PROCEDE DE PREPARATION

La présente invention concerne un composé lipopolyamine ci des compositions pharmaceutiques en comprenant. Plus particulièrement la présente invention concerne l'utilisation de cette composition pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule hôte. Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un composé selon l'invention, et un procédé de purification d'un isomère dudit composé.

Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base même de la thérapie génique. Cependant, un des problèmes majeurs est d'introduire une quantité suffisante d'acide nucléique thérapeutique dans la cellule hôte à traiter. Les vecteurs les plus efficaces à cet égard sont des vecteurs viraux, en particulier rétroviraux et adénoviraux. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans le noyau. Cependant, l'approche virale a ses limitations, notamment une capacité de clonage dans le génome viral restreinte, une production de particules virales infectieuses susceptibles de dissémination dans l'organisme hôte et l'environnement, un risque de mutagénèse insertioπnelle dans le cas des vecteurs rétroviraux, et une induction de réponses immunitaires et inflammatoires chez l'hôte. Ces inconvénients importants dans le cadre d'un usage humain justifient la recherche de systèmes alternatifs de transfert d'acides nucléiques.

De nombreuses méthodes sont disponibles à l'heure actuelle parmi lesquelles la coprécipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la microinjection ou encore la lipofection. Cette dernière utilise des lipides cationiques qui interagissent spontanément avec l'acide nucléique par interaction de charges pour former des complexes chargés positivement capables de fusionner avec les membranes cellulaires anioniques et faire pénétrer l'acide nucléique qu'ils transportent.

L'utilisation de lipides cationiques comme vecteur de transfert de diverses molécules d'intérêt thérapeutique a déjà été décrite dans la littérature. Il a été montré que les lipides cationiques de structures chimiques variées permettent la transfection de cellules de mammifères en culture avec des efficacités très différentes dépendant du type de cellule et de la formulation des complexes lipides-ADN. Cependant, les efficacités sont généralement variables et faibles chez l'animal, notamment en ce qui concerne une administration musculaire, et les résultats obtenus avec les molécules synthétiques actuellement disponibles, ne sont pas satisfaisants. Dans leur ensemble, ces études n'ont pas permis d'identifier des facteurs influençant l'efficacité du mécanisme de transfert de gènes et les essais d'optimisation en fonction de paramètres structurels tels que la taille des particules, la charge, le contenu en ADN etc... n'ont pas apporté de réponses claires.

EP 0 349 1 1 1 et W095/18863 (Behr et al.) se rapportent à la composition lipidique comprenant un composé 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide (encore désignée DOGS) qui résulte de la combinaison de la spermine avec un lipide à chaîne linéaire. WO95/1 8863 décrit des expériences de transfection in vivo réussies avec un rapport de charges + /- inférieur à 2, uniquement dans des souris nouveaux-nées par injections intracérébrales. Aucune transfection par administration intramusculaire ou intraveineuse n'est obtenue, en particulier sur des souris autres que nouveaux-nés.

L'article de Gao et Huang, 1991 dans BBRC 179, 280-285 et la demande internationale WO93/05162 décrivent une lipopolyamine, le DC-CHOL issue de la réaction du cholesteryl chloroformate et d'une amine tertiaire (diméthylethylène diamine) . Le DC-CHOL ou 3 R( [N - ( N\ N' - diméthylaminoéthane) - carbamoyl] cholestérol ne comporte qu'une charge positive et de ce fait présente un pouvoir transfectant faible.

Le but de la présente invention est de fournir de nouveaux lipides cationiques plus efficaces, en particulier pour une application comme vecteur de transfert d'ADN, notamment en vue d'une administration intramusculaire, intratrachéale ou encore intrapulmonaire.

La présente invention a donc pour objet un compose lipopolyamine de formule ;

C - (S) _m ( I ) dans laquelle :

- C représente un reste désoxy en position 3 du cholestérol ou un reste monovalent ou polyvalent d'un dérivé de cholestérol portant un ou respectivement plusieurs groupements réactifs susceptibles de réagir avec un groupe amine primaire ou secondaire d'une molécule polyamine ,

- S représente un reste amine dudit groupe amine d'une molécule polyamine, et

- m représente un nombre entier de 1 à 3.

On entend par "dérivé du cholestérol" un composé ayant pour formule le squelette du cholestérol lié à un ou plusieurs substituant(s) dont au moins un comprend un groupement réactif susceptible de réagir avec un groupe amine primaire ou secondaire d'une molécule polyamine.

A titre illustratif, on cite plus particulièrement comme :

- composés où m ≈ 1 , les composés dans lesquels C représente un reste monovalent désoxy en position 3 du cholestérol ;

- composés où m = 2, les composés dans lesquels C représente un reste divalent didesoxy de 5-cholesten-3β, 4β-diol, ou 5-cholesten- 3β, 25-diol, et,

- composés où m = 3, les composés dans lesquels C représente un reste trivalent tridesoxy- du cholesten - 3β, 5f _\ 6β-triol.

Dans un mode préféré de réalisation S est un reste d'une molécule polyamine de formule :

H2N - [-(CH ₂ )p - NH] _n - H ( IX)

et le composé lipopolyamine selon l'invention répond à la formule

HN [(CH ₂ ) _F Nh _n H ( n: I R i R2

dans laquelle :

- Ri et R ₂ représentent l'hydrogène ou un reste monovalent C ;

- le symbole R ₂ peut être identique ou différent dans les n fragments [(CH ₂ ) _P - N] ;

R2

- l'un seulement de R _! et des n substituants R ₂ représente undit reste monovalent C ;

- n est un nombre entier de 2 à 6 ; et

- p est un nombre entier de 2 à 6 identique ou différent dans les n fragments [(CH ₂ ) _P - N]

R2

De préférence dans la formule (II), Rj représente l'hydrogène et R ₂ représente l'hydrogène ou, pour un seul des n substituants, un reste déoxy en position 3 du cholestérol ou un reste monovalent ou polyvalent d'un dérivé de cholestérol portant un ou respectivement plusieurs groupements réactifs susceptibles de réagir avec un groupe amine secondaire d'une molécule polyamine ;

- n est un nombre entier de 2 à 6 ; et

- p est un nombre entier de 2 à 6 identique ou différent dans les n

[(CH2) _P - N] ^r 1

De préférence les composés n = 2 ou 3 et p = 3 ou 4.

De préférence encore S représente un reste de composé naturel spermine ou spermidine correspondant aux composés de formule (IX) dans laquelle n = 2 et p = 3 et 4 (spermidine) et n = 3 et p = 3 , 4 et 3 respectivement dans les différents chaînons (spermine).

