技术领域

本发明属于微生物工程生物技术领域， 具体涉及一种脂肪酶及重组表达工程 菌株， 即筛选的脂肪酶在毕赤酵母中的表达。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶， 它催化天然底物油脂水解， 生成脂肪酸、 甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸， 通常只有一条多肽 链。 它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。

说

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。 植物中含脂肪酶较多的是油料作 物的种子， 如蓖麻籽、 油菜籽， 当油料种子发芽时， 脂肪酶能与其他的酶协同 发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类， 提供种子生根发芽所必需的养料和能 量； 动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰书脏 和脂肪组织， 在肠液中含有少 量的脂肪酶， 用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足， 在肉食动物的胃液中含有 少量的丁酸甘油酯酶。 在动物体内， 各类脂肪酶控制着消化、 吸收、 脂肪重建 和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的 脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。 由于微生物种类多、 繁殖快、 易发生遗传变异， 具有比动植物更广的作用 p H、 作用温度范围以及底物专一性， 且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外 酶， 适合于工业化大生产和获得高纯度样品， 因此微生物脂肪酶是工业用脂肪 酶的重要来源， 并且在理论研究方面也具有重要的意义。

脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与 pH、 温度与 pH稳定性、 底物特异 性等几个方面。 迄今， 已分离、 纯化了大量的微生物脂肪酶， 并研究了其性质， 它们在分子量、 最适 pH、 最适温度、 pH和热稳定性、 等电点和其他生化性质 方面存在不同 （Veeraragavan等）。 总体而言， 微生物脂肪酶具有比动植物脂肪 酶更广的作用 pH、 作用温度范围， 高稳定性和活性， 对底物有特异性 （Schmid 等； azlauskas等 )。

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一， 可以催化解脂、 酯交换、 酯合成等 反应， 广泛应用于油脂加工、 食品、 医药、 日化等工业。 不同来源的脂肪酶具 有不同的催化特点和催化活力。 其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能 的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化 学品和手性化合物有重要意义。 发明内容

本发明的目的是提供一种新型脂肪酶及其重组 表达工程菌。 即利用基因工 程手段， 筛选出新的脂肪酶基因， 并转化入毕赤酵母中， 构建毕赤酵母工程菌。 构建的工程菌能高效表达脂肪酶基因， 且所产脂肪酶的酶学性质优良， 可广泛 用作词料添加剂， 提高饲料中油脂的利用率。

本发明一个方面提供一种新型的脂肪酶， 其特征在于：

1 ) 其氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1的脂肪酶；

2) 其氨基酸序列与 SEQ ID NO: 1同源性高于 80%的脂肪酶；

3 )在 1 ) 或 2) 中的氨基酸上发生取代、 缺失或添加一个或数个氨基酸得 到的， 具有脂肪酶活性的酶。

本发明另一方面提供了编码上述脂肪酶的基因 ， 其一种核苷酸序列为 SEQ ID NO: 2。 说

本发明的脂肪酶， 去掉信号肽后的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3， 其核苷酸 的序列为 SEQ ID NO: 4。

本发明提供了一种表达载体， 其包含上述编码基酸序列为 SEQ ID NO: 3的 书

脂肪酶的核苷酸。

本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞， 其携带有表达上述脂肪酶基因 的表达载体。

上述表达宿主细胞为毕赤酵母 ( Pichia pastoris 。

本发明脂肪酶用于制备词料添加剂。

本发明的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质 的利用率。 日粮中降低 75 Kcal/kg油脂添加量后， 通过添加脂肪酶， 肉仔鸡的生产性能优于负对照， 且与 正对照几乎一致， 所以能显著降低饲料成本。 而构建的毕赤酵母工程菌能够高 效表达本发明的脂肪酶， 酶活水平达到 229 u/ml。 重组表达的脂肪酶最适作用 温度为 40°C， 最适 pH为 4.0。

附图说明

图 1 : 本发明构建的重组表达载体质粒图谱。

图 2: 毕赤酵母工程菌发酵上清液 SDS-PAGE电泳分析图， 其中箭头所指 为重组表达的脂肪酶。

图 3 : 重组表达的脂肪酶温度作用曲线图。

图 4: 重组表达的脂肪酶 pH作用曲线图。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容 ， 本领域相关的技术人员可 以借助实施例更好地理解和掌握本发明。 但是， 本发明的保护和权利要求范围 不限于所提供的案例。 实施例 1斜卧青霉脂肪酶基因的克隆

