本发明涉及药物化学领域， 尤其是薰草菌素 A衍生物及其制备方法与应 用。

背景技术

薫草菌素 A ( Lavendustin A)是从链霉属的 gr i seolavendus菌的代谢 产物中分离得到的化合物， 对蛋白酪氨酸激酶具有较强的抑制活性。 而蛋白 酪氨酸激酶在控制肿瘤细胞增殖、 分化及死亡中扮演着重要角色， 近年来广 泛地被作为抗肿瘤药物的靶点， 小分子的蛋白酪氨酸激醇抑制剂已成为抗肿 瘤研究领域的重要课题之一。 薰草菌素 A作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的抑制 活性

薰草菌素 A 薰草菌素 B

可见二者之间不同之处在于 A环上酚羟基氢的给体能力差异， 给体能力 越强， 活性越强。

薰草菌素 A被报道是与受体型蛋白酪氨酸激酶类型中表� �生长因子受体 ( EGFR )相互作用， 进而抑制 EGFR的自身磷酸化， 发挥抗肿瘤作用。 为了寻 找活性比 f草菌素 A更强的蛋白酪氨酸激酶抑制剂， 学者们已围绕薰草菌素 A作了一些修饰和衍生化工作， 主要是对其 A环结构以及 C环结构进行改造， 并获得部分活性较好的化合物， 所涉及到得专利包括 Di subs t i tuted lavendustin A analogs and pharmaceutical composition comprising the analogs (专利号为 US 6943191 Bl) ^ Pharmaceutical compositions of Lavendustin (专利号为 US 2008/0242686 Al) , 而到目前为止， 未见对薰草 菌素 A中 B环进行改造的相关报道。 恶性肿瘤细胞从原发部位直接侵入周围组织或 者进入循环系统进行转 移。 肿瘤的转移是决定肿瘤患者存活的关键因素。 这种转移主要通过人体自 身的脉管系统： 血管 （血道转移）和淋巴管 （淋巴道转移） 来实现的。 肿瘤 细胞具有诱导血管和淋巴管新生的能力，这种 能力是通过 VEGF家族成员来起 作用的。 VEGF家族包括 VEGF ( VEGFA )、 VEGFB, VEGFC、 VEGFD及胎盘生长因 子（P IGF )。 这些内皮细胞生长因子能够激活内皮细胞上的 VEGFR家族， 并且 启动与内皮细胞增殖、 迁移相关的细胞信号转导通路。 目前对于肿瘤血管新 生的研究已经有了极大的进展。 肿瘤在生长到一定大小的时候， 缺氧的环境 和对营养的需求刺激肺瘤细胞分泌血管生长因 子 VEGF和 VEGFB, 从而诱导血 管往肿瘤方向发生， 为肿瘤提供氧气和营养， 同时也为肿瘤细胞的转移提供 重要的途径。 对于淋巴管新生的研究在近年来也取得很大的 突破。 VEGFR3/FLT-4被发现与淋巴管的发生有关。 通过动物模型获得到的实验结果 发现， 肿瘤诱导的淋巴管新生是通过分泌 VEGFC或者 VEGFD , 特异性地结合 并激活 VEGFR3来实现的。 淋巴管新生与肿瘤淋巴转移息息相关。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供薰草菌素 A衍生物。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述 薰草菌素 A衍生物的制备 方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述 薰草菌素 A衍生物的应 用。

为解决上述技术问题， 本发明的技术方案是：

薰草菌素 A衍生物， 为通式 I化合物、通式 I化合物药学上可接受的盐， 通式 I化合物加入助 液或化合物前体， 通式 I的化学结构如下：

其中， 式 I中 R为烷基、 醚基、 羰基、 对甲苯基、 五元杂环或五元取代 杂环、 六元杂环或六元取代杂环， 所述化合物前体是指当病人用适当的方法 服用后， 化合物在病人体内进行代谢或化学反应而转变 成通式 I化合物、 通 式 I化合物药学上可接受的盐或通式 I化合物加入助溶剂的溶液。

优选的， 上述薰草菌素 A衍生物， 所述式 I中 R为烷基、 酸基、 羰基、 对曱苯基、 五元杂环或五元取代杂环、 六元杂环或六元取代杂环。

优选的， 上述薰草菌素 A衍生物， 所述式 I中 R为环己基氧基、 4-氨基 嘧啶基、 2 -氧代 -3-吡啶曱基、 3-吡啶曱基、 5 -嘧啶基、 5-噻唑基、 2-曱基 -3- 羟基- 4-吡啶基、 3 -吡啶基、 3_[(1-氨基曱酰基- 2-氧代）吡咯基、 2- (5-甲基 呋喃）基、 4 -曱基苯基、 2-呋喃基、 2-曱基 -5-吡啶基和 3_羟基- 4-吡啶基。

上述薰草菌素 A衍生物，是由以下方法得到的：针对 VEGFR3为靶点采用 计算机药物虚拟筛选技术而设计出薰草菌素 A衍生物， 具体为通过巨大的碎 片库运用电子等排原理设计出大量薰草菌素 A衍生物， 依据被置换基团的相 似程度进行排序， 留取前 99个被改造的薰草菌素 A衍生物， 随后与参考化合 物薰草菌素 A—道用怏速刚性构象穷举对接程序 （Fast Rigid Exhaustive Docking)对接到靶标蛋白 VEGFR3酪氨酸激酶域的活性位点， 并对化合物与 VEGFR3间的相互作用程度进行评价， 作用越强， Total Score绝对值越大， 最终筛选出 14个化合物， 其活性优于薰草菌素 A， 依次被命名为 HQ_001、 HQ— 002、 HQ— 003、 HQ— 004、 HQ— 005、 HQ— 006、 HQ— 007、 HQ— 008、 HQ— 009、 HQ— 010, HQ 011、 HQ— 012、 HQ_013、 HQ— 014, 化学结构见表 1。

