Probe und Lichtblattmikroskop

Die Erfindung betrifft ein lichtblattmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung eines Volumenbildes einer Probe.

Konventionelle Lichtblattmikroskope weisen probenseitig zwei separate Objektive auf, von denen eines der Beleuchtung und das andere der Detektion dient. Über das Beleuchtungsobjektiv wird üblicherweise ein parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausgerichtetes Lichtblatt in die Probe fokussiert. Das von der Probe durch die Beleuchtung mit dem Lichtblatt erzeugte Fluoreszenzlicht wird dann von einem Detektionsobjektiv, dessen optische Achse rechtwinklig zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs liegt, auf einen Detektor abgebildet. Für Anwendungen, in denen eine Abbildung der Probe mittels eines solchen mit zwei separaten Objektiven ausgestatteten Lichtblattmikroskops mangels Raum nicht möglich ist, wurde in der US 8 582 203 B2 eine optische Anordnung vorgeschlagen, die mit einem einzigen der Probe zugewandten Objektiv auskommt. Bei diesem Mikroskop wird das Lichtblatt derart in die Probe fokussiert, dass es zur optischen Achse des Objektivs schräg gestellt ist. Wegen dieser Schrägstellung wird eine solche optische Anordnung auch als Schiefebenenmikroskop (OPM:„oblique plane microscope") bezeichnet.

Die aus der vorgenannten Druckschrift US 8 582 203 bekannte optische Anordnung zur Lichtblattmikroskopie umfasst eine Beleuchtungsoptik, eine Transportoptik und eine Detektionsoptik, deren optische Achse gegenüber der optischen Achse der Transportoptik verkippt ist. Ein von der Beleuchtungsoptik erzeugtes Lichtblatt wird durch die Transportoptik in eine Probe abgebildet. Dadurch wird eine in der Probe liegende Schicht beleuchtet und zur Fluoreszenz angeregt. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht wird durch die Transportoptik in einen Zwischenbildraum abgebildet, wodurch dort ein Zwischenbild der beleuchteten Schicht erzeugt wird. Die- ses Zwischenbild wird zur Erzeugung eines Schichtbildes durch die Detektionsoptik auf einen Bildsensor, beispielweise einen CCD-Chip, abgebildet. Um einen Volumenbereich der Probe mit dem Lichtblatt abzutasten, sind die Detektionsoptik und/oder die Beleuchtungsoptik bewegbar ausgeführt.

Aus der US 8 619 237 B2 ist eine alternative Anordnung bekannt, die eine laterale Abtastung des Volumenbereichs mit Hilfe zweier Umlenkelemente ermöglicht, von denen eines dem Lichtblatt und das andere einer Abbildungsebene zugeordnet ist. Die beiden Umlenkelemente sind an einem Polygonspiegel ausgebildet und damit geometrisch miteinander gekoppelt.

Werden Schichtbilder mehrerer längs einer Abtastrichtung in der Probe aufeinanderfolgender Schichten zu einem Schichtbildstapel zusammengesetzt, so ergibt sich aufgrund der Verkippung der optischen Achse der Detektionsoptik gegenüber der optischen Achse der Transportoptik eine Scherung des Schichtbildstapel und damit ein verschertes Volumenbild des beleuchteten Probenbereichs.

Um mit einem Schiefebenenmikroskop aufgenommene Volumenbilddaten sche- rungsfrei darzustellen, ist eine Transformation der Volumenbilddaten notwendig, die gemeinhin als Entscherung bekannt ist. Diese Entscherung ist insbesondere dann notwendig, wenn eine Korrelation der schiefebenenmikroskopisch aufgenommenen Volumenbilddaten mit Bilddaten hergestellt werden soll, die mit anderen, z.B. konfo- kalmikroskopischen Methoden gewonnen werden.

Üblicherweise erfolgt eine solche Entscherung durch Anwenden einer geometrischen Transformation, insbesondere einer inversen Scherung, die auf die Koordinaten eines Zielbildraums angewendet wird. Diese ergibt die Koordinaten eines Bildpunktes in den Volumenbilddaten, welcher dann in den Zielbildraum an den zugeordneten Ko- ordinaten übernommen wird. Da es sich bei den Volumenbilddaten um diskrete Bilddaten handelt, liegt in der Regel am rücktransformierten Koordinatenpunkt kein Bildpunkt. Darum ist es notwendig, die Bilddaten an diesem Koordinatenpunkt durch Interpolation zu ermitteln. Da dies für jeden Bildpunkt in dem Volumenbild durchgeführt werden muss, ist diese Methode numerisch aufwändig, insbesondere wenn viele Bildpunkte zu interpolieren sind und präzisere Interpolationsmethoden als z.B. eine multilineare Interpolation zum Einsatz kommen sollen. Ferner treten bei der Interpolation von Bildpunkten, insbesondere bei einer linearen Interpolation, unerwünschte Bildartefakte auf.