1.1 总 DNA的提取

将斜卧青霉 P. decumb 过夜培养， 取适量菌体置于离心管中， 13000 rpm离心 5 min,弃上清；加入 400μ1抽提缓冲液 (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1 SDS); 然后加 lOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡 2min 左右； 65 °C水浴 20min后， 加入 200μ1 10M NH ₄ AC， 冰浴 lOmin; 13000rpm离 心 lOmin, 取上清； 加入 2倍体积的无水乙醇， -20°C放置 30min; 13000 rpm离 心 lOmin, 弃上清； 用 70%乙醇洗涤 2次； 晾干， 加入水溶解， 于 -20°C保存。

1.2 总 RNA的制备 说

OMEGA公司的 E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的 mRNA， 其制备 过程参照试剂盒的操作手册。

1.3基因克隆

书

以 1.1 中提取的基因组总 DNA 为模板， 分别利用引物对 ( ATGATGATC AATTGGAAG和 TCAAATATGGAAAGACGC )进行 PCR扩增。 PCR扩增条件为 94 °C 5min _; 94V 30S ; 55 °C 30S， 72 °C 2min 30个循环； 72 °C 10min。 利用凝胶回收试剂盒回收 PCR扩增产物。

以 1.2中提取的基因组总 RNA为模板， 扩增其 cDNA序列。 采用 TaKaRa 公司的 PrimeScript RT-PCR Kit扩增 cDNA基因序列。

1.4测序分析

将 1.3中回收的扩增产物分别连接到 pMD18 T-载体， 相应的克隆载体分别 命名为 pT-lipl和 pT-lip2，把阳性克隆送至北京华大基因研究中� �进行测序分析。 测序结果为： Lip 1和 Lip 2比对分析显示该基因序列不含有内含子， Lipl和 Lip 2的核苷酸序列均为 SEQ ID NO: 2， 其编码的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

经 NCBI的 BLAST比对发现， SEQ ID NO: 1与 Aspergillus flavus NRRL3357 菌的胞外脂肪酶氨基酸序列的同源性最高， 同源性为 73%。 该蛋白属于酯酶-脂 肪酶家族， 具有脂肪酶保守催化和结构域。

1.5信号肽预测

利用网站 http://smart.embl-heidelberg.de/对 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列进行 预测分析， 结果显示序列的前 18个氨基酸为信号肽， 去除信号肽后的氨基酸序 列为 SEQ ID NO: 3， 其核苷酸序列为 SEQ ID NO: 4。

实施例 2表达去掉信号肽的脂肪酶基因的工程菌的构� �

2.1 毕赤酵母工程菌的构建 以质粒 pT- Lip 2为模板，利用引物（GGGGTACCATGATGATCAATTGGAAG 和 GCTCTAGATCAAATATGGAAAGACGC)进行 PCR扩增， PCR扩增条件是 94 °C 5min _; 94 °C 30S; 55 °C 30S, 72°C 2min 30个循环; 72°C 10min。 扩增产物 凝胶回收后， 先进行 Xbal和 Kpn I双酶切。 同样， 对表达质粒 pPIC9K也进行 Xbal和 Kpn I双酶切。 用 T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体 4°C连 接过夜。最后， 把连接产物导入大肠杆菌 DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名 为 pPIC-Lip， 该质粒图谱如图 1所示。

表达质粒 pPIC-Lip用 Sac I酶切电泳鉴定后， 经乙醇沉淀浓缩， 测定 DNA 浓度， 以 3μ _§ /μΙ^浓度稀释质粒片说段保存备用。制备 毕赤酵母 GS115电转化感受 态细胞， 最后重悬于 1 mL预冷的电泳缓冲液中 (含 ImM M _g Cl ₂ ， 10mM HEPES, 250mM蔗糖， pH 7.8)。 在 8(^L感受态细胞中加入 5 L线性化重组质粒； 电转 化 （条件为 1500V、 200Ω、 25 F); 最后涂布于 MM平板 （MM培养基组分： 书

1.34 YNB, 4X10- ⁵ %生物素， 0.5%甲醇）， 挑选重组菌株。 将其中一株重组菌 株命名为 Pichia pastoris Pi-Lip,测序结果表明插入的片段为 SEQ ID NO: 4，表 明扩增中没有出现错误。

实施例 3发酵和酶学性质测定

3.1毕赤酵母工程菌摇瓶发酵

将上述毕赤酵母工程菌 Pichia pastoris Pi-Lip) 接种于 5ml BMGY ( 1%酵 母提取物， 2%蛋白陈， 1.34%YNB,4xlO- ⁵ %生物素， 1%甘油）， 30°C培养过夜， 离心收集菌体， 把菌体加入 50ml BMMY诱导培养基 （1%酵母提取物， 2%蛋 白陈， 1.34 % YNB, 4x10— ⁵ %生物素， 0.5%甲醇）， 每 12小时补加 50μ!^甲醇， 诱导培养 5天， 取上清液， 测定其酶活水平达到 229u/ml。