优选的， 上述薰草菌素 A衍生物， 是由以下方法得到的：

(1 )碎片库的准备

将 FDA批准上市的一千多个小分子药物， 裁成具有不同体积形状、 不同 大小、 具有不同酯 /水分配系数、 不同荷电性质的碎片约 300000个。

(2)薰草菌素 A类似物的设计、 虛拟 选与评价

以背景技术中薰草菌素 A为参考化合物， 初步选取 B环部分， 运用电子 等排原理（bioisosteric search)， 用碎片库中的碎片进行置换改造， 设计出 新的薰草菌素 A类似物； 再依据与被置换基团的相似程度排序， 共留取前 99 个被改造的新化合物， 与参考化合物薰草菌素 A—起， 采用快速刚性构象穷 举对接程序 ( Fast Rigid Exhaustive Docking )对接 ( docking )到革巴标蛋 白 VEGFR3的酸氨酸激醃域 ( tyrosine kinase domain) 的活性位点 ( active site), 并对化合物与 VEGFR3间的相互作用程度进行评价， 作用越强， Total Score绝对值越大； 根据排列顺序利用电子等排原理改造设计所获 得的 99个 新化合物中， 筛选出 14个活性优于薰草菌素 A的化合物， 该新化合物依次被 命名为 HQ—001 , HQ— 002 HQ— 014， 化学结构见表 1。

表 1

5- [ (2， 5-二羟基苯甲基 )- (3-吡 啶乙基)] 氨基 -2-羟基苯甲酸

5- [(2, 5-二羟基苯甲基）-(5-嘧

HQ— 005 -92.74 -93.35 18.50 -17.41 -0.48 啶甲基)] 氨基 -2-羟基苯甲酸

5- [(2, 5-二羟基苯甲基 )-(5-噻

HQ— 006 -92.09 -93.70 11.90 -9.73 -0.57 唑甲基)] 氨基 -2-羟基苯甲酸

5- [(2， 5-二羟基苯甲基 )-(2-甲 基 -3-羟基 -4-吡啶甲基)氨

HQ— 007 -91.99 -15.04 -0.19 基] -2-羟基苯甲酸

■。入。

5- [(2， 5-二羟基苯甲基 )-(3-吡

HQ— 008 -91.69 -92.62 17.31 -15.83 -0.56 啶甲基） 氨基] -2-羟基苯甲酸

5-[(2, 5-二羟基苯甲基）-(2-甲 基 -5-吡啶甲基） 氨基] -2-羟基

HQ— 013 -90.32 -93.64 13.31 -9.56 -0.43 苯甲酸

5- [(2, 5-二羟基苯甲基 )-(3-羟 基 -4-吡啶曱基） 氨基] -2-羟基

HQ— 014 -90.28 -86.64 20.05 -21.80 -1.88

5- [[(2, 5-二羟苯基）甲基] [(2 - 羟基苯基）甲基]氨基] -2-羟基苯 薰草菌素 A -90.21 -87.80 14.66 -15.44 -1.63 甲酸 上述表 1中筛选出的 14个活性优于薰草菌素 A的化合物 （薰草菌素 A 衍生物） 的制备方法， 具体步骤为：

(A1 )每 5克 2 -羟基 _5 -硝基苯甲酸（ ）， 40毫升丙酮， 1亳升

.氟乙酸， 回流 2小时， TLC检测反应完全， 减压除去丙酮， 柱层析， 制得 ο ο

、、

( Α2 )每 2克 ¾， 50毫升乙醇， 500毫克 10%的 Pd/C, latra氢化

室温搅拌 2小时， TLC检测反应完全， 原料消失， 过滤， 浓缩制得

( A3 )每 2克 ， 0.8克二环己基碳二亚胺， 1.1克 1-羟基苯并三 氮唑， 50亳升二氯甲烷， 室温搅拌 12小时， TLC检测反应完全， 减压除去溶

剂， 柱层析， 制得

4 )每 1克 1. ² 克 NaBH ₄ - A1C1 ₃ , ：30毫升无水四氢呋 喃， 回流搅拌 2小时， TLC检测反应完全， 减压除去四氢呋喃， 残余物水洗， 二氯甲烷萃取， 浓缩，

5)每 500毫克 , 470毫克 3, 5 二羟基苯甲醛， 380毫 克氰基硼氢化钠， 30毫升甲醇， 回流 2小时， TLC检测反应完全， 加水淬灭

反应， 减压除去甲醇， 二

fi

(Α6)每 200毫克 , 含 100毫克氢氧化钠的 30毫升甲 醇溶液， 回流搅拌 2小时， TLC检测原料小时，反应完全， 2N盐酸调 PH为 5, 加压除去甲醇， 加入水， 二氯曱烷萃取， 浓缩得到 5- [[(2， 5-二羟基苯基）曱

基] [(环己基氧）曱基]氛基 ] -2-羟基苯曱酸， 即 ( Bl )每 2克 5-氨基水杨酸（ ), 1. 8克 2， 5 -二羟基苯甲醛，

2. 1克！^硼氢化钠， 80毫升甲醇， 回流 2小时， TLC检测反应完全， 加入

20毫升饱和氯化铵溶液， 减压除去曱醇， 残余物水洗， 二氯曱烷萃取， 浓缩,

柱层析，

( B2 )每 1克 , 1. 6克 4- Boc氨基- 5-嘧啶甲醛， 1. 2克氰基 硼氢化钠， 50毫升曱醇， 回流 2小时加入 50毫升饱和氯化铵溶液， 减压除

