Lipophile Metall-Komplexe für Nekrose und Infarkt-lmaging Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, d. h. die Verwendung von Metal Ikomplexen, die eine Plasmaproteinbindung von mindestens 10 % aufweisen, als bildgebende Diagnostika zur Lokalisation eines Infarktes oder einer Nekrose infolge der persistierenden Anreicherung der Substanzen im Infarkt oder Nekroseareal.

Detektion, Lokalisierung und Überwachung von Nekrosen oder Infarkten ist ein wichtiger Bereich in der Medizin. So resultiert der Myokardinfarkt nicht sofort in einem unwiederbringlich funktionsuntüchtigen Gewebe, sondern leitet einen dynamischen Prozeß ein, der sich über einen längeren Zeitraum (Wochen bis Monate) erstreckt. Die Erkrankung verläuft in etwa drei Phasen, die nicht scharf voneinander getrennt, sondern überlappend sind. Die erste Phase, die Entwicklung des Myokardinfarktes, umfaßt die 24 Stunden nach dem Infarkt, in denen die Zerstörung wie eine Stoßwelle (Wellenfrontphänomen) vom Subendokard zum Myokard fortschreitet. Die zweite Phase, der bereits bestehende Infarkt, umfaßt die Stabilisierung des Bereiches, in dem Faserbildung (Fibrose) als Heilprozeß erfolgt. Die dritte Phase, der ausgeheilte Infarkt, beginnt, nachdem alles zerstörte Gewebe durch fibröses Narbengewebe ersetzt ist. Während dieser Periode findet eine umfangreiche Restrukturierung statt.

Bis heute ist kein präzises und zuverlässiges Verfahren bekannt, das die aktuelle Phase eines Myokardinfarktes am lebenden Patienten diagnostizierbar macht. Für die Beurteilung eines Myokardinfarktes ist es von entscheidender Bedeutung, zu wissen, wie groß der Anteil des bei dem Infarkt definitiv verlorenen Gewebes ist und an welcher Stelle der Verlust erfolgte, denn von dieser Kenntnis hängt die Art der Therapie ab.

Infarkte erfolgen nicht nur im Myokard, sondern auch in anderen Geweben, besonders im Hirn.

Während der Infarkt in gewissem Umfang heilbar ist, können bei einer Nekrose, dem lokal begrenzten Gewebetod, nur die schädlichen Folgen für den Restorganismus verhindert oder wenigstens gemildert werden. Nekrosen können auf vielfache Weise entstehen : durch Verletzungen, Chemikalien, Sauerstoffdefizit oder durch Strahlung. Wie beim Infarkt ist die Kenntnis von Umfang und Art einer Nekrose wichtig für das weitere ärztliche Vorgehen.

Bekannt ist, daß Infarkt und Nekrose durch gegen intrazellulär vorkommende Biomoleküle gerichtete Antikörper und durch Porphyrine, Metalloporphyrine und deren Derivate dargestellt werden können. Antikörper und Porphyrine sind jedoch nur mit großem Aufwand herzustellen und in Handhabung und Verträglichkeit in mehrerer Hinsicht problematisch.

Es konnte nun gezeigt werden, daß überraschenderweise Metallkomplexe, die eine Plasmaproteinbindung von mindestens 10 % aufweisen, als bildgebende Diagnostika zur Lokalisation infarktbedingter oder anderweitig verursachter Nekrose, geeignet sind. Dabei besteht der wesentliche Vorteil in einer persistierenden positiven (hellen) Anfärbung der nekrotischen Areale bei geringem bis fehlendem Signalenhancement der Umgebung. Nicht proteingebundene, ansonsten vergleichbare Komplexe führen nur kurzfristig zu einem Signalenhancement gut perfundierter Gewebe, wobei minderperfundierte -auch vitale-Gewebe ausgespart bleiben. Die Durchblutung von Geweben kann auch mittels T2 oder T2-Stern (Suszeptibilitäts-) Effekten nachgewiesen werden, unterscheidet jedoch nicht vitales von nekrotischem Gewebe.

