本发明涉及生物工程技术领域， 尤其是涉及一种提高宿主抗菌能力的脂舦及其 衍生物、 及其制备方法和应用。 背景技术 自 20世纪三四十年代青霉素问世以来， 人钔又发现了头孢菌素类、氨基糖苷类、 大环内 酯类、 四环素类等诸多抗生素。 抗生素在治疗人类微生物感染中发挥了重要的 作用。 但目前 微生物耐药菌株越来越多， 很多抗生素对微生物感染不再起到良好的治疗 作用。 因此寻找抗 生素替代物成为人类越来越迫在眉睫的任务。

脂肽是由亲水的肽链和亲脂的脂肪酸链两部分 组成，即由 10个左右的多肽和脂肪酸链形 成环形或线性的脂肽。脂肽类物质主要源于微 生物的次级代谢产物， 其表现出多种生物活性。

1970年 Bemhekner和 Avigard就曾利用脂肽的抗虫特性将其作为杀虫� �使用 （翟颖,吕爽。一 种新型脂肽的抗菌活性研究.中国城乡企业卫� �.2006,4(114): 19- 21 )。 目前， 脂肽类抗生素的研 究引起人们的广泛关注。 达托霉素 （商品名： Cubisin ) 是第一个用于临床的脂肽类抗菌素， 于 2003年获得美国 FDA批准上市， 用于治疗由革兰氏阳性菌引起的并发性皮肤感 染和结构 性皮肤感染， 包括耐 '甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)及对万古霉素抗性的粪肠球菌 (VRE) , 先后在美国、 德国、 英国和荷兰上市。 目前越来越多的脂肽类抗生素被发现， 已经成为国内 外生物医药研究的热点。

皮肤是人体对外界环境的第一道防线， 在皮肤表面生存着各种各样的细菌。 人们通常将 人体皮肤表面的细菌分为 4个种类， 它们分别为葡萄球菌、 链球菌、 丙酸菌和棒状衧菌四类。 金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属， 是一种有害菌， 通常导致人体感染。 金黄色葡萄球菌所引 起的疾病， 最常见的有三大类： ·是人体化脓性感染； 二是医院内感染， 通过污染的器械 用品造成伤口化脓感染， 注射部位化脓感染， 或支气管炎、 肺炎等症； ≡是食物中毒， 由肠 毒素引起。 表皮葡萄球菌虽然也属于葡萄球菌属， 但是它是一种皮肤共生菌， 有文献报道表 皮葡萄球菌的发酵液可以抑制金黄色葡萄球菌 的感染 （Lai % Cogen AL, Radek KA, et a!. Activation of TLR2 by a small molecule produced by Staphylococcus epidermidis increases antimicrobial defense against bacterial skin infections, ,) Invest Dermatol, 2010, 130(9): •2 —I—I ~ 1. 发明内容 本发明公开了一种脂肽及其衍生物， 以及其制备方法和应用。 该脂肽是从表皮葡萄球菌 发酵液中提取获得， 可以大量诱导皮肤角质形成细胞中防御素的表 达， 具有良好的抑制金黄 色葡萄球菌感染的效果。

本发明的发明目的之一是提供一种脂肽， 所述脂肽包括肽链和脂肪链， 肽链和脂肪链通 过肽键相连； 其结构如式 （1 ) 所示， 成线状， 分子量为 2848 Da; SDTVnDATE

本发明的另一发明目的是提供一类脂肽衍生 物， 该脂肽衍生物在式 （]—) 的基础上， 由改 变肽链或脂链的长度、 亲水性或疏水性所得， 所述脂肽衍生物包括肽链和脂肪链， 肽链和脂 肪链通过舦键相连， 其结构如式 （2)、 （3)、 （4)、 （5)、 (6) 所示之任何一种；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH VKWI 式 (2)；

0=C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3

N H

VKWI 式 (3)；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IGDLVKWII 式 （4);

NH VKWI 式 (5)；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IISTIGDLVKWIIDTVIIDATE 式 （6

其中， 所述脂肽是提取自表皮葡萄球菌； 所述表皮葡萄球菌包括表皮葡萄球菌 1457或表 皮葡萄球菌 12228或表皮葡萄球菌 RP62A。

其中， 所述脂肽在水相可以形成排油圈； 薄层层析之后， 用水显色形成白色条带， 用茚 三酮显色形成紫红色条带。

本发明的另一发明目的是提供一种脂肽的制备 方法， 将表皮葡萄球菌发酵， 收集酸沉淀 的表皮蔔萄球菌发酵液， 经甲醇抽提， 得到脂肽提取物， 再经 HPLC纯化， 得到所述脂肽。

