本发明涉及一种发酵生产 DHA的方法， 具体涉及一种固料培养裂 殖壶菌液体发酵生产 DHA的方法。 背景技术

二十二碳六烯酸 (Docosahexenoic acid, 22:6 Δ4,7,10,13,16,19, 简 称 DHA)俗称"脑黄金"，属于 ω-3 型多不饱和脂肪酸，具有补脑健脑， 预防老年性痴呆症； 提高视力， 防治近视； 预防高血压、 动脉硬化、 关 节炎及治疗癌症等生理功能。 因此， DHA作为新一代功能性保健因子 具有广阔的市场前景。 随着市场需求量的扩大， 对 DHA品质的要求也 越来越高， DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展 ， 传统鱼 油来源的 DHA已逐渐被藻油 DHA所取代。 藻油 DHA是指通过微生 物发酵获得的含有 DHA等长链多不饱和脂肪酸的油脂， 其中 DHA生 产菌主要有裂殖壶菌、 破囊壶菌、 隐甲藻等。

裂殖壶菌 ( Schizochyirium)又称裂壸藻, 属于真菌门、 卵菌纲、 水 霉目、 破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌， 单细胞、 球形。 细胞累积大 量对人体有用的活性物质， 如油脂、 色素（类胡萝卜素、 叶黄素、 坏青 素）、 角鲨烯等， 其中总脂肪酸中 DHA含量高达 35% ~ 45%, 且细胞 中 90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂——甘 油三酯形式存在，是 DHA的理想生产菌林。

中国专利 CN101575584公开一种裂殖弧菌及利用其生产 DHA油脂 的方法， 该方法提供一种从渗透压和元素供应角度优化 菌林发酵培养 基，并结合流加策略， 实现裂殖壶菌高密度发酵，采用传统的发酵方 法， 从甘油保存种接入摇瓶活化→一级种子液→摇 瓶二级种子液→一级种 子罐→二级种子罐→发酵， 最终细胞干重达到 70g/L， 油脂含量达 31.5g/L, DHA占总脂肪酸含量高于 35%。

中国专利 CN101519676公开一种采用含微量元素的发酵培养� �� J£ 行发酵生产 DHA的发酵生产工艺， 采用传统方法培养菌种裂殖壶菌， 即斜面活化培养、 然后转接入摇瓶扩大培养、 再经一级扩大培养得到发 酵用种子液； 或菌种经斜面活化培养、 然后转接入摇瓶扩大培养、 再经 一级扩大培养和二级扩大培养后得到发酵用种 子液， 10T罐发酵 95h生 物量为 53g/L， 油脂含量 72%, DHA含量 50%。

但上述的传统的种子培养和发酵方法涉及的发 酵级数较多， 工艺较 繁瑣，培养周期长，投资成本高。 因此，本领域亟需改进种子制备方式， 简化扩种工艺， 降低生产成本， 以更有利于 DHA的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供可简化扩种工艺， 缩短种子培养和发酵周 期， 减少投资， 节约成本， 固料培养基营养丰富， 富含多种生长因子， 更利于种子的生长， 菌种细胞的生长活力强、 同步性较好， 培养固料种 子阶段产生的废水、 废渣少， 环境污染小的一种固料培养裂殖壶菌液体 发酵生产 DHA的方法。

本发明第一方面涉及一种固料培养裂殖壶菌液 体发酵生产 DHA 的方法， 其包括以下步骤：

(1)菌种活化： 将裂殖壶菌菌种接种于培养基 (例如斜面培养基)培 养活化， 制备获得菌悬液；

(2)—级种子制备：将步骤 (1)获得的菌悬液接种至固料培养基上培 养， 制成一级固料种子； 或者

将步骤 (1)获得的菌悬液接种到液体种子培养基培养 (例如摇瓶培 养)， 制成一级液体种子；

(3)二级固料种子制备： 将一级固料种子制成一级固料种子液， 在 固料培养基中接入一级固料种子液培养； 或者

在固料培养基中接入一级液体种子液培养；

制得二级固料种子；

(4)二级固料种子发酵罐扩大培养： 将二级固料种子制成二级固料 种子液， 接种至发酵罐液体培养基中扩大培养； (5)发酵结束后， 收集菌体细胞， 提取 DHA。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中所述裂殖壶菌为本领域 公知的裂殖壶菌。 在本发明的实施方案中， 所述裂殖壶菌选自 Schizochytrium sp.; 在^发明的实施方案中， 所述 Schizochytrium sp. 选自裂殖壶菌 Schizochytrium sp. KDW-12、裂殖壶菌 Schizochytrium sp. S31、 裂殖壶菌 Schizochytrium aggregatum和裂殖壶菌 Schizochytrium sp. S8, 其中所述裂殖壶菌 sp.KDW-12已于 2012年 11 月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员^ 通微生物中心 (地址： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编为 100101)， 保 藏编号 CGMCC No.6843。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (1)的特征在于以下 几项中的一项或数项：

a.所述培养的温度为 25 - 28 °C，培养至菌体浓度及菌体形态较好， 例如培养的时间为 2 ~ 3天；

b.所述菌悬液的菌体浓度为 1.0 ~ 2.5xl0 ⁶ 个 /mL。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (2)的特征在于以下 几项中的一项或数项：

a.所述接种量为 0.5 ~ 2%；

b.所述培养的温度为 25 ~ 28°C , 培养至菌体浓度和菌体形态较好， 例如培养的时间为 20 ~ 28h;

c.所述液体培养 (例如摇瓶培养)的转速为 180 - 220 rpm。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (3)的特征在于以下 几项中的一项或数项：

a.所述一级固料种子液的菌体浓度可为 1.0 - 2.5xl0 ⁶ 个 /mL;

b.按照体积 /盾量分数为 10% - 20%的接种量在固料培养基中接 入一级固料种子液；

c.按照体积 /盾量分数为 8% - 15%的接种量在固料培养基中接入 一级液体种子；

d.所述培养温度为 25 ~ 28°C，培养至菌体浓度和菌体形态较好，例 如培养的时间为 2~3天。

才艮据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (4)的特征在于以下 几项中的一项或数项：

a.将二级固料种子液按体积分数为 10% - 20%的接种量接种至发 酵罐扩大培养；

b.发酵过程的前 48h 温度控制在 25~28。C， 利用搅拌转速保持 30% ~ 50%的溶氧；

c.发酵过程的第 48h至发酵结束温度控制在 18~22。C， 利用搅拌转 速保持 8% - 12%的溶氧；

d.在菌体形态开始自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、 增 加较慢或有下降趋势时， 结束发酵， 例如发酵 3~5天；

e.发酵过程中通过氨: ^制发酵液 pH为 6.0 ~ 6.5;

f.发酵过程中通过自动流加葡萄糖溶液控制葡� ��糖浓度在 4~8 在本发明的实施方案中， 所述氨水的浓度为 28%。

在本发明的实施方案中， 所述葡萄糖溶液的浓度为 580g/L。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (1)中的斜面培养基 含有： 葡萄糖 20 - 30g/L, 蛋白胨 10 - 15g/L, 酵母粉 3 - 5g/L, 海水晶 15 - 20g/L, 琼脂粉 15~25g/L， pH值 6.0~7.0。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中步骤 (2)或步骤 (3)中的固 料培养基包括固态组分和液体营养液组分， 所述固态组分为谷物， 为 250~400g/L， 所述谷物选自米类、 麦类和玉米中的至少一种， 所述 米类选自大米、 小米、糙米等中的至少一种， 所述麦类选自大麦、 小麦、 燕麦中的至少一种；

