transformé avec LIM1 (Kan R) His tag avec site de clivage « Tobacco Etch Virus ».

- Préculture milieu LB classique avec 50 g/ml de kanamicyne

- Culture en milieu classique LB : Ensemencement avec une densité optique de 0.1 et 50 Mg/ml de Kanamicyne.

-Après 6 heures de culture, centrifugation 30 minutes 4000rpm

- Congélation des bactéries a -80 °C

- Cassage

- Reprise dans du tampon de lyse 50mM Tris pH 8, 150mM NaCI, 2mM MgC12 en précence d'anti-protéase et DNase

- Lyse des bactéries au micro-fluidizer 6x 12000psi

- Centrifugation : 20 minutes à 14 000 rpm

- Colonne d'affinité nickel Tampon d'équilibration = 20 mM Tris pH 8, 250 mM NaCl, 15 mM Imidazole

Tampon d'élution - 20 mM Tris pH 8, 200 mM Imidazole

Débit = lml/min

- Dilution des fractions d'élutions au cinquième avec de l'eau distillée pour diminuer la conductimétrie.

- Colonne échangeuse d'ions (HT Q 1ml)

Tampon d'équilibration = 20 mM Tris pH 8

Tampon d'élution = 20 mM Tris pH 8 1M NaCl

Elution par gradient linéaire

Débit = lml/min

- Concentration sur concentrateur ayant une membrane de 30kDa

- Dessalage par gel filtration dans un tampon tris pH 8 20 Mm

B) Cristallisation automatisée/Stabilité des complexes de lanthanide

a. La plateforme HTXlab.

Afin de déterminer les conditions de cristallisation d'une protéine, la plateforme HTXlab permettant de cribler un large panel de conditions de cristallisation a été utilisée. Ces conditions sont toutes décrites dans les Tableaux figurant en Annexe 2A et 2B et issus de https://embl.fr/htxlab/index.php?option=com

172.

Un criblage classique est constitué de 6 plaques de cristallisation de 96 puits chacune, soit 576 conditions.

Les études réalisées sur les protéines MDH-ANC80 et Pb6 ont utilisé les conditions décrites en Annexe 2A.

Les études réalisées sur les autres protéines ont été réalisées avec les conditions décrites en Annexe 2B, du fait d'un changement dû au fournisseur.

Stabilité des complexes

Les études de stabilité ont été réalisées avec les conditions décrites en Annexe 2A. Il a été montré que les complexes de lanthanide basés sur le tris-dipicolinate (DPA) [Ln(DPA) ₃ ] ^3" présentaient une « auto-cristallisation » pour certaines conditions de cristallisation. En particulier, la présence de cations divalents, de fortes concentrations en sels, la présence de MPD provoquait l'auto-cristallisation de ce type de complexe (Thèse de doctorat de R. Talon soutenue à Grenoble le 6 juin 2012). Deux concentrations de Ln(DPA) ₃ ^3" ont été évaluées (25 et 100 mM). Ainsi, sur 576 conditions, plus d'un quart des conditions conduisent à une auto- cristallisation/formation de précipités du Ln(DPA)3 ^3" à 100 mM et de l'ordre de 8% lorsqu'il est utilisé à 25 mM.

De manière équivalente, la stabilité du complexe 10 a été évaluée à 3 concentrations différentes (10, 50 et 100 mM). Le complexe 10, même à une concentration de 100 mM, présente une stabilité accrue. En effet, aucun cristal du complexe n'a été observé, comme détaillé ci-dessous où seule la présence de précipités a été détectée.

Récapitulatif du criblage des 6 plaques classique pour 100 mM de complexe 10 :

Plaque Hampton 3

Légères précipitations observées en présence de NaHP0 ₄ ou KHP0 ₄ .

Plaque Hampton 5

Majoritairement des PEGs dans ce cas 100 % des gouttes sont claires.

Plaque Hampton 4

Majoritairement des sels. Quelques conditions sont redondantes avec la plaque Hampton 3. Effet similaire en présence de HP0 ₄ ^" avec de légères précipitations observées.

Plaque Qîagen 1

Mélange PEGs, sels et métaux. Un léger précipité est observé en présence d'acétate de cadmium.

Plaque Hampton 6

Léger précipité observé en présence d'un mélange de métaux (cadmium, zinc, cobalt).

Plaque Hampton 2

Léger précipité en présence de NaF et de (NH- 2PO4

Ci-dessous le détail des conditions qui conduisent à ces précipités :

Avec 100 mM de complexe 10 ajoutés aux conditions classiques :

Plaque Hampton 4 : 21 conditions précipitées n° A7, B7, C7, A8, B8, ABCD 9, 10, 11 et 12 (majoritairement phosphate d'ammonium) Plaque Hampton 5 : Aucun précipité

Plaque Quiagen 1 : 6 conditions précipitées n° D6, B9, F9, F9, D10, E10

Plaque Hampton 6: 4 conditions précipitées n° A3, B3, C3, H8

Plaque Hampton 2 : 7 conditions précipitées n° C2, C5, B6, A7, C7, A12, B12 Plaque Hampton 3 : 4 conditions précipitées n° H3, E4, A6, E5

Soit un total de 42 conditions présentant des précipités. Sur un criblage de

576 conditions cela équivaut à 7,3 % ;

Aucun faux positif comme avec le DPA.

Avec 10 mM de complexe 10 ajoutés aux conditions classiques:

Plaque Hampton 4 : Aucun précipité marqué comme observé avec 100 mM quelque trace de précipité pour ABCD ligne 12

Plaque Qiagen 1 : E10 une condition légèrement précipitée

Plaque wizard I et II rigaku 5 conditions précipitées n° E6, C7, B9, C10, Hll Plaque JCSG : 3 conditions légèrement précipitées n° D2 G5, A6

Plaque PACT Qiagen : 5 conditions précipitées n° El, A5, A6, Eli, C12

Plaque PEGs Qiagen : Aucune condition précipitées

Soit un total de 18 conditions présentant de légères traces de précipités. (3,2% du criblage) sachant que des gouttes avec quelques traces de précipité ont été qualifiées de « précipité ». La quantité et le nombre d'essais entraînant des précipités n'ont rien à voir avec les précipités observés à 100 mM de complexe 10, ni à 25 mM de Ln(DPA) ₃ ^3" .

Il est à noter que la présence de ces précipités n'est pas incompatible avec l'apparition de cristaux de protéine. En effet, des essais de cristallisations manuelles de la protéine MDH de C. aurantiacus en présence de cadmium ont permis d'obtenir des cristaux en présence de 50 mM de complexe 10.

C) Criblage de nouvelles conditions de cristallisation

Pour réaliser un criblage de six plaques sur la plateforme HTXlab, 100 μΙ de solution de protéine sont nécessaires. Afin de disposer d'une comparaison directe, la protéine native (sans complexe de lanthanide) et la protéine en présence de 10 mM de complexe 10 ont été criblées en parallèle dans les mêmes plaques de cristallisation. a- Protocole de préparation des échantillons protéiques contenant le complexe de lanthanide.