Die Plasmaproteinbindung wird, wie dem Fachmann geläufig, durch Gleichgewichtsdialyse bestimmt.

Bevorzugt geeignet sind Metallkomplexe, die eine Plasmaproteinbindung von mindestens 50 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 % aufweisen. Die erfindungsgemäßen Metalikomplexe weisen ein Molekulargewicht von mindestens 350 Da, bevorzugt mindestens 400 Da, auf.

Sie besitzen eine T-Relaxivität von mindestens 2, 0 [s-1 mM~1], gemessen bei 37° C und 20 MHz in Plasma (s. z. B. Chem. Rev. 1987, 87, 901). Ihre Stabilitätskonstante beträgt mindestens 1015(logK = 15).

Die erfindungsgemäßen Metalikomplexe sind Metallderivate von z. B.

Polyaminopolycarbonsäuren, Polyaminopolyphosphonsäuren, Porphyrinen, Texaphyrinen, Sapphyrinen, Peptiden und deren Derivate, wie sie z. B. in _ US 5, 403, 576 WO 94/27644 EP 452 392 EP 391 766 US 5, 512, 294 US 5, 536, 491 WO 95/09848 US 5, 462, 725 WO 95/32741 EP 425571 US 5, 562, 894 WO 95/32004 US 5, 407, 657 US 5, 370, 860 US 5, 463, 030 WO 94/10182 JP 05186372 US 5, 277, 895 WO 93/16375 EP 413405 DE 43 02 287 EP 352218 DE 40 11 684 EP 405704 DE 38 34 704 EP 292689 WO 97/26017 EP 230893 WO 95/28179 US 5, 318, 771 WO 89/05802 US 5, 422, 096

US 4, 899, 755 US 5, 527522 US 5, 250, 285 WO 93/03351 WO 91/03200 WO 96/23526 EP 0722739 WO 95/28392 EP165716 EP 540075 US 5, 480, 990 WO 95/32192 WO 95/31219 US 5, 358, 704 US 5, 466, 438 WO 92/11232 WO 95/31444 WO 95/15319 WO 95/09161 US 5, 453, 264 JP 05186372 EP 661279 WO 94/03593 WO 97/30734 WO 97/30733 DE 44 05 140 GB 8903023 US 4, 880, 008 US 5, 583, 220 beschrieben sind.

Werden die erfindungsgemäßen Metallkomplexe für die NMR-Diagnostik verwendet, so muß das Metall paramagnetisch sein. Dieses kann ein Element aus der Reihe der Übergangsmetalle oder der Lanthaniden sein. Geeignete lonen umfassen diejenigen der Elemente Eisen, Mangan, Gadolinium und Dysprosium.

Werden die erfindungsgemäßen Metahkompiexe für die Radiodiagnostik verwendet, so muß das Metall radioaktiv sein. Dieses kann ein isotop aus der Reihe der Elemente Tc, In, Rh, Ga, Sc, Bi, Y, Fe, Sm, Ho, Co, Cu, Gd, und Eu sein.

Als geeignete Chelatoren seien beispielhaft genannt : 2- (4-Ethoxybenzyl)-3, 6, 9-tris (carboxymethyl)-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11- dicarbonsäure (Ligand von Eovist (E)), EP 405704 2-(4-Benzyloxybenzyl)-3, 6, 9-tris (carboxymethyl)-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11- dicarbonsäure, EP 405704 2- (4-Butylbenzyl)-3, 6, 9-tris (carboxymethyl)-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11- dicarbonsäure, WO 95/28179 2, 5, 8, 11-Tet4rakis(carbonxymethyl)-2, 5, 8, 11-tetraazabicyclo [l 0, 4, 0]-hexadecan, US 5, 358, 704 2, 5, 12, 15-Tetrakis (carboxymethyl)-2, 5, 12, 15-tetraazatricyclo [10, 4, 0, o6, 1 1] icosan, US 5, 358, 704 10- [1-Methyl-2-oxo-3-aza-5-oxo-5- {4-perfiuoroctylsu Ifonyl-piperazin-1-yl}- pentyl]-1, 4, 7-tris (carboxymethyl)-1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecan, WO 97/26017 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 10- [2-Hydroxy-4-aza-5-oxo-7-oxa-10, 10, 11, 11, 12, 12, 13, 13, 14, 14, 15, 15, 16, 16, 17, 17, 17,-heptadecafluorheptadecyl]-1, 4, 7-tris (carboxymethyl)- 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecan, WO 97/26017 2-[1,4,7,10-Tetraaza-4,7,10-tris(carboxymethyl)-cyclododecan -1-yl]3- benzyloxypropionsäure, WO 89/05802 2-Benzylxoymethyl-3, 6, 9-tris (carboxymethyl)-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11- dicarbonsäure, EP 230893