具体步骤如下：

( 1 ) 表皮葡萄球菌发酵

① 取出表皮葡萄球菌 1457或表皮葡萄球菌 12228或表皮葡萄球菌 RP62A，划线于胰鷗大豆 肉汤 (TSB ) 固体培养基上， 培养至长出单菌落。

② 挑取单菌落接种于 TSB液体培养基中培养。

③ 将过夜培养的表皮葡萄球菌菌液按转接于 TSB液体培养基中发酵。

(2) 发酵液酸沉淀

① 将表皮蔔萄球菌发酵液离心。

② 将离心后的表皮葡萄球菌发酵液上清液 ]¾盐酸调节 ρίί, 静置过夜。

( 3 ) 甲醇抽提

① 将酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液上清离心， 收集沉淀。

② 将沉淀置于甲醇中， 放在搅拌器上搅拌抽提。

③ 将抽提过夜的甲醇溶液离心， 收集上清。

④ 将甲醇抽提液在旋转蒸发仪上蒸千。 收集沉淀， 重新溶解于 PBS。

(4) HPLC纯化

将脂肽溶解后，利用分离型高压液相色谱仪 Agilent 1200和 C18柱，以含 TFA的水和 TFA 的乙腈为流动相梯度洗脱， 收集各个洗脱峰， 利用体外细胞实验检测各个洗脱峰诱导 beta-Ki 御素表达的能力； 将具有诱导 beta-防御素表达活性的洗脱峰利 )¾一级质谱鉴定洗脱峰中物质 的分子量， 从而得到目的产物。

鉴定多肽序列： 将目的产物在超高效液相色谱-四级衧飞行时� �质谱联用仪 （Waters, ACQUITY ^TM UPLC&Q-'roF Premier, 上海交通大学提供）上进行二级质谱分析， 根据二级质 谱图 算母离子解离的离子的大小， 迸而推算出氨基酸的种类， 该种方法也就是 de-novo测 序， 最终确定多肽的序列。

鉴定脂肪酸链序列： 将脂肽充分千燥后， 加入甲醇和浓硫酸， 加热。 旋转蒸发所有溶剂 后，加入己垸抽提，最后经双蒸水洗涤。将己 垸抽提液旋转蒸发。利用日本岛津 GCMS-QP2010 气质眹 仪（上海交通大学提供）和 ¾>.l(0.25mm*0.25um*30m) 色谱柱，分析所得到的物质。 根据气质联用分析结果， 鉴定该脂肽中的脂肪酸序列。

本发明中， 脂肪酸结合在多肽序列上的赖氨酸位点上所构 成的脂肽及其衍生物才具有抗 感染活性。 通过合成脂肽并验证其活性， 从而确定本发明脂肽及其衍生物的结构。

就目的产物的浓度测定， 可通过 BCA™ Protein Quality Kit测定 PBS中脂肽提取物中的 蛋白含量。

本发明的另一发明目的是提供脂肽衍生物的制 备方法。该脂肽衍生物的多肽链的合成是 通过固相合成方法合成的， 该脂肽衍生物的脂肪酸通过邻苯二甲酰丁辛酯 （BCP) 与 N-甲基 吗啉 （NMM ) 接在所述多肽链上。

本发明脂肽可以直接抑制痤疮丙酸杆菌的生长 。

本发明还提供了所述脂趺及其衍生物在制备抗 感染药物中的应用。

本发明还提供了所述脂肽及其衍生物在在制备 抗金黄色蔔萄球菌感染药物中的应用。 本发明还提供了所述脂肽及其衍生物在化妆用 品、 洗涤用品、 保湿 ]¾品中作为添加剂的 应用

本发明中， 所述脂肽及其衍生物与 TLR2受体结合， 激活 p38 MAPK信号通路， 诱导角 质形成细胞表达防御素。 所述脂肽及其衍生物在刺激人体皮肤角质形成 细胞后， 细胞裂解液 可抑制抗金黄色葡萄球菌的生长。 脂肽及其衍生物诱导皮肤抗菌肽表达量的大大 提高， 而 提高抗感染的能力。 本发明脂肽在皮肤共生菌葡萄球菌发酵液中提 取纯化获得。 利用脂肽诱 导防御素表达的机制， 以激活 TLR2-p38 MAPK信号通路诱导防御素表达。

本发明对脂肽在动物体内、 外的生物学活性进行了研究。

用不同浓度的脂肽刺激人原代角质形成细胞（ NHEK), 发现与对照组相比， 本发明脂肽 处理组的具有抑制革兰氏阳性细菌生长的抗菌 肽 beta-防御素的表达量被大量诱导表达， 其中 hBD3 的表达上调 2000倍以上, liBD2 的表达也可以上调 100 倍以上， 具有极显著性差异 (ρ<0·001 )。

