本发明涉及一种 8,4'-氧新木脂素苷类化合物及其制备方法。

背景技术

石斛属为兰科中最大的一个属，包括约 1100种植物，主要分布于热带亚 洲和太平洋岛屿。 中国约 63种石斛属植物， 供作药用的石斛属植物 39种。 从垂直看海拔 100〜3000米的高度都有分布。 药用石斛多在秋季采收， 干燥 切段， 或鲜用。 味甘， 性微寒。 能养阴清热， 益胃生津。 用于热伤津液， 低 热烦渴， 舌红少苔； 胃阴不足， 口渴咽干， 呕逆少食， 胃脘隐痛， 舌光少苔; 肾阴不足， 视物昏花。

叠鞘石斛是石斛属中常见的一个种， 广泛分布于中国南方各省， 前期研 究表明其含有多种活性代谢产物， 包括联苄、 菲类、 芴酮、 苯丙素、 黄酮和 香豆素类等。 在传统中药的应用中， 叠鞘石斛常被用于解热、 明目、 免疫调 节、 抗氧化、 抗肿瘤和延缓衰老， 具有广泛的生理活性。 随着人们对石斛认 识的加深和现代科学技术的进歩，石斛药效部 位和活性成分的研究迅速开展， 但是针对石斛木脂素苷的研究还很少， 而且有关神经细胞保护的活性研究也 十分缺乏。

发明内容

本发明的目的在于提供源于叠鞘石斛的一类新 的木脂素苷化合物。 本发 明的另一目的在于提供该类化合物的制备方法 和用途。

本发明提供了如式 I所示的化合物或其药学上可接受的盐， 其结构如 下：

式 I

其中， 、 为糖基， 为 H、 羟基或甲氧基； R ₄ 为羟基或甲氧基; 为11、 羟基或甲氧基。

进一歩地， 所述化合物结构式如下：

其中， 所述 、 R ₂ 分别选自葡萄糖基、 木糖基或鼠李糖基。

进一歩地， 所述 、 R ₂ 分别选自葡萄糖基。

进一歩地， 所述 R ₃ 为甲氧基。

进一歩地， 所述 R ₄ 为羟基。

进一歩地， 所述 R ₅ 为甲氧基。

更进一歩地，所述化合物为 4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新木脂垸 -7'- 烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷。

优选地，所述化合物为 (-M7&8 ?,7'^)-4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新 木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷。

本发明还提供了上述 (-)-(7&8 7' -4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新 木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷的制备方法， 它包括如下操 作方法：

( 1 )取石斛茎， 粉碎， 加 95%v/v乙醇提取， 合并提取液， 回收溶剂后， 得到乙醇浸膏；

(2 ) 将乙醇浸膏用水分散， 依次用乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 合并正 丁醇部分， 回收溶剂后， 得正丁醇浸膏； 再用非极性大孔吸附树脂柱对正丁 醇浸膏进行分离， 依次用水， 10%v/v乙醇， 30%v/v乙醇洗脱， 取 30%v/v乙醇 洗脱部分， 再上反相 C18液相色谱， 5%-90%v/v甲醇水溶液梯度洗脱， 收 集 40%-50%甲醇水洗脱部分；

(3 )操作（2 ) 中的 40%-50%v/v甲醇水洗脱部分再经羟丙基葡聚糖 凝胶柱分离， 甲醇-水 =1 : 1洗脱，薄层追踪，收集含有目标化合物的洗� �液， 回收溶剂， 剩余物再经反相液相制备色谱分离， 纯化即得。

本发明中将药材粉碎， 是植物化学领域中常用的提取前处理方法， 可以 增大药材比表面积， 提高提取效率， 但若以原料直接提取， 虽然提取效率相 对较低， 但是同样能够提取得到相应的化学成分， 也同样适合于本发明。

本发明中所述乙醇提取， 包括回流、 温浸、 超声、 常压或减压提取等各 种提取方式， 只要是以乙醇为溶剂， 辅以常规检测手段， 均可达到相同或相 似的提取效果。 上述歩骤中上大孔树脂和凝胶柱洗脱时， 均可以通过本领域常用的薄层 追踪方法来监控或适当调整洗脱操作。