去曱醇， 二氯甲烷萃

( B3 )每 500毫克 , 30毫升二氯甲烷， 1毫升三氟乙酸, 室温搅拌 10小时， TLC检测反应完全， 減压除去二氯甲烷， 饱和碳酸氢钠调 PH为 7 , 柱层析， 制得 5_ [ [ (2, 5-二羟基苯基）曱基] [5- ( ⁴ _ 嘧啶）曱基

氨基] -2-羟基苯 或

( C )每 1克 , 2克 3-吡啶基 _2-氧代-丙醛， 600毫克氰基硼 氢化钠， 50毫升曱醇， 回流 2小时， 加入 50毫升饱和氯化铵溶液， 减压除 去曱醇， 萃取， 浓缩， 柱层析， 制得 5- [ (2, 5 -二羟基苯甲基） （2 -氧代 _3 -吡

啶乙基） ] 氨基 - ² _羟基苯甲酸， 即

( D )每 1克 , 600毫克 3 -吡啶乙醛， 480毫克氰基硼氢化钠,

40毫升甲醇，回流 2小时， TLC监测反应完全，加入 50毫升饱和氯化铵溶液, 减压除去甲醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基 ) - (3-吡啶 乙基)] 氨基- 2-羟基苯曱酸， 即

( E )每 1 , 600毫克 5 -嘧啶甲醛， 480毫克氰基硼氢化钠, 40毫升甲醇，回流 I小时， TLC监测反应完全，加入 50毫升饱和氯化铵溶液, 减压除去甲醇， 二氯曱烷萃取， 浓缩制得 5- [(2， 5-二羟基苯曱基 )-(5-嘧啶

甲基）] 羟基苯曱酸， 即

， 600毫克 5 塞唑甲醛， 480毫克氰基硼氢化钠, 40毫升甲醇，回流 2小时， TLC监测反应完全，加入 50毫升饱和氯化铵溶液, 減压除去甲醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [(2, 5-二羟基苯曱基 )-(5-噻唑 曱基）] 氨基 -2-羟基苯曱酸， 即 或

( G )每 1 , 600毫克 2_甲基- 3-羟基- 4 -吡啶曱醛， 480 毫克氰基硼氢化钠， 40毫升甲醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加入 50 毫升饱和氯化铵溶液， 减压除去甲醇， 二氯曱烷萃取， 浓缩制得 5- [ (2, 5-二 羟基苯甲基) - (2-甲基- 3-羟基- 4-吡啶曱基)氨基] -2-羟基苯甲酸， 即

, 600毫克 3 -吡啶曱醛， 480毫克氰基硼氢化钠,

40毫升甲醇，回流 2小时， TLC监测反应完全，加入 50毫升饱和氯化铵溶液, 减压除去甲醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基 ) - (3-吡啶 曱基） 氨基] -2-羟基苯曱酸， 即

( I )每 1克 ， 600毫克 1-氨基曱酰基- 2-氧代- 3 -吡咯甲醛， 480毫克氰基硼氢化钠， 40毫升曱醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加 入 50毫升饱和氯化铵溶液，减压除去甲醇，二氯� ��烷萃取，浓缩制得 5- [ (2, 5- 二羟基苯甲基) - [ 3- [ a- 甲酰基 -2-氧代)吡咯甲基）] 氨基] -2-羟基苯甲

酸， 或

( J )每 1克 , 600毫克 5-甲基呋喃甲醛， 480毫克氰基硼氢 化钠， 40毫升甲醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加入 50毫升饱和氯化 铵溶液， 减压除去甲醇， 二氯曱烷萃取， 浓缩制得 5- [ (2, 5-二羟基苯曱 (5-曱基呋喃）甲基]] 氨基 -2-羟基苯甲酸

U)每 1克 , 600毫克对曱基苯甲醛， 480毫克氰基硼氢化 钠， 40毫升曱醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加入 50毫升饱和氯化铵 溶液，减压除去曱醇，二氯甲烷萃取， 浓 - [(2, 5-二羟基苯甲基 )-(4-

曱基苯甲基） 氨基] -2-羟基苯曱酸， 即 或

( L )每 1克 , 600毫克 2 -呋喃曱醛， 480毫克氰基硼氢化钠,

40毫升甲醇，回流 2小时， TLC监测反应完全，加入 50毫升饱和氯化铵溶液, 减压除去甲醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [(2, 5-二羟基苯甲基 )-(2-呋喃 曱基） tt] -2-羟基苯曱酸， 即

(M)每 1 , 600毫克 2_甲基- 5-吡啶甲醛， 480毫克氰基 硼氢化钠， 40毫升甲醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加入 50毫升饱和 氯化铵溶液， 减压除去曱醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [(2， 5-二羟基苯曱

基） -(2-曱基- 5-吡啶甲基） 氨基] -2-羟基苯甲酸， 即

或

(N)每 1克 , 600毫克 2_甲基- 5-吡啶甲醛， 480毫克氰基 硼氢化钠， 40毫升甲醇， 回流 2小时， TLC监测反应完全， 加入 50毫升饱和 氯化铵溶液， 减压除去曱醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得 5- [(2， 5-二羟基苯甲 基) -（3-羟基- 4 -吡啶曱基） 氨基 ] _2-羟基苯甲酸， 即 上述薰草菌素 A衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物方面的应� �。

优选的， 上述薰草菌素 A衍生物的应用， 所述肿瘤为淋巴瘤、 肺癌、 肝 癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 胃癌、 大肠癌、 结肠癌、 黑色素瘤或头颈部癌。