Dans un mode de réalisation particulier, le composé selon l'invention est caractérisé en ce que le reste monovalent C, est un reste monovalent désoxy en position 3 du cholestérol.

Le couplage de l'aminé S peut alors se faire par exemple par substitution nucléophile d'un groupe tosylate en position 3 d'un composé cholestérol tosylate par une fonction amine de S, créant ainsi une liaison amine directe. Ceci a l'avantage de préserver le nombre de charges positives de la spermidine (3 charges) et spermine (4 charges).

Mais le couplage de l'aminé S peut également se faire par couplage d'un groupe réactif de C avec une fonction amine du composé de formule (IX). C'est le cas où C représente un reste d'un dérivé de cholestérol. Plus précisément le reste C peut représenter un reste d'un dérivé de cholestérol en position 3 de formule L-R dans laquelle :

- L représente un radical aliphatique comportant un reste d'un groupe pouvant réagir avec un groupe amine primaire ou secondaire et

- R représente le reste en position 3 de formule

On cite en particulier les composés dans lesquels le reste de dérivé du cholestérol en position 3 a pour formule :

Ce reste (V) est un reste de dérivé chloroformate en position 3 de cholestérol.

On peut citer également les composés de formule (III) dans lesquels L représente un lien de type hemisuccinate de formule

- C - (CH ₂ ) ₂ - C I l I I

O O

Ce reste est alors un reste d'un dérivé OH - C - (CH ₂ h - C - R

U I I

O O que l'on peut obtenir en greffant un radical succinite anhydre sur le cholestérol. La réaction s'accompagne d'une ouverture du cycle succinite qui peut ensuite réagir avec la polyamine. Ce mode de réalisation introduit un bras entre cette dernière et le cholestérol.

La présente invention fournit également des isomères monosubstitués de cholestérol purifiés répondant à la formule :

H - N - (CH ₂ ) ₃ - N - (CH ₂ )4 - ^• NH (VI )

_|

Ri R2 ¹ R ₂ 2

dans laquelle Ri et R ₂ ', avec i = 1 et 2 ont les significations de Ri et R ₂ données précédement et des composés répondant à la formule :

H - N - (CH ₂ ) ₃ - N - (CH ₂ ) ₄ - N - (CH ₂ ) ₃ - N - H (VII ) 1 1 I I

Ri R2 ¹ R2 ² R2 ³

dans laquelle R i et R ₂ ' avec i = 1 , 2 et 3 ont les significations de R _t et R ₂ données précédemment.

On cite plus particulièrement, les composés de formule (VI) pour lesquels : - R ₂ ^l représente undit reste monovalent de cholestérol ou d'un dérivé de cholestérol en position 3 et,

- Ri et R ₂ 2 représentent H. ainsi que les composés pour lesquels :

- Ri et R ₂ ¹ représentent H et - R? ² représente undit reste de cholestérol ou d'un dérivé de cholestérol en position 3 et, les composés pour lesquels :

- R i représente undit reste monovalent de cholestérol d'un dérivé de cholestérol en position 3, et

- R ₂ ¹ et R ₂ ² représentent H.

De même, on cite plus particulièrement, un composé selon l'invention, caractérisé en ce que dans la formule (VU) - R ₂ t et R ₂ ² représentent H, et

- l'un de Ri et R ₂ ³ représente ledit reste monovalent d'un dérivé de cholestérol en position 3 et l'autre représente H. ainsi que les composés selon l'invention, caractérisé en ce que dans la formule (VII) - Ri et R ₂ ³ représentent H, et

- l'un de R ₂ ¹ et R ₂ ² représente ledit reste de cholestérol ou d'un dérivé de cholestérol en position 3 et l'autre représente H. Ces composés dans lesquels le cholestérol ou dérivé de cholestérol est substitué sur une amine terminale des composés (VI) ou (VII) sont préférés.

Les données expérimentales décrites ci-après montrent que le pouvoir transfectant de ces isomères est supérieur lorsque le reste d'un dérivé de cholestérol en position 3 est greffé sur une amine terminale primaire du composé de formule (IX), en particulier sur le bras long [(CH ₂ ).ι] de la spermidine.

Les com posés se lon l ' invention son t effectivemen t avantageusement utilisés pour leur pouvoir transfectant pour le transfert dans une cellule d'une substance thérapeutiquement active chargée négativement.

La présente invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un composé selon l'invention et une substance thérapeutiquement active chargée négativement.

On cite en particulier une composition dans laquelle ladite substance active est un acide.

De préférence, ladite substance active est un acide nucléique.

Ledit acide nucléique peut être un ADN ou un ARN sens ou aniisens. Les applications sens et anti sens sont bien connues de l'homme de l'art. En bref, on entend par :

- "anti sens" un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible ; et - "sens" un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéique et impliquée dans l'expression d'un gène donné.

Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique comporte un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de réalisation, ledit fragment d'acide nucléique est avantageusement sous forme de plasmide.

Dans le cadre de la présente invention, l'acide nucléique peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut être avantageux d'utiliser un acide nucléique codant pour une cytokine (interleukine dont I'IL-2 , interféron, facteur stimulateur de colonies...), un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation (Facteur VII, Facteur VIII, Facteur IX... ) , la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator en anglais) , l'insuline, la dystrophine, une hormone de croissance, une enzyme (uréase rénine, thrombine...), un inhibiteur d'enzyme (inhibiteur d'une protéasc virale, α 1-antitrypsine...), un polypeptide à effet antitumoral (produit de gènes suppresseurs de tumeurs, polypeptide stimulant le système immunitaire...), un polypeptide capable d'inhiber ou ralentir le développement d'une infection bactérienne, virale ou parasitaire (polypeptide antigénique, variant trans-dominant...), un anticorps, une toxine, une immunotoxine et

!0 enfin un marqueur (luciférase, β-galactosidase, produit conférant la résistance à un antibiotique...). Bien entendu, cette liste n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent également être employés.

Avantageusement, l'acide nucléique est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte. Par "éléments nécessaires", on désigne l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Ces éléments comprennent un promoteur régulable ou constitutif, lequel peut être héiérologue ou au contraire homologue au virus parental. On peut citer, à titre d'exemples, le promoteur du gène PGK (Phospho Glycérate Kinase) humain ou murin, le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Virus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur TK (Thymidine Kinase) du virus HSV-1 (Herpès Simplex virus) et les promoteurs adénoviraux El A et MLP. Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionnels (séquence intronique, séquence signal de sécrétion, séquence de localisation nucléaire, site d'initiation de la traduction, signal poly A de terminaison de la transcription...).

