Titre : Système d’éclairage, notamment à usage de microscopie Domaine technique

La présente invention concerne un système d’éclairage destiné notamment à être inclus dans un microscope, et les microscopes comportant un tel système.

La microscopie optique regroupe un ensemble vaste de techniques utilisées pour observer et analyser des objets à des échelles microscopiques. Ces techniques très variées sont développées depuis plusieurs siècles. Elles fournissent avantageusement une source optique d’excitation d’échantillons biologiques pour acquérir des données enrichies sur ces échantillons, telles que des informations morphologiques, en permettant la super-résolution, le traitement optique des images et/ou la tomographie optique.

Technique antérieure

Les microscopes connus reposent sur une architecture comprenant un statif, un objectif de microscope, un système d’éclairage, et un capteur photosensible, pouvant être une caméra ou l’œil. Ce type de microscopes est employé pour une observation directe des tissus biologiques dans le domaine médical, à des fins notamment de diagnostic ou d’observation. Il ne nécessite que des pièces à complexité limitée, permet une interprétation des images par son utilisateur, par exemple un médecin, un anatomopathologiste ou tout autre spécialiste, et ne pose que peu de contraintes quant à l’environnement de travail. Néanmoins, la variabilité des tissus biologiques et la multiplicité des savoir-faire locaux, notamment en ce qui concerne la préparation des échantillons spécifique à chaque laboratoire, ou l’œil de l’expert, rendent délicate G universalité des paramètres de réglage des outils numériques pouvant être associés à ce type de microscopes. En outre, un tel type de microscopes ne permet pas d’observer avec une résolution importante une grande surface d’échantillon, ainsi plus l’on cherche à obtenir des détails fins sur l’échantillon, plus la surface observée est petite. Cela ne permet pas une analyse globale et précise des tissus.

La microscopie par holographie numérique est une technique d’enregistrement de données particulièrement riche et sensible. Bien au-delà de la simple observation des tissus, l’objectif de cette technique est d’enregistrer des informations quantitatives sur les propriétés optiques des tissus. Contrairement aux techniques d’observations directes, la caractérisation physique de l’échantillon est ici mesurée à partir d’images. Différents traitements mathématiques et modèles physiques sont alors utilisés pour accéder à différentes propriétés du tissu, comme l’épaisseur optique, la morphologie 3D du tissu, ou ses anisotropies optiques. Ces informations quantitatives une fois isolées permettent à leur tour d’alimenter différents modèles optiques et biologiques à partir desquels les représentations recherchées du tissu seront formées, telles que des images, une cartographie de l’indice optique, une représentation en volume, par exemple en tomographie. Un simple enregistrement permet une multiplicité de représentations qui dépend principalement du cadre d’abstraction ou de la formulation du problème direct mis en place. L’acquisition des données repose sur un système interférométrique, qui peut intégrer des objectifs de microscope ou en être dépourvu, ou, dans le cas des microscopes par holographie en ligne, ne comporter aucun interféromètre. Pour être utilisables, ces microscopes doivent être installés dans un environnement bien contrôlé, fournissant une stabilité thermique et mécanique.

La microscopie par Ptychographie dans le domaine de Fourier (FPM pour « Fourier Ptychographie Microscopy » en anglais) est une technique de microscopie très récente, développée initialement dans le domaine de la microscopie électronique il y a près d’une vingtaine d’année et transposée en 2013 en régime optique, comme décrit dans l’article de Zheng et al « Wide-field, high-resolution Fourier ptychographie microscopy », Nature Photonics, vol. 7 n° 9, pages 739-745, 2013. Cette technique s’appuie sur une architecture traditionnelle de microscope, sauf que la source d’éclairage, pour l’excitation de l’échantillon, est constituée par une matrice de diodes électroluminescentes ou LEDs. Suivant la direction de l’onde plane utilisée pour exciter l’échantillon, dépendant du choix de la LED allumée, l’objectif du microscope collecte une partie du champ électromagnétique diffusé, issu de l’interaction entre la source et l’échantillon, et dont l’inclinaison est suffisamment faible pour pouvoir être collectée. Ce champ est enregistré par un détecteur matriciel photosensible, par exemple une caméra à transfert de charge (CCD) ou à capteur CMOS (« complementary metal-oxide-semiconductor » en anglais).

