Sector Técnico La presente invención se refiere a una composición dermatológica que comprende propionato de clobetasol encapsulado en liposoms, y la misma se encuentra dentro del campo de aplicación de los productos liposómicos para clínica humana.

Técnica anterior El propionato de clobetasol es conocido del estado del arte como un potente corticosteroide sintético con propiedades antialérgicas, antiexudativas y antiproliferativas que inhiben la respuesta inflamatoria provocada por agentes de naturaleza mecánica, química o inmunológica. Se indica en forma de crema (Clovate#) o ungüento (DECLOBAN#) en el tratamiento a corto plazo de las dermatosis tales como psoriasis, eczemas recidivantes, liquen plano y lupus eritematoso discoide, resistentes a los corticosteroides tópicos usuals. Sin embargo, con frecuencia la utilización tópica de este medicamento se ha visto restringida como máximo hasta 14 días, debido a los efectos secundarios que produce, especialmente inhibición hipófiso-suprarrenal, riesgo que aumenta con la potencia del preparado así como con la superficie de aplicación y con la duración de la terapia.

Las solicitudes de patentes WO 93/15740, EP 0391033, WO 98/36753, WO 96/27376 y JP 11130679, así como la patente US 5998395, describen formulaciones que comprenden fármacos antinflamatorios esteroidales donde se incluye valerat y propionato de clobetasol. En estas composiciones el propionato de clobetasol está disperso y aunque se encaminan a incrementar la actividad terapéutica del preparado, no logran disminuir los efectos adversos asociados al uso del medicamento.

Por otra parte las patentes US 5192528, US 4427649, US 4693999 y US 5190936, así como las solicitudes WO 97/13500 y WO 96/22764, refieren formulaciones liposómicas de corticosteroides pero ninguna de ellas comprende la encapsulación en liposoms de propionato de clobetasol o algún otro derivado del citado corticosteroide.

Divutgación de la invención.

La presente invención se relaciona con una formulación liposómica de propionato de clobetasol para uso tópico, la cual se caracteriza porque emplea bajas concentraciones del principio activo (entre 0,01 y 0,03) y rinde elevadas concentraciones del fármaco en la piel, acentuándose más este efecto en el estrato córneo, desde donde puede irse liberando controladamente el fármaco y disminuye la difusión del principio activo hacia la circulación sistémica, minimizando así la toxicidad del mismo, es decir sus efectos secundarios.

La eficacia de la formulación de la invención es similar a la de formulaciones clásicas de crema y ungüento donde el propionato de clobetasol está disperso, aunque de forma sorprendente se observó que al encapsular dicho principio activo en liposoms, su concentración puede ser reducida a la mitad de la cantidad usada en formulaciones clásicas de este principio activo, manteniendo su potente efecto antinflamatorio, ya que como resultado de la gran afinidad de los componentes de la bicapa lipidica de los liposoms con las membranas biológicas, se logra una máxima acción local.

La invención proporciona una formulación liposómica de aplicación tópica, preferentemente en forma de jalea, que comprende propionato de clobetasol a concentraciones bajas, fosfolipidos, un aditivo lipófilo, agentes antioxidantes, un disolvente para el propionato de clobetasol, fosfolípidos, aditivo lipófilos y agentes antioxidante; y además solución acuosa que forman parte de la suspensión liposómica, así como agentes auxiliares convencionales de la formulación de jalea o de las formulaciones tópicas tipo crema, ungüento o loción.

La presente composición inclue, preferiblemente, una suspensión liposómica, en particular liposoms de doble capa multilamelares que tienen un tamaño que varia entre 2000-5000 nm, preferiblemente de 3500 a 4500 nm.

Las composiciones de la invención, comprenden, en peso basado en el peso total de la composición, los siguientes componentes esenciales : - Fosfolípidos adecuados para su uso en la formulación, por ejemplo, fosfatidilcolinas, fosfatildiletanolaminas y fosfatidilserinas, y mezclas de los mismos, en particular los que son solubles junto con propionato de clobetasol en disolvente orgánico y farmacéuticamente aceptables y no tóxicos. Entre ellos son preferidos la

fosfatidilcolina o lecitina, por ejemplo lecitina de soja. La cantidad de fosfolipido utilizado en la presente formulación puede variar entre 0.5 y 4.0 %, preferiblemente entre 1.0 y 1.5 % y en particular es de aproximadamente 1.2 %.

