BREVE APRESENTAÇÃO

Trata a presente solicitação de Patente de Invenção de um inédito "MEIO

PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEPTOSPIROSE E VACINA CONTRA LEPTOSPIROSE ANIMAL", especialmente de um meio e vacina que utilizam um "pool" de cepas de leptospiras inativas (evitando que o operador seja colocado em risco), para diagnóstico da doença Leptospirose, em animais em geral(bovinos, suínos, equinos e caninos) e no homem, bem como vacina para uso animal e eventualmente, no homem.

Tecnicamente, o meio empregado para diagnóstico laboratorial, leva à vacina conta a Leptospirose animal, a qual apresenta uma imunogenicidade (formação de anticorpos) maior, protegendo com maior eficiência os animais emgeral (bovinos, suínos, equinos e caninos).

CAMPO DE APLICAÇÃO

A invenção é particularmente apropriada, num primeiro aspecto, para diagnóstico da Leptospirose, em animais em geral (bovinos, suínos, equinos e caninos), bem como no Homem (MEIO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DALEPTOSPIROSE).

Num segundo aspecto, a invenção é particularmente apropriada para proteção com maior eficiência dos animais em geral (bovinos, suínos, equinos e caninos), para tanto utilizando o meio desenvolvido para o diagnóstico laboratorial, este também aplicável ao homem.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Atualmente existem mais de 220 sorovares de leptospiras identificadas por técnicas preconizadas pela ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE (OMS). Dentre essas sorovariedades a grande maioria é de origem patogênicas (causam doenças).

Existem várias técnicas de laboratório para a determinação exata de qualleptospira está presente no rebanho. O isolamento seria o ideal, mas é difícil e muito oneroso. No caso do isolamento poderá ser utilizado como material de amostra urina do animal e amostra de sangue, colhidas na fase aguda da doença. E isso se mostra muito complexo, como mencionado acima. Nesse diapasão, há de se imaginar esse tipo de processo em um rebanho todo? Ou seja, por motivos óbvios, não se mostra prático, além do custo que se mostra muito alto. Portanto, não é usado na rotina de diagnóstico de nenhum país do mundo.

5 Sendo assim cabe aos pesquisadores confirmar os achados dos exames sorológicos para orientar os produtores de vacinas para que incluam aquelas sorovariedades prevalentes em cada país.

O que existe atualmente para diagnóstico da Leptospirose, é a metodologia recomendada pela ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, compreendendo a lOsorologia de micro-aglutinação (MAT) que utiliza uma bateria de no mínimo 18 sorovares de leptospiras de referência.

Para a realização da prova é necessário utilizar cultura dos vários sorovares de leptospiras, microscópio de campo escuro, técnico especializado, necessitando, ainda, de, no mínimo de 2 (duas) horas para obter os primeiros resultados.

15 No que se refere à Vacina contra leptospirose animal, atualmente comercializada, é obtida a partir do cultivo das cepas de leptospiras de maior relevância entre os animais em geral (bovinos, suínos, equinos e caninos), contendo 10 ⁸ leptospiras por ml. Esta cultura de leptospiras é utilizada para a obtenção da vacina, sendo adicionado adjuvante. A dose de vacina quando inoculada nos 0animais produz formação de anti-corpos contra as próprias leptospiras, bem como anticorpos inespecíficos contra proteínas existentes no próprio meio de cultura utilizado para o cultivo das leptospiras.

ESTADO DA TÉCNICA

No atual estado da técnica é conhecido o documento PI 0407032-1 , 5depositado em 15/01/2004, que apresenta uma vacina canina contra Bordetella bronchiseptica. Esta invenção refere-se a vacinas e métodos para a proteção de cães contra a doença causada por Bordebella bronchiseptica. Esta invenção refere- se igualmente a vacinas de combinação e métodos para a proteção de cães contra doença ou distúrbio causado por patógenos caninos, por exemplo, traqueobronquite 0infecciosa causada por Bordetella bronchiseptica, cinomose causada pelo vírus da cinomose (cd), hepatite canina infecciosa (ich) causada pelo adenovírus canino do tipo 1 (cav-1), doença respiratória causada pelo adenovírus canino do tipo 2 (cav-2), parainfluenza canina causada pelo vírus parainfluenza canina (cpi), enterite causada pelo coronavírus canino (ccv) e parvovírus canino (cpv), e leptospirose causada pela Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira cterohaemorrhagiae ou Lepbospira pomona. as vacinas da invenção do estado da arte incluem um antígeno p68 de Bordetella bronchiseptica, entretanto observa-se 5que o documento não prevê uma cultura de leptospiras a ser utilizada para a obtenção da vacina, sendo adicionado adjuvante.