进一歩地， 所述非极性大孔吸附树脂为 D101。

进一歩地， 歩骤 （3 ) 中， 所述反相液相制备色谱的色谱条件如下： 色谱柱为 C ₁₈ 半制备柱； 流速为 1.5 mL/min; 检测波长为 210 nm; 流动 相为 37%v/v甲醇水溶液。

其中， 本发明所述石斛 来源于叠鞘石斛 aurantiacum var. denneanum的 。

本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受 的盐在制备保护神经 细胞的药物中的用途。

进一歩地， 所述药物是预防或 /和治疗神经退行性疾病的药物。

除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初 始定义适用于整篇说明书 的该基团或者术语。对于本文没有具体定义的 术语，应该根据本发明公开内 容和上下文， 给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

本发明化合物的所有立体异构体，以及外消旋 混合物也都是本发明的一 部分。 另外， 也包括所有的几何异构体或位置异构体。

术语 "药学上可接受的盐"是指本发明化合物或其立� ��异构体， 与无机 和 I或有机酸和碱形成的酸式和 I或碱式盐， 也包括两性离子盐 （内盐）， 还包括季铵盐， 例如垸基铵盐。 这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中 直接得到。 也可以是通过将本发明化合物， 或其立体异构体， 与一定数量的 酸或碱适当 （例如等当量） 进行混合而得到。 这些盐可能在溶液中形成沉淀 而以过滤方法收集， 或在溶剂蒸发后回收而得到， 或在水介质中反应后冷冻 干燥制得。 例如， 包含有本发明化合物与盐酸、 氢溴酸、 硝酸、 硫酸、 磷酸、 柠檬酸、 苹果酸、 甲酸、 马来酸、 乙酸、 丙二酸、 双羟萘酸、 1,5-萘二磺酸、 环己基氨基磺酸、 水杨酸、 己二酸、 戊二酸、 香草酸、 草酰乙酸、 抗坏血酸、 乳酸、 富马酸、 琥珀酸、 酒石酸、 甲磺酸或对甲苯磺酸等形成的盐类， 或， 本发明化合物与碱形成的含钠、钾、 镁、锌或铁等的盐类， 但并不局限于此。

除本发明所述化合物及其药学上可接受的盐外 ， 所述化合物前体药物的 相关制药用途也应该被包括在本发明的保护范 围内， 其中， 所述前体药物是 指本发明所述式 I化合物经过化学结构修饰后得到的在体内经� �或非酶的转 化释放出活性成分而发挥药效的化合物。

本发明的一种实施方式中， 本发明包括了同位素标记的式 I化合物， 所 述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物 相同，但是其中的一个或多个 原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或 质量数不同于自然界中常见的 的原子质量或质量数。可以引入式 I化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、 硫， g卩 2 H, 3 H、 13 C、 14 C、 15 N、 17 0、 18 0、 35 S。 含有上述同位素 和 /或其它原子同位素的式 I 的化合物及其立体异构体， 以及该化合物、 立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范 围之内。

在某些实施方式中，本发明的一种或多种化合 物可以彼此联合使用。也 可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试 剂结合使用，用于制备调控细 胞功能或治疗疾病的药物或药物组合物。如果 使用的是一组化合物，则可将 这些化合物同时、 分别或有序地对受试对象进行给药。 本发明从石斛中得到的 8,4'-氧新木脂素苷类化合物， 对谷氨酸导致的 PC12细胞神经毒性有抑制作用，有一定的神经� �胞保护作用，可用于治疗神 经退行性疾病。

附图说明

图 1 化合物的 IR图

图 2 化合物的 HR-ESI-MS图

图 3 化合物的 -NM 图

图 4 化合物的 ¹³ C-NM 图

图 5 化合物的 HSQC图

图 6化合物的 HMBC图

图 7化合物的 CD图

具体实施方式

实施例 1 (- )-(7 8 7' -4-羟基 -3，3'，5，5'-四甲氧基 -8，4'-氧新木脂烷 -7'-烯 -7，9，9'-三醇 7，9'-双 葡萄糖苷的提取、 分离纯化和结构鉴定