-Aditivos lipófilos para modificar selectivamente las características de los liposoms.

Entre estos aditivos, por ejemplo, se incluye colesterol, ácido fosfatídico, estearilamina, siendo el colesterol un aditivo de elección. La cantidad de aditivo lipófilo utilizado puede variar entre 0.1 y 0.6 %, preferiblemente entre 0.2 y 0.4 % y en particular es aproximadamente 0.3 %. En general, la relación de la cantidad de aditivo lipófilo a la cantidad de fosfolipido varía entre 1 : 1 y 1 : 3 y en particular es aproximadamente 1 : 2.5.

-Agentes antioxidantes para la preparación de los liposoms, entre los que se pueden utilizar alfa-tocoferol o hidroxitolueno butilado (BHT), en particular, por ejemplo, BHT.

Para preparar la formulación, los citados fosfolipidos, aditivos, antioxidantes así como el ingrediente activo propionato de clobetasol se disuelven en un disolvente orgánico, soluble en agua, no tóxico y farmacéuticamente aceptable que pueda disolver dichos ingredientes.

-El disolvente orgánico utilizado en las suspensiones liposómicas de la presente invención puede ser un glicol, especialmente propilenglicol, en una cantidad entre 8 y 15 %, en particular entre 10.0 y 12.5 % y preferiblemente 11. 8 %.

EI término"componente orgánico"aquí utilizado se refiere a mezclas que comprenden los citados fosfolípidos, aditivos lipófilos, antioxidantes y disolventes orgánicos.

-EI ingrediente activo propionato de clobetasol se disuelve en el componente orgánico. La cantidad de ingrediente activo en la composición final varia entre 0.01 y 0.03 % y preferiblemente es entre 0.02-0.025 %.

-EI componente acuoso de la presente formulación comprende principalmente agua y puede contener diversos aditivos tales como electrolitos o sistemas tampón, preferiblemente sistemas tampón, en particular, por ejemplo tampón de Tris-HCI.

Dicho sistema tampón mantendrá el pH de la componente acuosa en el intervalo de 5 a 7.5, preferiblemente dentro del intervalo de 6 a 7.2 y especialmente dentro del intervalo de 6.5 a 7.

La presente invención incluye el producto terminado en forma de jalea para uso tópico que comprende conservantes, antioxidantes adicionales, así como ingredientes convencionales para la obtención de dicha forma terminada de jalea.

-Entre los conservantes que se pueden utilizar en la composición para evitar su degradación por microorganismos están el ácido benzoico, metilparabeno y propilparabeno. Preferiblemente, el metilparabeno y el propilparabeno se utilizan en cantidad de aproximadamente 0.2 % y 0.02 % respectivamente.

-Entre los antioxidantes que se pueden utilizar para preservar la composición están el ácido etilendiaminotetracético (EDTA), el edetato disódico y el metabisulfito de sodio. Preferiblemente, el EDTA y el metabisulfito de sodio, que se utilizan en cantidad de aproximadamente 0.01 % y 0.2 % respectivamente.

-La composición de la invención también incluye agentes gelificantes adecuados para la obtención de la forma terminada de uso tópico, estos agentes pueden ser por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, sus mezclas o carbopol 940, siendo el preferido el carbopol 940, conjuntamente con la trietanolamina. La cantidad de los agente gelificantes depende de los otros ingredientes y en general varia desde aproximadamente 0.5 a 1.0 % y en particular es aproximadamente 0.85 % para el carbopol 940 y 0.65% para la trietanolamina.

Para evitar la degradación de los materiales utilizados durante la preparación de la formulación liposómica, es ventajoso purgar todas las soluciones con un gas inerte tal como argón o nitrógeno y realizar todas las etapas bajo atmósfera inerte.