É conhecido ainda do estado da técnica o documento PI 0516253-0, depositado em 23/09/2005, que consiste em uma vacina canina multivalente contra Leptospira bratislava e outros patógenos. A invenção relaciona-se a vacinas e lOmétodos para proteção de cachorros contra doença causada por Leptospira bratislava. Esta invenção do estado da técnica também se relaciona a combinação de vacinas e métodos para proteger cachorros contra doença ou desordem causada por patógenos, por exemplo, infecções traqueobronquites causadas por Bordetella bronchiseptica, Cinomose canina causada por vírus da Cinomose canina (cc),

15infecção de hepatite canina (ihc) causada por adenovírus canino do tipo 1 (act-1 ), doença respiratória causada por adenovírus canino tipo 2 (act-2), parainfluenza canina causada por vírus Parainfluenza canina (pie), enterite causada por Coronavírus canino (eve) e Parvovírus canino (pvc), e Leptospirose causada por Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira 0icterohaemorrahagiae ou Leptospira pomona.. Portanto, o presente documento não prevê formulação do fungo mencionado, como ocorre na formulação da presente solicitação de Patente.

É conhecido ainda do estado da técnica o documento PI 0602669-9, depositado em 13/07/2006, que consiste um processo de clonagem, expressão e 5purificação de proteína de leptospira sp. por DNA recombinante, processo de obtenção de sequência de polinucleotídeo com potencial vacinai e diagnóstico, clonada em vetores de expressão em mamíferos ou não, para vacina de DNA, composição com potencial vacinai a base da dita proteína, composição para diagnóstico ou para detecção in vitro da ocorrência de infecção por Leptospira sp., e 0kit para diagnóstico in vitro de infecção por .Leptospira sp, mais especificamente esta invenção anterior refere-se a uma dada sequência de DNA presente no genoma da bactéria Leptospira sp, dito gene Iic 2892 que codifica uma sequência de aminoácidos ou uma proteína que poderá ser usada terapeuticamente como vacina ou componente vacinai, e também diagnosticamente, por exemplo, como composição de um kit para diagnóstico precoce da leptospirose, proteína esta denominada de Isp29, e que constitui uma proteína de superfície de leptospira para ser usada para detectar anticorpos em pessoas e também animais com suspeita da 5doença leptospirose, sendo que sua utilidade é voltada tanto para a saúde humana como para a animal.

É conhecido ainda do estado da técnica o documento PI 9905780-8, depositado em 01/12/1999, que consiste em antígenos vacinais de Leptospiras para prevenção da Leptospirose". São proporcionadas quatro preparações antigênicas, lOcada uma delas contendo uma proteína diferente de Leptospiras, que podem ser usadas imunologicamente em vacinas contra a Leptospirose causada por este microrganismo, também são proporcionados pela invenção polinucleotídeos codificadores destas quatro proteínas e anticorpos que se ligam às proteínas para uso no diagnóstico de Leptospirose.

15 Dos documentos estrangeiros, a presente invenção US 2004043391 (A1 ) trata de quatro preparações antigênicas fornecidas, cada uma daos quais contém uma proteína diferente de Leptospira, que pode ser usada imunologicamente em vacinas para Leptospirose causada por este organismo. Também previsto na invenção são polinucleotídeos codificando estas quatro proteínas e anticorpos que 0se ligam a proteínas para uso no diagnóstico de Leptospirose, o que não ocorre na formulação objeto da presente solicitação de Patente de Invenção.

O documento UA 20070000569 (U) prevê uma cepa de bactéria Leptospira interrogans yez bratislava sorológicos grupo Australis, Sorovar bratislava, depositados na coleção oficial do Estado e do Instituto de Pesquisa de Biotecnologia 5e Controle de cepas de microrganismos sob o n ⁰ 334, é usado para fabricação de vacina inativada contra a Leptospirose em animais e para o diagnóstico, o que não ocorre na formulação objeto da presente solicitação de Patente de Invenção.