Les expériences de transfection montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit fragment d'ADN est de 0,01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0, 1 à 10.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention pour préparer un vecteur de transfert dudit acide nucléique dans des cellules in vitro, ex vivo ou in vivo.

D'une manière générale, une composition selon l'invention peut être utilisée dans divers types de cellules hôtes. Il s'agit de préférence d'une cellule mammifère et en particulier d'une cellule humaine. Ladite cellule peut être une cellule primaire ou tumorale d'une origine

hématopoïetique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...) hépatique, épithcliale, fibroblaste... et tout particulièrement une cellule musculaire (myoblaste, cardiomyocyte...), une cellule trachéale ou pulmonaire. Par ailleurs, une composition selon l'invention peut comprendre un clément de ciblage vers une cellule particulière par exemple un ligand à un récepteur cellulaire. De tels éléments de ciblage sont connus.

Une composition selon l'invention peut être administrée par voie intragastrique, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale ou nasale. On préférera tout particulièrement les voies d'administration intracardiaque, intramusculaire, intrapulmonaire ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'invidu ou de la maladie à traiter ou encore de l'acide nucléique à transférer.

Une composition selon l'invention est destinée à la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal et, préférentiellement, par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocites du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transférer in vitro selon les techniques de l'art et de les réadministrer au patient.

La présente invention a donc également pour objet un vecteur de transfert d'acides nucléiques dans des cellules de microorganismes, de plantes, humaines ou d'animaux notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte une composition pharmaceutique selon l'invention comportant un acide nucléique et un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir transfectant de ladite composition.

Dans un mode de réalisation ledit adjuvant est un co-lipide neutre.

A titre d'exemples, on peut citer les phospholipides tels que la phosphatidyl éthanolamine, phosphatidyl choline, phosphatidyl serine, phosphatidyl glycérol ainsi que les détergents acceptables sur le plan pharmaceutique.

Il est également possible de combiner au mélange lipide/colipide une troisième substance pour amél iorer encore l'efficacité transfectionnelle ou la stabilité des complexes.

Le rapport molaire du composé lipopolyamine selon l'invention au co-lipide neutre adjuvant est de préférence de 0, 1 à 5 , de préférence encore de 0,25 à 2.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un composé lipopolyamine selon l'invention, caractérisé en ce qu'on réalise le couplage d'un composé chloroformate de formule :

O

I I

Cl - C \

O - R ( VII I )

dans laquelle R représente un reste désoxy en position 3 de cholestérol, avec un groupe amine du composé de formule :

H ₂ N-KCH ₂ )p - NHtnH (IX)

dans laquelle p et n ont les significations données ci-dessus.

Pour favoriser l'obtention de dérivés mono substitués de cholestérol, les conditions du procédé ont dû être adaptées.

La réaction étant effectuée en présence d'un excès d'aminé (IX) de 10 à 20 fois, à température de - 20°C, et en atmosphère de gaz inerte. En outre, le composé mono substitué de formule (II) est avantageusement obtenu par extraction dans un mélange eau/dichlorométhane suivi de deux étapes de cristallisation dans du méthanol de la fraction dichloromethane. En effet, on a dû sélectionner un solvant de cristallisation (le méthanol) adapté à l'hydrophobicité des molécules selon l'invention, capable de cristalliser en premier lieu les molécules les plus hydrophobes (dérivés polysubstitués), puis les monosubstitués (composés de formule (II)).

Pour obtenir un isomère d'un composé lipopolyamine selon l'invention, on prépare un composé de formule (X) qui correspond à un composé de formule (IX) dont au moins une fonction amine n'est pas protégée, mais dont les autres fonctions aminés sont protégées. Puis on réalise le couplage du composé (X) avec un composé chloroformate de fomule (VIII). On obtient ainsi un composé dont les fonctions aminés libres sont protégées et on déprotège lesdites fonctions aminés pour obtenir un composé de formule (II).

De préférence, pour préparer le composé de formule (VI) ou (VII) dans lesquelles p = 3 et 4 et n = 2 ou 3, on réalise le couplage d'une mole de 1 ,4 diaminobutane et 1 ou respectivement 2 moles d'acrylonitrile, puis on protège les groupes amine, puis on réduit le ou les groupe(s) nitrile(s) en groupe(s) amine(s). On obtient ainsi un composé de formule (VI) ou respectivement (VII) dans lequel le reste C est substitué sur une amine primaire terminale du composé de formule (IX).

Enfin, la présente invention a également pour objet un procédé de purification d'un isomère d'un composé selon l'invention, à partir d'un mélange d'isomères desdits composés, caractérisé en ce qu'on réalise une chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec une colonne supelcosil LC-ABZ.

La méthode de préparation des isomères sous forme substantiellement pure par HPLC en phase inverse s'est avérée particulièrement délicate à mettre en oeuvre du fait de leur caractéristique hydrophobe mais néanmoins polaire. A cet égard, le choix de la colonne s'est avéré déterminant : il a fallu employer une colonne à base de silice fortement dérivée en groupements Cl 8 et désactivée en surface, telle que la supelcosil® LC-ABZ prévue pour la purification de composés basiques. Les conditions de gradient appliquées ont également leur importance pour optimiser la purification d'isomères dont l'hydrophobicité est très proche.

Les résultats de transfection de lignées cellulaires en culture montrent une capacité de transfection de cellules d'origine tissulaires et d'espèces différentes. Dans une première série d'expériences menées en parallèle avec le DC Chol (3 β [N, N' - diméthylaminométhane) carbamoyie] cholestérol ), qui diffère des composés de l'invention par la présence de la N, N' - diméthyléthylènediamine ( 1 seule charge positive) à la place de la spermine ou spermidine (2 ou 3 charges positives), on observe une augmentation significative du transfert de gènes dans les cellules musculaires qui d'ordinaire sont réfractaires à la transfection. Par conséquent, les lipides cationiques de l 'invention sont tout particulièrement appropriés au traitement des maladies musculaires, notamment myopathies de Duchenne et Bccker. En outre, ils sont également efficaces pour transfecter les cellules pulmonaires et sont adaptés au traitement des maladies pu lmonaires, notamment mucoviscidose, cancer des poumon et asthme.