优选的， 上述薰草菌素 A衍生物的应用， 所述肿瘤为淋巴瘤或肺癌。 优选的， 上述薰草菌素 A衍生物的应用， 所述肿瘤为淋巴瘤。

本发明的有益效果是：

上述薰草菌素 A衍生物， 通过体外细胞水平实验发现， 具有显著性抑制 人淋巴内皮细胞 ( HLEC ) 和稳定高表达 VEGFD的 LL/2 Lewi s肺癌细胞株 ( VEGF-D-LL/2 )增殖的作用， 并诱导 HLEC细胞凋亡， 抑制 HLEC细胞成管能 力， 作用机制研究发现该薰草菌素 A衍生物具有更强地抑制肿瘤细胞 VEGFD 的表达以及 A T和 ERK磷酸化水平， 同时更强地抑制 HLEC细胞 VEGF 3的表 达， 斑马直模型也显示新型薰草菌素 A类似物具有更强地抑制血管生成的作 用； 其制备方法筒单， 工艺条件温和， 适合规模化工业生产的应用； 可广泛 用于肿瘤淋巴转移的治疗， 为抗肿瘤药物的开发提供了一种新的选择。

附图说明

图 1-14是实施例 1-14分别对应的反应方程式；

图 15是 HQ— 001与 VEGFR3的作用模式图。 （a) : VEGFR3用 so l id r ibbon 表示， 并根据其 Secondary Type着色； HQ—001用 CPK模型表示， 其中绿色 为碳原子， 红色为氧原子； （b) : HQ_ 001用球棍模型表示， 其中绿色为碳原 子， 红色为氧原子； 除极性氢（白色）外， 其余氢原子没有显示； VEGFR3酪 氨酸激酶域活性位点的氨基酸残基， 用棒状表示， 并根据残基着色。 化合物 HQ _ 001与活性位点残基间所形成的氢键用虛线标示 ；

图 I ⁶ 是 HQ— 001诱导人淋巴内皮细胞（HLEC )凋亡（P I染色） ： a.正常 HLEC细胞； b. 0. 5uM HQ_ 001诱导 HLEC细胞发生凋亡现象；

图 17是 HQ_ 001诱导人淋巴内皮细胞（ HLEC ) 凋亡作用的时间依赖关系 ( Hoechst 33258染色）： A.作用 Oh; B.作用 2h; C. 作用 4h; D. 作用 8h; E. 作用 12h; F. 作用 24h;

图 18是 HQ-001抑制人淋巴内皮细胞（HLEC) 的成管能力： a.未经处理 的 HLEC细胞在 matrigel表面 6h的成管结果； b. HLEC与 0.5uM HQ— 001共培 养 6h后在 matrigel表面的成管结果； c. 未经处理的 HLEC细胞在明胶表面 培养 6h的形态； d. HLEC与 0.5uM HQ_001共培养 6h后在明胶表面的形态； 图 19是 HQ_ 001抑制肿瘤细胞分泌 VEGFD及其作用机制；

图 20是 HQ_001抑制 HLEC细胞 VEGFR3的表达及其作用机制；

图 21是 HQ_001抑制斑马鱼节间血管的生成。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作 进一步的说明。

下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 下述实施例 中所用的试验材料， 如无特珠说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的； 下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值； 以下实施例 中的％, 如无特别说明， 均为质量百分含量。

实施例 1

如图 1所示， 制备方法如下：

( 1 ) 100毫升反应瓶中加入 5克 2-羟基- 5-硝基苯曱酸 (化合物 1) , 40 毫升丙酮， 1毫升三氟乙酸， 回流 2小时， TLC检测反应完全，减压除去丙酮， 柱层析，制得无色油状液体化合物 2即 6-硝基苯并 [d] [1, 3] -2, 2-二甲基 -4- 氧代- 1， 3-二氧六环， 重 3.7克。 LC-ESI-MS (M+H+)： 224.12;

(2 ) 100毫升反应瓶中加入 2克化合物 2, 50毫升乙醇， 500毫克 10% 的 Pd/C, latm氢化室温搅拌 2小时， TLC检测反应完全， 原料消失。 过滤， 浓缩制得黄色固体产物化合物 3即 6-氨基苯并 [d] [1, 3] -2， 2-二甲基 -4 -氧 代- 1， 3-二氧六环。 LC-ESI-MS (Μ+ίΤ): 194.22;

( 3) 100毫升反应瓶中加入 1克化合物 3， 0.8克二环己基碳二亚胺， 1.1 克 1 -羟基苯并三氮唑， 50毫升二氯甲烷， 室温搅拌 12小时， TLC检测反应 完全， 减压除去溶剂， 柱层析， 制得白色固体化合物 4即 6- (环己基氧甲酰 胺基）苯并 [d] [1, 3] -2, 2-二甲基 -4-氧代- 1, 3-二氧六环。 LC-ESI-MS (M+H+)： 320.38;

(4 ) 50毫升反应瓶中加入 1克化合物 4， 1.2克 NaBH4- A1C13, 30毫升 无水四氢呋喃， 回流搅拌 2小时， TLC检测反应完全， 减压除去四氢呋喃， 残余物水洗,二氯曱烷萃取，浓缩，柱层析得� �黄色油状液体化合物 5即 6- (环 己基氧甲基氨基)苯并 [d] [1， 3]- 2,2-二曱基 -4-氧代- 1,3-二氧六环， 重 720mg _o LC-ESI-MS (M+H ⁺ )： 306.89;

(5) 50毫升反应瓶中加入 500毫克化合物 5, 470毫克 3， 5 二羟基苯甲 醛， 380毫克氰基硼氢化钠， 30毫升甲醇， 回流 2小时， TLC检测反应完全， 加水淬灭反应， 减压除去甲醇， 二氯曱烷萃取， 柱层析，制得白色固体化合物 6即 6- [(环己基氧甲基）（2,5-二羟基苯基)氨基]苯并 [d] [1， 3] -2, 2-二甲基 -4-氧代- 1, 3-二氧六环， 重 0.67克。 LC- ESI- MS (M+H+)： 428.33;