( 1 ) 实验材料：

① 药材

石斛采自四川成都双流， 由四川万安石斛公司提供， 经成都中医药大学 中药鉴定教研室李敏教授鉴定为兰科植物叠鞘 石斛 Dendrobmm aurantiacum var. denneanum的 。

②试剂和填料

柱层析硅胶， 200〜300目 （试剂级）， 购于青岛海洋硅胶干燥剂厂； 薄层层析硅胶 G、 GF ₂₅₄ 和 H (化学纯）， 购于青岛海洋硅胶干燥剂厂； Sephadex LH-20葡聚糖凝胶， 购于瑞典 Amersham公司；

GF ₂₅₄ 硅胶制备薄层， 购于烟台江友硅胶开发有限公司；

色谱甲醇， 4L/瓶， 购于美国 Fisher公司；

石油醚、 氯仿、 二氯甲垸、 乙酸乙酯、 正丁醇、 甲醇等分析纯试剂， 购 于成都科龙化工试剂厂。

③ 实验仪器 Agilent 1200 series高效液相色谱仪 （美国 Agilent) ；

Waters Synapt G ₂ HDMS高分辨飞行时间质谱 （美国 Waters) ；

INOVA-500核磁共振仪；

Vector 22 FT-IR红外光谱仪 （瑞士 Bruker) ；

Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪 （日本 Shimadzu) ；

Perkin-Elmer 341旋光测定仪 （美国 PerkinElmer ) ；

BP211D十万分之一电子天平 （瑞士 Sartorius) ；

R-210旋转蒸发器 （瑞士 BUCHI) ；

DZG-6050型真空干燥箱 （上海森信） 。

(2) 药材的提取： 称取干燥的石斛茎 10Kg， 粉碎， 加 95%乙醇 （30L) 回流 3次，每次 3小时，合并乙醇提取液，减压回收溶剂，得� �乙醇浸膏 530 _g;

(3 ) 成分的分离纯化：

①将乙醇浸膏用水 （2.5 L) 分散， 依次用乙酸乙酯 （3 x 2.5 L) 、 正丁醇 （3 X 2.5 L) 萃取， 合并正丁醇部分， 回收溶剂后， 得正丁醇浸膏 HO g;

②采用 D-101型大孔吸附树脂柱 （1.5 Kg) 对正丁醇浸膏进行分离， 依次用水， 10%乙醇， 30%乙醇， 50%乙醇和 95%乙醇洗脱， 每次洗脱体积为 4 L, 得到相应的五个部分；

③ 取 30%乙醇洗脱部分 48 g，再上反相 C18中压液相色谱， 5%-90% 甲醇水溶液梯度洗脱， 收集 40%-50%甲醇水洗脱部分， 洗脱期间以薄层监 控；

④进一步将 40%-50%甲醇水洗脱部分 （6.5 g) 上羟丙基葡聚糖凝胶 柱 ( Sephadex LH-20, 20- 150 ， 150 g) 分离， 甲醇-水 ( 1 : 1 ) 洗脱， 薄 层追踪， 收集含有目标化合物的洗脱液， 回收溶剂， 得到化合物粗品；

⑤ 化合物粗品经反相液相制备色谱分离， 色谱柱型号为： Ultimate型半 制备柱 (250 X 10 mm),填料为 C ₁₈ (5 m) _; 流速为 1.5 mL/min;检测波长为 210 nm; 流动相为 37%甲醇水溶液， 收集色谱主峰， 减压回收溶剂， 即得化合物 (-)-(7 & 8i?,7' )-4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷 （6.5 mg) 。