Les complexes de lanthanide ont été stockés sous forme de poudre à 4°C, La masse correspondant à 10 mM pour 100 μΙ de solution de protéine a été pesée sur une balance de précision. La poudre a été centrifugée pour former un culot. Ce culot a été repris par 100 μΙ de la solution de protéine. Une centrifugation de deux minutes a été réalisée pour éliminer les éventuels agrégats. La solution a ensuite été changée de tube. Ce protocole a été appliqué pour l'ensemble des protéines envoyées au robot.

b. Détermination de nouvelles condition pour la protéine inconnue pb6

Les conditions les plus intéressantes en terme de cristallogenèse et permettant la cristallisation de pb6 sont répertoriés dans le tableau 6. Les conditions ayant permis la formation de cristaux uniquement en présence de 10 mM de complexe ÎO sont mentionnées en gras (il s'agit de pb6-l et pb6-4).

Tableau 6 : Conditions de cristallisation pour la protéine pb6 obtenues au robot HTX en absence ou en présence de complexe 10

La condition pb6-l a été reproduite manuellement en laboratoire et a également donné des cristaux, L'utilisation des complexes selon l'invention permet de doubler le nombre de conditions ayant conduit à une cristallisation.

c. Détermination de nouvelles condition pour la protéine inconnue MDH-ANC80 Les conditions les plus intéressantes en terme de cristallogenèse et permettant la cristallisation de la protéine ANC80 sont répertoriés dans le tableau 7, Les conditions ayant permis la genèse de cristaux uniquement en présence de 10 mM de complexe 10 sont mentionnées en gras (il s'agit de ANC-1 et ANC-2).

robot HTX en absence ou en présence de complexe 10

La condition ANC-1 a été reproduite au laboratoire et a permis la croissance de cristaux (Paragraphe D.a). L'utilisation des complexes selon l'invention permet de tripler le nombre de conditions ayant conduit à une cristallisation.

d. Statistiques d'obtention des cristaux des différentes protéines étudiées sur la plateforme HTXlab

Dans le Tableau 8 ci-après, est présenté le nombre de conditions ayant conduit à des cristaux après un criblage classique (de 576 conditions commerciales pour le complexe 10 et de 480 pour le complexe 31) sur la plateforme HTXlab des différentes protéines étudiées. Les valeurs indiquées correspondent à une observation des plaques de cristallisation après 85 jours. La colonne « conditions uniques » correspond au nombre de conditions qui entraînent une cristallisation en présence de complexe, mais aucune cristallisation dans les mêmes conditions en l'absence de complexe (dites natives).

Tableau 8

* Condition ayant conduit à cristailisation en l'absence de complexe (conditions natives) ** Condition ayant conduit à cristallisation avec ajout de complexe

Les conditions conduisant à une cristallisation correspondent à des conditions conduisant à l'apparition de cristaux potentiellement exploitables pour des expériences de diffraction. Ainsi, le complexe 10 permet l'augmentation significative du nombre de conditions de cristallisation pour les protéines suivantes : HEWL et Pho protéasel. Si son effet peut paraître moins efficace dans le cas des protéines 5

Proteinase K et Thaumatine, il n'en est rien. En effet, l'introduction du complexe 10 ne conduit pas à une augmentation importante du nombre de hits lanthanide, mais les conditions obtenues sont en grande partie différentes des conditions natives (21 pour Proteinase K et 2 pour Thaumatine). On augmente donc le nombre de conditions potentielles permettant d'obtenir des cristaux de la protéine d'intérêt.

Il est à noter que dans le cas de la protéine Protéasel avec le complexe 10, l'obtention de 113 conditions couvre une large gamme de conditions de cristallisation différentes. Cela prouve à nouveau que le complexe 10 est compatible avec l'ensemble des conditions physico-chimiques que l'on peut rencontrer dans les kits de cristallisation commerciaux.

Le complexe 10, comme les complexes 17 et 31, possèdent tous trois un caractère nucléant. Cependant, les complexes 17 et 31 sont moins efficaces que le complexe 10. A titre d'exemple, le complexe 31 semble moins efficace que le complexe 10 pour la protéinase K. Cependant, les 4 conditions ayant conduit à cristallisation, en présence du complexe 31, sont différentes de celles ayant conduit à des cristaux natifs. Ces cristaux sont potentiellement de meilleure qualité. Le fait d'obtenir de nouvelles conditions conduisant à une cristallisation est donc une avancée. D) Cristallisations réalisées manuellement en laboratoire

Les protéines commerciales (Paragraphe A.a), ont été cristallisées manuellement selon les conditions de cristallisation usuelles connues (Tableau 2). Les conditions de cristallisation décrites dans le Tableau 2 ont donc été reproduites en présence de complexes 10 ou 17 à une concentration de 10 mM. Pour réaliser ces gammes de cristallisation manuelles, les gouttes de cristallisation ont été préparées selon le schéma suivant : 1,5μΙ de solution de protéine + 1,5μΙ de solution de complexe à une concentration de 10 mM + 1,5μΙ de solution de précipitant. Afin de mettre en avant un potentiel effet des complexes de lanthanide sur la cristallisation, la gamme en agent précipitant a été ajustée de manière à se trouver en limite de la zone de cristallisation, puis, éventuellement étendue au-delà lorsqu'un effet était observé. Ainsi, dans le cas de la protéine lysozyme, un effet nucléant marqué a été observé. L'effet nucléant doit ici être entendu par la croissance de cristaux en présence du complexe de lanthanide à des concentrations en précipitant faible, concentrations qui ne permettent pas la formation de cristaux natifs. Afin de mettre clairement en évidence ce phénomène de nucléation induit par les complexes selon l'invention, des diagrammes de phase ont été réalisés en déterminant les gammes de concentration en agents précipitant et en protéine qui permettent l'obtention de cristaux.

a. Diagrammes de phase pour le lysozvme de blanc d'oeuf de poule natif et en présence de 10 mM de complexe 10 ou de complexe 17

Les diagrammes de phase de la protéine lysozyme obtenus après 2 jours et 15 jours de croissance sont représentés Figure 5 :

Chaque condition de cristallisation a été réalisée en triplicata. Après seulement deux jours de croissance cristalline, une nette différence a été observée. En présence du complexe 10 ou 17, des cristaux ont été obtenus à de faibles concentrations en protéine (5 mg/ml) et en précipitant.

Après 20 jours de croissance cristalline en présence de complexe 10 ou 17 à 10 mM, des cristaux ont été obtenus sur l'ensemble de la gamme évaluée. En particulier, des cristaux sont apparus pour 5mg/ml de lysozyme et pour une concentration en précipitant de 500 mM. Par comparaison, l'absence de complexe de lanthanide permet seulement la formation de cristaux jusqu'à 500 mM de NaCI et pour des concentrations de 20 mg/ml de protéine.

A titre de comparaison :

Les complexes de type IRM, qui n'induisent pas d'effets nucléants, sont classiquement utilisés à des concentrations de l'ordre de 50-300 mM.

- Le tris-dipicolinate de lanthanide a produit une nouvelle forme cristalline du lysozyme seulement lorsqu'il a été utilisé à des concentrations supérieures à 50 mM.

- Les MIPs proposées par Naomi E. Chayen (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L, Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N.

E. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081- 11086) conduisent à des décalages de la zone de cristallisation de seulement une à deux unités de concentration en agents précipitant. Les effets nucléants associés ne sont obtenus que pour des concentrations conventionnei!es de lysozyme de l'ordre de 30 mg/ml (Khurshid et al., Automating the application of smart materials for protein crystailization, (2014) Acta cryst D). Selon Saridakis et al. (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L, Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N. E. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081-11086.), la gamme de cristallisation du lysozyme en présence de leurs agents nucléants débute à partir de 480 mM de NaCI et ce, pour une concentration en protéine de 20 mg/mL. Aucun cristal de lysozyme n'a été observé en dessous de 460 mM NaCI. Concernant la protéine thaumatine (30 mg/ml) aucun cristal n'est observé en dessous de 0,2 M tartrate. En présence de leurs agents nucléants, ils obtiennent des cristaux pour 0,3 et 0,4 M tartrate (idem complexe 10) et des cristaux natifs pour 0,5 M tartrate,

- Les complexes de type POM ne présentent d'effet nucléant qu'avec des concentrations élevées de lysozyme (de l'ordre de 100 mg/ml), ce qui pose des problèmes de solubilité pour la plupart des protéines. (A. Bijelic et al Hen Egg- White Lysozyme Crystallisation: Protein Stacking and Structure Stability Enhanced by a Tellurium(VI)-Centred Polyoxotungstate ChemBioChem 2015, 16, 233 - 241).

b. Diagramme de phase pour le lysozyme de blanc d'ceuf de poule natif et en présence de 10 mM de complexe 11 ÎEu)

Le diagramme de phase obtenu en présence du complexe 11 (Figure 6) est équivalent à celui obtenu en présence du complexe 10. La nature du lanthanide présent au sein du complexe n'influence pas l'effet nucléant observé.

c. Diagrammes de phase pour la protéine de structure inconnue pb6

La protéine pb6 a été purifiée selon le protocole décrit précédemment. La condition pb6-l (Paragraphe Cb) obtenue au robot HTXlab a été reproduite manuellement. Des diagrammes de phases ont été déterminés. Ils sont représentés sur la Figure 7. Comme pour le lysozyme, l'effet nucléant est très important. Les cristaux obtenus en présence du complexe de lanthanide selon l'invention sont très prometteurs (voir Figure 8) pour une étude cristallographique. Les cristaux obtenus en présence de 10 mM de complexe 10 sont parfaitement exploitables pour des expériences de diffraction. Les cristaux natifs sont trop petits, trop fins et mal organisés. Ainsi dans le cas de la protéine pb6, on observe à la fois un effet nuciéant et cristallisant induit par le composé 10.

d. Effet cristallisant des complexes de lanthanide 10

Si une amélioration de la cristallisation (nombre de cristaux, taille des cristaux, amélioration de la diffraction) est observée par l'ajout de complexe de lanthanide, on parle alors d'effet cristallisant.

Dans le cas de la cristallisation de la protéine Protease 1 de P. horikoshii un effet cristallisant a également été observé lié à l'ajout du complexe 10. En effet, les cristaux obtenus en présence de 10 mM de complexe 10 sont apparus en moyenne 2,5 fois plus gros que les cristaux obtenus dans les mêmes conditions, mais sans complexe (taille moyenne évaluée sur 10 cristaux présents dans une goutte photographiée).

Cet effet cristallisant présente donc un intérêt certain pour la cristallographie aux rayons X puisque l'intensité diffractée est proportionnelle au volume de l'échantillon irradiée. Cela peut ainsi permettre d'obtenir une résolution supérieure pour les données de diffraction. E) Propriétés de luminescence et applications

Les complexes de coordinations du terbium et de l'europium (III) sont connus pour présenter des propriétés de luminescence très particulières, dues aux transitions f-f qui se traduisent par des raies d'émission fines et caractéristiques de chaque élément et des durées de vie longues (ps-ms). ïl est difficile d'induire cette luminescence par irradiation directe de l'ion métallique, car ces transitions f-f sont interdites et présentent donc de très faibles coefficients d'absorption molaire. En revanche, il est possible de sensibiliser cette luminescence par un processus indirect, appelé effet d'antenne, et qui consiste à exciter un ligand organique contenant un chromophore (typiquement un groupement aromatique) et de transférer cette énergie sur l'ion métallique (Luminescence of Lanthanide Ions in Coordination Compounds and Nanomaterials, Ed. A. De Bettencourt-Dias, Wiley 2014). Ces propriétés de luminescence des complexes de lanthanide proposés peuvent être mises à profit, lors de deux étapes de la détermination de la structure d'une protéine : a) la détection des cristaux lors des cristallisations et b) durant le centrage des cristaux lors de l'expérience de diffraction.

a. Détection des cristaux lors des cristallisations

La détection des cristaux peut parfois être compliquée, par exemple lorsque les cristaux sont de petites tailles, sont noyés dans du précipité ou encore obtenus en bord de goutte de cristallisation. Dans le cas particulier des protéines membranaires, on peut aussi citer le problème de la détection des cristaux obtenus par la technique de cristallisation en phase cubique de lipides.

Pour améliorer la détection des cristaux, de nombreux fournisseurs proposent des microscopes avec une source UV, permettant d'utiliser la fluorescence intrinsèque des acides aminés aromatiques, en particulier du tryptophane. A titre d'exemple, on peut citer la source UV proposée par Molecular Dimension (http://www.moleculardimensions.com/applications/upload/Xtal ight„100.pdf) ou le microscope UVEX (http://www.moleculardimensions.com/shopdisplayproducts. asp?id=299&cat=UVEX+ UV+Fluorescence+Imaging+systems) proposé par la même société.

L'utilisation de la luminescence des complexes de lanthanide peut contribuer à résoudre une grande partie des problèmes cités auparavant

La luminescence des complexes de lanthanide selon l'invention a donc été étudiée, en utilisant une source UV en voie de commercialisation par la société NatXray sur un microscope classique et une source UV LED externe de la société OceanOptics (Figure 9 ; Longueur d'onde d'excitation 365 nm ; Modèle LLS-365 ; http://oceanoptics.com/product/lls-family/) (cristaux de lysozyme obtenus en présence de lOmM du complexe 10 ou cristaux de la protéine MDH ANC80 obtenus en présence de 50mM de complexe 17).

A l'aide du système de la société NatX-ray, les cristaux obtenus en absence du complexe 10 apparaissent de couleur bleue (à gauche). A l'inverse ceux obtenus avec ce complexe apparaissent de couleur verte (à droite) qui se traduit par une augmentation du contraste entre les cristaux et la solution qui les entoure. Cela est également observable avec le système utilisant une source UV LED, puisque les cristaux, obtenus en présence du complexe 17 et sous illumination UV sont plus facilement identifiables que lorsqu'ils sont observés en lumière blanche. A titre d'exemple, un cristal de petite taille est indiqué par une flèche blanche (Figure 9).

On remarquera en outre que la luminescence est observable pour deux longueurs d'onde d'excitation (280 nm et 365 nm).

b. Aide au centrage des cristaux

Cette partie a été évaluée à l'aide de l'instrument CRYOBENCH de l'IBS-ESRF (http://www.isbg.fr/analyses-structurales/cryobench/) et sur la ligne de lumière FIP- BM30A de l'ESRF.

Les cristaux utilisés (cristaux de lysozyme obtenus en présence de lOmM du complexe 10 ou cristaux de la protéine MDH ANC80 obtenus en présence de 50mM de complexe 17) ont été congelés de manière classique à 100 K sur des boucles de nylon.

Pour prendre des photos, la même source UV LED externe de la société OceanOptics a été utilisée. La qualité des photos obtenues permet d'envisager différents moyens de faciliter le centrage :

~ un centrage direct grâce à la luminescence,

- l'utilisation d'un spectrophotomètre pour mesurer précisément la luminescence et rechercher les zones présentant les intensités les plus fortes qui correspondraient à la présence d'un cristal. L'idée serait donc de scanner la boucle avec un faisceau UV assez fin.