Seule l’intensité du champ pouvant être enregistrée dans le domaine optique, la phase est inévitablement perdue, mais elle peut être reconstruite numériquement, de façon similaire à ce qui est réalisé en holographie numérique, grâce à différentes techniques d’optimisation mathématiques et l’exploitation de l’intensité des différents champs I _j (x,y) enregistrés pour les j différentes diodes D _j allumées successivement. L’algorithme de Gershberg-Saxton permet par exemple de déduire la fonction de phase c| _j (x,y) du champ électromagnétique en appliquant une contrainte dans l’espace de Fourrer et en minimisant une fonction d’erreur globale. Cette dernière est utilisée pour construire dans l’espace de Fourrer une fonction de phase F issue des différents fr La fonction d’erreur est choisie en fonction de la formulation du problème direct choisi et associé au processus de mesure.

L’objectif de microscope est quant à lui modélisé par un filtre passe-bande. Dans l’espace de Fourrer, son gabarit est un disque de rayon de pulsation spatiale

2p·NA

R = — - — où NA représente l’ouverture numérique de l’objectif du microscope,

A l la longueur d’onde utilisée.

Son centre a pour coordonnées C _j = ( k _x ^J , k _y ^] ) avec k et k _y ^J les composantes du vecteur k suivant les axes x et y relatif à la j ^eme onde plane excitatrice associée à la diode

DJ·

La fonction de phase c| _j (x,y) répond à la contrainte suivante : la transformée de Fourrer T de l’intensité telle que mesurée par la caméra, doit être incluse dans un disque de rayon lié à l’ouverture numérique de l’objectif du microscope et centré en Cj.

Pour être en mesure de reconstruire correctement la fonction de phase F, un échantillonnage dans l’espace de Fourrer suffisamment régulier doit être effectué, comme expliqué dans l’article de Zheng et al mentionné ci-dessus. L’échantillonnage utilisé doit être tel que le recouvrement entre les filtres passe-bande relatifs à chaque diode est de l’ordre de 60%. Les diodes sont allumées une à une, et pour chaque diode, un cliché de l’échantillon est enregistré. Les images sont ensuite combinées numériquement dans l’espace de Fourrer de façon séquentielle suivant un parcours bien déterminé, par exemple à travers l’algorithme de Gershberg-Saxton, décrit notamment dans l’article de J. R. Fienup, « Phase retrieval algorithms: a comparison », Applied Optics, vol. 21, n° 15, page 2758, 1982. Cela permet de reconstruire progressivement le spectre complexe de l’échantillon sur une région bien plus étendue que celle originellement couverte par l’ouverture numérique de l’objectif du microscope. La limite de résolution théorique associée au processus d’imagerie effectué par le microscope est ainsi dépassée. Elle se calcule à partir de R _synt h où Rsynth désigne le rayon du disque le plus grand inscrit dans la région spectrale reconstruite de F. Pour un microscope conventionnel, le produit du champ de vue par la résolution, qui renseigne sur la capacité du microscope à observer un échantillon sur un grand champ de vue, correspondant à la surface observable, avec une bonne résolution, est limité. Ce produit ne peut dépasser une valeur maximale principalement définie par l’ouverture numérique de l’objectif, la longueur d’onde de travail, la surface de surface sensible de la caméra, la taille de chaque photorécepteur qui le compose. Cette limite théorique est repoussée de façon très substantielle en FPM.

La fonction de phase reconstruite grâce à G utilisation de la FPM donne accès à des propriétés inaccessibles aux microscopes conventionnels. En outre, dans ces derniers, les échantillons transparents ne sont pas facilement observables et demandent l’utilisation de colorants ou marqueurs, éléments chimiques dénaturant les tissus et ne permettant donc plus d’observer le fonctionnement naturel des cellules. Ils rendent également impropres G utilisation du même échantillon pour d’autres techniques d’analyse, par exemple la spectro scopie Raman.