Las composiciones preferidas del producto terminado comprenden, en peso basado en el peso total de la composición : (a) 0.01 a 0.03 % de propionato de clobetasol ; (b) 0.5 a 4.0 % de fosfolipido ; (c) 0.1 a 0.6 % de colesterol ; (d) 8 a 15 % de propilenglicol ; (e) 0.003 a 0.007 % de BHT; (f) agente tampón para mantener el pH de la componente acuosa en el intervalo de 5 a 7.5; (g) suficientes conservantes y antioxidantes dermatológicamente aceptables para evitar la degradación de la composición ;

(h) agente de carácter básico para ajuste de pH en la jale ; (i) 0.5 a 1.0 % de agentes gelificantes ; y (j) agua.

Las composiciones preferidas en particular son aquellas en las que : la cantidad de propionato de clobetasol es de 0.02 a 0.025 % ; la cantidad de fosfolipido es de 1.0 a 1. 5 %; la cantidad de colesterol es de 0.2 a 0.4 %; la cantidad de propilenglicol es de 10 a 12.5 %; la cantidad de gelificante es de 0.6-0.9 %.

La composición más preferida comprende aproximadamente (en peso basado en el peso total de la composición) : (a) 0.025 % de propionato de clobetasol (b) 1. 2 % de fosfolípido ; (c) 0.3 % de colesterol ; (d) 11.8 % de propilenglicol ; (e) 0.005 % de BHT; (f) 0.1 % de Tris (hidroximetil)-aminometano y 0.02 % de ácido clorhídrico ; (g) 0.2 % de metilparabeno y 0.02 % de propilparabeno ; (h) 0.01 % de EDTA y 0.2 % de metabisulfito de sodio; (i) 0.65 % de trietanolamina ; (j) 0. 85 % de Carbopol 940 y (k) agua La formulación liposómica de propionato de clobetasol de la presente invención puede prepararse preferiblemente de la siguiente forma : (a) se calienta el aditivo lipófilo y una parte del disolvente organic entre 100 y 140° C, preferiblemente entre 120 y 135° C en un primer vaso de precipitados, dejando que se enfríe la mezcla hasta 70-90° C, disolviendo alli el fosfolípido, el ingrediente activo y el antioxidante, preferiblemente entre 70 y 90° C y agitando la mezcla hasta obtener la disolución completa; (b) se calienta en un segundo vaso de precipitados la solución tampón, preferiblemente entre 70 y 90° C, tomando una parte de esta solución y añadiendo

al contenido del primer vaso de precipitados, agitando manteniendo la temperatura del primer vaso de precipitados, preferiblemente entre 70 y 90° C y obteniendo una pasta; (c) se hace pasar el resto del segundo vaso de precipitados, preferiblemente entre 70 y 90° C, a la mezcla del primer vaso de precipitados y agitando la combinación así obtenida con un mezclador de alto rendimiento; (d) se disuleven los conservantes en el disolvente orgánico en un tercer vaso de precipitados, agitando, preferiblemente con un aparato mezclador hasta disolución total ; (e) se añade una parte del agua el contenido del tercer vaso de precipitados, preferiblemente agitando con un aparato mezclador, disolviendo alli los antioxidantes y el gelificante, añadiendo trietanolamina disuelta en el resto del agua y el contenido obtenido en el primer vaso de precipitados, preferiblemente manteniendo agitación para homogeneizar.

En la etapa (c) se puede emplear cualquier instrumento mecánico de mezclado o cualquier homogeneizador que emplee fuerzas de cizalla elevadas sobre la mezcla.

En general se puede emplear una mezcladora capaz de conseguir velocidades de 2000 a 16000 r. p. m., en particular de 2500 a 6000 r. p. m. En las etapas siguientes se puede emplear cualquier medio de mezclado, en particular que emplee la varilla de agitación tipo propela.

Los liposoms preparados por el método antes descrito contienen por lo general la mayor parte del ingrediente activo encapsulado y no se requiere la separación de los liposoms del material sin encapsular.

Ejemplos de realización.

Ejemplo 1. Preparación de la formulación de propionato de clobetasol encapsulado en liposoms.