(4) 成分的结构鉴定： 无色胶状物， 红外光谱显示 OH (3374 cm— ¹ )和芳 环 (1588和 1502 cm— ¹ )的吸收峰。 高分辨质谱 HR-ESI-MS给出准分子离子峰 ([M+Na] ⁺ , w/ 783.2681), 表明化合物的分子式为 C ₃₄ H ₄₈ 0 ₁₉ ， 不饱和度为 11。 化合物的 ifi-NM 显示两个对称的 1,3,4,5-四取代苯环 [ 6.77 (Η-2', 6'), 6.72 (Η-2, 6)]和两个芳香甲氧基信号 ( 3.78, 3.73); 同时， 氢谱显示两个烯氢质子 信号 [ 6.59 (d, J = 16.0 Hz, Η-7'), 6.35 (dt, J = 16.0, 6.0 Hz, H-8')]，一个连氧的 亚甲基信号 [4.43 (dd, J = 13.0, 6.0 Hz, H-9'a), 4.20 (dd, J = 13.0, 6.0 Hz, H-9'b)], 表明分子中含有一个反式 -芳基丙烯醇片段。 此外， 氢谱显示出两个 邻位偶合的次甲基信号 [ 5.11 (d, J= 3.5 Hz, H-7), 4.27 (H-8)]和一个连氧亚 甲基信号 [ 3.59 (H-9a), 3.17 (H-9b)], 说明分子中含有一个芳基苯丙三醇片 段。 由两个端基质子信号 [ 4.34 (d, J= 7.5 Hz, H-l"), 4.22 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-l"')]和 3.00-3.70范围的多个连氧亚甲基及连氧次甲基信 号， 表明分子中 存在两个 ^葡萄糖基。在化合物的 ¹³ CNM 和 DEPT中，也显示了以上相应 的碳信号。 以上数据说明化合物的平面结构为 4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'- 氧新木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷。 该推论进一歩得到了 2D-NM 的确证，在 HMBC谱中， Η- 与 C-4相关， Η- '与 C-9相关， Η-2/6 与 C-l、 C-3/5、 C-4和 C-7相关， H-8与 C-4'相关， Η-2'/6'与 C-l'、 C-3'/5'、 C-4' 和 C-7'相关， H-7'与 C-l'、 C-2'/6'、 C-8'和 C-9'相关。

为了确定化合物的绝对构型， 进行了化合物的酶解反应， 得到一个单糖 和苷元化合物， 进一歩测定单糖的比旋度为 [a] ² _D ° +45.5， 确定该葡萄糖为 D- 葡萄糖。 根据该木脂素苷中 H-7和 H-8的偶合常数 （J ₇ , ₈ = 3.5 Hz), 可以推断 苯丙三醇片段为 7,8-苏式构型。 此外该木脂素苷及其苷元化合物的 CD谱分 别在 235 nm (Δε -0.18)和 239 nm (Δε -0.22)显示负的 Cotton效应， 表明苯丙 三醇片段为 7 & 8 ?构型。 因此， 化合物的准确分子结构为 (- (7 & 8i?,7' )-4-羟 基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -O D-葡萄 糖苷。

本发明提供了从石斛中获得的新的 8,4'-氧新木脂素苷类 [(-)-(7 & 8i?,7' )-4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'-三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷]。 它们的检测数据如下：

( 1 ) 旋光度： Perkin-Elmer 341旋光仪测定。

[a] ² _D ° =-12.2 (c = 0.20, MeOH)

(2) 红外光谱 (I ): Vector 22 FT-I 红外测定仪， KBr压片测定。

IR™" Vmax 3374, 2920, 1588, 1502, 1462, 1420, 1331, 1226, 1124,

1071, 1023, 835,706,615 cm ¹

(3) 高分辨质谱 （HR-ESI-MS): Waters SynaptG ₂ HDMS仪测定。

HRESI-MS: m/z 783.2681 [M+Na] ⁺ (calcd for C ₃₄ H ₄₈ 0i ₉ Na,

783.2687)， 分子式确定为 C ₃₄ H ₄₈ 0 _19;

(4) 核磁共振氢谱 （ -NM ) _: INOVA-500 spectrometer测定， 数据见 表 1。

(5)核磁共振碳谱（ ¹³ C-NM ): INOVA-500 spectrometer测定， 数据见 表 1。 表 1. 化合物的 1H MR (500 MHz)、 ¹³ C MR (125MHz)核磁数据（测定溶剂： DMS0-4 δ: ppm; J: Hz)

No. No.