本发明脂肽刺激分离得到的 C57BL/6小鼠的角质形成细胞，发现脂肽可以显� �性地诱 导小鼠角质形成细胞中 beta-防御素 mBDs的表达。

在证明脂肽可以诱导人角质形成细胞产生防御 素后， 将 NHEK细胞用脂肽刺激 24小时 后， 收集细胞， 超声波破碎， 收集细胞裂解液上清。 将 10μ _§ 的细胞裂解液与 10 ⁶ CFLI的表皮 葡萄球菌 1457、 金黄色葡萄球菌、 痤疮丙酸杆菌以及大肠杆菌 DH5a共同孵育 3h (37°C )， 然后梯度稀释， 取 ΙΟμΙ点在固体平板上检测细胞裂解液对细菌� ��抑制作用。 结果发现脂肽刺 激 ΝΗΕΚ细胞后， ΝΉΕΚ裂解液可以抑制金黄色葡萄球菌的生长� �� 但对表皮葡萄球菌、 痤疮 丙酸杆菌和大肠杯菌 DH5a的生长无影响。

在证明脂肽可以在体外增强角质形成细胞抑制 金黄色葡萄球菌生长的能力之后， 继续在 小鼠上验证其作用。 具体方法是： 将 8周的小鼠背部毛发去除， 24小^后， 皮间注射脂肽 或 PBS , 脂肽剂量为 2mg/kg， 22小时后再-一次皮间注射脂肽， 2··3小时后， 在相同位置注射 OD ₆ oo=0.7-0.8的金黄色葡萄球菌， 金黄色葡萄球菌注射前与含 2% cyiodex beads的 P:BS等体 积混合均匀。 金黄色葡萄球菌的剂量为每只 ΙΟΟμΙ ( 1.75- 2xl0 ⁷ CFU)。 每天观察小鼠背部皮肤 的感染情况并拍照。 三天后取对照组和脂肽注射组小鼠感染部位的 皮肤、 肝脏、 脾脏， 组织 匀浆后， 梯度稀释检测感染部位细菌的数量。 可见脂肽可以明显捭制金黄色葡萄球菌对小鼠 皮趺的感染。 脂肽注射组小鼠皮肤和肝脏中细菌含量显著低 于 PBS注射组， 脾脏中没有检测 出明显的差异。

本发明的脂肽及其衍生物在诱导防御素表达中 的应用。

研究在野生型（ ^+A )和？ 2^小鼠上检测脂肽抑制金黄色葡萄球菌感染的� ��况， 发现 在 Τίτ2敲除后小鼠不能再抵抗金黄色葡萄球菌� �感染。

用本发明脂駄分别注射？7r2 ^4/+ 小鼠和 r2- 小鼠的耳朵， 刺激 24h后， 剪 T耳朵， 提取 RNA,检测脂肽诱导 mBDs 表达的情况。发现本发明脂肽可以诱导 37r2 ^+A 小鼠 mBD4的表达, 但是在 ΤΙΓΓ'- 小鼠中没有诱导 mBD4的表达。

用 PBS、 脂肽、 SB2()2190(p38 MAPK inhibitor)、 脂肽加 SB202190分别刺激 ΝΉΕΚ细胞 发现， 加入脂肽可以显著性的诱导 hBDs的表达。而加入了抑制剂之后則不能诱导 hBDs的表 达。在小鼠角质形成细胞上我门重复出了相同 的结果。将 2 ·2敲除后发现脂肽不能诱导 mBDs 的表达。

用 PBS、脂肽、 SB202190(p38 MAPK inhibitor)、脂肽加 SB202190分别刺激 NHEK细胞; 发现脂趺可以诱导 p38的磷酸化， 而加入了抑制剂则不能诱导 p38的磷酸化。 说明脂肽是通 过激活 p38 MAP 信号通路来诱导防御素的表达。

本发明提供的可以诱导防御素表达、 预防或减少皮肤感染的脂肽衍生物， 通过化学方式 合成该脂肽衍生物。 然后用不同浓度的脂肽衍生物刺激人原代角质 形成细胞 （ΝΉΕΚ ) 细胞, 发现与对照组相比，脂肽衍生物都可以诱导人 β-防御素 2的表达。在合成的一系列衍生物中， 如式 6所述脂肽衍生物诱导防御素最明显。 与式 2、 3、 4、 5脂肽衍生物比较分析， 发现多肽 序列对脂肽诱导防御素表达非常重要， 将多肽序列截短之后， 即使保持脂肪酸链长短不变也 显著降低脂肽诱导防御素表达的活性。 跗图说明