Ausgehend von dem genannten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein lichtblattmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung eines Volumenbildes einer Probe sowie ein Lichtblattmikroskop anzugeben, die eine effiziente und artefaktfreie Volu- menbildgebung mit vergleichsweise geringem Aufwand ermöglichen.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen sowie der folgenden Beschreibung angegeben.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem Zwischenbildraum durch eine Beleuchtungsoptik ein Lichtblatt erzeugt. Das Lichtblatt wird mit Hilfe einer Transportoptik in die Probe abgebildet, wobei sich das Lichtblatt längs einer Lichtausbreitungsrichtung und einer hierzu senkrechten Ausdehnungsrichtung erstreckt. Mit Hilfe des Lichtblattes werden mehrere längs einer Abtastrichtung aufeinanderfolgende Schichten der Probe beleuchtet, so dass ein Volumenbereich der Probe abgetastet wird, der im Wesentlichen die Form eines Parallelepipeds hat, das durch die Lichtausbreitungsrichtung, die Ausdehnungsrichtung und die Abtastrichtung aufgespannt ist. Die beleuchteten Schichten werden durch die Transportoptik jeweils als Zwi- schenbild in den Zwischenbildraum abgebildet. Durch eine Detektionsoptik, deren optische Achse gegenüber der optischen Achse der Transportoptik um einen Kippwinkel verkippt ist, wird aus den Zwischenbildern der beleuchteten Schichten jeweils ein Schichtbild erzeugt. Es werden Volumenbilddaten erzeugt, die einen aus den Schichtbildern zusammengesetzten Schichtbildstapel darstellen, wobei die Relativpositionen der einzelnen Schichtbilder längs der Lichtausbreitungsrichtung aufgrund der Verkippung der optischen Achse der Detektionsoptik gegenüber der optischen Achse der Transportoptik gegenüber den Relativpositionen der beleuchteten Schichten längs der Lichtausbreitungsrichtung verändert sind, so dass der Schichtbildstapel gegenüber dem abgetasteten Volumenbereich um den Kippwinkel geschert ist.

Es werden erste Spektraldaten durch eine zweidimensionale erste Transformation eines durch die Scherung nicht verzerrten ersten Teils der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels erzeugt, wobei die erste Transformation in ersten Bildkoordinaten längs der Ausdehnungsrichtung und in zweiten Bildkoordinaten längs der Abtastrichtung erfolgt. Auf einen durch die Scherung verzerrten zweiten Teil der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels wird eine Entscheroperation angewendet. Durch die Ausdehnungsrichtung, die Abtastrichtung und eine zu den beiden vorgenannten Richtungen senkrechte dritte Richtung wird ein Zielbildraum definiert. In dem Zielbildraum wird aus den ersten Spektraldaten und dem durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teil der Volumenbilddaten das Volumenbild erzeugt. Das resultierende Volumenbild bildet dabei eine im Wesentlichen unverscherte Darstellung des Volumenbereichs der Probe.

Der Schichtbildstapel ist gegenüber dem Volumenbereich um den Kippwinkel in der Weise geschert, dass die Relativpositionen von Bildebenen, die durch die Ausdehnungsrichtung und die Abtastrichtung aufgespannt werden, längs der Abtastrichtung gegenüber den Relativpositionen der entsprechenden Ebenen des Volumenbereichs längs der Abtastrichtung verändert sind. Diese Bildebenen sind gegenüber entsprechenden Flächen des Volunnenbereichs jedoch nicht verzerrt. Damit ist insbesondere gemeint, dass die vorgenannten Ebenen des Volumenbereichs winkeltreu und unter Erhaltung ihrer Streckenverhältnisse auf die Bildebenen abgebildet werden. Unter einer solchen im erfindungsgemäßen Sinne nicht verzerrten Abbildung ist beispielsweise eine Abbildung zu verstehen, die ein Rechteck wieder in ein Rechteck überführt. Bildebenen, die durch die Lichtausbreitungsrichtung und die Abtastrichtung aufgespannt werden, sind hingegen gegenüber entsprechenden Ebenen des Volumenbereichs verzerrt. Eine im erfindungsgemäßen Sinne verzerrte Abbildung führt beispielsweise ein Rechteck in ein Parallelogramm über.

Die erste Transformation erfolgt in den ersten Bildkoordinaten längs der Ausdehnungsrichtung und in den zweiten Bildkoordinaten längs der Abtastrichtung. Es werden also genau jene Bildebenen transformiert, die durch die Scherung im erfindungsgemäßen Sinne nicht verzerrt sind. Durch die erste Transformation werden die in den Volumenbilddaten enthaltenen Bildinformationen gleichsam derart aufgeteilt, dass der durch die Scherung verzerrte Teil der Bildinformationen von dem von der Scherung nicht verzerrten Teil der Bildinformationen getrennt verarbeitet werden kann. Der nicht verzerrte Teil der Bildinformationen ist durch den ersten Teil der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels bzw. die ersten Spektraldaten repräsentiert, während der verzerrte Teil der Bildinformationen durch den zweiten Teil der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels repräsentiert ist. Die ersten Spektraldaten können ferner als Grundlage für weitere Bildverarbeitungsprozesse dienen, insbesondere der Anwendung von Filtern, die auf Dekonvolutionsalgorithmen basieren, um beispielsweise eine Bildunschärfe zu beseitigen. Bei der Entscheroperation handelt es sich insbesondere um die Multiplikation des zweiten Teils der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels mit einer sogenannten Phasenrampe.