La plupart des techniques de manipulation du signal développées dans le cadre général de l’optique électromagnétique étant transposable à la FPM, les limites conventionnelles, comme la compensation des aberrations chromatiques des objectifs ou les aberrations du front d’onde par optique adaptative numérique, et la compensation des erreurs de mise au point, peuvent être dépassées sur bien des aspects. En outre, sous réserve que la phase reconstruite est quantitative, la formulation en problème inverse du champ électromagnétique complexe et sa résolution permettent une reconstruction tomographique et l’accès à la structure en trois dimensions (3D) du tissu biologique et de ses différents composants.

Néanmoins, le facteur de super-résolution g étant défini par le rapport g = Rsynth/R, plus le rapport recherché est élevé, plus l’ouverture synthétique désirée doit être importante. Au-delà d’un facteur 2, des acquisitions de l’échantillon en condition de champ sombre deviennent alors inévitables. Cette condition impose une inclinaison des faisceaux incidents avec un angle Q non nul par rapport à la normale. En outre, plus la dynamique recherchée est importante, plus le temps effectif requis pour l’acquisition des clichés devient important, temps qui s’ajoute au temps nécessaire pour réaliser les calculs pour la reconstruction de la phase. Les ordres de grandeurs connus dépassent la minute pour l’acquisition et quelques minutes pour les calculs. Ces temps de mesure limitent l’accès aux propriétés dynamiques des échantillons. Par ailleurs, et pour des tissus statiques, par exemple des lames fixées, la productivité d’un microscope FPM est trop faible pour être facilement utilisée pour des applications de diagnostic médical.

Pour réduire le temps d’acquisition et de traitement des données, une solution est de produite une excitation des échantillons avec plusieurs points-sources allumés simultanément, notamment plusieurs diodes champ-sombre comme décrit dans les articles de Tian et al « Computational illumination for high-speed in vitro Fourier ptychographic microscopy », Optica, vol. 2, n° 10, pages 904-911, 2015 et « Multiplexed coded illumination for Fourier ptychography with a LED array microscope », Biomed. Opt. Express, vol. 5, n° 7, pages 2376-2389, 2014. Cette technique fournit une reconstruction de la phase grâce à une modification de l’algorithme de calcul, et l’excitation de l’échantillon par plusieurs diodes simultanément permet d’augmenter la puissance optique reçue par le capteur et donc de diminuer le temps d’exposition utilisé. Le gain est important et permet d’obtenir des acquisitions FPM complètes à une cadence de l’ordre d’une dizaine par minute.

Dans une autre technique, décrite dans l’article de Sun et al. « High-speed Fourier ptychographic microscopy based on programmable annular illuminations », Scientific Reports, (2018) 8:7669, DOI:10.1038/s41598-018-25797-8, les diodes sont spécifiquement placées sur des cercles concentriques pour respecter la symétrie de révolution des propriétés de l’objectif et assurer le maillage optimal de l’espace de Fourier. Il permet de réduire de façon importante le temps d’acquisition des images mais permet au plus de doubler la résolution des images reconstruites, le facteur de super-résolution étant volontairement limité à 2. Pour optimiser les flux optiques collectés, une unique lentille est également placée au-dessus des diodes pour concentrer la lumière excitatrice issue des différentes diodes sur l’échantillon.

Comme mentionné précédemment, le maillage de l’espace de Fourier ne peut être choisi de façon totalement arbitraire. En effet, le facteur de recouvrement des filtres relatifs à deux diodes voisines ne peut excéder une valeur limite (pour assurer une bonne convergence de l’algorithme de reconstruction). Ce recouvrement permet d’avoir une redondance d’information sur le spectre de l’échantillon. Il est utilisé pour assurer un référencement de phase adéquat sur l’ensemble du spectre (plutôt que par morceau). Cette valeur limite peut être allégée lorsque plusieurs diodes sont allumées simultanément, voire lorsque des variantes dans l’algorithme d’exploitation des données sont apportées, comme décrit dans l’article susmentionné de Tian et al « Multiplexed coded illumination for Fourier ptychography with a LED array microscope ».