所述液体营养液组分包括组分 1和组分 2， 所述组分 1的组成为： 葡萄糖 2~5g/L， 七:^酸镁 0.2~0.6g/L, 磷酸氢二钾 1.0 - 5.0g/L, 海盐 0.1 - 0.8g/L,甘氨酸 0.2 - 0.6g/L,苏氨酸 1.5 - 1.8g/L,蛋氨酸 2 - 3.5g/L, 苹果酸 3~6g/L， 加水定容， 调节 pH值为 6~7； 所述组分 2 的组成为： La ³⁺ 10 ~ 15mg/L， Ce ³⁺ l~4mg/L, Sm ³⁺ 2 - 6mg/L, Nd ³⁺ 8~ 12mg/L, Mn ²⁺ 0.6 - 1.2mg/L, Co ²⁺ 0.05 - O.lmg/L,生物素 0.2 - 0.6mg/L, 浅蓝菌素 0.1 - 0.3mg/L, 赤霉素 GA 2 ~ 5mg/L, VB ₁₂ 0.5 - l.Omg/L, 叶 酸 0.01~0.05mg/L， 余量为水；

所述固料培养基的制备方法为： 固态组分与液体营养 ^ a分 1混合 均匀， 将谷物蒸或煮至谷物中心无白心， 且含水率为 50%~65%， 获得 固料培养基原料； 将固料培养基原料与液体营养液组分 2混合均匀， 装 于固态发酵瓶中， 厚度 0.2~1.0cm， 灭菌， 制得固料培养基；

优选地， 所述固态组分与液体营养 ^ia分 1按盾量 /体积的配比为

(5~10) _§ ： (2-5) mL, 所述固料培养 料与液体营养 分 2 按盾量 /体积的配比为 （10~15) g: (3~6) mL, 其中固态组分按盾 量计算， 液体营养液组分按体积计算。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中在步骤 2)中， 所述液体 种子培养基含有： 葡萄糖 20~25g/L， 氯化钠 20 - 25g/L, 磷酸二氢钾 0.2 - 0.5g/L,酵母粉 3 - 5g/L,七:^酸镁 8 - 12g/L,海盐 0.1 - 0.8g/L, 谷氨酸 0.2~0.6g/L， pH值 6.0~7.0。

根据本发明第一方面任一项的方法， 其中步骤 (4)中的发酵罐液体 培养基含有： 葡萄糖 30~60g/L， NaCl 15 - 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 04 ~ 8 g/L, 酵母粉 3~8g/L， KH ₂ P0 ₄ 0.5-1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.2-0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8-1.2 g/L, CoCl ₂ 1.0 ~ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.5 ~ 1.0 g/L， VBi 0.05- O.lmg/L, VB ₁₂ 0.001 ~0.01mg/L, 初始 pH6.0~7.0。 本发明第二方面涉及用于培养裂殖壶菌发酵生 产 DHA的培养基， 所述培养基选自以下几种培养基中的一种或几 种：

1) 斜面培养基， 含有： 葡萄糖 ² 0~ ³ 0g/L， 蛋白胨 10~l ⁵ g/L， 酵 母粉 3 - 5g/L, 海水晶 15 - 20g/L, 琼脂粉 15 - 25g/L (例如 20 g/L ) ， pH值 6.0 - 7.0；

2)固料培养基， 包括固态组分和液体营养液组分， 所述固态组分 为谷物， 含量为 250 ~ 400g/L， 所述谷物选自米类、 麦类和玉米中的至 少一种， 所述米类选自大米、 小米、 糙米等中的至少一种， 所述麦类 选自大麦、 小麦、 燕麦中的至少一种；

所述液体营养液组分包括组分 1和组分 2， 所述组分 1的组成为： 葡萄糖 2~5g/L， 七?^酸鎂 0.2~0.6g/L, 磷酸氢二钾 1.0 - 5.0g/L, 海盐 0.1 ~ 0.8g/L,甘氛酸 0.2 ~ 0.6g/L,苏氨酸 1.5 ~ 1.8g/L,蛋氨酸 2 ~ 3.5g/L, 苹果酸 3 - 6g/L, 加水定容， 调节 pH值为 6 ~ 7; 所述组分 2 的组成为： La ³⁺ 10 ~ 15mg/L， Ce ³⁺ l~4mg/L, Sm ³⁺ 2 - 6mg/L, Nd ³⁺ 8~ 12mg/L, Mn ²⁺ 0.6 - 1.2mg/L, Co ²⁺ 0.05 - O.lmg/L,生物素 0.2 - 0.6mg/L, 浅蓝菌素 0.1 ~ 0.3mg/L, 赤霉素 GA 2 ~ 5mg/L, VB ₁₂ 0.5 - l.Omg/L, 叶 酸 0.01~0.05mg/L， 余量为水；

所述固料培养基的制备方法为： 固态组分与液体营养 ^ a分 1混合 均匀， 将谷物蒸或煮至谷物中心无白心， 且含水率为 50%~65%， 获得 固料培养基原料； 将固料培养基原料与液体营养液组分 2混合均匀， 装 于固态发酵瓶中， 厚度 0.2~1.0cm， 灭菌， 制得固料培养基；

优选地， 所述固态组分与液体营养液组分 1 按质量 /体积的配比为 (5~10) g: (2-5) mL, 所述固料培养基原料与液体营养液组分 2 按盾量 /体积的配比为（ 10 ~ 15 ) g： (3~6) mL, 其中固态组分按盾量 计算， 液体营养液组分按体积计算

3) 液体种子培养基，含有： 葡萄糖 20~25g/L， 氯化钠 20~25g/L， 磷酸二氢钾 0.2 ~ 0.5g/L， 酵母粉 3~5g/L， 七:^酸镁 8 ~ 12g/L， 海盐 0.1 - 0.8g/L, 谷氨酸 0.2~0.6g/L， pH值 6·0~7.0;