Der Zielbildraum kann vorteilhafterweise derart gewählt werden, dass eine Korrelation der schiefebenenmikroskopisch aufgenommenen Volumenbilddaten mit Bilddaten hergestellt werden kann, die mit anderen Methoden, z.B. mittels eines Konfokalmikroskops, gewonnen werden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens werden durch eine eindimensionale zweite Transformation des durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teils der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels zweite Spektraldaten erzeugt, wobei die zweite Transformation in dritten Bildkoordinaten längs der Lichtausbreitungsrichtung erfolgt. In dem Zielbildraum wird aus den ersten Spektraldaten und den zweiten Spektraldaten das Volumenbild erzeugt. Die zweite Transformation ist eine Interpolationsoperation in den dritten Bildkoordinaten. Durch die zweite Transformation werden die Bildpunkte des durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teils der Volumenbilddaten interpoliert. Die zweiten Spektraldaten können ferner als Grundlage für weitere Bildverarbeitungsprozesse dienen.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens ist die erste Transformation und/oder die zweite Transformation eine Chirp-Z-Transformation. Die Chirp- Z-Transformation kann numerisch effizient durch zwei diskrete Fourier- Transformationen (DFT) dargestellt werden, die jeweils durch eine schnelle Fourier- Transformation (FFT) durchgeführt werden kann. Für diese stehen eine Vielzahl von Algorithmen und Implementierungen sowohl für zentrale Verarbeitungseinheiten (CPU) als auch Grafikprozessoren (GPU) zur Verfügung. In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird durch die erste und/oder zweite Transformation ein Raster des Volumenbildes eingestellt. Insbesondere bei der Anwendung der Chirp-Z-Transformation kann das auch als Sampling bezeichnete Raster der diskreten Spektraldaten bei der Transformation frei gewählt werden. Dadurch liegen schon die Spektraldaten in dem gewünschten Raster vor, so dass zur Erzeugung des Volumenbildes im Zielbildraum nur eine einfache DFT notwendig ist, die sich effizient als FFT ausführen lässt.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird die Auflösung des Volumenbildes durch Anwenden einer ersten Bandpassfunktion auf die ersten Spektraldaten und/oder Anwenden einer zweiten Bandpassfunktion auf die zweiten Spektraldaten begrenzt. Bei allen drei Transformationen können in den Spektraldaten Frequenzen jenseits der Nyquist-Frequenz, d.h. Frequenzen, die aufgrund des Rasters der Volumenbilddaten gar nicht aufgelöst werden können, erzeugt werden. Diese Frequenzen verursachen bei der Erzeugung des Volumenbildes Artefakte aufgrund des sogenannten Alias-Effektes. Durch die Anwendung einer Bandpassfunktion werden diese Frequenzen aus den Spektraldaten beseitigt.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens liegt die Abtastrichtung längs der optischen Achse der Transportoptik, wodurch sich eine axiale Abtastung der Probe mittels des Lichtblattes realisieren lässt.

In einer alternativen Weiterbildung des Verfahrens liegt die Abtastrichtung quer zur optischen Achse der Transportoptik. In dieser Weiterbildung wird die Probe lateral mit dem Lichtblatt abgetastet. Vorzugsweise wird die Probe durch das Lichtblatt zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht beleuchtet. Dadurch lässt sich ein besonders probenschonendes fluoreszenzmikroskopisches Verfahren realisieren, das zugleich eine hohe Auflösung ermöglicht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop zur Erzeugung eines Volumenbildes einer Probe. Das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop umfasst eine Beleuchtungsoptik zur Erzeugung eines Lichtblattes in einem Zwischenbildraum. Das Lichtblatt erstreckt sich längs einer Lichtausbreitungsrichtung und einer hierzu senkrechten Ausdehnungsrichtung. Das Lichtblattmikroskop umfasst eine Transportoptik zum Abbilden des Lichtblattes in die Probe und zum Abbilden von aus der Probe stammendem Detektionslicht in den Zwischenbildraum. Das Lichtblattmikroskop hat eine Abtastvorrichtung zum schrittweisen Beleuchten mehrerer längs einer Abtastrichtung aufeinanderfolgender Schichten der Probe mit dem Lichtblatt. Dadurch wird ein Volumenbereich der Probe abgetastet, der im Wesentlichen die Form eines Parallelepipeds hat, das durch die Lichtausbreitungsrichtung, die Ausdehnungsrichtung und die Abtastrichtung aufgespannt ist. Das Lichtblattmikroskop hat eine Detek- tionsoptik zum Erzeugen jeweils eines Schichtbildes aus den Zwischenbildern der beleuchteten Schichten, wobei die optische Achse der Detektionsoptik gegenüber der optischen Achse der Transportoptik um einen Kippwinkel verkippt ist. Ferner weist das Lichtblattmikroskop eine Bildverarbeitungseinheit auf.

Die Bildverarbeitungseinheit erzeugt Volumenbilddaten, die einen aus den Schichtbildern zusammengesetzten Schichtbildstapel darstellen, wobei die Relativpositionen der einzelnen Schichtbilder längs der Lichtausbreitungsrichtung aufgrund der Verkippung der optischen Achse der Detektionsoptik gegenüber der optischen Achse der Transportoptik gegenüber den Relativpositionen der entsprechenden beleuchteten Schichten längs der Lichtausbreitungsrichtung verändert sind, so dass der Schichtbildstapel gegenüber dem abgetasteten Volumenbereich um den Kippwinkel ge- schert ist. Die Bildverarbeitungseinheit erzeugt erste Spektraldaten durch eine zweidimensionale erste Transformation eines durch die Scherung nicht verzerrten ersten Teils der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels, wobei die erste Transformation in ersten Bildkoordinaten längs der Ausdehnungsrichtung und in zweiten Bildkoordinaten längs der Abtastrichtung erfolgt. Die Bildverarbeitungseinheit wendet eine Ent- scheroperation auf einen durch die Scherung verzerrten zweiten Teil der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels an. Ferner erzeugt die Bildverarbeitungseinheit in einem Zielbildraum, der durch die Ausdehnungsrichtung, die Abtastrichtung und eine zu den beiden vorgenannten Richtungen senkrechte dritte Richtung definiert ist, aus den ersten Spektraldaten und dem durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teil der Volumenbilddaten das Volumenbild.