(6) 50毫升反应瓶中加入 200毫克化合物 6, 100毫克氢氧化钠的 30 毫升甲醇溶液， 回流搅袢 2小时， TLC检测原料小时， 反应完全。 2N盐酸调 PH为 5, 加压除去甲醇， 加入水， 二氯甲烷萃取， 浓缩得白色固体产品（化 合物 7 )即 5- [ [ (2, 5-二羟基苯基）甲基] [ (环己基氧）曱基] -2-羟基苯甲 酸， 重 121亳克。 ^-NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) δ： 12.12 (s， 1H), 10.34 (br， 1H), 9.41 (br, 1H), 6.71-7.23 (m， 6H) , 5.43 (s, 2H) , 5.02 (s， 2H) , 2.79 (s, 1H), 1..43-1.71 (m, 10H) . LC-ESI-MS (M+『） : 388.17。

实施例 2

如图 2所示， 制备方法如下：

(1 )100毫升反应瓶中加入 2克 5-氨基水杨酸（化合物 8 ), 1.8克 2, 5- 二羟基苯甲醛， 2.1克氰基硼氢化钠， 80亳升曱醇， 回流 2小时， TLC检测 反应完全， 加入 20毫升饱和氯化铵溶液， 減压除去曱醇， 残余物水洗， 二氯 曱烷萃取， 浓缩， 柱层析， 制得白色固体化合物 9即 5-(2, 5-二羟基苯曱基） 氨基 -2-羟基苯曱酸, 重 1.9克。 LC-ESI-MS (M+H十）: 276.76;

(2) 100毫升反应瓶中加入 1克化合物 9, 1.6克 4- Boc氨基 -5-嘧啶甲 醛， 1.2克氰基硼氢化钠， 50毫升甲醇， 回流 1小时加入 50毫升饱和氯化铵 溶液， 减压除去甲醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩， 制得淡黄色固体化合物 10即 5- [(2, 5-二羟基苯甲基） [5_(4-Boc氨基嘧啶甲基)氨基] -2-羟基苯曱酸， 重 1.15克。 LC-ESI-MS (Μ+Η ⁺ )： 483.74;

( 3) 50毫升反应瓶中加入 500毫克化合物 10, 30毫升二氯甲烷， 1毫 升三氟乙酸， 室温搅拌 10小时， TLC检测反应完全， 减压除去二氯甲烷， 饱 和碳酸氢钠调 ΡΗ为 7， 柱层析， 制得白色固体产品（化合物 11 )即 5- [ (2, 5- 二羟基苯甲基） [5-(4-氨基嘧啶）曱基]氨基] -2-羟基苯甲酸， 重 210毫克。 'H-NMR (300HZ, DMSO— d ₆ ) δ： 12.68 (br, 1H) , 10.21 (br, 1H), 9.96 (br, 1H), 8.87 (br, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.66—6.93 (m， 5H), 6.32 (br, 2H) , 5.32 (s, 2H) , 5.18 (s, 2H) . LC- ESI- MS (M+H ： 383. 38。

实施例 3

如图 3所示， 制备方法如下：

100毫升反应瓶中加入 1克化合物 9， 2克 3_吡啶基 -2-氧代-丙醛， 600 毫克氰基硼氢化钠， 50毫升甲醇， 回流 2小时， 加入 50毫升饱和氯化铵溶 液， 减压除去曱醇， 萃取， 浓缩， 柱层析， 制得白色固体产品 （化合物 12 ) 即 5_[( ² ，5-二羟基苯曱基） U-氧代- 3-吡啶乙基） ] 氣基 _ ² -羟基苯甲酸， 重 225毫克。 - NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) δ： 12.89 (br, 1H) , 9.97 (br, 2H) , 8.97 (br, 1H), 9.15 (s， 1H), 8.82 (s， 1H), 6.66-7.23 (m， 8H) , 5.08 (s, 2H), 4.46 (s, 2H). LC- ESI- MS (M+『）： 395.74。

实施例 4

如图 4所示， 制备方法如下：

100毫升反应瓶中加入 1克化合物 9, 600毫克 3-吡啶乙醛， 480毫克氰 基硼氢化钠， 40毫升甲醇， 回流 1小时， TLC监测反应完全， 加入 50亳升饱 和氯化铵溶液， 减压除去曱醇， 二氯甲烷萃取， 浓缩制得白色固体产品（化 合物 13 ) 即 5- [ (2, 5-二羟基苯曱基 )-（3-吡啶乙基）] 氨基 -2-羟基苯甲酸， 重 290毫克。 ^! H-NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) 5： 11.87 (br, 1H) , 9.67 (br, 2H) ,

8.84 (br, 1H)， 8.34 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 6.61-7.29 (m, 8H)， 5.08 (d, J = 4. 2 Hz, 2H) , 3.68 (d, J = 4. 2 Hz, 2H) . LC- ESI- MS (M+H+) : 381.66。

实施例 5

如图 5所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 5-嘧啶甲醛，其余所需原料、试剂和制备方法� ��实施 例 4, 得白色固体产品（化合物 14 ) 即 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基) - (5-嘧啶甲 基）] 氨基- 2-羟基苯甲酸。 NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) 8： 12.67 (br, 1H),

9.57 (br, 2H)， 9.06 (s, 1H) , 8.94 (br, 1H), 8.57 (s， 2H) , 6.51-7.23 (m, 6H), 5.23 (s, 2H) , 4.88 (s， 2H) . LC— ESI— MS (M+H+) : 368.34。