图 1表示本发明实施例 1和 2中表皮葡萄球菌分离的脂肽薄层层析分析。

图 2表示本发明实施例 3脂肽高效液相色谱分析。

图 3表示本发明实施例 3脂肽的一级质谱分析。

图 4表示本发明实施例 3脂舦的一级质谱分析。

图 5表示本发明实施例 3脂肽的一级质谱分析。

图 6表示本发明实施例 3脂肽二级质谱结果。

图 7表示本发明脂肽抑制痤疮丙酸杼菌的生长

图 8A表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素的� ��达。

图 8B表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素的� ��达。

图 9A表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素抑� ��金黄色葡萄球菌的生长。

图 9B表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不� ��制表皮葡萄球菌的生长。

图 9C表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不� ��制痤疮丙酸杆菌的生长。

图 91)表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不 抑制大肠衧菌的生长。

图 10表示本发明不同浓度脂肽诱导角质形成细胞� ��御素抑制金黄色葡萄球菌的生长。 图 11A表示本发明脂肽对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及增值的影响。

图 11B表示本发明脂肽对 NHEK细胞的毒性及增值的影响。

图 12A表示本发明脂肽裨制金黄色葡萄球菌对小鼠 的感染。

图 12B表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠 的感染。

图 12C表示本发明脂肽在金黄色葡萄球菌感染后对 小鼠体重的影响。

图 12D表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠 皮肤的感染。

图 12E表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠 肝脏的感染。

图 12F表示本发明脂肽对金黄色葡萄球菌对小鼠脾 脏的影响。

图 13表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14A表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14B表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防銜素的表达。

图 14C表示本发明脂趺激活 TLR2诱导防掏素的表达。

图 14D表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14E表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。 图 14F表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 15A表示本发明脂肽通过激活 p38 MAPK信号通路诱导人 β -防掏素 2的表达。

图 15B表示本发明脂肽通过激活 p38 MAPK信号通路诱导人 β -防御素 3的表达。

图 16A表示本发明脂肽通过激活 p38 MAP 信号通路诱导小鼠 β ··防御素 4的表达。 图 16B表示本发明脂趺通过激活 p38 MAPK信号通路诱导小鼠 β -防御素 4的表达。 图 17A表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防 御素的表达。

图 17B表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防 御素的表达。

图 17C表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防 御素的表达。

图 17D表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防 銜素的表达。

图 17E表示本发明脂舦衍生物诱导角质形成细胞防 御素的表达。

图 18A表示本发明脂肽衍生物对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18B表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18C表示本发明脂肽衍生物对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18D表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18E表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 19A表示本发明含有脂肽衍生物的涂抹液诱导小 鼠防御素的表达。

图 ₁₉ Β表示本发明含有脂肽衍生物的涂抹液诱� ��小鼠防御素的表达。

图 20A表示 PBS的 I1PLC图。

图 20B表示脂肽的 HPLC图。

图 20C表示对照组小鼠皮趺中不含有脂肽衍生物。

图 20[)表示实验组小鼠皮肤吸收本发明涂抹液中� �有的脂肽衍生物。

具体实施方法 结合以下具体实施例和附图， 对本发明作进一步的详细说明， 本发明的保护内容不局限 于以下实施例。 在不背离发明构思的精神和范围下， 本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中， 并且以所 ^的权利要求书为保护范围。 实施本发明的过程、 条件、 试 剂、 实验方法等， 除以下专门提及的内容之外， 均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明 没有特别限制内容。

实施俩 1 : 脂肽的分离纯化。

Smyth.'iliomas et al. Isolation and Analysis of Lipopeptides and High olecular Weight Biosurfec【ants, 2010。 选用的菌种为表皮蔔萄球菌 1457。

( 1 ) 表皮葡萄球菌发酵 ① 于. ·80Ό取出保存的表皮葡萄球菌 1457，划线于胰酶大豆肉汤（TSB)固体培养基上� �� 37 ^! Ό , I6h, 至长出单菌落。

② 挑取单菌落接种于 20ml TSB液体培养基中培养， 37'C , 220q>m,16h。

③ 将过夜培养的表皮葡萄球菌菌液按 1%转接于 200mi TSB 液体培养基中发酵， 3TC , 220— rpm, 16h。

(2) 发酵液酸沉淀

① 将表皮葡萄球菌发酵液离心。 〗000(kpm, 4。C , 20min。

② 将离心后的表皮葡萄球菌发酵液上清液用 6M盐酸调节至 ρΗ^.Ο, 静置过夜。

(3) 甲醇袖提

① 将酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液上清离心。 OOOOrpm, 4。C , 20min o 收集沉淀。