In einer vorteilhaften Weiterbildung erzeugt die Bildverarbeitungseinheit zweite Spektraldaten durch eine eindimensionale zweite Transformation des durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teils der Volumenbilddaten des Schichtbildstapels, wobei die zweite Transformation in dritten Bildkoordinaten längs der Lichtausbreitungsrichtung erfolgt. Ferner erzeugt die Bildverarbeitungseinheit aus den ersten Spektraldaten und den zweiten Spektraldaten das Volumenbild. Durch die zweite Transformation werden die Bildpunkte des durch die Entscheroperation entscherten zweiten Teils der Volumenbilddaten interpoliert. Die zweiten Spektraldaten können ferner als Grundlage für weitere Bildverarbeitungsprozesse, die durch die Bildverarbeitungseinheit durchgeführt werden können, dienen.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung weist das Lichtblattmikroskop ein einziges der Probe zugewandtes Objektiv auf. Dies ermöglicht einen Zugang zur fluoreszenzbasierten mikroskopischen Lichtblattbildmikroskopie in Proben, deren Abbildung mittels eines konventionellen, über zwei Objektive verfügenden Lichtblattmikroskops etwa mangels Raum nicht möglich ist. In einer vorteilhaften Weiterbildung weist die Beleuchtungsoptik wenigstens eine Lichtquelle und ein Beleuchtungsobjektiv auf. Die Lichtquelle erzeugt das Lichtblatt, das durch das Beleuchtungsobjektiv in den Zwischenbildraunn abgebildet wird. Zur Erzeugung des Lichtblattes kann die Lichtquelle z.B. eine Zylinderlinse aufweisen. Alternativ kann die Lichtquelle nnittels eines Abtastelements auch ein quasistatisches Lichtblatt erzeugen.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst die Transportoptik wenigstens das der Probe zugewandte Objektiv, eine Tubuslinse und ein Projektionsobjektiv. Die Transportoptik bildet vorzugsweise ein beidseitig telezentrisches optisches System, das den Bildtransport von dem Zwischenbildraum in die Probe und von der Probe in den Zwischenbildraum ermöglicht.

In einer vorteilhaften Weiterbildung u die Detektionsoptik wenigstens ein Detekti- onsobjektiv, eine erste Tubuslinse, eine zweite Tubuslinse und einen Bildsensor, beispielsweise einen CCD- oder CMOS-Chip. Das Detektionsobjektiv und die beiden Tubuslinsen bilden die in dem Zwischenbildraum erzeugten Zwischenbilder der beleuchteten Probenschichten jeweils auf den Bildsensor ab.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst die Abtastvorrichtung mindestens einen Rasterspiegel, durch welchen das Lichtblatt quer zur optischen Achse der Transportoptik bewegbar ist.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst die Abtastvorrichtung mindestens eine elektronische Fokussiereinrichtung zum Einstellen einer Schärfeebene der Transportoptik. Durch die elektronische Fokussiereinrichtung kann das Lichtblatt in einer axialen Abtastbewegung gleichsam durch die Probe geschoben werden. Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:

Figur 1 ein erstes Ausführungsbeispiel eines Lichtblattmikroskops, das eine

Abtastung lateral zur optischen Achse einer Transportoptik vorsieht,

Figur 2 ein zweites Ausführungsbeispiel eines Lichtblattmikroskops, das eine

Abtastung längs der optischen Achse der Transportoptik vorsieht,

Figur 3 die Geometrie eines Detektionsvolumens des Lichtblattmikroskops bei

Abtastung lateral zur optischen Achse der Transportoptik nach Figur 1,

Figur 4 die Geometrie eines Detektionsvolumens des Lichtblattmikroskops bei

Abtastung längs der optischen Achse der Transportoptik nach Figur 2,

Figur 5 ein Flussdiagramm zur Erläuterung eines Ausführungsbeispiels des Verfahrens zur Erzeugung eines Volumenbildes,

Figur 6 ein schiefwinkliges Koordinatensystem von Volumenbilddaten bei Abtastung lateral zur optischen Achse der Transportoptik nach Figur 1,

Figur 7 ein schiefwinkliges Koordinatensystem von Volumenbilddaten bei Abtastung längs der optischen Achse der Transportoptik nach Figur 2,

Figur 8 ein auf einen Zielbildraum bezogenes rechtwinkliges Koordinatensystem, und Figur 9 ein Blockdiagram zur Erläuterung eines Verfahrens zur Datennahme mit Hilfe des Lichtblattmikroskops mit lateraler Lichtblattabtastung gemäß Figur 1 oder mit axialer Lichtblattabtastung gemäß Figur 2.

Figur 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Lichtblattmikroskops 10 zur Erzeugung eines Volumenbildes einer Probe 12 in einer schematischen Darstellung.

Das Lichtblattmikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungsoptik 20, eine Transportoptik 30 und eine Detektionsoptik 50. Die optische Achse 03 der Detektionsoptik 50 ist gegenüber der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 um einen Kippwinkel α verkippt. Die optische Achse Ol der Beleuchtungsoptik 20 steht senkrecht auf der optischen Achse 03 der Detektionsoptik 50, so dass die optische Achse Ol der Beleuchtungsoptik 20 gegenüber der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 um einen Winkel 90° - α verkippt ist. Die drei vorgenannten optischen Achsen Ol, 02, 03 schneiden sich in einem Zwischenbildraum 14. Ferner weist das Lichtblattmikroskop 10 eine Bildverarbeitungseinheit 70 auf.