Un autre avantage des composés selon l'invention tels que spermine- cholestérol et spermidine-cholestérol, est qu'ils résultent de l'association de molécules naturellement présentes dans le corps humain. Le cholestérol constitue des membranes cellulaires et spermine et spermidine sont des molécules présentes de manière ubiquitaire dans les cellules. Cette caractéristique qui n'est pas partagée par les lipides cationiques de l'état de la technique, est un atout supplémentaire dans le cadre d'un usage

humain et limite les risques d'immunogénicité et de toxicité chez le patient. A cet égard, les composés de l'invention sont en effet susceptibles d'être métabolisés par les enzymes en produits naturels donc peu toxiques. Par conséquent, ils présentent des garanties de sécurité indispensables à un usage humain.

D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre.

Les données expérimentales qui suivent sont illustrées par référence aux Figures suivantes:

La Figure 1 illustre le profil HPLC analytique obtenu avec le composé spermidine-cholestérol après synthèse et 6 extractions consécutives eau/dichlorométhane.

La Figure 2 illustre le profil obtenu avec la préparation spermidine-cholestérol en HPLC semipréparative et visualise les trois isomères mono-cholestérol.

La Figure 3 illustre le profil obtenu avec la préparation spermine-cholestérol en HPLC semipréparative et visualise les deux isomères mono-cholestérol.

La Figure 4 représente schématiquement les étapes de synthèse de l'isomère N'-spermidine cholestérol par l'intermédiaire de groupements protecteurs.

La Figure 5 présente une chromatographie en couche mince d'isomères de spermine-cholestérol et spermidine-cholestérol produits par voie synthétique ou purifiés de la préparation lipidique (révélation par la ninhydrine).

La Figure 6 représente schématiquement les étapes de synthèse de l'isomère N^spermine cholestérol par l'intermédiaire de groupements protecteurs.

La Figure 7 illustre l'efficacité transfectionnelle du mélange spermidine-cholestérol/DOPE (ratio molaire de 1 : 0,74). L'axe Y représente l'absorbance lue à 405 nm, l'axe X la quantité de lipide/colipide (μg) par puit et l'axe Z la quantité d'ADN (μg) par puit.

La Figure 8 illustre l'efficacité de transfection de la lignée musculaire C2C12 avec les lipides cationiques (A) Transfectam, (B) DC-Chol, (C) spermidine-cholestérol et (D) spermine cholestérol.

La Figure 9 illustre l'efficacité de transfection des 3 isomères de spermidine-cholestérol (pic 1 à 3 de la Figure 2 ). L'axe X représente l'absorbance lue à 405 nm et l'axe Y la quantité d'ADN (μg) par puit.

1. Synthèse et purification du composé spermidine-cholestérol

La synthèse est effectuée dans des conditions favorisant l'obtention de dérivés monosubstitués. Pour ce faire, on se place en excès d'aminés (de préférence 10 à 20 fois d'excès molaire), à basse température (-20"C) pour ralentir la vitesse de réaction et en atmosphère en gaz inerte (par exemple argon) pour respecter les conditions anhydres. On indique que les produits de base spermidine, cholestéryl chloroformate et N-hydroxysuccinimide (NHS) sont disponibles commercialement (par exemple Sigma; référence S-2626, C-6633 et H-7377 respectivement).

On introduit dans un premier ballon sous argon:

- 1 ,6 g de cholestéryl chloroformate (soit 3,4 mmoles) repris dans 15 ml de dichloromethane anhydre (SDS, Peypin, France, référence 2910E16), et

- 0,5 g de NHS (4, 1 mmoles) dissous dans 5 ml de dioxane (SDS, Peypin, France, référence 03610) rendu anhydre par passage sur tamis moléculaire qui piège les molécules d'eau.

Le mélange A ainsi constitué est laissé sous agitation 15 h à 4°C.

En parallèle, dans un second ballon on introduit 10 g de spermidine (69 mmoles). Après séchage sous vide pendant 13 à 15 h, on ajoute afin de constituer le mélange B:

5 ml de dichloromethane anhydre, et

5 ml de diisopropyléthylamine (40 mmoles) (DIPEA, Applied Biosystem, St Quentin, France; référence 400136).

Le mélange B est également placé sous atmosphère argon.

Le mélange A est ajouté lentement dans le mélange B par l'intermédiaire d'un capillaire de 100 μm de diamètre, à raison d'environ 1 ml par min, à -20°C et sous agitation. On indique que le mélange A est relié par le même type de capillaire à un ballon connexe contenant 20 ml de dichloromethane anhydre place à une hauteur donnée qui définit le débit de passage de A dans B.

La préparation ainsi obtenue est tout d'abord lyophilisée à -80°C pour évaporer le solvant et le DIPEA. Le lyophilisât est repris dans environ 50 ml de dichloromethane, puis est extrait par un même volume d'eau. Après séparation des phases, on récupère la fraction dichloromethane qui est soumise à plusieurs extractions supplémentaires (en général 5 ) dans les conditions précitées. Les aminés libres qui sont extrêmement hydrophiles passent dans la phase acqueuse. La fraction dichloromethane est recueillie puis séchée.

Enfin, la qualité du produit peut être améliorée par deux étapes successives de cristallisation dans du méthanol. La première réalisée dans un volume de 120 ml, permet de cristalliser les produits les plus hydrophobes comme le cholestérol et les dérivés aminés polysubstitués. La seconde cristallisation est effectuée sur le surnageant de la première préalablement concentré à 10 ml par evaporation à 65°C. Les aminés monosubstituées sont récupérées dans le recristallisat à -20°C. A titre indicatif, on obtient 1 à 1,5 g de spermidine-cholestérol dans ces conditions ( 1,8 à 2,7 mmoles).

Il est bien entendu possible de procéder à la suite de cristallisations à des extractions supplémentaires dans le mélange eau/dichlorométhane (volume à volume) pour améliorer encore la pureté du produit.

2. Synthèse et purification du composé spermine-cholestérol

Le procédé mis en oeuvre est similaire à celui décrit précédemment mis à part les modifications suivantes:

Le mélange A est formé par addition de 2,09 g de cholestéryl chloroformate (4,65 mmoles) placés dans 15 ml de dichloromethane anhydre et 0,6 g de NHS (5,58 mmoles) repris dans 5 ml de dioxane.

Le mélange B résulte de la réaction de:

- 17,7 g de spermine ( 87,5 mmoles; Sigma, référence S-3256) préalablement séchés sous vide, et

- 5 ml de dichloromethane anhydre, et

- 5 ml de DIPEA (40 mmoles).

En ce qui concerne les rendements, ce procédé permet de générer 0,5 à 1 g de produit (0,8 à 1,6 mmoles).