② 将沉淀置于甲醇中， 放在搅拌器上搅拌抽提 16h， 温度为 37Ό。

③ 将抽提过夜的甲醇溶液离心。 lOOOOipm, 4°C , 20min。 收集上清。

④ 将甲醇抽提液在旋转蒸发仪上蒸干。 收集沉淀， 重新溶解于 PBS。

(4) HPLC纯化

将上述步骤获得的脂肽溶解后， 利用分离型高压液相色谱仪 Agilent 1200和 C18柱， 以含 0.1% TFA的水和 0.1% TFA的乙腈为流动相梯度洗脱， 收集各个洗脱峰， 得到目标产物。

(5 ) 浓度测定

通过 BCA™ Protein Quality Kit 测定 PBS中脂肽提取物中的蛋白含量。

在上述表皮葡萄球菌发酵步骤中， 本发明也可选用表皮葡萄球菌 12228、 表皮葡萄球菌 RP62A或其他表皮葡萄球菌作为菌种， 其他实验条件及步骤与上述相同。

实施例 2: 脂肽的鉴定。

将实施例 1分离的脂趺取 10μ:Ι点在薄层层析板上， 点样位置是距离下边缘 1cm处。 将层 析板放在 展层剂预饱和的层析缸内。 展层剂为正丁醇： 乙酸； 水 =4:2:1。 展层剂跑到距层 析板上边缘 lcm处后停止层析。放在通风厨内晾千。然后将 板放在水里面 5mi 之后在通风 厨自然晾干。 观察板上的脂肽的位置。 完全晾干后在板上喷 0,25%的茚王酮， 置于 60Ό烘箱 内， lOmiti后观察板上的脂肽。 实验结果如图 1所示， 脂肽在水相形成排油圈， 经薄层层析 之后， 用水显色产生白色条带， ]¾茚三酮显色在相对应的位置产生紫红色条带 。

实施例 3: 脂肽 HPLC分析及分子量鉴定， 多肽序列的鉴定

将实施例 1分离得到的脂肽上样到高压液相色谱分析仪 (上海中科新生命公司提供)上。以 含 0.1% TFA的水和 0.1 % ΪΡΆ的乙腈为流动相梯度洗脱, 80mi 然后， 将洗脱峰分别用多 肽质谱分析分子量。 经 HPLC分析， 如图 2所示， 得到三个主峰， 出峰时间分别是 lOmin, 69min, 70min。 经过多肽质谱分析， 如图 3所示， 出峰时间为 lOmin的峰表明有两种物质， 其分子量分别是 1437和 1621。 如图 4所示， 出峰时间为 69min的峰表明有一种物质分子量 为 2491。 如图 5所示， 出峰时间为 70min的峰对应的物质的分子量为 2848。

经如实施例 7所述的体外细胞实验检测， 分子量为 2848的物质具有抗病原菌感染活性， 即是实施例 1制备得到的脂肽。 分子量为 1437、 1621或 2491的其他物质均不具有抗病原菌 感染活性。

鉴定脂肽的多肽序列： 将出峰时间为 70min的洗脱峰在超高效液相色谱-四级杆飞行时 间 质谱联用仪（Waters,ACQUITY' UPLC&Q-TOF Premiei;上海交通大学提供）上进行二级质谱 分析， 得到如图 6所示的二级质谱图， 利用 de novo 测序， 分析该脂肽的多肽序列为- DIISTIGDLVKWIIDTVIID ATE。

实施俩 4 鉴定脂肽中的脂肪酸链

1. 取 3mg实施例 1所得脂飲， 充分干燥。

2. 加入 0.95ml甲醇和 0.05ml浓硫酸。 90°C加热 151ι。

3. 旋转蒸发千溶剂后， 加入 1ml己垸抽提。

4. 加入 1ml双蒸水洗涤。 将己烷抽提液转移至新的溶剂瓶内， 旋转蒸发。

5. 气质眹 分析脂肪酸序列。

利 ]¾日本岛津 GCMS- QP2010气质联用仪（上海交通大学提供）和 hp- l(0.25mm*().25um*30m) 色谱柱， 分析上述步骤 4所得到的物质。 根据气质联 分析结果， 经鉴定该脂肽中的脂肪酸 序列为： CH ₃ -(CH ₂ ) ₁₉ -COOHo

通过以上实施例 2、 3和 4确定实施例 1所得到的脂肽结构。 经体外细胞实验表明， 只有 当该脂肽中的脂肪酸结合在多肽序列上的赖氨 酸位点上的情况下， 所构成的脂肽才具有抗感 染活性。 而当脂肪酸与多肽序列通过其他方式结合所构 成的物质并不具有本发明的抗感染活 性。 实施例 5: 脂舦在抗病原微生物感染中的应 ]¾