O documento KR 20100011770 (A) trata de uma proteína antígeno recombinante para prevenir a leptospirose canina fornecida para uso como um 0antígeno para a vacina sub-unidade e maciçamente produzir OmpL1 LipL41 e proteína. A proteína antígeno recombinante contém proteína de membrana externa da Leptospira e MBP (Maltose-binding protein). A proteína da membrana externa é OmpL1 ou LipL41. O vetor de expressão recombinante contém membrana externa de codificação de sequência e MBP (maltose-binding protein) de leptospira. Umas células do hospedeiro que são transformadas com o vetor de expressão recombinante é E.coli depositados em um depósito número KCTC 11363BP ou 11019BP KCTC. Um kit para diagnóstico de Leptospirose canina contém um 5antígeno recombinante de Leptospira. A composição da vacina para a prevenção Leptospirose canina contém a proteína antígeno recombinante como um ingrediente ativo, entretanto a invenção anterior não prevê formulação, como ocorre na formulação da presente solicitação de Patente.

O documento RU 2395299 refere-se a biotecnologia. A vacina contém uma lOsubstância ativa e aditivos alvo. A substância ativa é apresentada com mistura suspensões inativadas de gado cepa de vírus a rinotraqueíte infecciosa, SVC (Estado Colecção Vírus) n ⁰ 2333, de família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesviridae, suspensão inativada de gado diarréia. O vírus SVC n ⁰ 2.336, família Flaviviridae, género Pestivirus, suspensão inativada de gado cepa de

15rotavírus, SVC n ⁰ 2.337, família Reoviridae, género rotavirus, suspensão inativada de gado cepa de coronavírus, SVC n ⁰ 2.338, família Coronaviridae, género coronavírus com a atividade de cada estirpe do vírus não inferior a 106,5 "õ" 50 por 1 cm ³ da vacina. Como disse substância ativa, a vacina também contém mista suspensão inativada de bactérias Leptospira interrogans sorogrupo Pomona células 0de linhagem de VGNKI-6, a suspensão inativada de células de bactérias Leptospira interrogans sorogrupo de tarassovi de tensão VGNKI-4, a suspensão inativada de bactérias Leptospira interrogans células de Grippotyphosa sorogrupo da estirpe VGNKI-1 , a suspensão inativada de bactérias Leptospira interrogans células de Sejroe sorogrupo da estirpe Hardjo e suspensões inaktivirovannoj de células de 5bactérias Leptospira interrogans sorogrupo de Sejroe de tensão VGNKI-5 tomadas na proporção igual à concentração final de cada cepa Leptospira não inferior a 270 milhões de células microbianas por 1 cm ³ da vacina. A vacina destina-se a prevenção de doenças infecciosas do gado acompanhados por distúrbios reprodutivos de várias gravidades. A vacina é melhor do que as vacinas comuns no espectro de 0proteção específica e eficácia para o grupo de animais tolerantes, duração da imunidade intenso, inocuidade para incalvers e bezerros recém-nascidos, a estabilidade de propriedades biológicas, incluindo antígeno e atividade imunógeno todo 18 meses, o que não ocorre na formulação objeto da presente solicitação de Patente de Invenção.

DA INVENÇÃO

Considerando a importância da leptospirose em nosso meio, o presente 5pedido tem como objetivo produzir, industrializar e comercializar o MEIO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LEPTOSPIROSE (teste qualitativo), utilizando um "poof de diferentes cepas de leptospiras, pela técnica de aglutinação macroscópica em placa de vidro, com resultados em 10 (dez) minutos; por ser um teste qualitativo, detecta a presença de IgM e IgG. É importante salientar que o lOmesmo poderá ser utilizado para realizar testes em campo, não necessitando de aparelhagem especifica, nem de técnico especializado para a realização da prova e várias cepas de Leptospiras, utilizadas no teste de micro aglutinação.

O meio é apresentado com um frasco contendo suspensão antigênica, com diferentes sorovares de leptospiras de concentrações pré-estabelecidas das

15leptospiras de maior relevância pra cada espécie animal.

Mediante o exposto pode-se afirmar que proposta da presente invenção é a padronização de um teste rápido, que trará como benefícios uma resposta dos resultados (10 minutos) com um custo bem menor quando comparado ao método tradicional (não coloca o operador em risco, pois trabalha-se com leptospiras 0inativas), os testes poderão ser realizados em campo, sem a necessidade de aparelhagens sofisticadas, técnicos especializados e meios de cultura para a manutenção da bateria de cepas de leptospiras.