3. Ca r a ct ér is ati on de s p r é pa r a ti o n s li pi di q u es spermidine-cholestérol et spermine-cholestérol.

3.1 Par chromatographie en couche mince

L'analyse par chromatographie en couche mince est effectuée après chaque étape clé du protocole de purification pour déterminer rapidement la contamination du produit de synthèse par les constituants de base. On applique les techniques conventionnelles (E. Stahl, Dunnschicht- Chromatographie, ein Laboratoriumshandbuch, 2 éd., Spinger-Verlag Berlin, Germany, 1967).

Brièvement, une aliquote est déposée sur une plaque de silice sur verre, laquelle est placée dans le solvant de migration N-propanol / ammoniaque 32 % (dans l'eau) / eau (6/3/1 en volume). Les différents constituants sont visualisés par l'acide sulfurique qui révèle toutes les molécules contenant du cholestérol ou par la ninhydrine 0, 1 % dans l'éthanol qui révèle uniquement les produits aminés.

La séparation est fonction de l'hydrophobicité, les produits les plus hydrophobes migrant le plus rapidement. La spermine et la spermidine libres sont détectées dans les phases aqueuses récoltées lors des extractions eau/dichlorométhane alors que la dernière phase dichloromethane contient majoritairement l 'aminé substituée par le cholestérol. La rétention frontale (Rf) caractéristique de chaque produit est de 0,71 et 0,68 pour la spermidine mono-cholestérol et la spermine monocholestérol.

3.2 Par chromatographie liquide haute performance en phase inverse

La qualité de la préparation lipidique peut également être suivie par HPLC (pour High Performance Liquid Chromatography en anglais) en conditions analytiques très particulières. On applique un gradient eau/isopropanol en présence d'acide trifluoroacétique (TFA) 0, 1 % dans les conditions expérimentales suivantes :

colonne : supelcosil LC-ABZ 15 cm x 4,6 mm (Supelco ; 5-9140) durée d'analyse : 35 minutes débit : 0,5 ml/minute injection : 10 à 100 μg dans 100 μl de solvant aux conditions initiales (80 % A 20 % B)/ : gradient A = eau + 0, 1 % acide trifluoroacétique gradient B = isopropanol (qualité HPLC 205 ) + 0, 1 % acide trifluoroacétique

- conditions initiales : 80 % A 20 % B

- 6 minutes : 60 % A 40 % B

- 20 minutes : 0% A 100 % B

- 30 minutes : 0% A 100 % B - 32 minutes : 80 % A 20 % B

détection : absorbance à 205 nm.

D'une manière générale, les différents constituants sont séparés selon leur hydrophobicité: la spermine et la spermidine libres ne sont pas retenues alors que les molécules hydrophobes le sont. Les dérivés monosubtitués sont élues en premier avant les dérivés polysubstitués.

La Figure 1 présente le profil HPLC typique obtenu sur la phase dichloromethane générée lors de la syn thèse du composé spermidine-cholestérol. Les résultats montrent que la préparation testée comporte en grande majorité la spermidine mono-cholestérol recherchée (temps de rétention 15 à 18 min). Les dérivés polysubstitués sont également présents (22 à 28 min) mais seront éliminés lors des étapes ultérieures de cristallisation. Une technique d'analyse indirecte de la fraction non retenue permet d'estimer la quantité de spermidine libre contaminant la préparation. Pour ce faire, les premières fractions récoltées sont déposées sur une plaque de chromatographie en couche mince, révélées par de la ninhydrine et comparées à une gamme de concentration établie à partir de spermidine commerciale. Si la

contamination est supérieure à 1 %, une ou plusieurs étapes supplémentaires d'extraction au dichloromethane sont introduites dans le protocole de purification.

On procède de même pour analyser les préparations de spermine-cholestérol.

4. Purification et caractérisation des isomères monocholestérol à partir des préparations lipidiques.

4.1 Purification des isomères par HPLC semi-préparative Les différents isomères monosubstitués ont une hydrophobicité très proche et présentent un temps de rétention voisin dans les conditions appliquées précédemment. Il faut donc définir de nouvelles conditions qui favorisent leur séparation pour pouvoir les caractériser et étudier leur efficacité transfectionnelle respective. Dans ce but, plusieurs centaines de μg de préparations lipidiques ont été déposés sur une colonne HPLC supelcosil LC-ABZ 25 cm x 10 mm (Supelco; référence 5-9170) et élues en gradient eau/acétonitrile en présence de TFA 0, 1 %. Les modalités expérimentales pour réaliser les chromatogrames des Figures 2 et 3 qui illustrent l'isolement des isomères de spermine et spermidine mono-cholestérol respectivement sont les suivantes :

Figure 2 (Spermidine - monocholestérol)

colonne : supelcosil LC-ABZ 25 cm x 10 mm (Supelco ; 5-9170) ; durée d'analyse : 12 minutes ; débit : 5 ml/minute ; injection : ~ 100 μg dans 100 μl de solvant aux conditions initiales (70 % A 30 % B) : gradient A = eau + 0, 1 % acide trifluoroacétique gradient B = acétonitrile (qualité HPLC 205 ) + 0, 1 % acide trifluoroacétique

9?

- conditions initiales : 70%A30%B - 1,5 minutes: 65%A35%B -2 minutes: 33%A67%B - 11 minutes: 28%A72%B

- 11,5 minutes: 70%A30%B

détection : absorbance à 205 nm

Figure 3 (Spermine - monocholestérol) :

colonne : supelcosil LC-ABZ 25 cm x 10 mm (Supelco : 5-9170) ; durée d'analyse : 9 minutes ; débit : 5 ml/minute ; injection : ~ 500 μg dans 100 μl de solvant aux conditions initiales (65%A35%B): gradient A = eau + 0,1 % acide trifluoroacétique gradient B = acétonitrile (qualité HPLC 205) + 0,1 % acide trifluoroacétique

- conditions initiales : 65%A35%B

- 0,2 minute : 65 % A 35 % B

- 1 minute : 39% A 61 %B -8,5 minutes: 34%A66%B

- 8,8 minutes : 65%A35%B

. détection : absorbance à 205 nm

Le chromatogramme (Figure 2) montre 3 pics de spermidine-cholestérol: un premier pic bien isolé (pic 1 migrant à 7,2 min) et deux pics moins proches (pics 2 et 3 migrant respectivement à 9,6 min et 10,6 min). Eventuellement, une réinjection des fractions recouvrant ces derniers permet de réduire la contamination de l'un par l'autre.

L'analyse HPLC de la préparation de spermine-cholestérol (Figure 3) produit deux pics bien séparés sortant à 4,9 min et 7 min.