将 10μ ₈ 的实施例 1所得脂肽与 10 ⁶ CFU的痤疮丙酸杆菌， 37Ό共孵育 3h,然后梯度稀释， 取 ΙΟμΙ点在固体培养基平板上， 与不含脂肽的对照组 （PBS) 相比， 发现该脂肽可以抑制痤 疮丙酸杼菌的生长， 实验结果如图 7所示， 其中， **表示 ρ<0,01 , *表示 ρ<0,(〕5。

实施例 6 脂肽诱导人角质形成细胞防御素的表达。

用不同浓度的实施例 1所得脂趺刺激人角质形成细胞 (ΝΗΕΚ)细胞 24小时， 然后提取细 胞的总 RNA, 反转录成 cDNA后， real-time RTPCR检测 β --防御素 2 (hBD2)和 β -防御素 3

(WBD3) 的表达。 实验结果表明， 如图 8Α、 图 8Β所示， 脂肽诱导 ΝΗΕΚ表达大量 hBD2 和 hBD3, 与对照组 （PBS组.， 未加入脂肽， 表达量设为 1 ) 相比， 脂肽处理组 hBD3的表达 量上调 2000倍以上， hBD2的表达量上调 100倍以上。

实施例 1 脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金黄色葡萄 球菌的生长

将 NHEK细胞用实施例 1所得脂肽刺激 24小时后， 收集细胞， 超声波破碎， 收集细胞裂 解液上清。 将 10μ _§ 的细胞裂解液与 10 ⁶ CFU的表皮葡萄球菌 】457、 金黄色葡萄球菌、 大肠 杆菌 DH5a、 痤疮丙酸杆菌共同孵育 3h ( 37°C ), 然后梯度稀释， 取 ΙΟμΙ点在固体平板上检 测细胞裂解液对细菌的抑制作用。 实验结果表明， 如图 9Α所示， 与对照组 （PBS组） 相比， ΝΗΕΚ细胞受脂肽刺激之后， 其裂解液可以明显捭制金黄色葡萄球菌的生长 。 如图 9Β , 图 9C、 图 9D所示， 与对照组 （PBS组） 相比， NHEK细胞受脂肽刺激之后， 其裂解液对表皮 葡萄球菌 ₁₄₅₇ 、 痤疮丙酸杆菌、 大肠杆菌 DH5a的生长无影响。

结合实施例 5可见， 脂肽本身可以抑制痤疮丙酸杯菌的生长， 脂肽诱导 NHEK细胞后产 生防御素， 防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长。

实施例 8: 不同浓度脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金 黄色葡萄球菌的生长

分别用不同浓度的实施例 1所得脂肽刺激 NHEK细胞 24小时后， 收集细胞， 经超声波破 碎， 收集细胞裂解液上清。 将 10μ _§ 的细胞裂解液与 10 ⁶ CFU的金黄色葡萄球菌共同孵育 3h ( 37Ό ), 然后梯度稀释， 取 ΙΟμΙ点在固体平板上检测细胞裂解液对金黄� ��蔔萄球菌的抑制 作 。 如图 10所示， 实验结果表明， 用 2.5 g/mi 2i^g/mi脂肽刺激 NHEK细胞后， 其裂解液 可以明显抑制金黄色葡萄球菌的生长， 但当脂肽浓度降低到 ig/ml以 ^, ΝΉΕΚ细胞裂解 液则不能抑制金黄色葡萄球菌的生长。

实施例 9 脂肽对 NHEK细胞的毒性及增殖的影响。

分别用不同浓度的实施例 1所得脂肽刺激 NHEK细胞 24h后，取细胞上清用 LDH细胞毒 性检测试剂盒检测脂肽对 NHEK的毒性。 利用 MTT法检测脂肽对 ΝΉΕΚ细胞增殖的影响。 如图 11A所示， 实验结果表明， 高浓度脂肽对 NHEK会产生毒性， 毒性随着脂肽浓度的升高 逐渐升高， 低浓度脂肽对细胞没有毒性。 如图 11B所示， 高浓度 （例如 15 g/ml或以上） 的 脂趺抑制 ΝΉΕΚ细胞的增殖， 但低浓度（例如 1.25fig/m!或以下） 的脂肽不抑制 NHEK细胞 的增殖。

实施例 10: 脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。

将 8周的小鼠背部毛发脱去， 24小^后， 皮间注射实施例〗所得脂肽或 PBS (对照组）， 脂肽剂量为 2mg/kg， 22小^†后再一次皮间注射脂肽， 2·3小时后， 在相同位置注射