A Vacina contra leptospirose animal, atualmente comercializada, é obtida a partir do cultivo das cepas de leptospiras de maior prevalência entre os animais 5citados, contendo 10 ⁸ leptospiras por ml. A cultura de leptospiras assim obtida, contendo o meio de cultura utilizado, será utilizada para a obtenção da vacina, adicionado do adjuvante. A dose de vacina quando inoculado nos animais produzirá formação de anticorpos contra as próprias leptospiras, bem como anticorpos inespecíficos contra proteínas existentes no próprio meio de cultura utilizado para o 0cultivo das leptospiras.

Diante disto, o inventor propõe uma nova metodologia de obtenção da vacina contra leptospirose animal que consiste em uma vacina com maior poder de imunogenícidade, a partir da obtenção de uma massa pura de leptospiras íntegras, a partir da centrifugação da cultura de leptospiras, desprezando o sobrenadante (meio de cultura utilizado), não contendo, portanto, a presença de outras proteínas oriundas do próprio meio de cultura, quando comparada com as vacinas produzidas e comercializas atualmente.

5 Também se propõe obter uma vacina que contenha 10 ⁹ leptospiras por ml adicionada de adjuvante (Hidróxido de Alumínio). Nestas condições, a vacina a ser obtida, poderá dar uma proteção vacinai nos animais entre 09 à 12 meses contra a referida infecção (outra vantagem em relação as vacinas comercializadas que dá proteção de 06 meses). Propõe-se preparar a vacina utilizando cepas de leptospiras lOde maior prevalência entre os animais, a partir de referências científicas. As cepas de leptospiras cultivadas separadamente, após centrifugação, deverão ser lavadas em solução de NaCI (cloreto sódio), sendo então misturada ("pool" - todas as culturas de letospiras juntas), e re-suspensas em solução de NaCI 0,9%, contendo de 0, 1 a 1 ,0% de formalina, ajustando a concentração para 10 ⁹ leptospiras

15por ml, utilizando solução de hidróxido de alumínio como adjuvante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção no que se refere ao MEIO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEPTOSPIROSE, objetiva a uma padronização de um teste rápido que trará como benefícios uma resposta dos resultados em 10(dez) minutos 0com um custo bem menor quando comparado ao método tradicional citado acima, não coloca o operador em risco, pois trabalha-se com leptospiras inativas, os testes poderão ser realizados em campo, sem a necessidade de aparelhagem sofisticadas, técnicos especializados e meios de cultura para a manutenção da bateria de cepas de leptospiras.

5 Para obtenção das suspensões antigênica de leptospiras (MEIO e VACINA), ou seja, para a realização dos trabalhos, são utilizados os sorovares de leptospiras, causadores da Leptospirose e de maior relevância no Homem e nos animais bovinos, suínos, equinos e caninos: L. icterohaemorrhagiae; L. copenhageni; L. canicola; L. pomona; L. grippotyphosa; L. hardjo e L. wolffi. Estes sorovares de 0leptospiras, foram, obtidos no Centro de Referência para Leptospirose, na FIOCRUZ/RJ. Estas cepas de Leptospiras são mantidas em meio semi-sólido, com repiques a cada três meses. As amostras de leptospiras são cultivadas em meio liquido. Este meio liquido é preparado, numa primeira fase, 10 (dez) vezes concentrado, totalmente estéril, podendo ser acondicionado à temperatura ambiente. O meio de cultura assim elaborado, contém para cada 1000 ml, 1 ,0g de Fosfato Disódico; 0,3g de Fosfato 5Monopotásico; 1 ,0g de Cloreto de Sódio; 0,25g de Cloreto de Amónio; de 0,1 mg à 0,8mg de Tiamina; 0,1g à 0,7g de Piruvato de Sódio; 0,1 ml de Glicerina; Cloreto de Cálcio e Cloreto de Magnésio 0,5mg à 15mg; 4mg de ZnSO ₄ .7H2o; Hémacias Bovina entre 0,1 à 1 ,4mg; 2mg de Cianocobalamina e Tween-80 entre 0,7 à 1 ,5ml. O meio de cultura deverá ser esterilizado por sistema de filtração, tendo o pH final 6,0 à 8,7, lOantes do uso. O cultivo das cepas de leptospiras, será realizado em tubos de vidro com tampa de rosca contendo 10 ml de meio de cultura, adicionando de 2 à 10% de cultura de leptospira e mantidos a temperatura de 15-30° C por até 10 (dez) dias para crescimento.