4) 发酵罐液体培养基，含有：葡萄糖 30 - 60 g/L, NaCl 15 - 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 4~8 g/L, 酵母粉 3~8 g/L, KH ₂ P0 ₄ 0.5 - 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.2 ~ 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 - 1.2 g/L, CoCl ₂ 1.0 - 2.0 g/L， MnS0 ₄ 0.5 ~ 1.0 g/L， VBi 0.05 ~ O.lmg/L, VB ₁₂ 0.001 - O.Olmg/L, 初 始 pH6.0~7.0。 本发明还涉及一种固料培养裂殖壶菌液体发酵 生产 DHA的方法， 其特征在于包括如下步骤：

1)菌种活化与菌悬液制备： 将裂殖壶菌菌种接种于斜面培养基上 培养活化， 培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗涤菌体， 获得菌悬 液；

2)一级种子制备： 将步骤 1)获得的菌悬液按盾量分数为 1%的 接种量接种至固料培养基上培养， 制成一级固料种子； 或

将步骤 1 )获得的菌悬液按体积分数为 1%的接种量接种至液体种 子培养基， 摇瓶培养， 制成一级液体种子；

3 )二级固料种子的制备： 一级固料种子以 0.85%的生理盐?! M艮据 1:1(W/V)比例洗涤菌体， 制成菌悬液；

在无菌条件下：

积 /盾量分 10% - 20%的接种量在固 ^^养基中接入一级 固料种子液； 或

积 /盾量分 8% ~ 15%的接种量在固料培养基中接入一级 液体种子， 摇动固态发酵瓶混合均匀， 25~28°C， 培养 2~3天；

制得二级固料种子；

4)二级固料种子发酵罐扩大培养： 二级固料种子加入 1:3 ~ 5 (W/V)无菌水振荡洗下菌体， 按体积分数为 10% ~ 20%的接种量接 种至发酵罐扩大培养， 发酵前 48h温度控制在 25~28°C， 利用搅拌转 速保持 30% ~ 50%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 18~22。C， 发 酵 3 ~ 5天，通 it*量百分比为 28%的氨:^制发酵 pH6.0 - 6.5,整个 发酵过程自动流加经 118。C灭菌 25min的浓度为 580g/L的葡萄糖溶液 控制发酵葡萄糖浓度在 4~8 g/L;

5)发酵结束后， 收集菌体细胞， 提取 DHA油脂。

在本发明的实施方案中， 步骤 1) 中， 所述斜面培养基的配方为： 葡萄糖 20~30g/L， 蛋白胨 10~15g/L， 酵母粉 3~5g/L， 海水晶 15 ~ 20g/L,琼脂粉 15 - 25g/L(例如 20 g/L )， pH值 6 ~ 7， 121。C灭菌 30min; 所述培养活化的温度可为 25~28'C，培养活化的时间可为 2~3天； 所 述菌悬液的菌体浓度可为 1.0~2.5xl0 ⁶ 个 /mL。

在本发明的实施方案中， 在步骤 2)中， 所述固料培养基包括固态 组分和液体营养 ^ BL分， 所述固态组分为谷物， 含量为 250 ~ 400g/L， 所述谷物可选自米类、 麦类和玉米中的至少一种， 所述米类可选自大 米、 小米、 糙米等中的至少一种， 所述麦类可选自大麦、 小麦、 燕麦 中的至少一种。

在本发明的实施方案中， 在步骤 2)中， 所述液体营养液组分包括 组分 1和组分 2， 所述组分 1的组成为： 葡萄糖 2~5g/L， 七水硫酸镁 0.2 - 0.6g/L,磷酸氢二钾 1.0 - 5.0g/L,海盐 0.1 - 0.8g/L,甘氨酸 0.2 - 0.6g/L, 苏氨酸 1.5 - 1.8g/L, 蛋氨酸 2 - 3.5g/L, 苹果酸 3 - 6g/L, 加 水定容，调节 pH值为 6 ~ 7; 所^ &分 2的组成为： La ³⁺ 10 - 15mg/L, Ce ³⁺ 1 - 4mg/L, Sm ³⁺ 2 - 6mg/L, Nd ³⁺ 8~ 12mg/L, Mn ²⁺ 0.6 - 1.2mg/L, Co ²⁺ 0.05 - O.lmg/L, 生物素 0.2 - 0.6mg/L, 浅蓝菌素 0.1 - 0.3mg/L, 赤霉素 GA 2 ~ 5mg/L， VB ₁₂ 0.5 - l.Omg/L, 叶酸 0.01 ~ 0.05mg/L， 余 量为水。

在本发明的实施方案中， 在步骤 2)中， 所述固料培养基的制备方 法为： 固态组分与液体营养 ¾ 分 1 混合均匀， 将 蒸或煮至谷物 中心无白心， 且含^为 50%~65%， 获得固 养基原料； 将固料 培养基原料与液体营 分 2混合均匀， 装于固态发酵 K瓶中， 厚 度 0.2~1.0cm， 121。C灭菌 30min， 制得固料培养基。

在本发明的实施方案中， 所述固态组分与液体营养 ^ a分 1按盾 量 /体积的配比为（ 5 ~ 10 ) g： ( 2 ~ 5 ) mL，其中固态组分按盾量计算， 液体营养^ a分 1 积计算；

所述固料培养基原料与液体营养液组分 2按盾量 /体积的配比为 (10-15) _§ ： (3~6) mL, 其中固料培养基原料按盾量计算， 液体 营养 ^ a分 2 积计算。

在本发明的实施方案中， 在步骤 2)中， 所述液体种子培养基的组 成为： 葡萄糖 20 - 25g/L,氯化钠 20 - 25g/L,磷酸二氢钾 0.2 - 0.5g/L, 酵母粉 3 - 5g/L,七:^酸镁 8 - 12g/L,海盐 0.1 - 0.8g/L,谷氨酸 0.2 - 0.6g/L, pH值 6~7， 121。C灭菌 30min。

在本发明的实施方案中， 在步骤 2) 中， 所述培养的温度为 25~ 28。C， 培养的时间为 1天。 在本发明的实施方案中， 在步骤 2) 中， 所述摇瓶的转速为 180 ~ 220 rpm; 摇瓶培养的温度为 25 ~ 28。C， 摇瓶培养的时间为 1天。