OD600-0.7-0.8的金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄� �菌注射前与含 2% cytodex beads的 PBS混合 均匀。 金黄色葡萄球菌的剂量为每只 ΙΟΟμΙ ( 1.75-2xl0 ⁷ CFU 每天观察小鼠背部皮肤的感染 情况并拍照。 三天后取对照组和脂肽组小鼠感染部位的皮趺 、 肝脏、 膊脏， 组织匀浆后， 梯 度稀释检测感染部位细菌的数量。

如图 12A所示， 分别用两组小鼠进行实验。 与对照组的小鼠 1、 小鼠 3相比较， 脂肽组的 小鼠 2、 小鼠 4的皮肤感染的病灶面积明显小， 可见脂肽明显抑制金黄色葡萄球菌对小鼠皮 肤的感染。 如图 12B所示， 实验统计结果表明， 与对照组相比较， 脂肽明显有效地控制感染 面积并抑制金黄色葡萄球菌对小鼠皮肤的感染 。 如图 12C所示， 脂肽注射组的小鼠体重显著 高于 PBS组。 如图 121〕、 图 12E所示， 脂肽注射组的小鼠皮肤、 肝脏细菌含量显著低于 PBS 注射组。 如图 12F所示， 脾脏中未检测出脂肽组与对照组之间的明显差 异。

实施俩 11 : 脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达

分别提取了 Π^2 ⁺ ' ^/+ 小鼠和 r2- 小鼠的角质形成细胞， 用实施例 1所得脂肽刺激 2411, 提取 RNA, real-time RT-PCR检测 mBD4的表达。 如图 13所示， 实验结果表明， 脂肽可以 诱导 Ϊ7Γ2 ^+/+ 小鼠角质形成细胞抗菌肽 m:BD4的表达， 但是在 Tlrf 小鼠的角质形成细胞没有 看到明显变化。

如实施例 6， 在 27r2 ⁴ 小鼠和 nr2- ^A 小鼠上分别注射 PBS (对照组）或实施倒 1所得脂 肽， 然后注射 OD _6(XF :0,6-0.8的金黄色葡萄球菌 （1.75-2xl0 ⁷ CFU ) ；!, 检測脂肽注射后小鼠抵 抗金黄色葡萄球菌感染的能力。 如图 14A、 图 14C所示， 实验结果表明， 脂肽注射的 n ^+A 小鼠可以抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

但是， 如图 14B、 图 14C所示， 脂肽注射的 77r 2敲除小鼠 Tir ) 却不能抵抗金黄色 葡萄球菌的感染。 如图 14E、 图 14F、 图 14G所示， 皮趺、 肝脏、 脾脏中的金黄色蔔萄球菌 的数目没有显著性差异。 可见脂舦是通过结合 ΠΓ 2来抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

实施例 12: 脂肽通过激活 Ρ38 ΜΑΡΚ.信号通路诱导防御素的表达。

用 PBS、 实施例 1所得脂肽、 SB202190(p38 MAPK抑制剂)、 实施倒 1所得脂肽加 SB202190分别刺激 ΝΉΕΚ细胞， 如图】 5A、 图 15B所示， 加入实施例 1所得脂舦可以显著 性地诱导人 β防御素 - hBDs (liBD2 , liBD3) 的表达， 而加入了抑制剂之后則不能诱导 hBDs 的表达。

分离小鼠的角质形成细胞, 用 PBS、 实施例 1所得脂肽、 SB202190(.p38 MAPK抑制剂)、 实施例 1所得脂肽加 SB202190分别刺激。 实验结果如图 16 A、 图 16B所示， 实施例 1所得 脂肽可以诱导小鼠角质形成细胞防御素的表达 ， 加入 SB202190将 p38 MAPK信号通路抑制 之后， 实施例 1所得脂肽不能诱导小鼠角质形成细胞防御素� �表达。 说明脂肽诱导小鼠角质 形成细胞产生防御素也是通过 p38 MAP 信号通路。

实施例 13: 脂肽衍生物诱导防御素的表达

在式（1 ) 的基础上， 改变肽链或脂链的长度、 实施俩 1所得脂肽亲水性或疏水性获得一 系列不同结构的脂肽衍生物。 委托吉尔生化 （上海） 有限公司合成不同结构的脂肽衍生物， 其结构分别为式 （2)、 ( 3)、 (4)、 (5)、 (6), 通过固相合成方法合成其中的肽链， 通过邻苯 二甲酰丁辛酯和 N-甲基吗琳合成其中的脂肪酸并接在该肽链上� ��成脂肽衍生物。用不同浓度 的脂肽衍生物刺激人角质形成细胞 细胞 24小时， 然后提取细胞的总 RNA, 反转录成 cDNA后， reai-time RT PCR检测 β -防御素 2 (hBD2) 和 β ··防御素 3 (hBD3) 的表达。