实施例 6

如图 6所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 5-噻，，坐甲醛，其余所需原料、试剂和制备� ��法同实施 例 4, 得白色固体产品（化合物 15 ) 即 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基) - (5-噻唑甲 基）] 氨基 -2-羟基苯曱酸。 'H-NMR (300Hz, DMS0-d ₆ ) δ： 12.19 (br, 1H), 9.87 (br, 2H)， 8.94 (br, 1H) , 8.67 (s, 2H) , 6.88-7.33 (m, 7H) , 5.23 (s, 2H), 4.61 (s, 2H). LC-ESI-MS (M+H ： 373.38。

实施例 Ί

如图 7所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 2-曱基 -3-羟基 -4-吡啶曱醛，其余所需原料、试剂和 制备方法同实施例 4, 得淡黄色固体产品（化合物 16 )即 5- [ (2, 5-二羟基苯 曱基） -(2-曱基- 3-羟基 -4-吡啶甲基)氛基 ] -2-羟基苯曱酸。 'H-NMR (300Hz, DMS0-d ₆ ) δ： 12.38 (br, 1H), 9.68 (br, 2H)， 8.74 (br, 2H) , 8.26 (s， 1H), 6.88-7.33 (m, 7H) , 5.23 (s， 2H) , 4.61 (s， 2H) , 2.53 (s, 3H) . LC-ESI-MS (M+H+): 397.89。

实施例 8

如图 8所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 3-吡啶曱醛，其余所需原料、试剂和制备方法� ��实施 例 4, 得淡黄色固体产品（化合物 17) 即 5_[ (2, 5-二羟基苯甲基 )-（3-吡啶 曱基）氨基] -2-羟基苯甲酸。 ^-NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) δ： 12.58 (br, 1H), 9.78 (br, 2H), 8.78 (br, 2H) , 8.59 (s, 1H), 8.26 (d, / = 7.8 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 6.98-7.33 (m, 7H) , 5.23 (s, 2H) , 4.61 (s, 2H) . LC-ESI-MS (M+H+): 367.45。

实施例 9

如图 9所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 1-氨基甲醜基 -2-氧代 -3-吡咯甲醛， 其余所需原料、 试剂和制备方法同实施例 4, 得白色固体产品（化合物 18 ) 即 5- [ (2, 5-二羟 基苯甲基) -[3- [(1-氨基甲酰基 -2-氧代)吡咯甲基） ] 氨基] -2-羟基苯曱酸。 'H-NMR (300Hz, DMSO— d ₆ ) δ： 12.88 (br, 1H), 9.98 (br, 1H), 8.74 (br, 1H), 6.75-7.23 (m, 7H) , 6.25 (br, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 4.21 (s, 2H) . LC-ESI-MS (M+H ： 414.45。

实施例 10

如图 10所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 5-曱基呋喃曱醛， 其余所需原料、试剂和制备方法同 实施例 4, 得白色固体产品 （化合物 19) 即 5- [(2, 5-二羟基苯甲基） [2- (5- 曱基呋喃）曱基]] 氨基 _ ² -羟基苯甲酸。 -丽 R (300Hz, DMS0-d ₆ ) δ: 12.48 (br, 1H), 9.78 (br, IH), 8.75 (br, 1H) , 6.75-7.23 (m, 6H) , 6.25 (d, /= 5.1 Hz, IH), 6.02 (d, /= 5.1 Hz, IH) , 2.3 (s， 3H) . LC-ESI-MS (M+H十）： 370.49。

实施例 11

如图 11所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成对甲基苯甲醛， 其余所需原料、 试剂和制备方法同实 施例 4, 得白色固体产品（化合物 20) 即 5- [(2， 5-二羟基苯曱基 )-(4-甲基 苯曱基） 氨基] -2-羟基苯曱酸。 -匪 R (300Hz, DMS0-d ₆ ) δ： 12.78 (br, IH), 9.88 (br, IH), 8.72 (br, IH), 7.23 (d， / = 7.8 Hz， 2H)， 7.02 (d， J = 7.8 Hz, 2H), 6.75-7.23 (m, 6H) , 5.21 (s, 2H) , 2.3 (s， 3H) . LC-ESI-MS (M+H+): 380.30。

实施例 12

如图 12所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 2-呋喃曱醛，其余所需原料、试剂和制备方法� ��实施 例 4, 得白色固体产品（化合物 21 ) 即 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基) - (2-呋喃甲 基） 氨基]—2—羟基苯曱酸。 - NMR (300Hz, DMSO- d ₆ ) 5： 12.98 (br, IH), 9.81 (br, IH), 8.70 (br, IH), 6.75-7.23 (m, 9H) , 5.21 (s, 2H) , 5.09 (s, 2H) . LC-ESI-MS (M+H+): 356.69。

实施例 13

如图 13所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 2-甲基- 5-吡啶甲醛， 其余所需原料、 试剂和制备方 法同实施例 4,得白色固体产品（化合物 11 )即 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基) - (2- 甲基- 5-吡啶曱基） 氨基] -2-羟基苯甲酸。 -匪 R (300Hz, DMS0-d ₆ ) δ: 12.77 (br, IH), 9.98 (br, IH), 8.95 (br, IH) , 8.60 (s， IH) , 6.75-7.73 (m， 8H), 5.23 (s, 2H), 5.08 (s, 2H) , 2.3 (s, 3H) . LC-ESI-MS (M+Hl： 381.90。