DTPA-Lys-Asp-Asp-4-pentylbicyclo [2, 2, 2]-octan-1-carbonsäure, Mallinckrodt MP-2269, Vancouver SMRM, April 1997.

4- [Hydroxymethyl- (4, 4-diphenyl) cycfohexyloxy-phosphorsäurediester]-3, 6, 9- carboxymethyl-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11-dicarbonsäure (MS-325), WO 96/23526.

4-[Hydroxymethyl-(10-phenyl)-decyloxy-phosphorsäurediest er]-3,6,9- carboxymethyl-3, 6, 9-triazaundecan-1, 11-dicarbonsäure (MS-323, WO 96/23526.

N- (4-Decyiphenylcarbamoylmethyl)-diethylentriamin-N, N', N", N"- tetraessigsäure, EP 603403.

4,5-Diethyl-10,23-dimethyl-9,24-bis(3-hydroxypropyl)-16,1 7-bis[2-[2-(2- methoxyethoxy]ethoxy]-13,20,25,26,27-pentaazapentyacyclo[20. 2.1.]3,6 #18,11.014,19]heptacosa-3,5,8,10,12,14,16,18,20,22,24-undeca ene. US 5, 583, 220.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man die entsprechenden Komplexverbindungen-gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze-in wäßrigem Medium suspen- diert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie zum Beispiel Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern oder schwachen Komplexen (wie zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure oder die zu den erfindungsgemäßen Metallkomplexen korrespondierenden Ca-Kom- plexe) oder-falls erforderlich-Elektrolyte wie zum Beispiel Natriumchlorid oder-falls erforderlich-Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure.

Sind für die enterale bzw. parenterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, werden sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff (en) [zum Beispiel Methyl-cellulose, Lactose, Mannit] und/oder Tensid (en) [zum Beispiel Lecithine, Tween, Myrj ] und/oder Aromastoff (en) zur Geschmackskorrektur [zum Beispiel ätherischen Ölen] gemischt.

Prinzipiell ist es auch möglich, die pharmazeutischen Mittel ohne Isolierung der Komplexe herzustellen. In jedem Fall muß besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, die Chelatbildung so vorzunehmen, daß die erfindungsgemäßen Komplexe praktisch frei sind von nicht komplexierten toxisch wirkenden Metallionen.

Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Farbindikatoren wie Xylenolorange durch Kontrolltitrationen während des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung der Komplexverbindungen und ihrer Salze. Als letzte Sicherheit bleibt eine Reinigung des isolierten Komplexes.

Die pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 0, 1 mol-1 Mol/I des Komplexes und werden in der Regel in Mengen von 0, 0001-5 mMol/kg dosiert.

Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt. Die Komplexver- bindungen kommen zur Anwendung 1. für die NMR-Diagnostik in Form ihrer Komplexe mit den lonen der Elemente mit den Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 und 58- 70 ; 2. für die Radiodiagnostik in Form ihrer Komplexe mit den Radioisotopen der Elemente mit den Ordnungszahlen 27, 29, 31, 32, 37-39, 43, 49, 62, 64, 70, 75 und 77.