Die Beleuchtungsoptik 20 umfasst eine Lichtquelle 22 und ein Beleuchtungsobjektiv 24. Die Lichtquelle 22 erzeugt ein Lichtblatt, beispielsweise mit Hilfe einer in Figur 1 nicht explizit gezeigten Zylinderlinse, wobei sich das Lichtblatt unter Bezugnahme auf ein in Figur 1 dargestelltes schiefwinkliges Koordinatensystem in einer Lichtausbreitungsrichtung A und einer hierzu senkrechten Ausdehnungsrichtung B erstreckt. Alternativ kann die Lichtquelle 22 mittels eines eigens hierfür vorgesehenen Abtastelements auch ein quasistatisches Lichtblatt erzeugen. Das Beleuchtungsobjektiv 24 bildet das Lichtblatt in den Zwischenbildraum 14 ab.

Die Transportoptik 30 umfasst von der Probe 12 her gesehen ein der Probe 12 zugewandtes Objektiv 32, eine erste Tubuslinse 34, ein erstes Okular 36, ein zweites Oku- lar 38, eine zweite Tubuslinse 40 und ein Projektionsobjektiv 42, die längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 angeordnet sind. Zwischen dem ersten Okular 36 und dem zweiten Okular 38 ist eine Abtastvorrichtung 60 mit einem Rasterspiegel 64 angeordnet, an dem die optische Achse 02 der Transportoptik 30 umgelenkt wird.

Die Transportoptik 30 bildet das Lichtblatt aus dem Zwischenbildraum 14 in die Probe 12 ab. Durch das Lichtblatt innerhalb der Probe 12 beleuchtete Schichten 82 (vgl. Figur 3) werden durch die Transportoptik 30 jeweils als Zwischenbild zurück in den Zwischenbildraum 14 abgebildet.

Mit Hilfe des beweglichen Rasterspiegels 64 kann das Lichtblatt längs einer Abtastrichtung C, die in der Probe 12 senkrecht zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 liegt, durch die Probe 12 bewegt werden. Dadurch können die längs der Abtastrichtung C aufeinanderfolgenden Schichten 82 der Probe 12 beleuchtet werden, so dass ein Volumenbereich 80 der Probe 12 abgetastet wird, der im Wesentlichen die Form eines Parallelepipeds hat, das durch die Lichtausbreitungsrichtung A, die Ausdehnungsrichtung B und die Abtastrichtung C aufgespannt und durch den Kippwinkel α charakterisiert ist. Die Geometrie des abgetasteten Volumenbereichs 80 ist in Figur 3 dargestellt. Der in Figur 3 gezeigte Volumenbereich 80 resultiert aus einer Scherung eines Quaders um einen Scherwinkel von 90° - α in Richtung der Abtastrichtung C.

Die Detektionsoptik 50 umfasst von dem Zwischenbildraum 14 her gesehen ein De- tektionsobjektiv 52, eine Tubuslinse 54 und einen Bildsensor 56. Die in dem Zwischenbildraum 14 liegenden Zwischenbilder der beleuchteten Schichten 82 werden durch das Detektionsobjektiv 52 und die Tubuslinse 54 auf den Bildsensor 56 abgebildet. Auf diese Weise werden auf dem Bildsensor 56 Schichtbilder erzeugt, die den mit dem Lichtblatt beleuchteten Schichten 82 zugeordnet sind. Die Bildverarbeitungseinheit 70 verarbeitet die durch den Bildsensor 56 aufgenommenen Schichtbilder in Form von Bilddaten weiter zu einem Volumenbild des in Figur 3 gezeigten Volumenbereichs 80 der Probe 12. Dieser Bildverarbeitungsprozess wird später unter Bezugnahme auf Figur 5 näher erläutert.

Bei dem in Figur 1 gezeigten Ausführungsbeispiel erfolgt die Abtastung der Probe 12 mittels des Lichtblatts in der Weise, dass das Lichtblatt in Abtastrichtung C quer zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 bewegt wird. Demgegenüber ist in Figur 2 ein zweites Ausführungsbeispiel des Lichtblattmikroskops 10 gezeigt, das sich von dem ersten Ausführungsbeispiel nach Figur 1 im Wesentlichen dadurch unterscheidet, dass die Abtastung der Probe 12 durch das Lichtblatt axial, d.h. längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 erfolgt. Die Geometrie des derart abgetasteten Volumenbereichs 80 ist in Figur 4 dargestellt. Der in Figur 4 gezeigte Volumenbereich 80 resultiert aus einer Scherung eines Quaders um den Kippwinkel α in Richtung der Abtastrichtung C.

In dem zweiten Ausführungsbeispiel umfasst die Transportoptik 30 von dem Zwi- schenbildraum 14 her gesehen das Projektionsobjektiv 42, die beiden Tubuslinsen 34, 40 und das der Probe 12 zugewandte Objektiv 32. Das Projektionsobjektiv 42 weist eine elektronische Fokussiereinrichtung 62 auf.

Die Detektionsoptik 50 umfasst von dem Zwischenbildraum 14 her gesehen das De- tektionsobjektiv 52, die Tubuslinse 54 und den Bildsensor 56.

In dem Ausführungsbeispiel nach Figur 2 ist die Abtastvorrichtung 60 durch die elektronische Fokussiereinrichtung 62 gebildet. Durch die elektronische Fokussiereinrichtung 62 sind das Lichtblatt und gleichzeitig die dazu koplanare Detektionsebene längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 bewegbar. Das entsprechende Schichtbild der durch das Lichtblatt beleuchteten Schicht 82 wird durch den Bildsensor 56 aufgenommen.

Figur 5 zeigt ein Flussdiagramm zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung eines Volumenbildes.