Passados os dias de incubação, os tubos apresentando crescimento

15bacteriano, são examinados quanto à pureza, densidade e presença ou não de auto- aglutinação. Os tubos com crescimento bacteriano satisfatório serão utilizados para uma segunda passagem, sendo inoculados em frascos com 100ml do mesmo meio de cultura e incubados com agitação, a temperatura entre 15 - 3° C, para crescimento por mais uma semana. Após este período, procede-se novamente a 0avaliação quanto à pureza, densidade e auto-aglutinação. Os frascos com aspectos satisfatórios ao exame visual (crescimento homogéneo com turvação no terço superior do tubo e sem presença de grumos), serão inoculados em erlenmeyer de 2 (dois) litros, contendo entre 200ml à 1000ml do mesmo meio de cultura e incubado, com agitação, a temperatura entre 15 - 30° C. Este procedimento será utilizado para 5os 7 (sete) diferentes sorovares de leptospiras citados anteriormente. Após este período, proceder a avaliação da cultura, quanto à pureza, densidade de crescimento e auto-aglutinação. Apresentando condições satisfatórias, inativar a cultura com formol à mais e verificação de inexistência de leptospiras vivas por meio de microscopia de campo escuro com aumento de 450 vezes, procedendo-se a 0centrifugação a 5000 rpm de 30 à 60 minutos.

Após a centrifugação e desprezando o sobrenadante, as leptospiras são lavadas com solução salina (NaCL 0,15M) e, finalmente re-suspensas em pequeno volume de solução salina tamponada (PBS) 0,01 M. As bactérias assim preparadas serão deixadas uma noite a 4 ^o C, para estabilização. Para cada cepa de leptospira, deverá ser realizado a obtenção das suspensões antigênicas, utilizadas no preparo do meio empregado para diagnóstico sorológico da leptospirose animal e humana, bem como na obtenção da vacina contra leptospirose animal.

5 Após o período de estabilização, no preparo do meio para diagnóstico laboratorial, determinar a concentração da suspensão de leptospiras em fotocolorímetro com comprimento de onda entre 230nm à 850nm, entre 10 e 38% de Transmitância, utilizando como diluente, solução contendo NaCI, Glicerol e Formol. As suspensões assim obtidas serão armazenadas em frascos de vidro com rolhas lOde borracha por uma semana em refrigerador a 4 ^o C para estabilização, para posteriormente serem avaliadas com os soros controles positivo e negativo para Leptospirose.

Na execução do teste de controle de qualidade (sensibilidade e especificidade) das suspensões antigênicas de leptospiras, são realizados soros

15humanos e de animais considerados suspeitos para Leptospirose, todos previamente avaliados pela soroaglutinação microscópica (teste Gold, preconizado pela OMS), sendo submetidos à prova de aglutinação macroscópica. Para tanto será utilizado uma placa de vidro com divisões.

A presente invenção, no que se refere à VACINA CONTRA 0LEPTOSPIROSE ANIMAL, objetiva uma vacina com maior poder de imunogenicidade, a partir da obtenção de uma massa pura de leptospiras integras, sem a presença de outras proteínas oriundas do próprio meio de cultura, quando comparada com as vacinas produzidas e comercializadas atualmente.

Também se propõe obter uma vacina que contenha 10 ⁹ leptospiras por ml 5adicionada de adjuvante (Hidróxido de Alumínio). Nestas condições, a vacina a ser obtida, poderá dar uma proteção vacinai nos animais entre 9 à 12 meses contra a referida prevalência entre os animais, a partir de referências científicas.

As cepas de leptospiras cultivadas separadamente, após centrifugação, deverão ser lavadas em solução de NaCI (Cloreto de Sódio), sendo então 0misturadas ("pool" - todas as culturas de leptospiras juntas) e re-suspensas em solução de NaCI 0,9%, contendo de 0,1 a 1 ,0% de formalina, ajustando a concentração para 10 ⁹ leptospiras por ml, utilizando solução de Hidróxido de Alumínio como adjuvante. A eficácia da inativação das leptospiras pela formalina é checada inoculando a vacina em meio de cultura líquido, mantido a 15 - 30° C.