实验结果表明， 如图 17所示， 脂肽衍生物都可以诱导 ί¾ΐ銜素 2的表达。 图 17A为式（2) 所述脂肽衍生物诱导 防銜素 2 (hBD2) 的表达结果； 图 17B为式 （3 ) 所述脂肽衍生物诱 导 β ·防銜素 2 (hBD2)的表达结果；图 17C为式（4)所述脂肽衍生物诱导 β ··防御素 2 (hBD2) 的表达结果； 图 17D为式 （5) 所述脂肽衍生物分别诱导 β -防御素 2 (hBD2)、 β -防御素 3 (liBD3) 的表达结果； 图 17E为式 (6) 所述脂肽衍生物分别诱导 β -防御素 2 (hBD2)、 β - 防御素 3 ChBD3) 的表达结果， 认结果可以看出式（6)所述脂趺衍生物诱导防� ��素的效果最 为明显， 其中 6,4 μ Μ的式 (6) 脂肽衍生物可以使 hBD2表达上调 280倍， h:BD3表达上调 25倍， 表达量显著提高。

实施例 14: 脂肽衍生物的细胞毒性以及其对角质形成细胞 增殖的影响。

分别用不同浓度的如式 （2)、 式 （3)、 式 （4)、 式 （5)、 式 （6) 所述脂肽衍生物刺激 NHE 细胞 24h后， 取细胞上清用 LDH细胞毒性检测试剂盒检测脂肽对 NHEK的毒性。 在 细胞中加入 MTT, 检测脂肽衍生物对 NHEK细胞增殖的影响。结果如图 18所示。 图 18A为 式 （2) 所述脂肽衍生物的结果； 图 18B为式 （3) 所述脂肽衍生物的结果； 图 18C为式 （4) 所述脂趺衍生物的结果； 图 18D为式 （5 ) 所述脂肽衍生物的结果； 图】 8E为式 （6) 所述脂 肽衍生物的结果。 实验结果表明， 脂肽衍生物对 NHEK会产生轻微的毒性， 毒性随着脂肽浓 度的升高逐渐升高。 高浓度的脂肽衍生物对 NHEK细胞的增殖也有轻微的抑制作用。 但是这 些毒性都在可接受的范围内。

实施例 15: 脂肽及其衍生物在化妆品、 洗涤用品中的应用。

将式（6)所述脂肽衍生物（终浓度 lffig/mi)与 DMSO (终浓度 25% )、 1†油 (终浓度 25%) 混合均匀形成涂液。 将 8周的小鼠背部毛发脱去， 24h后， 涂抹混合液， 作为脂肽组。 48h后 取一部分小鼠组织抽提 RNA, 利 )¾ realtime RT-PCR检测小鼠 β -防御素 4和 β -防御素 14的 表达。 如图 19A, 图 19B所示， 与对照组相比较， 脂肽组可明显提高小鼠皮肤 β ··防銜素 4和 β—防御素 14的表达。 但是由于小鼠个体之间差异太大， 未表现显著性差异。

检验小鼠皮肤吸收脂肽的情况。 将经涂液涂抹的小鼠皮肤剪下， 组织勾浆后， 离心， 取 上清， 在 Aigiem 1200高效液相色谱仪上检测皮肤对脂肽衍生物� �吸收。 结果如图 20所示： 图 20A所示为单独 PBS (对照组） 的 HPLC图， 图 20B所示为脂肽衍生物组的 HPLC图， 箭 头所示位置为脂肽衍生物的出峰， 出峰时间为 26.37nnin。 在小鼠皮肤表面涂抹脂肽衍生物 48h之后，取皮肤匀浆后，离心取上清上样到 HPLC上，可以看到在 26.30min出现一与图 20B 相同的脂舦峰图， 如图 20D所示。 由于色谱柱温度、 环境温度或机器本身的影响， 同一种物 质两次实验的保留时间可能会出现一定的漂移 ， 图 20B与图 20D中脂肽衍生物保留时间相差 0.07min, 可以认定为同一物质。 如图 20C所示， 对照组在 26,37mii 左右没有出现与图 20B 相似的峰。 可见小鼠皮肤可以吸收脂肽衍生物， 进而诱导防御素的表达， 抑制病原菌的感染。

将如式 （1 )所示的脂肽 （终浓度 lmg/ml) 与 DMSO (终浓度 25% )、 甘油 (终浓度 25%) 混合均匀形成涂液， 采用与上述相同的实验方法， 得到的实验结果同上， 表明涂抹如式 （1 ) 所示的脂肽的小鼠， 其皮肤可以吸收该脂肽， ϋ皮肤 β -防御素 4和 β -防御素 14的表达明显 提高， 捭制病原菌的感染。