In Schritt S10 werden die Schichtbilder bereitgestellt. Dies kann insbesondere mit Hilfe der lateralen Lichtblattabtastung gemäß Figur 1 oder mit Hilfe der axialen Lichtblattabtastung gemäß Figur 2 erfolgen. Die einzelnen Schichtbilder entsprechen jeweils den durch das Lichtblatt beleuchteten Schichten 82 längs der Abtastrichtung C innerhalb der Probe 12.

In Schritt S12 werden aus den bereitgestellten Schichtbildern Volumenbilddaten erzeugt. Die Volumenbilddaten repräsentieren einen aus den Schichtbildern zusammengesetzten Schichtbildstapel. Die einzelnen in dem Schichtbildstapel enthaltenen Schichtbilder sind aufgrund der Verkippung der optischen Achse 03 der Detekti- onsoptik 50 gegenüber der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 längs der Lichtausbreitungsrichtung A gegeneinander versetzt, so dass der Schichtbildstapel ein um den Kippwinkel α geschertes Bild des Volumenbereichs 80 der Probe 12 darstellt.

Ferner werden die Volumenbilddaten in Schritt S12 in einem Speicherbereich abgelegt. Der Speicherbereich ist dabei so groß gewählt, dass er Bilddaten innerhalb eines quaderförmigen Volumens fassen kann, das den in Figur 3 bzw. Figur 4 gezeigten Volumenbereich vollständig einschließt. Dadurch ist gewährleistet, dass für die folgenden Operationen genug freie Speicherkapazität zur Verfügung steht. Die Bildpunkte der Volumenbilddaten liegen auf den Koordinaten p ' _qrs = q - Δχ' x ' + r ^■ Δγ' y ' + s ^■ Δζ' z ' vor, wobei die Indizes q = 0 ... Q'— 1, r = 0 ... R'— 1, s = 0 ... S'— 1 die Rasterpunkte der detektierten Daten und (Δχ', Δγ', Δζ') die Rasterabstände bezeichnen.

Erfolgt die Abtastung lateral zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30, so sind die Vektoren x ', y ' und z ' die Einheitsvektoren in Ausdehnungsrichtung B, Abtastrichtung C bzw. Ausbreitungsrichtung A. Somit entsprechen die Vektoren x ', y ' und z ' den Basisvektoren eines schiefwinkligen Koordinatensystems, in dem erste Bildkoordinaten, zweite Bildkoordinaten und dritte Bildkoordinaten definiert sind. Im Falle der lateralen Abtastung sind die ersten Bildkoordinaten dem Vektor z ' , die zweiten Bildkoordinaten dem Vektor y ' und die dritten Bildkoordinaten dem Vektor x ' zugeordnet. Das durch die Vektoren x ', y ' und z ' aufgespannte, schiefwinklige Koordinatensystem ist durch den Kippwinkel α charakterisiert. Die Vektoren z ' und y ' schließen den Kippwinkel α ein, während der Vektor x ' senkrecht auf der von z ' und y ' aufgespannten Ebene steht. Das durch die Vektoren x ', y ' und z ' aufgespannte Koordinatensystem ist für die laterale Abtastung in Figur 6 gezeigt. Die Rasterabstände Δχ' und Δζ' entsprechen den Pixelgrößen des Bildsensors 56, und Δγ' entspricht einem Abtastschritt des Rasterspiegels 64.

Erfolgt die Abtastung axial, d.h. längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30, so sind die Vektoren x ', y ' und z ' die Einheitsvektoren in Ausdehnungsrichtung B, Ausbreitungsrichtung A bzw. Abtastrichtung C. Somit entsprechen die Vektoren x ', y ' und z ' wiederum den Basisvektoren eines schiefwinkligen Koordinatensystems, in dem erste Bildkoordinaten, zweite Bildkoordinaten und dritte Bildkoordinaten definiert sind. Im Falle der axialen Abtastung sind die ersten Bildkoordinaten dem Vektor y ', die zweiten Bildkoordinaten dem Vektor z ' und die dritten Bildkoordinaten dem Vektor x ' zugeordnet. Das durch die Vektoren x ', y ' und z ' aufgespannte, schiefwinklige Koordinatensystem ist durch den Kippwinkel α charakterisiert. Die Vektoren z ' und y ' schließen einen Winkel von 90° - α ein, während der Vektor x ' senkrecht auf der von z ' und y ' aufgespannten Ebene steht. Das im Falle axialer Abtastung durch die Vektoren x ', y ' und z ' aufgespannte Koordinatensystem ist in Figur 7 gezeigt.

Den Pixelgrößen des Bildsensors 56 entsprechen Δχ' und Ay' , und Δζ' entspricht einem Schritt der Fokussiereinrichtung 62 (z. B. Piezo-Fokussiereinrichtung) entlang der Abtastrichtung C.

In Schritt S14 wird ein Zielbildraum eingestellt, in dem die Volumenbilddaten dargestellt werden sollen. Dieser kann insbesondere so gewählt werden, dass eine Korrelation der schiefebenenmikroskopisch aufgenommenen Volumenbilddaten mit Bilddaten hergestellt werden kann, die mit anderen Methoden gewonnen werden.