Se emplearon los componentes de la formulación en las siguientes proporciones (Tabla 1) : Tabla 1. Ingrediente Cantidad, g/100g de jalea Propionato de clobetasol 0.025 Lecitina de soja hidrogenada 1. 200 Colesterol 0.300 Propilenglicol 11.800 Hidroxitolueno butilado 0. 005 Tris (hidroximetil)-aminometano 0. 100 Ácido clorhidrico 0. 020 Metilparabeno 0. 200 Propilparabeno 0. 020 Ácido etilendiaminotetracético 0. 010 Metabisulfito de sodio 0. 200 Carbopol 940 0. 850 Trietanolamina 0. 650 Agua purificada 84. 620

Procedimiento : 1. Se calienta el colesterol en aproximadamente una sexta parte de propilenglicol a 120-135° C. Se deja enfriar la disolución hasta aproximadamente 70-90° C.

Se disuelve el propionato de clobetasol, la lecitina de soja y el hidroxitolueno butilado en la mezcla anterior a 70-90° C. Se agita hasta disolución completa.

2. Se disuelven 0.1 g de Tris (hidroximetil)-aminometano y 0.02 g de ácido clorhidrico en aproximadamente una cuarta parte de agua en un vaso de precipitados aparte y se mantiene aproximadamente a 70-90° C. Se toma una parte de esa solución, aproximadamente 5 mi y se añaden a la mezcla resultante de la etapa 1. Se agita hasta obtener una pasta.

3. Se incorpora el resto de la solución de la etapa 2 a la pasta obtenida, aproximadamente a 70-90° C. Se homogeneiza durante 5 minutos a 3000 r. p. m. con ayuda de una mezcladora de alto rendimiento.

4. Se disuelven los parabenos en el propilenglicol restante en un vaso de precipitados aparte, con agitación constante, hasta disolución total.

5. Se añade a aproximadamente la mitad del agua total la resultante de la etapa 4 con agitación constante. Se adicionan el EDTA y el metabisulfito de sodio agitando en cada caso hasta disolución total. Se añade poco a poco con agitación fuerte y constante el carbopol 940 manteniendo la agitación aproximadamente durante 30 minutos. Se añade la trietanolamina disuelta en el resto del agua y seguidamente se incorpora la resultante de la etapa 3.

EI homogeneizador empleado es un equipo de dispersión POLYTRON @ de alto efecto de cizalla, el mezclador utilizado en las etapas 4 y 5 es un agitador mecánico IKA con varilla de propela.

La jalea liposómica blanca resultante de la etapa 5 se puede introducir convenientemente en recipientes adecuados, tales como tubos, por ejemplo, tubos de aluminio recubiertos con PVC.

Ejemplo 2. Ensayo de la formulación en edema en la oreja del ratón inducido por aceite de crotón.

Se confeccionaron grupos de 10 animales (ratones machos con peso corporal de 28-32 g) a los cuales se le indujo el edema, en la oreja derecha, por la aplicación de 50 pI de aceite de crotón al 5 % en etanol al 95 % (v/v), el mismo volumen de etanol se aplicó en la oreja izquierda. Las formulaciones de ensayo fueron aplicadas tópicamente 30 minutos antes de inducido el edema, en todos los casos se aplicó 20 mg de muestra/oreja. EI grupo control negativo recibió solamente el aceite de crotón. Se formaron los siguientes grupos experimentales : Grupos Dosis (g de clobetasol/oreja) Ungüento DECLOBAN"10 Crema Clovate'10 Jalea liposómica de la Tabla 1 5 Control Sin tratamiento

Transcurridas 1,2,3,4,5 y 6 horas de inducido el edema fueron sacrificados todos los grupos de animales por dislocación cervical, ambas orejas fueron cortadas para la obtención y pesada de discos de 5 mm de diámetro.

En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de diferencia de peso de la oreja según los grupos de tratamiento, se puede observar que todos los grupos experimentales difieren estadísticamente (p<0.05) del grupo control, en el intervalo de 4 a 6 horas de inducido el edema, lo que evidencia el efecto inhibidor del ungüento, la crema y la preparación liposómica, a la dosis ensayada.