Die Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. So sind sie hervorragend dazu geeignet, nach oraler oder parenteraler Applikation durch Erhöhung der Signalintensität das mit Hilfe des Kernspintomographen erhaltene Bild in seiner Aussagekraft zu verbessern. Ferner zeigen sie die hohe Wirksamkeit, die notwendig ist, um den Körper mit möglichst geringen Mengen an Fremdstoffen zu belasten, und die gute Verträglichkeit, die notwendig ist, um den nichtinvasiven Charakter der Untersuchungen aufrechtzuerhalten.

Die gute Wasserlöslichkeit und geringe Osmolalität der Mittel erlaubt es, hochkonzentrierte Lösungen herzustellen, damit die Volumenbelastung des Kreislaufs in vertretbaren Grenzen zu halten und die Verdünnung durch die Körperflüssigkeit auszugleichen. Weiterhin weisen die Mittel nicht nur eine

hohe Stabilität in-vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in- vivo, so daß eine Freigabe oder ein Austausch der in den Komplexen gebundenen-an sich giftigen-lonen innerhalb der Zeit, in der die Kontrast- mittel vollständig wieder ausgeschieden werden, nur äußerst langsam erfoJgt. lm allgemeinen werden die Mittel für die Anwendung als NMR-Diagnostika in Mengen von 0, 0001-5 mMol/kg, vorzugsweise 0, 005-0, 5 mMol/kg, dosiert.

Die Mittel sind aufgrund ihrer günstigen radioaktiven Eigenschaften und der guten Stabilität der in ihnen enthaltenen Komplexverbindungen auch als Radiodiagnostika geeignet. Details einer solchen Anwendung und Dosierung werden z. B. in"Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, beschrieben.

Bei der in-vivo-Applikation der Mittel können diese zusammen mit einem geeigneten Träger wie zum Beispiel Serum oder physiologischer Kochsalzlosung oder zusammen mit einem Protein wie zum Beispiel Human Serum Albumin verabreicht werden. Die Dosierung ist dabei abhängig von der Art der zellulären Störung, dem benutzten Metallion und der Art der bildgebenden Methode.

Die Mittel werden üblicherweise parenteral, vorzugsweise i. v., appliziert. Sie können auch-wie bereits erörtert-intravasal oder interstitiell/intrakutan appliziert werden.

Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstands :

MRI Experimente an Tieren mit induzierten Niereninfarkten Das Enhancement im MRI Experiment wurde nach einmaliger intravenöser Applikation der Substanz Eovist 0 an Tieren mit experimentell erzeugten Nieren-Nekrosen bzw.-Infarkten untersucht. Plasmaproteinbindung : 10 %- (Europ. Workshop on Magn. Reson. in Medicine, Santiago de Compostela, Spanien, 28.-30. 9. 1994) Die Induktion der Niereninfarkte erfolgte an narkotisierten (Rompun (E)/ <BR> <BR> Ketavet, i. p.) Ratten (Han. Wistar, Schering SPF, ca. 200 g Körpergewicht) durch Okklusion eines (caudalen) Astes der linken Nierenarterie. Die Kontrastmittelapplikation (Dosis : 300 bzw. 500 umol Gd/kg Körpergewicht) erfolgte ca. 24 h nach der Infarktinduktion. Die Tiere wurden vor und bis 24 h nach Kontrastmittel-Applikation MR-tomographisch (SISCO SIS 85, 2 Tesla ; SE-Sequenz, TR : 400 ms, TE : 15 ms, nt=4, ni=128, FOV : 12-7 cm, SD ; 3 mm, je 1 Schicht axial bzw. coronar) untersucht.

Nach Abschluß der MRI-Experimente wurden die narkotisierten Tiere durch Entbluten (via V. cava) getötet und beide Nieren präpariert. Zur Verifizierung des Infarktes (Größe und Lage) wurde die linke (infarzierte) Niere entnommen, in Scheiben geschnitten und anschließend eine NBT ("Vital-") Färbung durchgeführt.

Vor Kontrastmittelapplikation war keine Unterscheidung zwischen vitalen und avitalen (infarzierten) Arealen in der (linken, behandelten) Niere möglich (s.