Die Koordinaten der Bildpunkte des Zielbildraums sind mit q = 0 ... Q— 1, r = 0 ... R— 1, s = 0 ... S— 1. Die Vektoren x, y und z spannen ein rechtwinkliges Koordinatensystem auf, das in Figur 8 dargestellt ist. Das Spektrum des Zielbildraums, d.h. der Fourier-Raum, hat ein Raster, d.h. ein Sampling,

Λ Λ Λ

X y z

k Imn + m ^■ + n ^■

ΙΔχ ΜΔγ ΝΔζ ^' Hier kann Δχ = Δχ' (analog für die anderen Dimensionen) gewählt werden. Es kann aber auch ein anderes Raster für den Zielbildraum als für die Volumenbilddaten gewählt werden. Beispielsweise kann ein Raster gewählt werden, dass einem Raster eines anderen bildgebenden Verfahrens entspricht. Insbesondere kann das Raster der Volumenbilddaten gröber gewählt werden als das Raster für den Zielbildraum. Dadurch kann eine schnellere Volumenbildgebung erfolgen, da weniger Bildpunkte abgetastet und verarbeitet werden müssen. Dabei ist zu beachten, dass die Punkte

i

jenseits der Nyquist-Frequenz— (analog für die anderen Dimensionen) negative

Frequenzen darstellen. Dies ist aus den Eigenschaften der diskreten Fourier- Transformation bekannt. Deshalb muss bei der Verrechnung der Fourier-Raum- Indizes /, m und n für l > L/2 -» l— L ersetzt werden, analog für m und n.

Zwischen den Bildpunkten der Volumenbilddaten und den Bildpunkten des Zielbildraums lässt sich mittels einer geometrischen Transformation umrechnen. Diese geometrische Transformation lässt sich beispielweise für den Fall, dass die Abtastung lateral zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 erfolgt, wie folgt darstellen:

\0 0 sina/ wobei α den Kippwinkel angibt.

Erfolgt die Abtastung längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30, hat die geometrische Transformation die Form

Pqrs qrs- In Schritt S16 werden erste Spektraldaten durch eine zweidimensionale erste Chirp- Z-Transformation erzeugt. Die ersten Spektraldaten lassen sich im Fall einer Abtastung lateral zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 schreiben als

Q'-l R,-l

( Δχ' Δγ'

)exp

f Ims , f (P <? ^rs 2πί I ql + ττ— rm

\ ΙΔχ MAy

q=0 r=0

wobei f p' _q rs) = fqrs das Signal am Bildpunkt p' _qrs ist. Im Fall einer Abtastung längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 lassen sich die ersten Spektraldaten schreiben als

In den ersten Spektraldaten taucht der Kippwinkel α nicht auf, d.h. die ersten Spektraldaten sind von der Scherung nicht betroffen. Die erste Transformation teilt somit gleichsam die Volumenbilddaten in den von der Scherung nicht betroffenen ersten Teil und den von der Scherung betroffenen zweiten Teil auf.

Die ersten Spektraldaten lassen sich als eine zweidimensionale, separierbare erste Chirp-Z-Transformation formulieren. Die erste Chirp-Z-Transformation ist so gewählt, dass die ersten Spektraldaten in dem bei der Einstellung des Zielbildraums gewählten Raster vorliegen.

Die erste Chirp-Z-Transformation kann durch vier schnelle Fourier-Transformationen (FFT) - zwei FFT pro Dimension - berechnet werden kann. Alternativ kann die erste Chirp-Z-Transformation auch durch zwei zweidimensionale FFT berechnet werden. Aufgrund der Separierbarkeit der ersten Chirp-Z-Transformation ist es nicht nötig, die benötigten Faltungskerne zweidimensional zu berechnen, es genügen zwei eindimensionale Berechnungen.

In Schritt S18 wird eine erste Bandpassfunktion auf die ersten Spektraldaten angewendet. Insbesondere durch die Wahl eines feineren Rasters für den Zielbildraum als für die Volumenbilddaten, d.h. die detektierten Daten, entstehen in den ersten Spektraldaten Frequenzen jenseits der Nyquist-Frequenz, d.h. Frequenzen, die aufgrund des Rasters gar nicht aufgelöst werden können. Diese Frequenzen erzeugen im Volumenbild unerwünschte Artefakte und werden deswegen mit Hilfe der ersten Bandpassfunktion aus den ersten Spektraldaten beseitigt. Die erste Bandpassfunktion wirkt als Blende des Detektionssystems in der Ausdehnungsrichtung B und der Ausbreitungsrichtung A.

In Schritt S20 wird eine Entscheroperation auf den zweiten Teil der Volumenbilddaten angewendet. Die Entscheroperation ist im Fall einer Abtastung lateral zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 eine Multiplikation des zweiten Teils der Volumenbilddaten mit einer Phasenrampe

_A (S) _A (1) Az cosa

f Ims f Ims *~^P 2πί sm

MAy

Im Fall einer Abtastung längs der optischen Achse 02 der Transportoptik 30 ist die Entscheroperation einer Multiplikation des zweiten Teils der Volumenbilddaten mit einer Phasenrampe

_A (S) _A (1) Ay sin a

f Im f Im *~^P 2πί rn

MAz Diese Multiplikation wird für alle s = 0 ... S' — 1 bzw. r = 0 ... R' — 1 durchgeführt.

In Schritt S22 werden zweite Spektraldaten durch eine eindimensionale zweite Chirp- Z-Transformation erzeugt. Die zweiten Spektraldaten lassen sich im Fall einer Abtastung lateral zur optischen Achse 02 der Transportoptik 30 schreiben als

Die zweiten Spektraldaten sind durch die Scherung betroffen, was bedeutet, dass hier der Kippwinkel α auftritt. Im Fall einer Abtastung parallel zur optischen Achse 02 der Transportoptik lassen sich die zweiten Spektraldaten schreiben als

Die zweite Chirp-Z-Transformation ist so gewählt, dass die zweiten Spektraldaten in dem bei der Einstellung des Zielbildraums gewählten Raster vorliegen.