脂肪酶活力

lg固体酶粉 （或 1ml液体酶）， 在一定温度和 pH条件下， lmin水解底物产 生 Ιμπιοΐ的可滴定的脂肪酸， 即为一个酶活力单位， 以 u/g(u/ml)表示。

酶活测定方法：

取两个 ΙΟΟπιΙ 三角瓶， 分别于空白瓶 （A) 和样品瓶 (B)中各加入底物溶液 4.00ml和磷酸缓冲液 5.00ml， 再于 A瓶中假如 95%乙醇 15.00ml, 于 40°C ±0.2 °C水浴中预热 5min， 然后于 A、 B瓶中各加待测酶液 1.00ml, 立即混匀计时， 准确反应 15min后， 于 B瓶中立即补加 95%乙醇 15.00ml终止反应， 取出； 于空 白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴， 用氢氧化钠标准溶液滴定， 直至微红色 并保存 30s， 不褪色为滴定终点， 记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。 脂肪酶的酶活力按下列公式计算：

Χ _{ι =} X 1/15

0. 05

式中：

XI 样品的酶活力， u / ml ;

VI——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积� �� ml；

V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积� �� ml；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度， mol I L;

说

50—— 0. 05mol/L氢氧化钠溶液 1. 00ml相当于脂肪酸 50 u mol ;

n 酶液稀释倍数；

0. 05 氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

1/15——反应时间 15min， 以 lmin计；

所得实验结果表示至整数。 书

3.2酶学性质分析

( 1 ) 最适温度分析

分别测定上述上清液在 25°C、 30°C、 35 °C、 40°C、 45°C、 50°C、 55 °C、 60°C， pH4.0的条件下酶活， 以最高酶活为 100%， 计算相对酶活， 做温度 -相对酶活曲 线， 结果如图 3所示。 由图 3可知， 本发明重组表达的脂肪酶的最适作用温度 为 40°C。

(2)最适 pH分析

用 pH值分别为 2.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0的缓冲液稀释上述上 清液， 在温度 40°C条件下测定酶活， 以最高酶活为 100%， 计算相对酶活， 做 pH-相对酶活曲线， 结果如图 4所示。 由图 4可知， 本发明重组表达的脂肪酶的 最适作用 pH为 4.0。

实施例 4本发明脂肪酶对肉鸡生产性能的影响实验

4. 1 材料与方法

4. 1. 1 试验动物与分组

六和种鸡场提供的罗斯肉雏鸡 300只， 随机分为 3个处理， 每个处理 10个 重复， 每个重复 10只肉鸡。 具体分

试验组 -75 Kcal/kg (鸡鸭油） 200g/t 脂肪酶

4. 1. 2试验样品

本试验选用本发明实施实例 3制备得到的上清液的冻干

4. 1. 3测定指标

分别在肉鸡 0d、 7d、 21d、 35 日龄时， 对各栏试验鸡统一进行称重并记录 采食量， 计算日增重 （ADG)、 日采食量 （ADFI )、 料肉比 （FCR) 和体重 （BW) 等指标。

4. 1. 4数据处理与分析

说

试验数据采用 SPSS13. 0统计软件中 AN0VA方法进行分析， 所有指标以每个 重复为试验单位,用 Duncan ' s多重比较进行检验。 结果用均值及平均标准差表 示， P〈 0. 05为差异显著。

4. 2 结果与分析 书

本发明的脂肪酶对 0-35日龄肉鸡生产性能影响

表 2 脂肪酶对 0-35日龄肉鸡生产性能的影响

注： 表中数字右上角字母有相同字母或没有标注者 者表示差异不显著（Ρ > 0. 05)， 字母不同表示差异显著 （Ρ<0. 05 )

由表 2肉鸡 0_35d试验结果可知， 全期来看试验组肉鸡日增重在正对照组 基础上分别提高了 2. 15%, 在负对照组基础上分别提高了 3. 17%, 料重比分别在 负对照组基础上降低了 0. 02% ₀ 试验组肉鸡日增重、采食量均高于正对照 组和负 对照组。 在此阶段负对照组即降低油脂组， 在采食量、 日增重和料肉比等方面 均不及其它组。 总体来看试验组优势较为明显。 试验全期增重料肉比均较好， 优于其它各组。

实验结果表明， 本发明的脂肪酶能显著提高词料中油脂类物质 的利用率。 日粮中降低油脂的添加量后添加脂肪酶， 肉仔鸡的生产性能优于负对照， 且与 正对照几乎一致， 因此， 使用本发明的脂肪酶能够显著减少油脂的添加 ， 从而 降低饲料成本。