1 129.8 1" 4.34 d (7.5) 103.1

2 6.72 s 106.1 2" 3.18 m 75.2

3 148.2 3" 3.06 m 77.8

4 135.6 4" 3.03 m 71.1

5 148.2 5" 3.02 m 78.3

6 6.72 s 106.1 6"a 3.66 (overlapped) 62.1

7 5.11 d (3.5) 79.5 6"b 3.41 (overlapped)

8 4.27 m 85.0 1"' 4.22 d (8.0) 103.2

9a 3.59 m 61.2 2"' 3.00 m 74.5

9b 3.17 m 3"' 3.13 m 77.4

1' 133.1 4"' 3.12 m 70.9

2' 6.77 s 104.8 5"' 3.23 m 77.9

3' 153.7 6"'a 3.62 (overlapped) 61.9

4' 136.7 6"'b 3.40 (overlapped)

5' 153.7 3/5 -OMe 3.73 s 57.0

6' 6.77 s 104.8 /5'-OMe 3.78 s 57.0

7' 6.59 d (16.0) 132.2

8' 6.35 dt (16.0, 6.0) 126.8

9'a 4.43 dd (13.0, 5.0) 69.6

9'b 4.20 dd (13.0, 6.0)

(6)二维核磁共振异核单量子相关谱（HSQC): INOVA-500 spectrometer 测定， 将分子中的 核与直接相连的 ¹³ C核进行了关联。

(7 ) 二维核磁共振异核多键相关谱 （HMBC): INOVA-500 spectrometer 测定， 确定了化合物分子中基团的连接位置， 确证化合物结构。 HMBC相关 信息如下式所示 （箭头部分） 。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例 1 化合物的神经细胞保护活性测定

对数生长期的 PC12细胞（模拟神经元细胞）， 弃去原培养液， 以 5χ 10 ³ / 管接种于含 5%胎牛血清， 5%马血清， 青霉素 （100 IU/mL ) , 链霉素 （100 /g/mL )和 L-谷氨酰胺（2 μΜ)的 DMEM培养基的 96孔板中， 于 37°C C0 ₂ 培养箱中培养 24小时， 然后加入终浓度为 10〃M、 1 μΜ和 0.1 μΜ的单体化 合物 [(-)-(7 & 8i?,7' )-4-羟基 -3,3',5,5'-四甲氧基 -8,4'-氧新木脂垸 -7'-烯 -7,9,9'- 三醇 7,9'-双 -C 5-D-葡萄糖苷]， 并在培养基中加入谷氨酸至 20 ， 培养 24 小时， 即为样品组。 谷氨酸模型组中， 对数生长期的 PC12细胞， 弃去原培 养液， 以含 20 谷氨酸的 DMEM完全培养基进行培养， 空白对照组中， 以 5 %胎牛血清和 5 %马血清的 DMEM培养基进行培养均培养 24小时。

各组培养 24小时后每孔加入 MTT (终浓度 0.5 mg/mL )再培养 4小时。 除去上清液，每孔加入 150 /L DMSO置微量震荡器上震荡 5分钟，在 BIORAD 550型酶标仪上测定 570 nm处的光密度值。 细胞活力以相对保护率来评价。

样品组的 OD (光密度） 值一模型组的 OD值

相对保护率(％) : 100%

对照组的 OD值一模型组的 OD值

实验结果显示， 该化合物在 10 、 1 和 0.1 的浓度下， 对谷氨酸 造成的 PC12细胞损伤具有一定的保护作用， 相对保护率分别为 48.1 ± 2.5%、 25.7 ± 2.2%和 10.9 ± 1.9%， 存在药效-剂量依赖关系， 表明此 8,4'-氧新木脂素 苷类对神经细胞有一定保护作用， 可用于神经退行性疾病的预防或治疗。 本发明从石斛中得到的 8,4'-氧新木脂素苷类化合物， 对谷氨酸导致的 PC12细胞神经毒性有抑制作用，有一定的神经� �胞保护作用，可用于治疗神 经退行性疾病。