- Effectuer un pré-positionnement grâce à la luminescence, complété par un centrage précis par la technique dite de Raster scanning (Aishima et al, Acta D (2010), D66, 1032-1035), notamment dans le cas des cristaux de petite taille ou de type aiguille fine.

F) Potentiel phasant des complexes de lanthanide selon l'invention a- Méthodologie utilisée

L'évaluation du potentiel phasant des complexes de lanthanide selon l'invention a été effectuée de manière conventionnelle, en utilisant différentes méthodes de novo de détermination des phases, représentant un panel des techniques couramment utilisées pour la détermination des structures de macromolécules biologiques. Cela montre que l'utilisation des complexes selon l'invention permet une utilisation habituelle des méthodes de phasage.

Les méthodes testées sont :

• la méthode SAD, qui présente l'avantage de nécessiter un seul cristal et d'effectuer un seul enregistrement de diffraction,

• la méthode MAD, qui présente l'avantage de nécessiter un seul cristal, qui suppose un enregistrement à plusieurs longueurs d'onde et qui produit théoriquement des phases de meilleure qualité que la méthode SAD,

• la méthode SIRAS, qui suppose un enregistrement sur un cristal de la protéine en absence de complexe et un enregistrement sur un cristal de la protéine en présence de complexe. Cette méthode suppose un excellent isomorphisme des deux cristaux et donc nécessite qu'ils présentent la même forme cristalline.

Les données de diffraction ont été intégrées et mises à l'échelle avec les programmes XDS, SCALA et TRUNCATE.

Le programme AutoSharp ( https://www.qlobalphasinq.com/sharp/ a été utilisé.

Ce programme effectue, de manière automatique, la recherche de la position des atomes lourds, leur affinement, la détermination initiale des phases, ainsi que leur amélioration. Le programme a été utilisé avec les paramètres par défaut. Le résultat du phasage est évalué sur la base des figures de mérite (FOM pour « Figure of Merit »), avant et après amélioration des phases.

Dans un second temps, la qualité du phasage a été évaluée en effectuant une reconstruction automatique du modèle de la protéine considérée. On dispose, alors, du nombre de résidus modélisés sur le nombre de résidus attendus. Le programme Buccaneer (http://www.ccp4. ac.uk/dist/html/cbuccaneer.html) a été utilisé avec les paramètres par défaut et avec 10 cycles de reconstruction.

En ce qui concerne l'obtention des données de diffraction, ces dernières ont été enregistrées de manière conventionnelle sur ligne de lumière synchrotron. Afin de déterminer de manière précise te seuil d'absorption Lm du lanthanide utilisé, une mesure de fluorescence a été effectuée et traitée à l'aide du programme Chooch (http://www.gwyndafevans.co.uk/chooch.html). Les longueurs d'onde d'enregistrement sont ainsi obtenues, afin d'exploiter de manière optimum le signal anomal du lanthanide (méthodes SAD et MAD). Dans le cas de la méthode SIRAS et en plus de l'enregistrement au seuil l_m du lanthanide sur le cristal dérivé, un enregistrement sur un cristal natif a été effectué à la longueur d'onde de 0,9798 Â. Les résultats sont présentés Figure 10.

Pour chacune des méthodes de phasage évaluées, les enregistrements ont été effectués aux longueurs d'onde indiquées dans le Tableau 9 :

Tableau 9: Méthodes de phasage utilisées et énergies d'enregistrement associées. b. Test de diffraction de protéines cristallisées en présence de 10 mM de complexe 10 ou 17

Les cristaux des protéines co-cristal Usées en présence de 10 mM de complexe

10 ou 17 (Condition d'effet nucléant du complexe de lanthanide) ont été évalués en termes de diffraction. Les résultats de cette évaluation sont résumés dans le Tableau 10 :

Tableau 10 : Résultats des tests de diffraction obtenus sur différentes protéines cristallisées en présence des complexes de lanthanide

Dans le cas de la protéine Protéase 1, l'effet cristallisant se manifeste aussi bien par une augmentation de la taille moyenne des cristaux, comme indiqué précédemment, que par la résolution obtenue pour la diffraction. En effet, les données de diffraction enregistrées sur un cristal obtenu en présence de 10 mM de complexe 10 présentent une résolution de 1,7 Â. Le meilleur modèle actuellement disponible dans !a Protein Data Bank est à 2,0 Â (Code PDB : 1G2I Référence publication : idem protocole partie lb).

c Phasaae de novo des protéines modèle

Les structures des différentes protéines modèles ont été déterminées selon les différentes méthodes explicitées dans le paragraphe F.a.

En outre, les tentatives de phasage ont été effectuées sur des cristaux obtenus en conditions nucléantes du complexe (c'est-à-dire à 10 mM), mais la possibilité d'effectuer un trempage d'un cristal obtenu en présence de 10 mM de complexe 10 ou 17 dans une solution similaire à la condition de cristallisation et contenant 100 mM de complexe de lanthanide a également été étudiée. Ceci avait pour but d'augmenter éventuellement le taux de marquage de la protéine et de faciliter ainsi la détermination de Sa structure. Le temps de trempage était de l'ordre de la minute. Il est à noter que cette technique de trempage peut aussi être appliquée à des cristaux natifs (obtenus en absence de complexe de lanthanide).

En résumé, les trois méthodes de préparation des cristaux suivantes ont été évaluées pour un phasage de novo en utilisant les complexes de lanthanide selon l'invention :

- cristal co-cristallisé en présence de 10 mM de complexe (condition nucléante),

- cristal co-cristallisé en présence de 10 mM de complexe et trempé dans une solution contenant 100 mM du même complexe,

- cristal natif trempé dans une solution de 100 mM du complexe de lanthanide.

L'ensemble des données de diffraction a été obtenu en accord avec la méthodologie explicitée au paragraphe F.a. Les résultats sont présentés dans le Tableau 11 ci-après.

Protéine Complexe Concentration Méthode Résolution FOM FOM Buccanneer

(Â) après après % de

SHARP SOLO- modèle

MON reconstruit

Hewi 10 10 mM SAD 1,8 0,428 0,881 79,1

Hewl 17 10 mM SAD 1,8 0,314 0,839 46,5

Proteas Trempage * SAD 2,0 0,389 0,955 95

el

PfuGR 17 Trempage*su SIRAS 2,5 0,043 0,943 68

r cristal natif

PfuGR 10 Trempage * SAD 2,5 0,184 0,923 84,5

Tableau 11 : Résultats des phasage de novo pour les protéines modèles

* Trempage : Dans une solution cryoprotectante contenant 100 mM de complexe

Le haut pouvoir phasant des complexes objets de la présente invention se reflète dans le pourcentage de modèle reconstruit dans intervention manuelle. Plus la détermination des phases est de qualité (ce qui dépend de la méthode de phasage utilisée, de l'occupation des sites de fixation des complexes, de la qualité des données...) plus la carte de densité électronique expérimentale sera interprétable par les programmes de reconstruction automatique (tel que le programme Buccaneer). Dans les cas évalués, des modèles reconstruits automatiquement de Tordre de 50% à pratiquement 100% du modèle final ont été obtenus.

d. Exemples de densité électroniques obtenues après phasage et aplatissement de solvant

Un exemple de densité électronique expérimentale obtenue selon les méthodes décrites précédemment pour la protéine glyoxylate réductase et pour la protéine Protéase 1 sont illustrées Figure 11. Les cristaux de glyoxylate réductase ont été obtenus selon les conditions décrites dans le tableau 4 en présence de 10 mM de complexe 10. Les cristaux de la protéine Protéase 1 ont été obtenus selon les conditions décrites dans le tableau 4 en présence de 10 mM de complexe 10 puis trempés dans une solution cryoprotectante contenant 100 mM de complexe 10,

Dans les deux cas, compte tenu de la qualité de la détermination des phases, on obtient des cartes de densité électronique expérimentale aisément interprétables, où l'on distingue les chaînes latérales des acides aminés. Une tyrosine pour la carte de la glyoxylate réductase et un tryptophane pour la carte de de la protéine Protéase 1. Les images ont été produites à l'aide du logiciel coot.