In Schritt S24 wird eine zweite Bandpassfunktion auf die zweiten Spektraldaten angewendet. Die zweite Bandpassfunktion entfernt Frequenzen jenseits der Nyquist- Frequenz aus den zweiten Spektraldaten, so dass das aus den zweiten Spektraldaten erzeugte Volumenbild frei von Artefakten ist, die durch den Alias-Effekt entstehen.

Die erste und die zweite Bandpassfunktion können insbesondere die Form eines optimalen Filters, eines sogenannten Wiener-Filters, aufweisen. Generell sind auch verschiedene andere Formen denkbar, beispielsweise eine harte Kante oder eine Fenster-Funktionen wie beispielsweise Hamming- oder Von-Hann-Fenster. In Schritt S26 wird durch eine diskrete Fourier-Transformation (DFT) aus den ersten Spektraldaten und den zweiten Spektraldaten das Volumenbild erzeugt. Da die ersten Spektraldaten und die zweiten Spektraldaten jeweils durch die erste bzw. zweite Chirp-Z-Transformation, erzeugt wurden, entspricht das Raster der Spektraldaten bereits dem gewählten Raster des Zielbildraums, so dass zu Erzeugung des Volumenbildes nur noch eine einfach und effizient durchführbare DFT notwendig ist.

Durch das Verfahren nach Figur 5 ist es also eine effiziente und artefaktfreie Volu- menbildgebung mit vergleichsweise geringem Aufwand realisiert.

In Figur 9 ist ein Blockdiagram zur Erläuterung der Datennahme mit Hilfe des oben beschriebenen Lichtblattmikroskops 10 gemäß Figur 1 oder Figur 2 gezeigt. In dem Verfahren zur Datennahme erfolgt eine Erfassung der Volumenbilddaten in einem Funktionsblock 100. Die Volumenbilddaten werden in einem Funktionsblock 102 zur Erzeugung eines Volumenbildes entschert, in einem Funktionsblock 104 in einem nicht-flüchtigen Speicher abgelegt und/oder in einem Funktionsblock 106 dargestellt. Das in dem Funktionsblock 102 erzeugte Volumenbild wird in dem nicht-flüchtigen Speicher des Funktionsblocks 104 abgelegt, in dem Funktionsblock 106 dargestellt und/oder in einem Funktionsblock 108 ausgewertet. Die einzelnen Funktionsblöcke 100 bis 108 im Folgenden näher beschrieben.

In dem Funktionsblock 100 werden die Volumenbilddaten erfasst. Diese Datenerfassung erfolgt insbesondere mit Hilfe der Schritte S10 und S12 nach Figur 5. Ausgabe des Funktionsblocks 100 sind die Volumenbilddaten.

In Funktionsblock 102 werden die Volumenbilddaten entschert. Diese Entscherung erfolgt insbesondere mit Hilfe der Schritte S14 bis S26 des Verfahrens nach Figur 5. Quelle der Volumenbilddaten sind die Datenerfassung in dem Funktionsblock 100 oder der nicht-flüchtige Speicher des Funktionsblocks 104. Ausgabe des Funktionsblocks 102 ist das Volumenbild der Probe 12.

In dem Funktionsblock 104 werden Bilddaten für eine spätere Weiterverarbeitung in dem nicht-flüchtigen Bildspeicher abgelegt. Bei den gespeicherten Bilddaten handelt es sich um die in dem Funktionsblock 100 erfassten, unverarbeiteten Volumenbilddaten oder um das in dem Funktionsblock 102 erzeugte Volumenbild. Der Funktionsblock 104 kann die in dem nicht-flüchtigen Speicher abgelegten Volumenbilddaten zur Entscherung an den Funktionsblock 102 ausgeben.

In dem Funktionsblock 106 findet eine Darstellung von Bilddaten statt. Die Darstellung erfolgt beispielsweise auf einem Bildschirm. Bei den dargestellten Bilddaten handelt es sich um die in dem Funktionsblock 100 erfassten, unverarbeiteten Volumenbilddaten oder um das in dem Funktionsblock 102 erzeugte Volumenbild.

In dem Funktionsblock 108 findet die Weiterverarbeitung des in dem Funktionsblock 102 erzeugten Volumenbildes statt. Beispielsweise kann eine morphologische Auswertung des Volumenbildes erfolgen oder das Volumenbild mit Bilddaten verglichen werden, die mit anderen, z.B. konfokalmikroskopischen Methoden gewonnen werden.

Das Verfahren nach Figur 9 ist ein Beispiel dafür, wie sich die Volumenbilderzeugung nach Figur 5 in den Betrieb des in den Figuren 1 und 2 gezeigten Lichtblattmikroskops 10 einbinden lässt. Bezugszeichenliste

10 Lichtblattmikroskop

12 Probe

20 Beleuchtungsoptik

22 Lichtquelle

24 Beleuchtungsobjektiv

30 Transportoptik

32 Objektiv

34, 40 Tubuslinse

36, 38 Okular

42 Projektionsobjektiv

50 Detektionsoptik

52 Detektionsobjektiv

54 Tubuslinse

56 Bildsensor

60 Abtastvorrichtung

62 elektronische Fokussiereinricht

64 Rasterspiegel

70 Bildverarbeitungseinheit

80 Volumenbereich

82 Probenschicht

A Lichtausbreitungsrichtung

B Ausdehnungsrichtung

C Abtastrichtung

A Kippwinkel

102 bis 108 Funktionsblöcke