Dès lors et dans la mesure où l’encombrement des diodes disponibles commercialement ne peut être inférieur à la taille minimale des boîtiers utilisés pour leur packaging (généralement de forme carrée), leur espacement est contraint. L’espacement minimal entre deux diodes est de l’ordre de quelques mm pour les technologies bas coût actuelles. Cet espacement impose une condition sur la distance minimale séparant la matrice de LED de l’échantillon. Pour une ouverture numérique fixée, cette distance peut être facilement calculée par approche géométrique. Elle est imposée par les conditions de maillage de l’espace de Fourier désiré. Le facteur de super-résolution g théoriquement accessible dépend alors uniquement de la surface couverte par la matrice de diodes. Si l’ensemble des diodes utilisées permet le pavage complet d’un disque de l’espace de Fourier de rayon alors :

[Math 1]

Dans cette équation, NAsynth représente l’ouverture synthétique associée à l’arrangement des diodes utilisées, qui s’exprime, avec Q l’angle d’incidence du faisceau lumineux issu d’une des diodes périphériques :

[Math 2]

Ce facteur est, de manière connue, limité à environ 6 ou 7 pour une ouverture numérique NA égale à 0.1. La surface qui doit être couverte par les diodes est alors raisonnable et l’optimisation du design de la matrice des diodes est plutôt aisée dans le cas d’un unique objectif de microscope. Cette optimisation se complique toutefois dès lors que l’on cherche à utiliser une même matrice de diodes pour un microscope FPM avec différents objectifs de microscope aux ouvertures numériques distincts. La surface de la matrice qui doit alors être couverte est d’autant plus importante que l’écart entre les ouvertures numériques des différents objectifs est élevé.

Or, dans un microscope, l’espace et la surface au sol réservée au système d’éclairage sont limités, étant de l’ordre d’une dizaine de centimètres pour la plupart des microscopes connus. Pour utiliser un même matrice de diodes pour différents objectifs, il est possible de régler leur position chaque fois que l’on change d’objectif pour optimiser les flux optiques, mais ce réglage est délicat. Il est également possible de concevoir un corps de microscope et une matrice de diodes spécifiques, ce qui nécessite de faire appel à des techniques contraignantes et coûteuses.

L’étude suivante permet d’identifier l’origine des limitations rencontrées pour les images en champ sombre en microscopie FPM. Des simulations ont été effectuées en réduisant progressivement la dynamique du capteur. Ces simulations ont montré que la reconstruction de la phase commence à être problématique en dessous d’une dynamique des images de 8 bits dans le cas d’une exploitation seule du champ-clair. Elle l’est également en conditions d’exploitation d’images champs-sombre avec un dynamique d’image inférieure à 10 bits. La reproduction satisfaisante des images reconstruites à partir de données expérimentales est ainsi possible, lorsque la dynamique des images expérimentales est comprise entre 8 et 12 bits.

Les résultats expérimentaux obtenus avec une mire de résolution USAF comme visible aux figures 1(a) et 1(b), illustrent respectivement une image reconstruite en utilisant uniquement des diodes associées à des images champ-clair et celle reconstruite en utilisant des diodes en champ clair et en champ sombre avec une caméra 12bits. Contrairement aux résultats de simulation et théoriques attendus, aucun gain en résolution n’est constaté par comparaison entre la figure 1(a) et figure 1(b). Par ailleurs la qualité des images est dégradée sur la figure 1(b).

Les résultats de simulations démontrent que la dynamique des images n’est pas essentielle pour exploiter les images en champ sombre. Ceux expérimentaux attestent que le bruit thermique, lié à l’excitation des porteurs du fait de la température du capteur et particulièrement visible sur les pixels faiblement éclairés de la caméra, participe grandement à la dégradation des reconstructions en microscopie FPM. Ce bruit doit donc être efficacement minimisé.

Pour ce faire, les méthodes connues peuvent utiliser un capteur refroidi. En variante ou en combinaison, des temps de pose réduits au mieux peuvent être utilisés, la puissance du bruit thermique étant directement liée aux statistiques d’excitation thermique des porteurs et donc au temps de pose utilisé pour acquérir chaque image, pour une température de travail fixée. Cette réduction est particulièrement bénéfique pour acquérir les images en champ sombre, mais est peu aisée à obtenir. Dans les méthodes connues, les sources sont disposées dans un plan, ou sur une surface sphérique ou demi-sphérique, ce qui permet, dans le deuxième cas, d’avoir une puissance d’excitation de l’échantillon uniforme et identique pour chaque source. Mais ces dispositions ne peuvent s’affranchir de la contrainte imposée par la distance entre l’échantillon et les sources en champ clair, telle que mentionnée précédemment.