G) Application de la technologie à la détermination de la structure de la protéine MDH ANC80

a. Effet nucléant et cristallisant : le cas de la MDH A1MC80

La protéine MDH de TANC80 concentrée à 10 mg/ml a été envoyée au robot de cristallisation pour un criblage classique des 576 conditions. La condition de cristallisation la plus prometteuse est la condition ANC-1 du Tableau 7. Les photos obtenues au robot de cristallisation pour cette condition sont présentées Figure 12.

Cette condition a été reproduite manuellement au laboratoire. Des cristaux sont apparus en présence de 10 mM de complexe 17 et 10 mM de complexe 10 en 7 jours. La même condition en condition native (sans complexe de Ianthanide) a également été réalisée. Après environ 3 semaines, des cristaux de formes différentes sont apparus (non représentés).

Les cristaux natifs ont été testés en diffraction. Celle-ci présente une résolution de l'ordre de 2,5 Â. Ces cristaux présentent une symétrie différente de celle obtenue pour les cristaux obtenus en présence de complexe 10 ou 17 (Groupe d'espace F222) avec des paramètres de maille de l'ordre de 81, 140 et 395 Â respectivement pour a, b, et c. Ceci est à comparer au groupe d'espace obtenu pour les cristaux en présence de complexe et à la résolution obtenue pour les données de diffraction. En effet, les cristaux en présence de 10 mM de complexe de Ianthanide diffractent à 1,7 Angstrôm. Ainsi, les effets nucléants et cristallisants sont bien observés dans le cas de cette protéine.

La détermination de la structure de la MDH de l'ANC80 a été réalisée selon la méthode MAD. Trois jeux de données ont été enregistrés sur le même cristal au seuil d'absorption L _m du terbium. Un jeu de données supplémentaire a été mesuré au seuil d'absorption K du sélénium pour obtenir la meilleure résolution possible. Les statistiques, après intégration sur l'ensemble des données collectées, sont présentées dans le Tableau 12 ci-après. ANC80 ANC80

lOmM complexe 17 lOmM complexe

17

Collection des Seuil K du Se Seuil UII Tb

données Ligne id23-2 (ESRF) Ligne BM30A

(ESRF)

Groupe d'espace R3 R3

Paramètres de maiile a, b, c (Â) a = b = 217,5 a = b = 217,5

c = 86,3 c = 86,3

pk* inf rm

Longueur d'onde 0,8726 1,650237 1,65087 1,64766

Résoiution (Â) 1,85 2 2 2

0,093 (0,850) 0,126 (0,617) 0,117 (1,035) 0,116 (1,111)

I / sigma(I) 7,3 (1,3) 6,8 (2,1) 7 (1,5) 7,6 (1,3)

Complétude (%) 98,9 (97,6) 99,5 (96,8) 99,6 (97,0) 99,5 (96,5)

Multiplicité 3,9 (3,9) 5,5 (5,2) 5,5 (5,1) 5,5 (5,0)

Reconstruction 99,2 % du modèle reconstruit à 2,0 Angstrom automatique

(Buccaneer)

Tableau 12 Collecte des données, phasage et statistiques d'affinements

* selon la Figure 8

L'affinement du modèle conduit à des facteurs de qualité très bons avec un facteur R et Rfree de 19,2 et 21,2 %.

Les complexes luminescents suivants ont été également testés à 10 mM et ne présentent pas d'effet sur la cristallisation :

ANNEXE 1 : Séquence en acides aminés

des différentes protéines testées Lysozyme (Galius gallus) HEWL : SEQ ID N°l

KVFGRCELAAAMKRHGLD YRGYSLG WVCAA FES FNTQATNRNTDGSTDYGÏLQINSR WWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQ AWIRGCRL Thaumatine (T. danielii) : SEQ ID N°2

ATFEIVNRCSYTVWAAAS GDAALDAGGRQLNSGESVmNVEPGTNGGKÏWARTDCYFDDS GSGICKTGDCGGLLRCKRFGRPPTTLAEFSLNQYGKDYIDISNIKGFNVPMNFSPTTRGC RGVR CAADIVGQCPAKLKAPGGGCNDACTVFQTSEYCCTTGKCGPTEYSRFFKRLCPDAFSYVL DKP TTVTCPGSSNYRVTFCPTA

Protéinase K (Tritirachium Album) : SEQ ID N°3

QTNAPWGU\RISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQ VKTYYYSS RDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNC P KGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASD RY DRRSSFSNYGSVLDIFGPGTDIl^TWIGGS RSISGTSMATPHVAGL YLMTLGKTTAASACR YIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

Glyoxylate hydroxtypyruvate réductase (P. furiosus) : SEQ ID N°4

MKP VFITRAIPENGINMLEEEFEVEVWEEEREIPREKLLEKVKDVDALVTMLSERIDQEVFEN A PRLRÏVANYAVGYDNIDVEEATRRGIYVTNTPDVLTNATADHAFALLLATARHWKGDKF VRS GEWKRKGIAWHPKWFLGYELYGKTIGIVGFGRIGQAIARRAKGFNMRILYYSRTRKSQAE KEL GAEYRPLEEVLKESDFVILAVPLTKETMYMINEERLKLMKPTAILVNIARGKVVDTKALI KAL E GWIAGAGLDVFEEEPYYNEELFSLDNWLTPHIGSATFEAREAMAELVARIMLIAFKRGEI PPTLV N KEVIKIRKPG FIM EQ

Protéase 1 (P. horikoshii OT3) : SEQ ID N°5

MKVLFLTANEFEDVELIYPYHRLKEEGHEVYIASFERGTITGKHGYSVKVDLTFDKVNPE EFDAL

VLPGGRAPERVRLNEKAVSIARKMFSEGKPVASICHGPQILISAGVLRGRKGTSYPG IKDDMIN

AGVEWVDAEWVDGNWVSSRVPADLYAWMREFV LL

Pb6 protéine majoritaire de la queue du phage T5 : SEQ ID N°6

MSLQLLRNTRIFVSTV TGH taNTQEILVQDDISWGQDSNSTDITVNEAGPRPTRGSKRFN DSLNAAEWSFSTYILPYKDKNTSKQIVPDYMLWHALSSGRAINLEGTTGAHNNATNFMVN F DNSYHELAMLHIYILTDIOWSYIDSCQINQAEVNVDÏEDÏGRVTWSGNGNQLIPLDEQ PFDPD QIGIDDEPfMTIQGSYIKNKmLKIKDMDTNKSYDIPITGGTFTINNNrTYLTPNVMSRNm PIG SFTGAFELTGSLTAYLNDKSLGSMELYKDLIKTLKVVNRFEIALVLGGEYDDERPAAILV AKQAH NIPΉETDDVLGTSVEFKAIPSDLDAGDEGYLGFSSKYTR ^" ΓΠN LIVNGDGATDA\Π ^" AΓT KS AGN TτL RSATLQMSVE\Π ^" PSSARN E TWAITAGD Ή ATGLLRADASKTGA T EATA KDGSGVKGTKVITVTAGG