实施例 14

如图 14所示， 制备方法如下：

将 3-吡啶乙醛换成 2-甲基- 5-吡啶甲醛， 其余所需原料、 试剂和制备方 法同实施例 4,得白色固体产品（化合物 23 )即 5- [ (2, 5-二羟基苯甲基) - (3- 羟基- 4-吡啶曱基） 基]- 2-羟基苯曱酸。 -丽 R (300Hz, DMSO- d ₆ ) δ: 12.97 (br, 1H)， 9.68 (br, 1H) , 8.75 (br, 2H) , 8.30 (s, 1H), 6.75—7.83 (m, 8H) , 5.23 (s, 2H), 5.08 (s, 2H) . LC-ESI-MS (M+H+) : 383.39。

实施例 15

新型薰草菌素 A类似物抑制人淋巴内皮细胞（ HLEC )和 VEGFD高表达的 LL/2细胞 ( VEGFD-LL/2 )增殖

试验方法： 细胞培养 HLEC细胞培养在含 5%胎牛血清， 1%内皮细胞生长 添加剂（ ECGS )， 100IU/mL青霉素和 100 μ g/mL链霉素的内皮细胞培养基（ ECM) 中。 培养环境也是饱和湿度、 37°C的 5% C02孵箱。 VEGFD- LL/2细胞常规培 养于含 10%胎牛血清、 100U/ml青霉素和 100 mg/L链霉素的 DMEM培养液中， 置饱和湿度、 37 °C的 5¾ C02孵箱中培养。

MTT试验 取对数生长期细胞， 消化液消化或直接吹打混匀后计数； 调整细胞悬液浓度 2 lOVmL, 于 96孔板中每孔加入 lOOul细胞悬液； 24 h 后吸掉原有培养基， 分别加入 200 ul含有包括薰草菌素 A在内的 15个化合 物的完全培养液（阴性对照组加等量 DMS0 ), 每组 3复孔， 继续培养于 C02 孵箱； 分別于加药后 48 h后取出 96孔板, 每孔加入 5 mg/1 MTT试剂 50ul, 继续培养 4小时； 吸出孔中的液体， 每孔加入 15Q ul DMS0, 室温震荡 15分 钟充分溶解沉淀， 用酶标仪在 570 nm波长检测每孔细胞 0D值。 根据相对抑 制率判断薰草菌素 A类似物对 HLEC和 VEGFD-LL/2细胞的抑制作用：

相对抑制率 = (对照孔平均 0D值 -加药孔平均 0D值） /对照孔平均 0D值 X 100¾。

并计算 IC ₅ 。值。 结果见表 2。

表 2 薰草菌素 A及 14个新型类似物对 HLEC和 YEGFD-LL/2增殖的抑制 作用

化合物 IC ₅ 。 (uM) for IC ₅ 。 (uM) for

HLEC VEGFD-LL/2

HQ— 001 0.38 0.42

HQ— 002 1.75 2.10

HQ— 003 0.62 1.95

HQ— 004 1.36 12.65

HQ— 005 7.31 6.22

HQ— 006 2.17 9.40

HQ— 007 13.62 >50 HQ— 008 8.16 26.51

HQ— 009 >50

HQ— 010 3.06 8.52

HQ— Oil 19.51 31.90

HQ— 012 8.07 12.63

HQ— 013 5.84 19.78

HQ— 014 22.08 40.12

Lavendustin A 5.18 9.06 实施例 16

HQ_001与 VEGFR3间的相互作用模式

采用计算机药物虚拟筛选技术和细胞水平技术 获得 HQ_001 HQ_002, HQ_003, HQ_005和 HQ_010抗肿瘤效果皆比母体薰草菌素 A更佳， 于是 选择活性相对最优的 HQ_001作为以下研究的新型化合物。 图 15显示了 HQ— 001与 VEGFR3间的相互作用模式。 从图 15 (b)中观察到， HQ_001的邻羟 基苯甲酸部分的羧基氧和羟基氧， 与 CyslOO的 alpha-氨基氬形成氢键； HQ-001的对二羟基苯酚部分其中一个羟基氧，为 Lys49的 alpha-氨基氢提供 氢键受体（acceptor) , 而该羟基上的氢， 为 Ala47的羰基氧， 提供氢键给体 (donor)

实施例 17

HQ_ 001诱导人淋巴内皮细胞（HLEC) 凋亡

按照 MTT结果， 选择 0.5uM的 HQ_001处理 HLEC细 J包， DMS0对照组加入 等体积的 DMS0, 空白对照组加入等体积的完全培养基， 处理 48h后进行 PI 染色观察： 1)将原有的培养基吸出， 吸干净， 注意轻柔操作， 以免导致细胞 丢失；

2)加入碘化丙锭 (PI)染色液， 避光染色 5分钟左右； 3) 于导致显微镜 下观察并保存图像； 结果见图 16。 由图 16 b可见 HLEC细胞容积变小， 染色 质固缩， 并产生核碎片和凋亡小体。

实施例 18

HQ _ 001诱导人淋巴内皮细胞（ HLEC ) 凋亡的时间依赖性

为了探索 HQ_001诱导 HLEC细胞凋亡在时间上的规律， 实验中还对 HQ-001作用下的 HLEC细胞核形态进行了动态观察（图 17 )。 在 HQ-001分别 作用 Oh, 2h, 4h, 8h， 12h和 24h之后， 对细胞进行 Hoechst33258染色。在 荧光显 镜下观察发现， HQ_001作用 8h后， HLEC细胞开始产生凋亡的迹象， 这种迹象随着时间的延长逐渐增多。 在作用 24h之后， 能明显看到大量的细 胞产生核固缩、 染色体凝集等现象， 并能观察到凋亡小体的存在。