在本发明的实施方案中， 在步骤 4)中， 所述扩大培养采用的液体 发酵培养基的组成为： 葡萄糖 30~60 g/L, NaCl 15 - 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 4~8 g/L, 酵母粉 3~8 g/L, KH ₂ P0 ₄ 0.5 - 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.2 - 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 - 1.2 g/L, CoCl ₂ 1.0 ~ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.5~1.0 g/L， VBi 0.05 ~ O.lmg/L, VB ₁₂ 0.001 ~ O.Olmg/L, 初 始 pH6.0~7.0; 所^ C酵最好溶氧维持在 8% ~ 12%。 在本发明的具体实施方案中， 固料培养裂殖壶菌液体发酵生产 DHA的方法包括以下步骤：

1)菌种活化与菌悬液制备： 将裂殖壶菌菌种接种于斜面培养基上 培养活化，培养到期斜面加入无菌水或等渗盐 溶液 (例如 0.85% - 0.9% 的生理盐水)洗涤菌体， 获得菌悬液；

在步骤 1) 中， 所述斜面培养基的配方可为： 葡萄糖 20~30g/L， 蛋白胨 10~15g/L， 酵母粉 3~5g/L， 海水晶 15~20g/L， 琼脂粉 15 ~ 25g/L, pH值 6~7， 灭菌 (例如 121。C灭菌 30min); 所述培养活化的温 度可为 25~28°C，培养活化的时间可为 2 ~3天； 所述菌悬液的菌体浓 度可为 1.0~2.5xl0 ⁶ 个 /mL;

2 )一级种子制备： 将步骤 1 )获得的菌悬液接种 (例如按盾量分数 为 0.5-2%、 1%的接种量)至固料培养基上培养， 制成一级固料种子； 或

将步骤 1)获得的菌悬液接种 (例如按盾量分 0.5-2%、 1%的接 种量)至液体种子培养基， 摇瓶培养， 制成一级液体种子；

在步骤 2) 中， 所述固料培养基包括固态组分和液体营养 ¾ 分， 所述固态组分为谷物， 含量为 250~400g/L， 所^物可选自米类、 麦 类和玉米等中的至少一种， 所述米类可选自大米、 小米、 糙米等中的 至少一种， 所述麦类可选自大麦、 小麦、 燕麦等中的至少一种； 所述液体营养液组分包括组分 1和组分 2， 所述组分 1的组成为： 葡萄糖 2~5g/L， 七:^酸镁 0.2 - 0.6g/L, 磷酸氢二钾 1.0 ~ 5.0g/L， 海盐 0.1 - 0.8g/L,甘氨酸 0.2 - 0.6g/L,苏氨酸 1.5 - 1.8g/L,蛋氨酸 2 - 3.5g/L, 苹果酸 3~6g/L， 加水定容， 调节 pH值为 6~7； 所述组分 2 的组成为： La ³⁺ 10 - 15mg/L, Ce ³⁺ 1 - 4mg/L, Sm ³⁺ 2 - 6mg/L, Nd ³⁺ 8 - 12mg/L, Mn ²⁺ 0.6~ 1.2mg/L, Co ²⁺ 0.05 ~ O.lmg/L , 生物素 0.2 ~ 0.6mg/L, 浅蓝菌素 0.1 ~ 0.3mg/L， 赤霉素 GA 2 ~ 5mg/L， VB ₁₂ 0.5 - l.Omg/L, 叶酸 0.01 ~ 0.05mg/L， 余量为水；

所述固料培养基的制备方法可为： 固态组分与液体营养 ^ a分 1 混合均匀，将^^蒸或煮至谷物中心无白心，且� ��水率为 50%~65%， 获得固料培养 料； 将固^^养 料与液体营养 ^ a分 2混合均 匀， 装于固态发酵 K瓶中， 将固料种子按照 150g~2500g/瓶分装进规 格为 1L ~ 10L的固态发酵瓶中， 厚度 0.2 - 1.0cm, 121。C灭菌 30min， 制得固料培养基；

所述固态组分与液体营养 ^ a分 1按盾量 /体积的配比可为 （5~

10 ) g： ( 2 ~ 5 ) mL, 其中固态组分按盾量计算， 液体营养^&分 1 积计算；

所述固料培养基原料与液体营养 ^ a分 2按盾量 /体积的配比可为

(10-15) _§ ： (3~6) mL, 其中固料培养基原料按盾量计算， 液体 营养 ^ a分 2 积计算；

所述液体种子培养基的组成可为： 葡萄糖 20~25g/L，氯化钠 20 ~ 25g/L,磚酸二氢钾 0.2 - 0.5g/L,酵母粉 3 - 5g/L,七:^酸镁 8 - 12g/L, 海盐 0.1 ~ 0.8g/L， 酸 0.2~0.6g/L， pH值 6~7， 灭菌 (例如 121。C 灭菌 30min);

所述培养的温度可为 25 - 28°C ,培养至菌体浓度及菌体形态较好， 例如培养的时间可为 20-28h (例如 1 天左右)； 所述摇瓶的转速可为 180 - 220 rpm; 摇瓶培养的温度可为 25 ~ 28。C， 培养至菌体浓度及菌 体形态较好， 例如摇瓶培养的时间可为 20-28h (例如 1天左右)；

3)二级固料种子的制备：一级固料种子以无菌� ��或等渗盐溶液 (例 如为 0.85%的生理盐水)洗涤菌体 (例如根据 1:1(W/V)比例)， 制成菌悬 液；

在无菌条件下：

积 /盾量分 10% - 20%的接种量在固 ^^养基中接入一级 固料种子液； 或

积 /盾量分 8% ~ 15%的接种量在固料培养基中接入一级 液 子；

摇动 K瓶混合均匀， 25 ~ 28°C，培养至菌体浓度及菌体形态较好， 例如培养 2 ~ 3天；

制得二级固料种子；

4)二级固料种子发酵罐扩大培养： 二级固料种子加入 1:3 ~ 5 (W/V)无菌水振荡洗下菌体， 按体积分数为 10% ~ 20%的接种量接 种至发酵罐扩大培养， 发酵前 48h温度控制在 25~28°C， 利用搅拌转 速保持 30% ~ 50%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 18~22。C， 发 酵至菌体形态开始自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、增加较 慢或有下降趋势， 例如发酵 3~5天， 通过氨水 (例如为 28%的氨水)^ 制发酵 pH6.0~6.5， 整个发酵过程自动 葡萄糖溶液 (例如经 118。C 灭菌 25min 的浓度为 580g/L 的葡萄糖溶液)控制发酵葡萄糖浓度在 4~8 g/L;

在步骤 4) 中， 所述扩大培养采用的液体发酵培养基的组成可 为： 葡萄糖 30~60g/L， NaCl 15 - 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 04 ~ 8 g/L, 酵母粉 3~8 g/L, KH ₂ P0 ₄ 0.5 - 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.2 - 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 - 1.2 g/L, C0CI21.0 - 2.0 g/L, MnS0 ₄ 0.5 - 1.0 g/L, VBi 0.05 ~ O.lmg/L, VB ₁₂ 0.001 - O.Olmg/L, 初始 pH6.0~7.0; 所^1酵最好溶 氧维持在 8% - 12%;