ANC80 Maiate Déhydrogénase (protéine synthétique) : SEQ ID N°7

MTKVSVVGAAGTVGAAAGYNLALRDIADELVFVDIPDQEDWIGQAADTNHGVAYDSNTTV R QGGYEDTAGSDVWITAGIPRQPGQTRIDLAGDNAPI EDIGSSLAEHNDDFVTITTSNPVDL LNRHLYETGDRAREKVIGFGGRLDSARFRYVLSQRFDAPVQNVEATILGEHGDAQVPVFS KVR VDGTDPEFSADEKEEILGDLQESAMDVIERKGATQWGPATGVAHMVEAVLHDTGEVLPGS W LDGEFGHEDTAFGVPVKLGSNGVEEWEWDLDDYEQDL DDAAEKLSDQYDKÏA

ANNEXE 2A

Annexe plaque « Quiagen »

ANNEXE 2A

ANNEXE 2A

Annexe laque « Hampton 2 »

ANNEXE 2A

Annexe la ue « Ham ton 2 »

ANNEXE 2A

ANNEXE 2A

Annexe la ue « Ham ton 3 »

ANNEXE 2A

Annexe plaque « Hampton 3 »

Annexe 2A

Annexe plaque « Hampton 4 »

Puit C u Tampon PH C U Précipitant

A01 0,1 M acide citrique 0,8 M sulfate d'ammonium

A02 0,1 M acide citrique S 0,8 M sulfate d'ammonium

A03 0,1 M MES 6 0,8 M sulfate d'ammonium

A04 0,1 M HEPES 7 0,8 M sulfate d'ammonium

A05 0,1 M TRIS 8 0,8 M sulfate d'ammonium

A06 0,1 M bïcîne 9 0,8 M sulfate d'ammonium

B01 0,1 M acide citrique 4 1,6 M sulfate d'ammonium

B02 0,1 M acide citrique 5 1,6 M sulfate d'ammonium

B03 0,1 M MES 6 1,6 M sulfate d'ammonium

B04 0,1 M HEPES 7 1,6 M sulfate d'ammonium

B05 0,1 M TRIS S 1,6 M sulfate d'ammonium

B06 0,1 M bîcine 9 1,6 M sulfate d'ammonium

COI 0,1 M acide citrique 4 M sulfate d'ammonium

C02 0,1 M acide citrique 5 2,4 M sulfate d'ammonium

C03 0,1 M MES 6 2,4 M sulfate d'ammonium

C04 0,1 M HEPES 7 2,4 M sulfate d'ammonium

C05 0,1 M TRIS 8 2,4 M sulfate d'ammonium

C06 0,1 M bicine 9 2f M sulfate d'ammonium

D01 0,1 M acide citrique 4 3 M sulfate d'ammonium

D02 0,1 M acide citrique 5 3 M sulfate d'ammonium

D03 0,1 M MES 6 3 M sulfate d'ammonium

D04 0,1 M HEPES 7 3 M sulfate d'ammonium

D05 0,1 M TRIS 8 3 M sulfate d'ammonium

D06 0,1 M bïcîne 9 3 M sulfate d'ammonium

EOl 4 1 M malonate

E02 4 1,5 M malonate

E03 ^r 1,9 M malonate

E04 4 2,4 M malonate

E05 4 ,9 M malonate

E06 4 3,4 M malonate

FOI 5 1 M malonate

F02 5 •t» _f 5 M malonate

F03 5 1,9 M malonate

F04 5 2,4 M malonate Annexe 2A

Annexe p aque « Hampton 4 »

F05 5 M malonate

F06 5 3,4 M malonate

G01 6 1 M malonate

G02 6 1,5 M malonate

G03 6 1,9 M malonate

G04 6 2,4 M malonate

G05 6 2,9 M malonate

G06 6 M malonate

H01 7 1 M malonate

H02 7 JL 5 M malonate

H03 7 1.9 M malonate

Annexe 2A

Annexe 2A

0

Annexe 2A Annexe 2A

Annexe plaque « Hampton 5 »

Wel! C u Sel C U ^' Fampon pH c U Précipitant

H04 0,1 M HEPES 7 65 %(v/v) 2-Methyl-2.4-pentanediol

H05 0,1 M TRIS 8 65 %(v/v) 2-Methyl-2,4-pentanediol

H06 0,1 M sicine 9 65 %(v/v) 2-Methyl-2,4-pentanediol

A07 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 4

A08 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 5

A09 1 M chlorure de lithium 0,1 M MES 6

A10 1 M chlorure de lithium 0,1 M HEPES 7

Ail 1 M chlorure de lithium 0,1 M TRIS 8

A12 1 M chlorure de lithium 0,1 M bicine 9

B07 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 4 10 %{w/v) PEG 6000

B08 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 5 10 %(w/v) PEG 6000

B09 1 M chlorure de lithium 0,1 M MES 6 10 %(w/v) PEG 6000

B O 1 M chlorure de lithium 0,1 M HEPES 7 10 %(w/v) PEG 6000

BU 1 M chlorure de lithium 0,1 M TRIS 8 10 %(w/v) PEG 6000

B12 1 M chlorure de lithium 0,1 M bicine 9 10 %(w/v) PEG 6000

C07 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 4 20 %(w/v) PEG 6000

C08 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 5 20 ⁰ /0(W/V) PEG 6000

C09 1 M chlorure de lithium 0,1 M MES 6 20 %(w/v) PEG 6000

CIO 1 M chlorure de lithium 0,1 M HEPES 7 20 %(w/v) PEG 6000

eu i M chlorure de lithium 0,1 M TRIS 8 20 %(w/v) PEG 6000

C12 1 M chlorure de lithium 0,1 M bicine 9 20 %(w/v) PEG 6000

D07 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 4 30 %(w/v) PEG 6000

D08 1 M chlorure de lithium 0,1 M acide citrique 5 30 %(w/v) PEG 6000

D09 1 M chlorure de lithium 0,1 M MES 6 30 %(w/v) PEG 6000

D10 1 M chlorure de lithium 0,1 M HEPES 7 30 %(w/v) PEG 6000

DU 1 M chlorure de lithium 0,1 M TRIS 8 30 %(w/v) PEG 6000

D12 1 M chlorure de lithium 0,1 M bicine 9 30 °/fl(w/v} PEG 6000

E07 0,1 M acide citrique 4 5 %(v/v) PEG MME 5000

E08 0,1 M acide citrique S 5 %(v/v) PEG MME 5000

E09 0,1 M MES É S i %fv/v) PEG MME 5000

E10 0,1 . M HEPES 1 S > %(v/v) PEG MME 5000 Annexe 2A

Annexe plaque « Hampton S »