Exposé de l’invention

En conséquence, il existe un besoin pour améliorer encore l’encombrement et les performances des microscopes, en particulier les microscopes à base de ptychographie dans le domaine de Fourier, notamment en réduisant le bruit des images acquises avec une meilleure gestion des flux optiques et le temps d’acquisition et de traitement des données et en apportant de la flexibilité en termes d’échantillonnage dans l’espace de Fourier des échantillons biologiques.

Fa présente invention a précisément pour objet de répondre à ce besoin.

Résumé de l’invention

Fa présente invention a ainsi pour objet un système d’éclairage, destiné notamment à être inclus dans un microscope ou un dispositif d’imagerie microscopique, comportant une pluralité de sources de lumière disposées selon des régions de plan définissant un espace solide coupant un axe de référence passant par un point de référence du système.

F’invention repose sur un système d’éclairage constitué par plusieurs point- sources répartis dans un volume, et permet de réduire le bruit de mesure en intensité et en phase grâce notamment à l’optimisation des flux optiques, et donc d’améliorer la qualité des images obtenues par rapport aux méthodes connues utilisant des sources réparties sur une surface plane ou sphérique.

Fe système d’éclairage selon l’invention permet de mieux gérer le flux optique arrivant sur un échantillon sous test, notamment dans le cas où le système est inclus dans un microscope ou un dispositif d’imagerie microscopique. En effet, en particulier pour la microscopie par ptychographie de Fourier, le facteur de super-résolution accessible dépend de deux paramètres : l’inclinaison des faisceaux incidents provenant des sources, et la densité de l’échantillonnage dans l’espace de Fourier des ondes planes associées. Dans les méthodes connues, ces deux contraintes amènent à éloigner la source d’éclairage d’une certaine distance. Le flux optique arrivant sur l’échantillon, proportionnel à l/d ² où d est la distance entre la source et l’échantillon, est donc limité et conduit à des temps d’exposition importants. La disposition en volume selon l’invention permet de rapprocher certains des points-sources et donc de réduire le temps d’acquisition global tout en réduisant le bruit d’obscurité, proportionnel au temps d’acquisition, sans apporter de difficultés supplémentaire par rapport à la contrainte relative à la distance inter- source minimale et imposée par l’encombrement du boîtier de chaque source.

L’invention permet de gérer de façon fine et souple l’échantillonnage effectué dans l’espace de Fourier. Il est avantageusement possible de choisir de façon fine l’inclinaison des faisceaux en rapprochant les sources d’un échantillon sous test sans pour autant réduire le pas d’échantillonnage pour les inclinaisons faibles, les sources étant placées à distance plus éloignée pour cela. Ce maillage fin de l’espace de Fourier est avantageusement réalisé pour un encombrement fixé, imposé d’une part par le design des microscopes connus mais aussi par l’encombrement minimum des sources utilisées. Le système d’éclairage selon l’invention peut ainsi être conçu de façon très polyvalente pour être utilisable sur tous les microscopes connus et les transformer, si besoin, en microscope par FPM.

Cet échantillonnage flexible et fin permet de plus de réaliser un traitement des images de façon entièrement optique et flexible. Cela peut être particulièrement bénéfique pour repérer des objets d’intérêt sur une lame. Plutôt que de réaliser cette opération avec des dispositifs spécialisés, peu flexibles, et coûteux, tels que les objectifs à contraste de phase, ou la mise en œuvre d’imagerie en champ sombre, l’utilisateur peut programmer la fonction de filtrage désirée en choisissant les sources à allumer.

En outre, un seul système d’éclairage selon l’invention peut convenir à différents objectifs de microscope en même temps, objectifs pouvant aller du fort grossissement au faible grossissement. Il n’est ainsi pas nécessaire de changer de matrice de sources ou des régler à nouveau ces dernières pour optimiser les flux optiques à chaque fois que l’on change d’objectif.