TABLA 2 Tiempo (h) Control Ungüento Crema Jalea liposómica # ~ DS 10 µg/oreja 10 pg/oreja de la Tabla 1 <BR> <BR> <BR> <BR> X DS X DS 5 ug/oreja<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> XDS 1 0.77 ~ 0. 7 1. 70 ~ 1.1 2.74 ~ 1.6 1.08 ~ 0. 6 2 3.172.0 2.652.7 2.51 ~ 0. 9 1. 86 ~ 0. 6 3 6. 84 ~ 2. 8 3.16 1.6 4. 47 ~ 2. 1 5.032.4 4 7.72 2.6 2.351.5 5. 17 ~ 2. 4 4.41 3.7 5 9.42 1.9 3.47 2.4 3.86 2.2 4.26 2.6 6 7.76 2.0 3.51 ~ 2. 8 2.88 1.7 2.95 2.7 EI análiis estadístico demostró que no existen diferencias significativas, en ninguno de los tiempos estudiados, entre el ungüento, la crema y la jalea liposómica a la dosis de 5 (0.025 %) µg de propionato de clobetasol/oreja, encontrándose una mayor inhibición del edema para el grupo tratado con el ungüento en el intervalo de 4 y 5 horas, respectivamente.

La respuesta inhibitoria frente al edema inducido por el aceite de crotón, durante el tiempo estudiado, aparece en la Figura 1.

Como se puede apreciar dicha respuesta fue muy similar entre todos los grupos tratados con el clobetasol, siendo mayor en los grupos administrados con la crema y la jalea de liposoms a la dosis de 5 ug/oreja.

Al comparar el comportamiento encontrado entre los grupos tratados con la jalea de liposoms se pudo apreciar que en el momento de máxima de inflamación (5 horas), esta formulación mostró un mayor porciento de inhibición del edema.

Ejemplo 3. Ensayo de la formulación en granuloma inducido por pellet de algodón.

Se utilizaron ratas Wistar machos con una masa corporal comprendida entre 250 y 300 g, las cuales fueron mantenidas en un cuarto a temperatura controlada de 20 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12-12 horas. Los animales se anestesiaron por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico 30 mg/kg. Se les practicó una incisión en la parte dorsal y se introdujeron 2 pellets de algodón de 35 2 mg, previo decolamiento de la piel, quedando situados a 2 cm aproximadamente de la herida. Posteriormente se suturó y se añadió una solución antiséptica sobre la herida para evitar la sepsis. Los animales fueron administrados tópicamente (0.3 g muestra/pellet de algodón) durante 7 días y al 8vo. se sacrificaron bajo atmósfera de éter y se extrajeron los granulomas y se pesaron, éstos se Ilevaron a peso seco constante en un horno a 65°C durante 24 horas aproximadamente para determinar el contenido acuoso del granuloma (peso húmedo-peso seco) y el fibrogranuloso (peso seco-peso del pellet de algodón). 3 Se formaron los siguientes grupos experimentales.

Grupos Dosis (ug de clobetasol/pellet) Ungüento DECLOBAN° 150 Crema Clovate @ 150 Jalea liposómica de la Tabla 1 75 Control Sin tratamiento En este ensayo se observó un incremento en peso seco del pellet de algodón en cada grupo de tratamiento, comprobándose que la implantación subcutánea del pellet de algodón en ratas resulta en la formación de un granuloma en el sitio de implantación por la formación de una capsula fibrosa, vascularizada, donde se plantea la presencia de células mononucleares.

Los valores del contenido acuoso y el fibrogranuloso obtenidos tras la administración de las sustancias de ensayo por 7 días aparecen en las Figuras 2 y 3.

En la Figura 2 se aprecia que, al evaluar los resultados encontrados entre las diferentes formulaciones de propionato de clobetasol, todos los grupos difieren, obteniendo un resultado inhibitorio en el siguiente orden : Crema > jalea liposómica de la Tabla 1> Ungüento. Atendiendo a los resultados presentados se observa que todos los grupos experimentales difieren significativamente (p<0.05) en el contenido acuoso con respecto al grupo control, lo que evidencia el efecto inhibidor del ungüento, la crema y la preparación liposómica, a las dosis ensayadas.