实施例 19

HQ— 001抑制人淋巴内皮细胞（HLEC) 的成管能力

通过体外 matrigel成管实验， 研究了 HQ_001对人淋巴管内皮细胞 HLEC迁移分化并形成管状结构的影响。 光镜下观察结果（图 18 )显示， 对照 组 HLEC细胞在 6小时内能够在 Matr igel上迁移分化， 伸展并相互连接， 形 成较好的网络管状结构。 这种结构呈毛细血管状， 并形成多中心的结点（图 18 a); 而与 0.5uM HQ_001共培养的情况下， 与对照组相比， 管状结构的形 成明显受到抑制， 使 HLEC细胞形成的网格明显减少， HLEC细胞形态由拉伸 的长梭形逐渐变圓 （图 18 b)。

为了验证 matrigel組分的诱导作用和排除药物毒性的影响� ��实验中设置 了在明胶表面的对照实验。在没有药物作用和 没有 matrigel的情况下， HLEC 细胞在明胶表面正常贴壁生长， 不发生迁移和分化， 也不形成管状结构（图 18 c )。 与 0.5uM HQ_ 001共培养并没有明显影响 HLEC细胞的正常贴壁和生长 (图 18 d)。由此可见， HQ— 001能够在较短时间内明显抑制 HLEC的成管能力。 这种抑制作用并不是由于其细胞毒作用导致的 内皮细胞损伤。 因此证明， HQ-001具有抑制淋巴管生成的作用。

实施例 20

HQ_001抑制肿瘤细胞 VEGFD的分泌

本实验通过 Western blot方法首先检测了肿瘤细胞中 VEGFD的表达。肿 瘤细胞中 VEGFD的分泌与转录因子 AP-1有关，因此实验对 c_fos的上游激酶 ERK1/2的磷酸化进行了检测。 同时， 也对调控细胞存活、 迁移、 增殖的 PI3K/AKT通路进行了检测。 Western blot实验结果（图 19)显示， VEGFD- LL/2 细胞较空载的 pcDNA- LL/2细胞， VEGFD的表达水平显著增高。 并且在 0.5uM HQ_001作用 12h后， VEGFD-LL/2的 VEGF-D表达水平受到明显的抑制。 这种 抑制作用与 HQ_001阻断了肿瘤细包中 MEK/ERK1/2通路有关。 从结果可以看 到， 肿瘤细胞中 BRK呈现组成性激活， 对照组的细胞中 ERK发生了明显的磷 δ交化， 这种磷酸化的激活被 HQ_001阻断。 同样， AKT的磷酸化也受到了明显 的抑制。 因此， HQ-001对于 VEGFD-LL/2细胞的信号通路有直接的抑制作用。 HQ_001抑制淋巴管新生和淋巴转移的结果与 HQ-001抑制肿瘤细胞中 ERK和 AKT的活化， 从而下调 VEGFD的表达有关。

实施例 21

HQ— 001抑制人淋巴内皮细胞 ( HLBC ) VEGFR3的表达

本实验通过 Western blot方法检测了 HLEC细胞中 VEGFR3的表达。 同时 也对激酶 BRK1/2的磷酸 4匕和 PI3K/AKT通路进行了检测。 Western blot 实验 结果（图 20 )显示， 在 HLEC细胞中 ERK1/2的磷酸化和 VEGFR3表达水平受 到了明显抑制。 VEGFR3通路是调控淋巴管新生的主要途径， 肿瘤诱导的淋巴 管生成作用就是通过分泌 VEGFD来激活 VEGFR3通路起作用的。 故 HQ-001可 通过抑制 BRK1/2磷酸化、 VEGFR3表达， 从而下调细胞分裂、 迁移、 成管， 进而达到抑制淋巴管生成的作用。

实施例 22

HQ_001抑制斑马鱼节间血管的生成

肿瘤的生长、 侵袭和转移的过程都依赖新生血管的生成， 而斑马鱼模型 由于能清晰地观察到血管的发生发展， 已成为一种新型体内模式生物学， 非 常适合体内血管生物学的研究。 本实验采取先收集斑马鱼鱼卵， 挑除死卵和 不健康的鱼卵， 置 28.5°C鱼水中培养。 用鱼水稀释 HQ_001到所需浓度， 6 小时后，将鱼卵分配到六孔板中，加入 HQ_001溶液处理。孵育 24h后，用 0.05% 水合氯酸麻醉， 荧光显微镜下剥卵并观察血管新生情况。

结果见图 21, 在 Control组中， 节间管非常完整， 成漂亮的梯形排布， 0.1 μΜ HQ_001处理时， 药效作用并不明显， 但当 HQ_001作用浓度提高后，在 0.2 μΜ、 0.4 μΜ时， 斑马鱼节间管的萌芽被抑制， 形成并不完整。 相同浓度 ( 0.4 μΜ)的 HQ_001与薰草菌素 Α处理后， HQ_001体现了更强地抑制斑马鱼节 间管形成的作用。 这说明 HQ_001能很强抑制新血管的形成。

综上所述， 通过体外细胞水平实验可以发现， 本发明所述薰草菌素 A衍 生物具有显著性抑制人淋巴内皮细胞（HLEC )和稳定高表达 VEGFD的 LL/2 Lewis肺癌细胞株 ( VEGF-D-LL/2 )增殖的作用， 并诱导 HLBC细胞凋亡， 抑 制 HLEC细胞成管能力，作用机制研究发现该薰草� �素 A衍生物具有更强地抑 制肿瘤细胞 VEGFD的表达以及 AKT和 ERK磚酸化水平， 同时更强地抑制 HLEC 细胞 VEGFR3的表达；斑马鱼模型也显示了该薰草菌素 A衍生物具有更强地抑 制血管生成的作用。 上述参照具体实施方式对该薰草菌素 A衍生物及其制备方法与应用进行 的详细描述， 是说明性的而不是限定性的， 可按照所限定范围列举出若干个 实施例， 因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改 ， 应属本发明的保护 范围之内。