Dans la présente invention, par « espace solide », il faut comprendre une figure à trois dimensions, limitée par une surface fermée à volume mesurable et dont tous les points sont à des distances invariables, de telle sorte que sa forme et son volume soient ainsi déterminés.

Le système selon l’invention comporte avantageusement une multiplicité de couches de sources de lumière. L’invention offre ainsi une solution multicouches.

L’espace solide peut définir une surface enveloppe présentant au moins une face non plane.

Dans une variante, l’espace solide définit une surface enveloppe présentant uniquement des faces planes, l’espace solide formant notamment un cube.

Dans le cas où l’espace solide forme un cube ayant six faces, chacune des faces dudit cube porte de préférence au moins une source de lumière, mieux une pluralité de sources de lumière.

Dans la présente invention, dans le cas où le système d’éclairage est inclus dans un microscope ou un dispositif d’imagerie microscopique, l’axe de référence correspond, de façon connue, à l’axe optique dudit microscope ou dispositif d’imagerie microscopique.

La distance d’une source de lumière audit point de référence est avantageusement fonction de l’angle d’incidence entre l’axe de référence Z et la droite reliant ladite source de lumière au point de référence.

De préférence, le point de référence est non compris dans l’espace solide défini par les sources de lumière.

Les sources de lumière peuvent être disposées sur des régions de plan coupant chacune perpendiculairement l’axe de référence.

Dans une variante, au moins une partie de la pluralité de sources de lumière est disposée sur au moins une région de plan coupant obliquement l’axe de référence.

De préférence, chaque source de lumière comporte un ou plusieurs éléments émissifs, chaque élément émissif de chacune des sources de lumière étant ponctuel.

Les sources de lumière situées à plus grande distance dudit point de référence sont avantageusement configurées pour acquérir des images en champ clair.

Les sources de lumière situées à plus petite distance dudit point de référence sont avantageusement configurées pour acquérir des images en champ sombre. Dans le cas où le système d’éclairage selon l’invention est inclus dans un microscope ou un dispositif d’imagerie microscopique destiné à l’observation d’un échantillon, une puissance forte est en effet obtenue en se rapprochant de l’échantillon. Le système selon l’invention peut comporter des circuits électroniques souples formant les régions de plan et portant les sources de lumière. Ces circuits peuvent être portés par une structure, notamment réalisée par impression 3D, ce qui permet de fournir une structure plus rigide avec une orientation angulaire des sources facilement adaptable. Il convient de veiller à ménager du vide pour que chaque source de lumière accède à l’échantillon.

Le système selon l’invention peut comporter des microlentilles de collimation associées à chaque source de lumière. Dans une variante, le système comporte une lentille globale.

Le système selon l’invention comporte avantageusement un module de contrôle configuré pour sélectionner les sources de lumière à allumer, notamment pour la réalisation d’une fonction de filtrage des fréquences spatiales d’un échantillon à étudier placé de façon centrée au niveau dudit point de référence. Le gabarit de la fonction de filtrage à réaliser de façon toute optique peut être réglée de façon souple en réglant l’intensité de chaque source de lumière. Ceci permet de révéler les fréquences recherchées, ce qui est particulièrement intéressant pour remplacer certaines étapes de traitement des images par un traitement entièrement optique, par exemple pour repérer des objets d’intérêts.

L’intensité peut être la même pour chaque source de lumière. Dans une variante, l’intensité d’une ou plusieurs sources de lumière est réglable. Grâce à l’invention, il n’est pas nécessaire de régler l’intensité des sources de lumière, une même intensité pour chaque source est utilisée, alors qu’une puissance différente atteint l’échantillon à cause de la distance variable des sources de lumière à l’échantillon.

De préférence, les sources de lumière sont des diodes.

Microscope et dispositif d’imagerie microscopique

L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un microscope comportant le système d’éclairage selon l’invention, tel que défini ci-dessus.

L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un dispositif d’imagerie microscopique comportant le système d’éclairage selon l’invention, tel que défini ci-dessus.