4.2 Caractérisation de la masse des isomères par spectrométrie de masse à ionisation-electrospray (ESI-MS)

Les fractions HPLC recouvrant chacun des pics ont été rassemblées et analysées par spectrométrie de masse (Edmonds et Smith, Hectrospray ionization mass spectrometry, in Methods in Enzymology, Vol 193, pp 412-432; éd. McCloskey, Académie Press, San Diego, USA, 1990).

Les 3 pics de spermidine-cholestérol comportent des produits de masse moléculaire d'environ 558 Da qui concorde avec celle attendue pour un produit monosubstitué (masse calculée: 557,84 Da). Ces données confirment la production lors de la synthèse chimique, des trois isomères par attachement du groupement cholestérol sur l'une des trois aminés de la spermidine.

De même, les fractions HPLC recueillies à partir de la préparation lipidique de spermine-cholestérol renferment des produits d'une masse moléculaire de 615 Da environ correspondant à celle attendue pour la spermine substituée par une molécule de cholestérol ( masse calculée 614,96 Da). Du fait de la symétrie de la spermine, seuls deux isomères peuvent être produits selon la fixation du cholestérol sur une amine primaire ou secondaire.

4.3 Caractérisation des isomères par RMN au 13C

Les fractions HPLC semi-préparatives sont extraites dans un mélange dichloromethane soude 20 mM dans le but de déprotoner les aminés avant d'être soumises à la RMN au 13C (Gunther, NMR Spectroscopy,

2ed., Wiley, Chichester, UK, 1995; Kimberley et Goldstein, 1981, Anal. Chem.

53, 789-793; Dagnall et al., 1984, J. Chem. Soc. Perkin Trans. II, 435-440).

7/29118 PCÏ7FR97/00225

24

Cette analyse permet de déterminer sur quel type d'aminé, primaire ou secondaire, est fixé le groupement cholestérol. Elle est réalisée en parallèle avec des standards spermine, spermidine et cholestérol et les spectres obtenus avec les molécules à tester et les standards sont comparés. Le déplacement des signaux par rapport aux standards indique un changement de l'environnement chimique dépendant du site de fixation du cholestérol.

En ce qui concerne le composé spermine-cholestérol, le pic 1 visualisé sur le profil HPLC rapporté à la Figure 3, contient l'isomère dans lequel le cholestérol est lié à l'aminé secondaire et le pic 2 à l'aminé primaire. Pour ce qui est de la spermidine-cholestérol, l'isomère substitué sur l'aminé secondaire est détecté dans les fractions recouvrant le pic sortant le plus rapidement (pic 1 de la Figure 2) et les isomères modifiés sur les aminés primaires correspondent aux pics 2 et 3. Ces derniers ont été différentiés par comparaison avec un standard constitué par l'isomère de spermidine-cholestérol obtenu sous forme pure par synthèse chimique

(voir 5. 1 ). Le pic 2 correspond à l'isomère synthétique dans lequel le cholestérol est fixé sur l'aminé primaire du bras court (CH ₂ ) ₃ de la spermidine et le pic 3 à celui modifié sur le bras long (CH ₂ ) ₄ .

Exemple 5: Préparation d'isomère par voie synthétique

5.1 Synthèse de l'isomère de spermidine-cholestérol substitué au niveau de l'aminé primaire du bras court.

Les principales étapes sont représentées dans la Figure 4:

1 ) synthèse d'un produit intermédiaire avec deux intermédiaires possibles selon le site d'addition de la partie acrylonitrile ;

2) protection des aminés par un groupement protecteur Boc (Boc ≈ tert-butyloxycarbonyl) ;

3) réduction catalytique du nitrile terminal ;

4) réaction avec le cholestérylchloroformate, et 5) déprotection des aminés par le TFA.

Le protocole appliqué pour obtenir le 1 ,4-Diboc-spermidine est publié par Goodnow et al. ( 1990, Tetrahedron 46, 3267-3286) à la différence près que l'étape de purification des intermédiaires est omise. 50 mg ( 177μmoles) sont repris dans 3ml de dichloromethane anhydre et 40μl (417 μmoles) de diisopropyléthylamine puis refroidis à 0°C. La réaction est démarrée par addition lentement de 90 mg (200 μmoles) de cholestérylchloroformate placés dans 3 ml de dichloromethane anhydre. On vérifie au bout d'une heure que la réaction est complète par chromatographie en couche mince. La déprotection des aminés est effectuée par addition de 300 μl TFA (concentration finale de 4,7 %). Le mélange réactionnel est laissé à température ambiante toute la nuit.

Le produit de synthèse est purifié par chromatographie sur gel de silice (5 g de gel pour une colonne de 2 cm de diamètre et 3,5 cm de hauteur) en utilisant un mélange dichloromethane/ éthanol (77/23) pour charger la colonne et dichlorornéthane/méthanol/triéthylamine ( 15/5/1 ) pour l'élution. L'isomère est caractérisé par HPLC en phase réverse et par chromatographie en couche mince. Comme l'illustre la Figure 5, le produit synthétique présente une Rf de 0,72 caractéristique de la spermidine-cholestérol (migration identique à l'isomère du pic 2).

5.2 Synthèse de l'isomère de spermine-cholestérol substitué au niveau de l'aminé primaire.

Le protocole de synthèse est représenté schématiquement à la

Figure 6. L'intermédiaire N-N' dipropionitrile 1 ,4 diamino butane est formé par réaction de 2 moles d'acrylonitrile et 1 mole de 1 ,4 diaminobutane. En pratique, on ajoute sous agitation (i) 75,2 mmoles d'acrylonitrile (Fluka; référence 01710) à 0°C à (ii) 37,6 mmoles de 1 ,4 diaminobutane (Fluka; référence 32790) reprises dans 2ml de méthanol et 3 , 8 ml de dichloromethane à 0°C. Après retour à la température ambiante, on ajoute au mélange 99 mmoles de Boc-On (2-Boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile) ( Flu ka; référence 1 5475 ) suspend ues dans u n mél an ge

dichlorométhane/méthanol ( 1/3 ). Le groupement Boc se fixe sur les aminés libres en l'occurence les aminés secondaires. Le produit "protégé" (dipropionitrile di-Boc 1,4 diamino butane) est soumis à différents cycles d'évaporation et extractions pour éliminer les solvants et produits contaminants. Puis, on procède à l'étape de réduction des nitriles en présence de 140 mmoles de UAIH4 (Sigma; LO260) reprises dans de l'éther en contrôlant la température (0 ^β C). Lorsqu'on estime que la réduction est complète (par chromatographie en couche mince), la réaction est arrêtée par addition de soude. Le mélange est filtré, on récupère la fraction ethérée et les sous produits réactionnels sont éliminés par plusieurs extractions avec une solution aqueuse de NaCl 20 %.

