Laser-Scanning-Mikroskop

Bei einigen Applikationen der Laser-Scanning-Mikroskopie ist es erforderlich, mit sehr hohen Scangeschwindigkeiten zu arbeiten, um schnell ablaufende Vorgänge zu erfassen, wie beispielsweise in der Physiologie bei der Beobachtung extrem schneller

Vorgänge.

Ein LSM gliedert sich im wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt in 4 Module: Lichtquelle,

Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen.

Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der

Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt.

Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser).

Die Vereinigung unterschiedlicher Wellenlängen im Lichtquellenmodul erfolgt wie in

Fig.1 im Lichtquellenmodul rechts dargestellt über Strahlteiler bzw. Spiegel.

Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die

Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto- optischen Kristalls (AOTF) .

Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete

Spiegelanordnung in das Scanmodul.

Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die

Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen Sekunden.

Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen

Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht.

Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet.

Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen. Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).

In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).

Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.

In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit dem Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt

nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilem (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x). Das LSM LIVE der Carl Zeiss Microlmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde (http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents- Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).

Unterschiedliche diskrete Laserwellenlängen werden über einen durchstimmbaren

AOTF in einem Strahlengang vereinigt.

Das können Laser L1 sein die mehrere Wellenlängen ausstrahlen und

Einzelwellenlängenlaser L2, L3.

Laser mit mehreren Wellenlängen werden vorteilhaft unter der nullten

Beugungsordnung in den AOTF eingestrahlt und weitere Laser beispielsweise unter der +/- ersten Beugungsordnung.

Es können auch mehrere Laser unter unterschiedlichen Winkeln eingestrahlt werden, hierzu wird die Frequenz der akustischen Welle des AOTF entsprechend angepasst. Es besteht folgender Zusammenhang zwischen dem Beugungswinkel zwischen gebeugter und ungebeugter Strahlung (Theta), der Wellenlänge (lambda) und der Frequenz der akustischen Wellen (F):

Theta = lambda * F / v

wobei v die Geschwindigkeit der akustischen Welle im Kristall ist.

Nimmt man typische Werte v=4000 m/s und F=IOOMHz an, dann ergeben sich folgende

Winkel für folgende Wellenlängen:

Die Winkelaufspaltung (theta) bei konstanter Frequenz (F) ist somit sehr klein. Die Aufspaltung kann zusätzlich noch erhöht werden, indem der akustooptische Kristall mit verschiedenen Frequenzen (F) betrieben wird. Diese Frequenzen können zusätzlich auch parallel in den Kristall eingespeist werden.

Bisherige Lasermodule ( siehe oben) wiesen zwar bereits AOTF zum schnellen wellenlängenabhängigen Strahlschalten bzw. Abschwächen ( DE 19829981 A1 ) auf, neu und vorteilhaft ist hier die Verwendung zur variablen und flexiblen Kombination unterschiedlicher Lichtquellen.

Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung eines Prismas P (oder Spiegelelements oder anderes Umlenkelements), das für den Multilinelaser L1 durchlässig ist, und durch das mehrere Lichtstrahlen L2.L3 so umgelenkt werden, dass sie für die relativ kleinen

Einfallswinkel des AOTF (z.B. bei Verwendung einer konstanten Frequenz (F)) geeignet sind.

Dieses Prisma P oder Spiegelelement kann vorteilhaft drehbar zur Einstellung des

Einfallswinkels oder verschiebbar zur Einstellung des Auftrefffortes angeordnet werden.

Wie im Stand der Technik ist eine Koppelstelle zu einem Mikroskop , hier beispielsweise zwei Ports für zwei Scanmodule eines LSM vorgesehen.

Die Einkopplung in Lichtleitfasern F erfolgt im Stand der Technik beispielsweise über

Kollimatoroptiken KO

Vorteilhaft kann am Ausgang des AOTF zur Weiterleitung der Strahlung in Richtung des Mikroskops eine Faser fest angekoppelt sein ( Vorjustierung des Kristalls zur Faser).