Le dispositif d’imagerie microscopique peut comporter une source de lumière additionnelle, étant notamment une source laser ou une source Kohler. Cette source de lumière additionnelle apporte des fonctionnalités additionnelles, notamment une mesure holographique grâce à la source laser, et un éclairage traditionnel par le biais de la source Kohler.

Les caractéristiques énoncées ci-dessus pour le système s’appliquent au microscope et au dispositif d’imagerie microscopique, et vice-versa.

Procédé

L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé d’analyse d’un échantillon utilisant un système d’éclairage selon l’invention, comportant au moins les étapes suivantes :

- analyser dans le domaine fréquentiel les puissances de chaque source de lumière dans une zone de recouvrement créée entre deux sources adjacentes, afin de compenser les puissances arrivant sur l’échantillon, et

- initialiser le spectre de façon à pouvoir supprimer toute source de lumière placée sur l’axe de référence afin de réaliser la reconstruction de l’échantillon.

La compensation des puissances arrivant sur l’échantillon est due à la distance variable entre l’échantillon et chaque source de lumière.

L’éclairage homogène de sources n’est plus requis car pouvant être compensé numériquement ou électroniquement.

Dans la mesure où les angles d’illumination possibles par les sources sont très variés, et que le maillage de l’espace de Fourier est fin, il est possible d’utiliser l’invention pour révéler des détails choisis de l’échantillon, par simple programmation des sources. Par exemple, on peut l’utiliser pour obtenir des images champ-sombre et révéler les fréquences spatiales élevées de l’échantillon.

Toutes les étapes du procédé sont avantageusement mises en œuvre automatiquement par un ordinateur.

Produit programme d’ordinateur

L’invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un produit programme d’ordinateur pour la mise en œuvre du procédé d’analyse d’un échantillon selon l’invention, le produit programme d’ordinateur comportant un support et enregistrées sur ce support des instructions lisibles par un processeur pour que, lorsqu’exécutées,

- les puissances de chaque source de lumière sont analysées, dans le domaine fréquentiel, dans une zone de recouvrement créée entre deux sources adjacentes, afin de compenser les puissances arrivant sur l’échantillon, et - le spectre est initialisé de façon à pouvoir supprimer toute source de lumière placée sur l’axe de référence afin de réaliser la reconstruction de l’échantillon.

Les caractéristiques énoncées ci-dessus pour le système s’appliquent au procédé et le produit programme d’ordinateur, et vice- versa.

Brève description des dessins

L’invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d’exemples non limitatifs de mise en œuvre de celle-ci, et à l’examen du dessin annexé, sur lequel :

[Fig 1] la figure 1, précédemment décrite, illustre le résultat d’une reconstruction ptychographique dans l’espace de Fourier réalisée dans une installation de microscopie FPM de l’art antérieur avec des temps d’exposition et des puissances identiques pour chacune des diodes utilisées et disposées sur un unique plan,

[Fig 2] la figure 2 illustre un exemple de système d’éclairage selon l’invention inclus dans un dispositif d’imagerie microscopique,

[Fig 3] la figure 3 présente des résultats comparatifs entre l’invention et l’art antérieur, et

[Fig 4] la figure 4 présente d’autres résultats comparatifs entre l’invention et l’art antérieur.

Description détaillée

On a illustré à la figure 2 un exemple de système d’éclairage 1 selon l’invention. Dans l’exemple considéré, le système d’éclairage 1 est inclus dans un dispositif d’imagerie microscopique 10 destiné à étudier un échantillon E, notamment un échantillon biologique, placé au niveau d’un point de référence P _r du système 1.

Le système d’éclairage 1 comporte une pluralité de sources de lumière 2 disposées selon des régions de plan définissant un espace solide S coupant perpendiculairement un axe de référence Z passant par ledit point de référence P _r du système. L’espace solide S définit une surface enveloppe présentant uniquement des faces planes, et forme un cube ayant six faces. Chacune des six faces dudit cube porte une pluralité de sources de lumière. Le système selon l’invention comporte ainsi une multiplicité de couches de sources de lumière. Le dispositif d’imagerie microscopique 10 comporte une lentille microscopique 6 et un appareil photo 7.