5)发酵结束后， 收集菌体细胞， 提取 DHA。

在本发明的实施方案中， 经测定， 发酵液中细胞干重达 105 ~ 160g/L, DHA含量达 20~35g/L。

在本发明中， 所述裂殖壶菌可以为本领域公知的任何裂殖壶 菌， 例如包括可以从美国典型培养物收集中心、 日本大阪发酵工程研究所 等保藏机构获得的裂殖壶菌菌种。 在本发明的实施方案中， 所述裂殖 壶菌为裂殖壶菌 ( Schizochytrium sp. ) , 其中所述裂殖壶菌 ( Schizochytrium sp. )例如可以为裂殖壶菌 ( Schizochytrium sp. ) KDW-12, S31、 S8或裂殖壶菌 Schizochytrium aggregatim

本发明采用的菌种裂殖壶菌（ Schizochytrium sp. ) KDW-12, 已于 2012年 11月 20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员^ 通微生物 中心，保藏中心登记入册编号为 CGMCC No.6843,地址为北京市朝阳 区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编为 100101。 在本发明的实施方案中， 所述等渗盐溶液为生理盐水， 即 0.85-0.9%的氯化钠溶液。

在本发明中， 二级固料种子及前期各阶 ¾t酵培养时间的确定，是 根据前期开展的最佳培养时间优化实验而定， 在选定的培养时间内获得 的菌体浓度及菌体形态较好； 发酵罐上控制发酵结束的指标为菌体形态 开始自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋 势。

在本发明中， 氨水和葡萄糖的控制均为公知的现有技术， 即利用氨 水控制 _P H主要是通过发酵罐上的自动控制系统设� �控制值， 低于此设 定值， 蠕动泵会自动流加氨水进行调节； 而葡萄糖的控制类似氨水的控 制， 每次取样通过生物传感分析仪测定剩余的糖浓 度， 根据设定的控制 点计算需补入的葡萄糖体积， 在自动控制体统中设定相应的开度和周 期， 通过蠕动泵自动调节。

在本发明中， 所述培养时间中的 1天并不局限于准确的 24小时， 例如可约为 20 ~ 28小时、 22 ~ 26小时、 24小时。

在本发明中， 将活化后的菌种或一级、 二级固料种子制成相应的种 子液的方法为： 对于活化后的菌种和一级固料种子， 可以加入无菌水或 等渗盐溶液，例如 0.85% - 0.9%的氯化钠溶液，洗涤菌体，制成菌悬液； 对于二级固料种子， 可以加入无菌水， 制成菌悬液； 所述菌悬液即相应 的种子液； 所述菌悬液的菌体浓度可为 1.0 ~ 2.5xl0 ⁶ 个 /mL。

在本发明中，所述制备菌悬液或种子液时质量 /体积百分数中的质量 以及按照体积 /盾量百分数接种中的质量均指固料培养基的� �量。 发明的有益效果

本发明摒弃传统的种子培养工艺¾½， 直接由固料发酵获得的种子 液进行液体发酵培养:斜面活化→一级固料种� � /摇瓶液 子→二级固 料种子液—液体发酵。 本发明改进种子制备方式， 简化扩种工艺， 缩短 种子培养和发酵周期， 可减少投资， 节约成本， 更适合 ^^化生产； 同 时固料培养基营养丰富， 富含多种生长因子， 更利于种子的生长， 菌种 细胞的生长活力强、 同步性较好； 培养固料种子阶段产生的废水、 废渣 少， 环境污染小。

本发明克服了传统发酵方法种子扩培级数较多 的缺陷， 通过改进 DHA发酵用种子液的制备， 可简化 DHA生产工艺过程； 固料培养基 营养丰富， 种子饱满活力强， 可缩短种子上罐后延迟期， 提高 DHA产 量， 降低生产成本， 保持稳定的生产能力； 培养固料种子阶段产生的 废水、 废渣少， 环境污染小； 发酵得到的 DHA可作为营养强化剂， 为 人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通 过市购获得的常规产品。 实施例中用到的菌种为：

裂殖壶菌 ( Schizochytrium sp. ) KDW-12, 已于 2012年 11月 20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心 (地址： 北京 市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编为 100101)， 保藏编 号 CGMCC No.6843。

裂殖壶菌 （ Schizochytrium sp. ) S31 (ATCC No. 20888)

裂殖壶菌 （ Schizochytrium sp. ) S8 (ATCC No. 20889)

裂殖壶菌 Schizochytrium aggregatum (ATCC No. 28209) 实施例 1:

将裂殖壶菌（ Schizochytrium sp. ) KDW-12菌种接种于斜面培养基 上培养活化， 温度为 25°C , 培养 2天。 斜面培养基配方为 （g/L ) ： 葡 萄糖 20，蛋白胨 15，酵母粉 3， 海水晶 (海盐 )15， 琼脂粉 20， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。 培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗涤菌体， 获 得菌悬液， 控制菌体浓度为 2.5X10 ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液按体积 /盾量分数为 1%(V/W,菌悬液体积 /固料培养 量)的接种量直 种至灭菌的固料培养基上（固料培养基的装量 为 1000ml麟的 K氏餘 150g/瓶分装）， 25。C培养 1天，培^间每 隔 8-12h摇动 K氏瓶一次混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得一级固料种子。

在无菌条件下， 按体积 /盾量分数为 10%(V/W)的接种量在固料培 养基 (二级固料培养基按 150g/瓶分装于规格为 1000ml的 K氏瓶） 中 接入一级固料种子（用于接种的一级固料种子 以 0.85%的生理盐?! M艮 据 1:1(W/V)比例洗涤菌体， 制成菌悬液， 控制菌体浓度为 l.OxlO ⁶ 个 /mL )，摇动 K氏瓶，混合均匀， 25。C，培养 2.5天，培养期间每隔 8-12h 摇动 K氏瓶一次， 混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二 级固料种子。

二级固料种子加入 1:4 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 1.5X10 ⁶ 个 /mL， 积分数为 15%的接种量接种至 50L发酵罐扩 大培养， 接后体积 32L。 发酵前 48h温度控制在 25°C， 利用搅拌转速 和通气量保持 40%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 22。C， 溶氧维 持在 10%左右，发酵过程中每隔 8h ^#—次测 ¾1酵液中的残糖、菌 体浓度、 细胞干重和 DHA含量， 发酵 4天， 此时菌体形态开始自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、增加较慢或有下降趋势。通 过盾 量百分比为 28%的氨水控制发酵 pH6.5， 整个发酵过程自动流加经 118。C灭菌 25miii的浓度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度 在 8 g/Lo