Le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice (5 g de silice pour 1 g de produit dans 10 ml de solvant d'équilibration). La silice contenant le produit adsorbé est appliquée sur une colonne de 2 cm de diamètre et 23 cm de hauteur chargée avec 25 g de gel. Le solvant d'équilibration est constitué par le mélange dichlorométhane/éthanol ( 2 / 1 ) e t l e t a m p o n d ' é l u t i o n p a r d u dichlorométhane/méthanol/triéthylamine ( 15/5/1 ). On détermine par chromatographie en couche mince les fractions contenant la spermine-diboc sur lesquelles on fait réagir le cholestérylchloroformate ( 1 ,48 m moles de spermine diboc pour 492 μ moles de cholestérylchloroformate). Le mélange réactionnel est lyophilisé, suspendu dans du dichloromethane, puis déprotégé en présence de TFA 5 % et enfin purifié sur chromatographie en gel de silice dans les mêmes conditions que ci-dessus mis à part que la colonne utilisée est plus résolutive. L'isomère N i spermine-cholestérol est caractérisé par HPLC analytique et chromatographie en couche mince. La rétention frontale du produit synthétique est caractéristique de la spermine-cholestérol (Figure 5) constituée ici de l'isomère du pic 2.

Exemple 6: Transfert d'acide nucléique in vitro

6.1 Plasmides

Le plasmide reporter pCH UON est utilisé pour évaluer l'efficacité transfectionnelle des composés de l'invention. Il comporte le bloc promoteur/enhancer précoce du virus SV40 (Simien Virus) dirigeant l'expression du gène LacZ codant pour la β-galactosidase d'Escherichia coli munie en N-terminal d'un signal de localisation nucléaire issu de SV40. Mais tout autre plasmide peut également être utilisé. On peut citer par exemple un plasmide exprimant (i) un gène de résistance à un antibiotique, (ii) un gène luciférase ou (iii) un gène facilement détectable. De tels plasmides sont connus dans le domaine de l'art. Toutes les expériences sont réalisées en parallèle avec le DC-Chol à titre de contrôle de transfection et, lorsque cela est indiqué, on inclut également le transfectam et la Lipofectin. Le DC-Chol est obtenu par synthèse chimique à une échelle de 20 g selon le procédé décrit dans Gao et al. ( 1991, BBRC 179, 280-285 ) . Le Transfectam et la Lipofectin sont disponibles commercialement (Sepracor, MA, USA; 26395 1 et Gibco BRL, MD, USA; 18292.01 1 respectivement). Afin d'accroître les efficacités de transfection, les lipides cationiques peuvent être associés à un colipide. Le colipide retenu est le DOPE (Sigma, P5078) qui est largement utilisé dans l'état de la technique.

6.2 Détermination du ratio optimal lipide sur colipide ( DOPE)

Les transfections sont réalisées en plaques de 96 puits (Falcon) ensemencés chacun avec 2xl0 ⁴ à 4xl0 ⁴ cellules A549 (ATCC CCL 185) dérivées d'un carcinome pulmonaire humain. La culture est laissée une nuit à 37°C dans un milieu conventionnel additionné de sérum de veau foetal ( FCS) à une concentration finale de 10%.

Dans un premier temps, le lipide cationique est mélangé à une quantité variable de DOPE pour évaluer l'effet de celui-ci sur les efficacités de transfection. 500 μg de spermine-cholestérol ou spermidine-cholestérol sont dissous dans 50 à 100 μl de dichloromethane, placés dans un tube en verre stérile et mis en présence d'une quantité variable de DOPE repris dans 50 à 100 μl de chloroforme (voir tableau ci-après).

spermine-cholestérol spermidine-cholestérol

Ratio DOPE lipide Ratio DOPE lipide

(M) (μg) (μg) (M) (μg) (μg)

1:0,5 290 500 1:0,5 334 500

1:0,86 500 500 1:0,74 500 500

1:1 580 500 1:1 668 500

1:2 1160 500 1:2 1336 500

1:4 2320 500 1:4 2672 500

Le mélange est séché sous flux d'azote. On ajoute 1 ml de NaCl à 0,9 % et l'ensemble est laissé une nuit à 4°C avant d'être soniqué 3 à 5 min jusqu'à l'obtention d'une solution laiteuse à translucide. Le mélange lipidique est stocké à 4°C jusqu'à utilisation. On préparc des dilutions en séries (de 2 en 2) de la solution de plasmide et du mélange lipidique. Une large gamme de complexes lipide/ADN est formée par transfert d'un volume donné de dilutions d'ADN dans un volume identique de dilutions lipidiques.

Après avoir aspiré le milieu de culture, les cellules sont mises en présence de 100 μl des complexes précédents et incubées en atmosphère humide à 37°C, 5 à 10% C0 ₂ . Le milieu est ajouté en deux temps: 50 μl de milieu comportant 30 % de FCS 4 à 6 h après la transfection puis 100 μl à 10% FCS 24 h après. Les deux dernières colonnes sont généralement réservées aux témoins et à la gamme étalon.

L'activité β-galactosidase est révélée, 48 h post-transfection, après lyse des cellules par addition de 50 μl de tampon de lyse (0, 1% Triton X-100, 250 mM Tris-HCI pH8). On ajoute 50 μl de tampon PBS comprenant 0,5 % de BSA ( Bovine Sérum Albumin). La gamme étalon est constituée par des dilutions en série d'un standard de β-galactosidase ( Boehringer Mannheim; référence 567 779) préparées dans le même tampon PBS-BSA. A titre indicatif, la gamme s'étend de 50 à 0,39 ng/ml. Enfin, on ajoute 150 μl de substrat ONPG (OrthoNitroPhénol Galactopyrannoside Sigma : référence NI 127) à une concentration de 2 mg/ml dans du PBS, 0,5 % BSA. L'absorbance est mesurée à 405 nm dans un lecteur Elisa après 30 min, 4 h ou 24 h d'incubation.

Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les cellules sont transfectées en condition à peu près équimolaire (lipide/colipide 1 : 1 à 1 :074). Ainsi, dans le cas du mélange spermidine-cholestérol / DOPE à un ratio 1 :0,74 (figure 7), l'activité β-galactosidase est élevée (absorbance atteignant 3 à 3,5) ceci pour une large gamme de concentrations de lipides et d'ADN. Le pouvoir transfectant du mélange selon un ratio 1 :2 est efficace, tout particulièrement dans la gamme à haute concentration en lipides. Quant aux ratio extrêmes ( 1 :0,5 ou encore 1 :4), l'activité de transfection bien que plus faible est encore acceptable.