En la Figura 3 se observa que al evaluar los resultados encontrados entre las diferentes formulaciones de propionato de clobetasol, se encontró un resultado inhibitorio en el siguiente orden : crema > jalea liposómica de la Tabla 1 > ungüento.

Atendiendo a los resultados presentados se observa que todos los grupos experimentales difieren significativamente (p<0.05) en el contenido fibrogranuloso con respecto al grupo control, lo que evidencia el efecto inhibidor del ungüento, la crema y la preparación liposómica, a las dosis ensayadas. En este sentido la encapsulación del propionato de clobetasol en liposoms resulta ventajosa puesto que se puede disminuir la dosis a la mitad de la dosis convencional empleada en las otras formulaciones y obtener igual efecto terapéutico.

Los resultados obtenidos en el estudio preclínico indican que la jalea liposómica de propionato de clobetasol 0.025 % tiene efecto antinflamatorio tópico en el modelo experimental evaluado, siendo similar y en algunos casos superior que el efecto observado con la crema y unguent convencionales.

Ejemplo 4. Estudio de absorción percutánea"in vitro".

Primeramente se realizó el marcaje isotópico del propionato de clobetasol con tritio por el método de intercambio isotópico catalítico heterogéneo en fase sólida. Se obtuvo una actividad específica de 150 mCi/mmol y un 95 % de pureza radioquímica. EI propionato de clobetasol marcado se incorporó en las diferentes formulaciones sujetas al estudio, estas fueron :

Jalea liposómica de propionato de clobetasol al 0.025 % Jalea de propionato de clobetasol al 0.05 % Crema de propionato de clobetasol al 0.05 % Ungüento de propionato de clobetasol al 0.05 % Para el estudio de absorción percutánea in vitro se utilizó piel humana proveniente de cirugías estéticas de mamas.

Se tomaron muestras del fluido del compartimiento receptor a las 24 horas de aplicadas las formulaciones sobre la piel. Posteriormente se realizó el"stripping"y se separaron el estrato córneo, la epidermis y la dermis. La medición de radiactividad en cada una de las muestras tomadas se realizó por centelleo líquido.

El"stripping", de la forma realizada, representa fundamentalmente los residuos de aplicación aunque lleva junto con él parte de las capas mas superficiales del estrato córneo.

En la Figura 4 se muestran los porcientos de radiactividad acumulados en las muestras medidas con relación a la actividad aplicada en cada caso. Se demuestra que la formulación liposómica deposita mayores concentraciones del propionato de clobetasol en la piel (cerca del 50 % de la dosis aplicada), acentuándose más este efecto en el estrato córneo y una menor difusión hacia el compartimiento receptor en comparación con las formulaciones convencionales, aún cuando en ella se redujo la concentración de propionato de clobetasol a la mitad.

Por otra parte se observa la mayor cantidad de propionato de clobetasol en el compartimiento receptor en las formulaciones no liposómicas, destacándose el ungüento con más de un 70%. A partir de estos resultados se puede esperar una menor difusión del propionato de clobetasol incorporado en liposoms hacia la circulación sistémica después de su aplicación"in vivo".

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Presenta la respuesta inhibitoria frente al edema inducido por el aceite de crotón, en el intervalo de tiempo estudiado, mediante el ploteo de la diferencia en peso de las orejas en miligramos contra el tiempo en horas.

Figura 2. Presenta los valores del contenido acuoso obtenidos después del tratamiento por 7 días con las distintas sustancias de ensayo.

Figura 3. Presenta los valores del contenido fibrogranuloso obtenidos después del tratamiento por 7 días con las distintas sustancias de ensayo. En dicha figura, letras iguales no difieren significativamente según prueba de Duncan.

Figura 4. Se presentan los porcientos de radiactividad acumulados en las muestras analizadas y para cada una de las formulaciones evaluadas con relación a la radiactividad aplicada.