Abbildung 1 a, 2a).

Direkt nach Substanzapplikation stellte sich der nicht-perfundierte Anteil der Niere jeweils als hypointenses Areal dar (s. Abbildung 1 b, 2b). Ab ca. 15-30 min p. i. stieg die Signalintensität im nicht-perfundierten Areal etwas an bzw. die Größe des abgegrenzten (signalarmen) Areals nahm ab (--> langsame Diffusion in die Nekrose). In der späten Phase (ca. 4-6 h p. i.) war bei allen untersuchten Tieren ein deutlicher Signalanstieg (Enhancement) im nekrotischen Areal der Niere festzustellen (s. Abbildung 1 c, 2c). Die Abgrenzung des nekrotischen Areals im MRI-Experiment korrelierte sehr gut mit den Ergebnissen der histologischen"Vital"-Färbung.

MRI-Experimente an Tieren mit induziertem Myocardinfarkt Das nekroseselektive Enhancement wurde nach einmaliger intravenöser Applikation der Substanz MS-325 (WO 96/23526, Beispiel 10, Gd-DTPA- Derivat) an Tieren mit experimentell erzeugtem Myokardinfarkt im MRI Experiment untersucht. Die Induktion der Herzinfarkte erfolgte an narkotisierten (Domitor/Dormicum i. m.) Ratten Han. Wistar, Schering SPF, mannl., ca.

300 g KGW, N=10) durch Okklusion der linken Coronararterie. Die Kontrastmittelapplikation (Stammlösung mit Blut verdünnt, Dosis 100 u mol/kg, i. v. bolus) erfolgte 24 Stunden nach Infarktinduktion. Die Tiere wurden vor und bis zu 3 Stunden (1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150 und 180 Minuten) p. i. kontinuierlich sowie 24 Stunden nach KM-Applikation MR-tomographisch untersucht (SE, SAT, EKG-getriggert, TR : ca. 400 ms, TE : 10 ms, nt=4, Ma : 128 * 256, FOV : 7 * 7 cm, SD # 3mm, je 1 Schicht axial).

Nach 24 Stunden p. i. wurden die Tiere-im MRT-durch eine Narkotikaüberdosis getötet und ein MRI-Experiment am"frischtoten"Tier (keine Bewegungsartefakte) durchgeführt. Zur Verifizierung des Infarktes (Größe und Lage) wurde das Herz präpariert, in Scheiben geschnitten und einer Färbung mit NBT (nitro blue tetrazolinum chloride) unterzogen. Es erfolgte subjektive Beurteilung des Enhancements und Korrelation mit dem gefärbten Gewebe. Die Signalintensitäten wurden auf eine Gd-DTPA-Lösung (0, 25 mol/1) standardisiert und das prozentuale Enhancement SI post-Sl pre)/Sl pre 100 % sowie der Kontrast SI inf/Sl myocard wurden berechnet.

Im gesunden Myocard (Septum) wie auch im Muskel zeigte sich das maximale Enhancement unmittelbar nach der Substanzapplikation mit 100 % bzw. 60 %.

Die Signalintensität sank dann und erreichte nach 150 Minuten einen Wert zwischen 10 und 20 %.

Im infarzierten Bereich dagegen stieg die Signalintensität innerhalb 60-75 Minuten auf etwa 130 % an und blieb dann nahezu unverändert (bis zur 180.

Minute).

Beim Kontrast war in den ersten 10 bis 15 Minuten ein negativer Kontrast (SI inf / SI myocard <1) zu beobachten. Etwa ab der 30. Minute war ein positiver Kontrast (SI inf/Sl myocard >1) festzustellen.

Nach einem Tag p. i. war in allen Geweben etwa wieder die Ausgangsintensität (5-15 %) erreicht und eine Kontrastierung des Myocardinfarktes (SI inf/Sl myocard # 0, 98) nicht mehr erkennbar.

MS-325 zeigt eine Eignung als Infarkt-Kontrastmittel.