Comme décrit précédemment, la distance d’une source de lumière 2 audit point de référence P _r est avantageusement fonction de l’angle d’incidence entre l’axe de référence Z et la droite reliant ladite source de lumière au point de référence. Le point de référence P _r est en outre non compris dans l’espace solide S défini par les sources de lumière 2.

Dans cet exemple et de préférence, l’intensité est la même pour chaque source de lumière 2, et les sources de lumière sont des diodes.

Le système 1 selon l’invention peut également comporter un module de contrôle, non illustré, configuré pour sélectionner les sources de lumière 2 à allumer, notamment pour la réalisation d’une fonction de filtrage des fréquences spatiales de l’échantillon E à étudier placé au niveau dudit point de référence P _r . Une interface homme-machine permet de faire le lien entre le système et l’étude de l’échantillon.

Dans une variante non représentée, l’espace solide S défini par les régions de plan sur lesquelles sont disposées les sources de lumière définit une surface enveloppe présentant des faces non planes, les sources de lumière 2 étant disposées sur des régions de plan coupant obliquement l’axe de référence Z.

Selon un mode de réalisation, comme représenté en traits pointillés, le dispositif d’imagerie microscopique 10 peut comporter une source de lumière additionnelle 8, étant notamment une source laser, un condenseur optique, ou une source Kohler.

Des résultats comparatifs sont présentés à la figure 3. Le résultat intitulé « raw » correspond à une image enregistrée avec la source de lumière centrale. Les images obtenues grâce au système selon l’invention (LED 3D) sont mieux résolues, les bords étant beaucoup plus fins, et les images faisant apparaître des points d’intérêt plus facilement observables que dans les images obtenues avec les méthodes connues.

D’autres résultats comparatifs sont présentés à la figure 4, pour les images en phase et les images en intensité, incluant également une comparaison avec une source source Kohler. Les images obtenues grâce au système selon l’invention sont mieux résolues.

Bien entendu, l’invention n’est pas limitée aux exemples qui viennent juste d’être décrits. En particulier, d’autres sources de lumière peuvent être utilisées, ainsi que d’autres dispositions pour ces dernières. L’invention peut être utilisée dans la microscopie conventionnelle, l’holographie numérique, notamment en ligne, la tomographie optique, la microscopie sans lentille (« lensless microscopy » en anglais), ou la microscopie par ptychographie de Fourier. Le système d’éclairage selon l’invention peut être utilisé pour le diagnostic médical, par le biais de l’observation de tissus biologiques, notamment pour l’observation du paludisme ou des différentes lignées cellulaires du sang anormales, telles que les schizocytes, amas de plaquettes, ou globules blancs anormaux.

L’invention peut être avantageusement employée pour la production de lames biologiques virtuelles, ou clones numériques, pour un diagnostic automatisé, et associée par exemple à des algorithmes d’intelligence artificielle. Les données reconstruites avec le système de l’invention sont largement manipulables numériquement, et sont riches, tant en intensité qu’en phase, et fines.

Le système d’éclairage selon l’invention peut être en particulier utilisé à la place des systèmes d’éclairage connus des microscopes avec une souplesse accrue et de façon avantageuse, car offrant un système plus simple, ne nécessitant notamment pas d’élément mécanique et optique pour régler l’inclinaison des faisceaux. Si toutes les sources sont allumées en même temps, il est possible de former des images tout à fait similaires à celles obtenues par une source Kohler. Pour être adaptées aux différentes applications de microscopie traditionnelle, le réglage de la source Kohler est remplacé par la programmation des sources à allumer, qui peut être bien plus varié et fin dans l’invention que dans une source Kohler. Un tel réglage permet également une excitation de l’échantillon inaccessible aux sources Kohler.

L’invention peut également être utilisée pour réaliser de la microscopie à contraste de phase différentielle, décrite dans l’article de Tian et al « Quantitative dijferential phase contrast imaging in an LED array microscope », Optics Express, vol. 23n n° 9, pages 11394-11403, 2015.

De façon plus générale, l’invention peut être utilisée pour toutes les applications d’imagerie où il est utile de pouvoir contrôler l’incidence des faisceaux et la puissance, notamment en fonction de l’inclinaison, par exemple dans des applications d’imagerie fréquentielle pour la détection d’objets d’intérêts.