EU 0,1 M TRIS 8 5 %(v/v) PEG MME 5000

E12 0,1 M bicine 9 5 °/ofv/v) PEG MME 5000

FÔ7 0,1 M acide citrique 4 10 %(v/v) PEG MME 5000

F08 0,1 M acide citrique 5 10 %(v/v) PEG MME 5000

F09 0,1 M MES 6 10 %fv/v) PEG MME 5000

F10 0,1 M HEPES 7 10 %(v/v) PEG MME 5000

Fil 0,1 M TRIS 8 10 %(v/v) PEG MME 5000

F12 0,1 M bicine 9 10 %(v/v) PEG MME 500Θ

G07 0,1 M acide citrique 4 15 %(v/v) PEG MME 5000

G08 0,1 M acide citrique 5 15 %[v/v) PEG MME 5000

G09 0,1 M MES 6 15 %(v/v) PEG MME 5000

G10 0,1 M HEPES 7 15 %{v/v) PEG MME 5000

Gll 0,1 M TRIS 8 15 %(v/v) PEG MME 5000

G12 0,1 M bicine 9 15 %(v/v) PEG MME 5000

H07 0,1 M acide citrique 4 20 %{v/v) PEG MME 5000

H08 0,1 M acide citrique 5 20 °/ofv/v) PEG MME 5000

H09 0,1 M MES 6 20 %(v/v) PEG MME 5000

H10 0,1 H HEPES 7 20 %(V/V) PEG MME 5000

Hll 0,1 M TRIS 8 20 %(v/v) PEG MME 5000

H12 0,1 M bicine 9 20 <¼>(v/v) PEG MME 5000

Annexe 2A

Annexe 2A

Annexe la ue « Ham ton 6 »

Annexe 2A

Annexe 2A

ANNEXE 2B

Annexe la ue : « The JC5G »

ANNEXE 2B

ANNEXE 2B

Annexe : Plaque « The PACT »

Puits ( j Sel C rampon pH C U Précipitant

A01 0,1 tampon SPG 4 25 %(w/y) PEG 1500

A02 0,1 tampon SPG 5 25 %{w/v) PEG 1500

A03 0,1 tampon SPG 6 25 °/ofw/v) PEG 1500

A04 0,1 tampon SPG 7 25 %(w/v) PEG 1500

A05 0,1 tampon SPG 8 25 %(w/v) PEG 1500

A06 0,1 tampon SPG 9 25 PEG 1500

A07 0,2 chlorure de sodium 0,1 acétate de sodium 5 20 %(w/v) PEG 6000

A08 0,2 chlorure d'ammonium 0,1 acétate de sodium 5 20 %fw/v) PEG 6000

A09 0,2 chlorure de lithium 0,1 acétate de sodium 5 20 %(w/v) PEG 6000

A10 0,2 chlorure de magnésium 0,1 acétate de sodium 5 20 °/o(w/v) PEG 6000

Ail 0,2 chlorure de calcium 0,1 acétate de sodium 5 20 %(w/v) PEG 6000

A12 0,01 chlorure de zinc 0,1 acétate de sodium 5 20 %(w/v) PEG 6000

B01 0,1 tampon IB 4 25 %(w/v) PEG 1500

B02 0,1 tampon MIB 5 25 °/a(w/v) PEG 1500

B03 0,1 tampon MIB 6 25 %{w/v) PEG 1500

B04 0,1 tampon MIB 7 25 %(w/v) PEG 1500

B05 0,1 tampon MIB 8 25 %tw/v) PEG 1500

B06 0,1 tampon MIB 9 25 %(w/v) PEG 1500

B07 0,2 chlorure de sodium 0,1 MES 6 20 %(w/v) PEG 6000

B08 0,2 chlorure d'ammonium 0,1 MES 6 20 %(w/v) PEG 6000

B09 0,2 chlorure de lithium 0,1 MES 6 20 %(w/v) PEG 6000

B10 0,2 chlorure de magnésium 0,1 MES 6 20 %(w/v) PEG 6000

Bll 0,2 chlorure de calcium 0,1 MES 6 20 °/o(w/v) PEG 6000

B12 0,01 chlorure de zinc 0,1 MES 6 20 °/o(w/v) PEG 6000

COI 0,1 tampon PCB 4 25 %(w/v) PEG 1500

C02 0,1 tampon PCB 5 25 %(w/v) PEG 1500

C03 0,1 tampon PCB 6 25 %(w/v) PEG 1500

C04 0,1 tampon PCB 7 25 %fw/v) PEG 1500

C05 0,1 tampon PCB 8 25 %(w/v) PEG 1500

C06 0,1 tampon PCB 9 25 %(w/v) PEG 1500

C07 0,2 chlorure de sodium 0,1 HEPES 7 20 %(w/v) PEG 6000

C08 0,2 chlorure d'ammonium 0,1 HEPES 7 20 ¾(W/V) PEG 6000

C09 0,2 chlorure de lithium 0,1 HEPES 7 20 %(w/v) PEG 6000

CIO 0,2 chlorure de magnésium o,i HEPES 7 20 %(w/v) PEG 6000

Cil 0,2 chlorure de calcium 0,1 HEPES 7 20 %(w/v) PEG 6000

C12 0,01 chlorure de zinc 0,1 HEPES 7 20 °/o(w/v) PEG 6000

D01 0,1 tampon MMT 4 25 %fw/v) PEG 1500

D02 0,1 tampon MMT 5 25 %(w/v) PEG 1500

D03 0,1 tampon MMT 6 25 %fw/vl PEG 1500

D04 0,1 tampon MMT 7 25 %(w/v) PEG 1500

D05 0,1 tampon MMT 8 25 °/o(w/v) PEG 1500

D06 0,1 tampon MMT S 25 %(w/v) PEG 1500

D07 o,; chlorure de sodium 0,3 TRIS E 2C 1 %(w/v) PEG 6000

DOS o,: chlorure d'ammonium 0,1 TRIS 8 2(1 1 %(w/v) PEG 6000

D09 o,; chlorure de lithium 0,1 TRIS G l 2C 1 %(w/v) PEG 6000 ANNEXE 2B

Annexe : Plaque « The PACT »

Puits C J Sel C u Tampon pH C J Précipitant

D10 0,2 chlorure de magnésium 0,1 FRIS 8 20 %(w/v) PEG 6000

DU 0,2 chlorure de calcium 0,1 TRIS 8 20 %(w/v) PEG 6000

D12 0,01 chlorure de zinc 0,1 TRIS 8 20 %(w/v) PEG 6000

EOl 0,2 Fluorure de sodium 20 %fw/v) PEG 3350

E02 0,2 bromure de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E03 0,2 iodure de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E04 0,2 thiocyanate de potassium 20 °/o(w/v) PEG 3350

E05 0,2 nitrate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E06 0,2 formiate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E07 0,2 acétate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E08 0,2 sulfate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E09 0,2 potassium / tartrate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E10 0,2 sodium / phosphate de potassium 20 %(w/v) PEG 3350

Eli 0,2 citrate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E12 0,2 sodium malonate 20 (w/v) PEG 3350

FOI 0,2 fluorure de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F02 0,2 bromure de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F03 0,2 iodure de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %{w/v) PEG 3350

F04 0,2 thiocyanate de potassium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %fw/v) PEG 3350

F05 0,2 nitrate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F06 0,2 formiate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F07 0,2 acétate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F08 0,2 sulfate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F09 0,2 potassium / tartrate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F10 0,2 sodium / phosphate de potassium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

Fil 0,2 citrate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 %(w/v) PEG 3350

F12 0,2 malonate de sodium 0,1 bis-tris propane 6,5 20 ^D /ofw/v) PEG 3350

G01 0,2 fluorure de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(W/V) PEG 3350

G02 0,2 bromure de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(w/v) PEG 3350

G03 0,2 iodure de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(w/v) PEG 3350

G04 0,2 thiocyanate de potassium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %fw/v) PEG 3350

G05 0,2 nitrate de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %{w/v) PEG 3350

G06 0,2 formiate de sodium 0,1 bîs-tris propane 7,5 20 °/o( /v) PEG 3350

G07 0,2 acétate de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(w/v) PEG 3350