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养液组分组成， 其中固态组分为小米， 为 375g/L (固料组分盾量 /液体营养^ &分体 积)， 小米与液体营养 ^ BL分 1按 8: 3 ( W/V )比例^^均匀， 将谷物 蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为 55%, 获得固料培养基原料。 固 料培养基原料与液体营养 ^ a分 2按 10: 3 ( W/V )比例混合均匀， 装 于固态发酵 K氏瓶中， 装量为 1000ml 的 K氏瓶按 150g/瓶分装， 厚度 0.3cm， 121。C灭菌 30min， 制得固料培养基。

液体营养 ^ BL分 l(g/L): 葡萄糖 3， 七^酸镁 0.2, 磷酸氢二 钾 3.0， 海盐 0.6， 甘氨酸 0.6， 苏氨酸 1.5， 蛋氨酸 2, 苹果酸 4， 加 水定容至所需体积， 调节 pH值至 6.5。 组分 2 ( mg/L ) : La ³⁺ 15, Ce ³⁺ 2， Sm ³⁺ 3, Nd ³⁺ 8, Mn ²⁺ 1.0， Co ²⁺ 0.08， 生物素 0.2， 浅蓝菌素 0.1， 赤霉素 GA 5， VB ₁₂ 1.0, 叶酸 0.03， 余量为水。

液体发酵培养 JBL成： 葡萄糖 30 g/L， NaCl 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 5 g/L,酵母粉 3 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.4 g/L, NaHC0 ₃ 1.2 g/L, CoCl ₂ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.7 g/L， VBi 0.06mg/L, VB ₁₂ 0.005mg/L, 初始 pH6.5。 初始 pH是指培养基配制好后， 灭菌前通过 pH计调节得 到的 pH。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 125g/L， 气相检测 DHA含量达 25g/L。发酵液的处理和 DHA的提取测定方法 参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。提取的 DHA可作为 营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 实施例 2:

将裂殖壶菌（ Schizochytrium sp. ) KDW-12菌种接种于斜面培养基 上培养活化， 温度为 28。C， 培养 2天。 斜面培养基配方为 （g/L ): 葡 萄糖 25，蛋白胨 12，酵母粉 3，海水晶 16，琼脂粉 20， pH值 6.0， 121°C 灭菌 30min。培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬 液， 控制菌体浓¾^ l.OxlO ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液直 种至摇瓶液体培养基 ( 500ml三角瓶装液量为 150ml )上， 接种量 1%， 摇瓶转速 220 rpm, 28。C培养 1天， 制得一 级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成 ( g/L ): 葡萄糖 25， 氯化钠 20, 磷酸二氢钾 0.2， 酵母粉 5， 七:^酸镁 10， 海盐 0.4， 谷氨酸 0.4， pH 值 6.0， 121。C灭菌 30min。

在无菌糾下， 积 /盾量分数为 10%的接种量在固 养^ (装 量为 1000ml规格的 K氏瓶按 250g/瓶分装） 中接入一级液体种子， 摇 动 K氏瓶混合均匀， 26。C， 培养 3天， 培:^间每隔 8-12h摇动 K氏 瓶一次， 混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二级固料种 子。

二级固料种子加入 1:3 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 2.5X10 ⁶ 个 /mL， 按体积 /盾量分数为 20%的接种量接种至 100L发 酵罐扩大培养， 接后体积 60L。 发酵前 48h温度控制在 28。C， 利用搅 拌转速和通气量保持 30%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 18。C， 溶氧维持在 10%左右。发酵过程中每隔 8h取样一次测定发酵液中的残 糖、 菌体浓度、 细胞干重和 DHA含量， 发酵 5天， 此时菌体形态开始 自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋势。 通过 28%的氨水控制发酵 pH6.0,整个发酵过程自动流加经 118。C灭菌 25min的浓度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在 7 g/L。

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养液组分组成， 其中固态组分为小米， 含量为 300g/L， 小米与液体营养^ BL分 1按 8: 3 ( W/V )比例混合均匀， 将谷物蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为

60%, 获得固 ^^养基原料。 固^^养^料与液体营养 ^ a分 2按

10: 4 ( W/V )比例混合均匀， 装于固态发酵 K氏瓶中， 装量为 1000ml 的 K 250g/瓶分装， 厚度 0.5cm, 121。C灭菌 30min， 制得 固料培养基。

液体营养 ^ia分 l(g/L): 葡萄糖 5， 七^酸镁 0.4, 磷酸氢二钾 2.0， 海盐 0.5， 甘氨酸 0.3, 苏氨酸 1.5， 蛋氨酸 3.5， 苹果酸 6， 加水 定容至所需体积， 调节 pH值 6.0。 组分 2 ( mg/L ) : La ³⁺ 10, Ce ³⁺ 4, Sm ³⁺ 5, Nd ³⁺ 9, Mn ²⁺ 0.8, Co ²⁺ 0.06, 生物素 0.2， 浅蓝菌素 0.1， 赤霉 素 GA 2， VB ₁₂ 0.8, 叶酸 0.03， 余量为水。

液体发酵培养基组成： 葡萄糖 40 g/L， NaCl 15g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 4g/L,酵母粉 5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.2 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 g/L, CoCl ₂ 1.5 g/L， MnSO ₄ 1.0 g/L， VBi O.lmg/L, VB ₁₂ 0.01mg/L, 初始 ρΗ6·0。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 159g/L， 气相检测 DHA含量达 34.5g/L。 发酵液的处理和 DHA的提取测定方 法参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。提取的 DHA可作 为营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 实施例 3:

将裂殖壶菌（ Schizochytri腿 sp. ) KDW-12菌种接种于斜面培养基 上培养活化， 温度为 28。C， 培养 3天。 斜面培养基配方为 （g/L ): 葡 萄糖 30，蛋白胨 12，酵母粉 3，海水晶 15，琼脂粉 20， pH值 6.5， 121°C 灭菌 30min。培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬 液， 控制菌体浓¾^ 2.0xl0 ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液按 1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基（ 500ml 三角 液量为 150ml )上， 摇^ il 220 rpm， 28。C培养 1天， 制得 一级液体种子。 摇瓶液体种子培养基组成 ( g/L ): 葡萄糖 20， 氯化钠 22，磷酸二氢钾 0.2， 酵母粉 3，七:^酸镁 10， 海盐 0.3，谷氨酸 0.6， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。

在无菌糾下，按体积 /盾量分数为 8%的接种量在固 养基（装 量为 1000ml 的 K氏 300g/瓶分装） 中接入一级液 子， 摇 动 K氏瓶混合均匀， 26。C， 培养 3天， 培:^间每隔 8-12h摇动 K氏 瓶一次， 混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二级固料种 子。