Pour ce qui est du mélange spermine-choiestérol/DOPE, on préférera un ratio compris entre 1:0,86 à 1:2 pour lesquels l'efficacité de transfection est la plus élevée pour une gamme de dilutions du mélange lipidique et de l'ADN assez large.

6.3 Transfection de lignées établies de cellules musculaires.

Cette série d'expériences est menée en parallèle avec les deux compositions de l'invention, le DC-Chol et le Transfectam sur la lignée C2C 12 (ATCC CRL- 1772) dérivée de myoblastes de souris. Les cellules sont réparties dans des plaques de culture à 6 puits en raison de 5x10 ⁵ cellules

par puit, cultivées une nuit dans les conditions habituelles et transfectées le lendemain par différentes dilutions de complexes lipide/colipide/ADN (ratio lipide cationique/DOPE à peu près équimolaire sauf dans le cas du transfectant qui est utilisé tel quel). Après 48 h de culture, les cellules sont fixées et l'activité enzymatique est révélée par le X-Gal. Les noyaux des cellules transfectées (qui produisent une β-galactosidase nucléaire), apparaissent en bleu et on estime la proportion de cellules colorées. La Figure 8 illustre les résultats obtenus pour chaque composition lipidique. Le nombre de cellules bleues est significativement plus élevé avec les complexes à base de spermine-cholestérol ou spermidine-cholestérol (taux de transfection à peu près équivalent dans les deux cas) qu'avec ceux constitués de DC-Chol. En comparaison, le taux de transfection des complexes à base de Transfectam est très faible.

6.4 Transfection de myoblastes primaires.

Les myoblastes sont prélevés de diaphragmes de souris adultes C57 Black 10 ou de cuisses de souris m d.v adultes (4 semaines). Les prélèvements musculaires sont dissociés dans un mélange de dispase et collagcnase et les cellules sont mises en culture dans des plaques de 24 puits et dans du milieu DMEM ou F14 additionné de facteurs de croissance (insuline, FGF, EGF, glutamine) et de sérum de veau à une concentration de 10 %.

Les cellules sont transfectées en milieu sans sérum avec 1 ,875 μg de plasmide pCHUON complexé à divers lipides (spermine-cholestérol, spermidine-cholestérol, DC-Chol et Transfectam) en présence de DOPE (rapport lipide/DOPE 1: 1 et rapport ADN/mélange lipidique 1 :4). A titre de comparaison, on constitue également un témoin ADN nu. 4 h après la transfection, la culture est poursuivie dans un milieu supplémenté en sérum. Les myoblastes sont capables de proliférer puis fusionner en structures plurinuclées constituant des fibres musculaires ou myotubes. Les cellules sont fixées au bout de 48 h, traitées aux X-Gal et le nombre de cellules colorées estimé. Les meilleurs taux de transfection sont obtenus

avec les complexes à base d e spermine-cholestérol , de spermidine-cholestérol et de Transfectam. Les cellules bleues sont beaucoup plus faibles dans le cas du DC-Chol. L'ADN nu transfecte encore moins bien (moins de 1 % de cellules β-galactosidase positives).

Une autre série d'expériences est menée sur des cardiomyocites primaires de muscles cardiaques de souriceaux C57 Black 10 nouveau-nés, avec les mêmes mélanges lipidiques et également la lipofectin/DOPE. La transfection est effectuée après 4 jours de culture dans un milieu classique et l'efficacité de transfection déterminée 2 jours après. Dans ces conditions, le mélange Transfectam/DOPE donne un pourcentage de cellules bleues légèrement plus élevé que ceux à base de spermine-cholestérol et spermidine-cholestérol, mais très supérieur aux mélanges DC-Chol et Lipofectin/DOPE. Comme précédemment, l'ADN nu transfecte très mal.

6.5 Efficacité transfectionnelle des isomères purifiés par HPLC

a) sur cellules pulmonaires ;

Le protocole appliqué est similaire à celui décrit dans le paragraphe 6.2 à la différence près que l'on utilise 500 μg d'isomères purifiés par HPLC semi-préparative à la place de la préparation lipidique. Dans le cas de la spermidine-cholestérol, l'isomère substitué au niveau de l'aminé primaire du bras long de la spermidine (correspondant au pic 3 de la Figure 2) présente la meilleure activité transfectionnelle dans les cellules A549 par rapport aux deux autres isomères (Figure 9) et au mélange, (non montré).

Ces expériences sont reproduites en mettant en oeuvre un plasmide exprimant le gène luciférase placé sous le contrôle du promoteur CMV précoce.

Les isomères de spermidine-cholestérol ont des activités transfectionnelles très proches et comparables à celles obtenues avec le mélange. L'isomère correspondant au pic 2 est légèrement plus faible que les isomères 1 (substitution sur l'aminé secondaire) et 3 (substitution sur l'aminé primaire du bras long).

Les expériences menées avec les isomères de spermine cholestérol montrent une nette supériorité de l'isomère substitué sur l'aminé primaire (pic 2), particulièrement aux faibles concentrations d'ADN (par exemple 0,525 μg d'ADN pour 4 à 0,5 μg en lipides). L'isomère correspondant au pic 1 a une activité transfectionnelle du même ordre de grandeur que celle du mélange.

b) sur cellules satellite musculaires

Le protocole appliqué est similaire à celui décrit dans le paragraphe 6.4. mis à part que l'on utilise 500 μg d'isomères purifiés par HPLC semi¬ préparative et le plasmide rapporteur luciférase.

Parmi les isomères de spermidine-cholestérol, celui substitué sur l'aminé secondaire (correspondant au pic 1 ) est 3 à 4 fois plus efficace que le mélange. La meilleure activité est obtenue pour 2 μg d'ADN et 4 à 0,25 μg en lipide total. L'isomère spermine-cholestérol substitué sur l'aminé secondaire est plus efficace que le mélange (notamment dans une gamme 1 μg d'ADN pour 4 à 0,25 μg en lipide total).

Dans leur ensemble, ces données montrent que chaque isomère peut être adapté à la transfection d'un type cellulaire particulier. En particulier, les isomères substitués sur les aminés primaires de la spermine- cholestérol et de la spermidine-cholestérol transfectent efficacement les cellules pulmonaires alors que les isomères substitués sur les aminés secondaires sont particulièrement efficaces à l'égard des cellules musculaires.