G08 0,2 sulfate de sodium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 °/o{w/v) PEG 3350

G09 0,2 potassium/sodium tartarte 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(w/v) PEG 3350

G10 0,2 sodium / phosphate de potassium 0,1 bis-tris propane 7,5 20 %(W/V) PEG 3350

Gll o,; citrate de sodium 0,1 bîs-tris propane 7,5 20 %(w/v) PEG 3350

G12 o,: malonate de sodium 0,1 bis- tris propane 7,5 20 %( /v) PEG 3350 ANNEXE 2B

Annexe ; Plaque « 1 ^" he PACT »

H01 0,2 fluorure de sodium 0,1 bis-tris propane 8,S 20 %fw/v) PEG 3350

HÛ2 0,2 bromure de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %fw/v) PEG 3350

H03 0,2 iodure de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

H04 0,2 thiocyanate de potassium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %fw/v) PEG 3350

H05 0,2 nitrate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

H06 0,2 formiate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

H07 0,2 acétate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %fw/v) PEG 3350

H08 0,2 sulfate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %( /v) PEG 3350

H09 0,2 potassium / tartrate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %{w/v) PEG 3350

H10 0,2 sodium / phosphate de potassium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

Hll 0,2 citrate de sodium 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

H12 0,2 sodium tnalonate 0,1 bis-tris propane 8,5 20 %(w/v) PEG 3350

ANNEXE 2B

ANNEXE 2B

ANNEXE 2B

Annexe : Plaque « Ciassic suite » Quiagen

ANNEXE 2B

Annexe : Plaque « Classic suite » Quiagen

ANNEXE 2B

Annexe plaque : « The PEGs »

Puits C u Sel c u Tampon PH C U Précipitant

AOl 0 0 O _r l M acétate de sodium 4,6 40 %(v/v) PEG 200

A02 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 30 %(v/v) PEG 300

A03 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 30 %fv/v) PEG 400

A04 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %fv/v) PEG 550 MME

A05 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %fw/v) PEG 1000

A06 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %(w/v) PEG 2000 MME

A07 0 0 0,1 M MES 6,5 40 %(v/v) PEG 200

A08 0 0 0,1 M MES 6,5 30 %(v/v) PEG 300

A09 0 0 0,1 M MES 6,5 30 %(v/v) PEG 400

A10 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %(v/v) PEG 550 MME

Ail 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %fw/v) PEG 1000

A12 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %fw/v) PEG 2000 MME

BOl 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 40 Vo(vM PEG 200

B02 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 30 %(V/V) PEG 300

B03 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 30 %(v/v PEG 400

B04 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(v/v) PEG 550 MME

B05 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(w/v) PEG 1000

B06 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(W/V) PEG 2000 MME

B07 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 40 %(v/v) PEG 200

B08 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 30 %(v/v) PEG 300

B09 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 30 %(v/v PEG 400

B10 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 °/o(v/v) PEG 550 MME

Bll 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 %(w/v) PEG 1000

B12 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 %Cw/v) PEG 2000 MME

COI 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %(w/v) PEG 3000

C02 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %fw/v) PEG 4000

C03 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 o/ofw/v) PEG 6000

C04 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 25 %fw/v) PEG 8000

C05 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 20 %fw/v) PEG 10000

C06 0 0 0,1 M acétate de sodium 4,6 15 %(wM PEG 20000

C07 0 0 0,1 M MES 6,5 25 °/o(w/v) PEG 3000

C08 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %{w/v) PEG 4000

C09 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %(w/v) PEG 6000

CIO 0 0 0,1 M MES 6,5 25 %fw/v) PEG 8000

Cil 0 0 0,1 M MES 6,5 20 %(w/v) PEG 10000

C12 0 0 0,1 M MES 6,5 15 (w/v) PEG 20000

D01 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(w/v) PEG 3000

D02 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %fw/v) PEG 4000

D03 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(w/v) PEG 6000

D04 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 25 %(w/v) PEG 8000

D05 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 20 %fw/v) PEG 10000

D06 0 0 0,1 M Sel de sodium d'HEPES 7,5 15 %(w/v) PEG 20000

D07 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 %(w/v) PEG 3000

D08 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 %(w/v) PEG 4000

D09 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 25 %(w/v) PEG 6000 ANNEXE 2B

Annexe plaque ; « T e F >EGs »

Puits i C u Sel C U Tampon pH C L) Précipitant

D10 0 0 0,1 M Î IS HCI 8,5 25 %fw/v) PEG 8000

DU 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 20 %(w/v) PEG 10000

D12 0 0 0,1 M TRIS HCI 8,5 15 %(w/v) PEG 20000

E01 0,2 M Fluorure de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E02 0,2 M fluorure de potassium 20 %(W/V) PEG 3350

E03 0,2 M fluorure d'ammonium 20 %(w/v) PEG 3350

E04 0,2 M chlorure de lithium 20 %(w/v) PEG 3350

E05 0,2 M chlorure de magnésium 20 %(w/v) PEG 3350

E06 0,2 M chlorure de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

E07 0,2 M chlorure de calcium 20 %(w/v) PEG 3350

E08 0,2 M chlorure de potassium 20 PEG 3350

E09 0,2 M chlorure d'ammonium 20 %(w/v) PEG 3350

E10 0,2 M iodure de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

EU 0,2 M Iodure de potassium 20 %{w/v) PEG 3350

E12 0,2 M iodure d'ammonium 20 %(w/v) PEG 3350

FOI 0,2 M thiocyanate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

F02 0,2 M thiocyanate de potassium 20 %(w/v) PEG 3350

F03 0,2 M nitrate de lithium 20 %(w/v) PEG 3350

F04 0,2 M nitrate de magnésium 20 %(w/v) PEG 3350

F05 0,2 M nitrate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

F06 0,2 M nitrate de potassium 20 %(w/v) PEG 3350

F07 0,2 M nitrate d'ammonium 20 %(w/v) PEG 3350

F08 0,2 M formiate de magnésium 20 (w/v) PEG 3350

F09 0,2 M formiate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

F10 0,2 M formiate de potassium 20 %(w/v) PEG 3350

Fil 0,2 M formiate d'ammonium 20 %(w/v) PEG 3350

F12 0,2 M acétate de lithium 20 %(w/v) PEG 3350

G01 0,2 M magnésium acétate 20 %(w/v) PEG 3350

G02 0,2 M zinc acétate 20 %(w/v) PEG 3350

G03 0,2 M acétate de sodium 20 %(w/v) PEG 3350

G04 0,2 M acétate de calcium 20 %(w/v) PEG 3350

G05 0,2 M acétate de potassium 20 %(w/v) PEG 3350

G06 0,2 . M acétate d'ammonium 20 °/o(w/v) PEG 3350

G07 0,2 . M Sulfate de lithium 2G %(w/v) PEG 3350

G08 0,2 » M Sulfate de magnésium 2tl %(w/v) PEG 3350

G09 0,3 1 M sulfate de sodium 2C %fw/v) PEG 3350

G10 o,; l M sulfate de potassium 2C %(w/v) PEG 3350 ANNEXE 2B

ANNEXE 2B

Annexe plaque « Wiiard I et II de Rigaku »

ANNEXE 2B

Annexe plaque « Wizard I et II de Rigaku »

ANNEXE 2B

Annexe plaque « Wizard î et lî de Rigaku »

ANNEXE 2B

Annexe plaque « Wirard I et ÏI de Rigaku »

ANNEXE 2B

ANNEXE 2B

ANNEXE 2B