二级固料种子加入 1:3 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 2.0xl0 ⁶ 个 /mL， 积分数为 10%的接种量接种至 100L发酵罐 扩大培养， 接后体积 60L。 发酵前 48h温度控制在 25°C， 利用搅拌转 速和通气量保持 30%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 20。C， 溶氧 维持在 10%左右。 发酵过程中每隔 8h ^#—次测 ¾1酵液中的残糖、 菌体浓度、细胞干重和 DHA含量，发酵 5天，此时菌体形态开始自溶、 菌体细胞干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋势。 通过 28%的氨水控制发酵 pH6.0， 整个发酵过程自动流加经 118°C灭菌 25min的浓度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在 8 g/L。

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养^ &分组成， 其中固态组分为小麦， 为 350g/L，小麦与液体营养 ^ a分 1按 10: 4 ( W/V )比例混合均匀， 将谷物蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为

55%, 获得固^^养基原料。 固^^养^料与液体营养 ^ a分 2按

15: 4 ( W/V ) 比例齡均匀， 装于固态发酵 K瓶中， 装量为 1000ml 的 K 300g/瓶分装， 厚度 0.7cm, 121。C灭菌 30min， 制得 固料培养基。

液体营养 ^iBL分 l(g/L): 葡萄糖 3.5， 七^酸镁 0.3, 磷酸氢二 钾 3.0， 海盐 0.4， 甘氨酸 0.5, 苏氨酸 1.6, 蛋氨酸 3.5， 苹果酸 5， 加 水定容至所需体积，调节 pH值 6.0。组分 2 ( mg/L )： La ³⁺ 12， Ce ³⁺ 4， Sm ³⁺ 5, Nd ³⁺ 8, Mn ²⁺ 0.9, Co ²⁺ 0.08， 生物素 0.4， 浅蓝菌素 0.1， 赤霉 素 GA 3， VB ₁₂ 0.8, 叶酸 0.02， 余量为水。

液体发酵培养基组成： 葡萄糖 40 g/L， NaCl 16 g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 6 g/L,酵母粉 4 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 1.2 g/L, CoCl ₂ 2.0 g/L， MnSO ₄ 1.0 g/L， VBi 0.05mg/L, VB ₁₂ 0.005mg/L, 初始 ρΗ6·0。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 132g/L， 气相检测 DHA含量达 30.5g/L。 发酵液的处理和 DHA的提取测定方 法参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。提取的 DHA可作 为营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 实施例 4:

将 壶菌 (Schizochytrium sp. S31 ) ( ATCC No. 20888)菌种接种 于斜面培养基上培养活化， 温度为 28。C， 培养 2天。 斜面培养基配方 为 （g/L ): 葡萄糖 30， 蛋白胨 12， 酵母粉 3， 海水晶 15， 琼脂粉 20， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。 培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗 涤菌体， 获得菌悬液， 控制菌体浓度为 1.5X10 ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液按 1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基（ 500ml 三角 液量为 150ml )上， 摇^ il 200 rpm， 28。C培养 1天， 制得 一级液体种子。 摇瓶液体种子培养基组成 ( g/L ): 葡萄糖 20， 氯化钠 22，磷酸二氢钾 0.2， 酵母粉 5，七:^酸镁 12， 海盐 0.3，谷氨酸 0.6， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。

在无菌糾下， 积 /盾量分数为 15%的接种量在固 养^ (装 量为 1000ml 的 K氏麵 170g/瓶分装） 中接入一级液 子， 摇 动 K氏瓶混合均匀， 26。C， 培养 2天， 培^间每隔 8-12h摇动 K氏 瓶一次， 混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二级固料种 子。

二级固料种子加入 1:3 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 2.0xl0 ⁶ 个 /mL， 按 10%的接种量接种至 100L发酵罐扩大培养， 接后体积 60L。 发酵前 48h温度控制在 25°C， 利用搅拌转速和通气量 保持 30%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 20。C， 溶氧维持在 10% 左右。 发酵过程中每隔 8h取样一次测定发酵液中的残糖、 菌体浓度、 细胞干重和 DHA含量， 发酵 4.5天， 此时菌体形态开始自溶、 菌体细 胞干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋势。 通过 28%的 氨?! 制发酵 ρΗ6.0, 整个发酵过程自动 »经 118。C灭菌 25min的 浓度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在 6g/L _e

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养^ &分组成， 其中固态组分为小米， 为 350g/L，小米与液体营养^ &分 1按 10: 4 ( W/V )比例混合均匀， 将谷物蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为

55%, 获得固^^养基原料。 固^^养^料与液体营养 ^ a分 2按

10: 4 ( W/V )比例混合均匀， 装于固态发酵 K氏瓶中， 装量为 1000ml 规格的 K氏瓶按 170g/瓶分装， 厚度 0.3cm, 121。C灭菌 30min， 制得 固料培养基。

液体营养 ^iBL分 l(g/L): 葡萄糖 3， 七^酸镁 0.5, 磷酸氢二钾 5.0， 海盐 0.8， 甘氨酸 0.2, 苏氨酸 1.6， 蛋氨酸 3.5， 苹果酸 3， 加水 定容至所需体积， 调节 pH值 6.0。 组分 2 ( mg/L ) : La ³⁺ 15, Ce ³⁺ 4, Sm ³⁺ 5, Nd ³⁺ 10, Mn ²⁺ 0.9, Co ²⁺ 0.1， 生物素 0.4， 浅蓝菌素 0.2， 赤 霉素 GA 2， VB ₁₂ 1.0, 叶酸 0.02， 为水。

液体发酵培养基组成： 葡萄糖 40 g/L， NaCl 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 6 g/L,酵母粉 4 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 g/L, CoCl ₂ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.5 g/L， VBi 0.05mg/L, VB ₁₂ 0.005mg/L, 初始 ρΗ6·0。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 115g/L， 气相检测 DHA含量达 22.7g/L。 发酵液的处理和 DHA的提取测定方 法参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。提取的 DHA可作 为营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 实施例 5:

将裂殖壶菌 (Schizochyirium sp. S8 )( ATCC 20889)菌种接种于斜面 培养基上培养活化，温度为 28°C，培养 2天。斜面培养基配方为（ g/L ): 葡萄糖 20， 蛋白胨 12， 酵母粉 3， 海水晶 20， 琼脂粉 20， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。 培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗涤菌体， 获 得菌悬液， 控制菌体浓度为 2.5X10 ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液按 1%的接种量直接接种至摇瓶液体培养基 ( 1L三 角 液量为 350ml )上， 摇瓶 il 220 rpm， 28。C培养 1天， 制得一 级液体种子。摇瓶液体种子培养基组成 ( g/L ): 葡萄糖 25， 氯化钠 22, 磷酸二氢钾 0.5， 酵母粉 5， 七:^酸镁 12， 海盐 0.3， 谷氨酸 0.6， pH 值 6.5， 121。C灭菌 30min。