O teste de esterilidade da vacina, é realizado pelo inoculado de 0,5ml à 2,5ml da vacina em 5,0ml à 20,0ml de meio de cultura de Tioglicolato.

5 O teste para determinar a potência da vacina (imunogenicidade), será realizado em hamster (animal com 21 dias de vida), após determinar a DL ₅ o, segundo método de Reed & Muench ( forma padrão de chegar ao resultado da DLso).

Após realizar o controle de qualidade dos lotes da vacinas de leptospiras lOproduzidos ("pool"), os mesmos serão envazados e liberados para comercialização.

Conforme descrito anteriormente e repetido abaixo a obtenção segue os seguintes passos:

- Para a realização dos trabalhos, são utilizados os sorovares de leptospiras, causadores da Leptospirose e de maior relevância no Homem e nos animais

15bovinos, suínos, equinos e caninos: L. icterohaemorrhagiae; L. copenhageni; L. canicola; L. pomona; L. grippotyphosa; L. hardjo e L. wolffi. Estes sorovares de leptospiras, foram, obtidos no Centro de Refência para Leptospirose, na FIOCRUZ/RJ. Estas cepas de Leptospiras são mantidas em meio semi-sólido, com repiques a cada três meses.

0 - As amostras de leptospiras são cultivadas em meio líquido. Este meio líquido é preparado, numa primeira fase, 10 (dez) vezes concentrado, totalmente estéril, podendo ser acondicionado à temperatura ambiente. O meio de cultura assim elaborado, contém para cada 1000 ml, 1 ,0g de Fosfato Disódico; 0,3g de Fosfato Monopotásico; 1 ,0g de Cloreto de Sódio; 0,25g de Cloreto de Amónio; de 0,1 mg à 50, 8mg de Tiamina; 0, 1g à 0,7g de Piruvato de Sódio; 0,1 ml de Glicerina; Cloreto de Cálcio e Cloreto de Magnésio 0,5mg à 15mg; 4mg de ZnSO ₄ .7H2o; Hémacias Bovina entre 0,1 à 1 ,4mg; 2mg de Cianocobalamina e Tween-80 entre 0,7 à 1 ,5ml. O meio de cultura deverá ser esterilizado por sistema de filtração, tendo o pH final 6,0 à 8,7, antes do uso. O cultivo das cepas de leptospiras, é realizado em tubos de vidro com 0tampa de rosca contendo 10ml de meio de cultura, adicionando de 2 à 10% de cultura de leptospira e mantidos a temperatura de 15-30° C por até 10 (dez) dias para crescimento. - Passados os dias de incubação, os tubos apresentando crescimento bacteriano, serão examinados quanto à pureza, densidade e presença ou não de auto-aglutinação. Os tubos com crescimento bacteriano satisfatório serão utilizados para uma segunda passagem, sendo inoculados em frascos com 100ml do mesmomeio de cultura e incubados com agitação, a temperatura entre 15 - 3 ^o C, para crescimento por mais uma semana. Após este período, procede-se novamente a avaliação quanto à pureza, densidade e auto-aglutinação. Os frascos com aspectos satisfatórios ao exame visual (crescimento homogéneo com turvação no terço superior do tubo e sem presença de grumos), serão inoculados em erlenmeyer de 2(dois) litros, contendo entre 200ml à 1000ml do mesmo meio de cultura e incubado, com agitação, a temperatura entre 15 - 30° C. Este procedimento é utilizado para os 7 (sete) diferentes sorovares de leptospiras citados anteriormente. Após este período, proceder a avaliação da cultura, quanto à pureza, densidade de crescimento e auto-aglutinação. Apresentando condições satisfatórias, inativar acultura com formol à mais para verificação de inexistência de leptospiras vivas por meio de microscopia de campo escuro com aumento de 450 vezes, procede-se, então, a centrifugação a 5000 rpm de 30 à 60 minutos.

- Após a centrifugação e desprezando o sobrenadante, as leptospiras serão lavadas com solução salina (NaCL 0, 5M) e, finalmente re-suspensas em pequenovolume de solução salina tamponada (PBS) 0,01 M. As bactérias assim preparadas serão deixadas uma noite a 4° C, para estabilização. Para cada cepa de leptospira deverá ser realizado individualmente, todo o processo descrito acima.

A dose de vacina inoculada compreende:

1. Animais de porte grande: 02 à 03 ml da vacina.

2. Animais de porte pequeno: 01 ml da vacina.