在无菌糾下， 积 /盾量分数为 12%的接种量在固 养^ (装 量为 10L规格的 K氏瓶按 2250g/瓶分装） 中接入一级液体种子， 摇动 K氏瓶混合均匀， 28。C， 培养 3天， 培:^间每隔 8-12h摇动 K氏瓶 一次， 混匀, 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二级固料种子。

二级固料种子加入 1:4 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 2.0xl0 ⁶ 个 /mL， 按 18%的接种量接种至 1000L发酵罐扩大培养， 接后体积 600L。发酵前 48h温度控制在 28°C， 利用搅拌转速和通气量 保持 30%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 20。C， 溶氧维持在 10% 左右。 发酵过程中每隔 8h取样一次测定发酵液中的残糖、 菌体浓度、 细胞干重和 DHA含量， 发酵 5天， 此时菌体形态开始自溶、 菌体细胞 干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋势。 通过 28%的氨 水控制发酵 pH6.5, 整个发酵过程自动流加经 118。C灭菌 25min的浓 度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在 8 g/L。

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养^ &分组成， 其中固态组分为大米， 含量为 300g/L， 大米与液体营养^ BL分 1按 8:

5 ( W/V )比例混合均匀， 将谷物蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为

50%, 获得固^^养基原料。 固^^养^料与液体营养 ^ a分 2按

15: 3 ( W/V ) 比例齡均匀， 按 2250g/瓶分装于 10L ^¾ ^的 K氏瓶 中， 厚度 0.5cm。

液体营养 ^iBL分 l(g/L): 葡萄糖 3， 七^酸镁 0.5, 磷酸氢二钾 5.0， 海盐 0.8， 甘氨酸 0.2, 苏氨酸 1.6， 蛋氨酸 3.5， 苹果酸 3， 加水 定容至所需体积， 调节 pH值 6.0。 组分 2 ( mg/L ): La ³⁺ 15, Ce ³⁺ 4, Sm ³⁺ 5, Nd ³⁺ 10, Mn ²⁺ 1.2, Co ²⁺ 0.1， 生物素 0.4， 浅蓝菌素 0.2， 赤 霉素 GA2， VB ₁₂ 1.0, 叶酸 0.02， 余量为水。

液体发酵培养基组成： 葡萄糖 40 g/L， NaCl 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0

6 g/L,酵母粉 4 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.5 g/L, NaHC0 ₃ 0.8 g/L, CoCl ₂ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.5 g/L， VBi 0.05mg/L, VB ₁₂ 0.005mg/L, 初始 ρΗ6·5。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 138g/L， 气相检测 DHA含量达 31.6g/L。 发酵液的处理和 DHA的提取测定方 法参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。提取的 DHA可作 为营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。 实施例 6:

将裂殖壶菌 (Schizochytrium aggregatum) ( ATCC 28209)菌种接种 于斜面培养基上培养活化， 温度为 25。C， 培养 2天。 斜面培养基配方 为 （g/L ): 葡萄糖 20， 蛋白胨 15， 酵母粉 3， 海水晶 15， 琼脂粉 20， pH值 6.5， 121。C灭菌 30min。 培养到期斜面加入 0.85%的生理盐水洗 涤菌体， 获得菌悬液， 控制菌体浓度为 2.5X10 ⁶ 个 /mL。

获得的菌悬液按体积 /盾量分数为 1%的接种量直接接种至灭菌的 固料培养基 (装量为 lOOOmL规 的 K氏瓶按 225g/瓶分装 )上 28。C 培养 1天， 培养期间每隔 8-12h摇动 K氏瓶一次， 混匀， 以利于种子 充分利用营养成分生长。 制得一级固料种子。

在无菌糾下， 积 /盾量分数为 20%的接种量在固 养^ (装 量为 10L 的 K氏^^ 2250g/瓶分装 ) 中接入一级固料种子（用于 接种的一级固料种子以 0.85%的生理盐水根据 1:1(W/V)比例洗涤菌 体， 制成菌悬液， 控制菌体浓度为 1.5X10 ⁶ 个 /mL )， 摇动 K氏瓶混合 均匀， 25。C， 培养 3天， 培:^间每隔 8-12h摇动 K氏瓶一次， 混匀， 以利于种子充分利用营养成分生长。 制得二级固料种子。

二级固料种子加入 1:4 ( W/V )无菌^荡洗下菌体， 控制菌体浓 度为 2.0xl0 ⁶ 个 /mL， 按 12%的接种量接种至 1000L发酵罐扩大培养， 接后体积 600L。发酵前 48h温度控制在 28°C， 利用搅拌转速和通气量 保持 40%的溶氧， 48h至发酵结束温度控制在 18。C， 溶氧维持在 10% 左右。 发酵过程中每隔 8h取样一次测定发酵液中的残糖、 菌体浓度、 细胞干重、 DHA含量， 发酵 5天， 此时菌体形态开始自溶、 菌体细胞 干重和 DHA产量均无增加、 增加较慢或有下降趋势。 通过 28%的氨 水控制发酵 pH6.5, 整个发酵过程自动流加经 118。C灭菌 25min的浓 度为 580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在 8 g/L。

固料培养基的制备方法为： 由固态组分和液体营养液组分组成， 其中固态组分为大麦， 含量为 375g/L， 大麦与液体营养^ BL分 1按 8: 3 ( W/V )比例混合均匀， 将谷物蒸煮至谷物中心无白心， 且含水率为

55%, 获得固^^养基原料。 固^^养^料与液体营养 ^ a分 2按

10: 3 ( W/V ) 比例齡均匀， 按 2250g/瓶分装于 10L ^¾ ^的 K氏瓶 中， 或者按照 225g/瓶分装于 1L麟的 K氏瓶中， 厚度 0.5cm。

液体营养 ^iBL分 l(g/L): 葡萄糖 5， 七^酸镁 0.2, 磷酸氢二钾 3.0, 海盐 0.6， 甘氨酸 0.6, 苏氨酸 1.5， 蛋氨酸 2， 苹果酸 4， 加水定 容至所需体积， 调节 pH值 6.5。 组分 2 ( mg/L )： La ³⁺ 15， Ce ³⁺ 2， Sm ³⁺ 3, Nd ³⁺ 8, Mn ²⁺ 1.2, Co ²⁺ 0.08， 生物素 0.2， 浅蓝菌素 0.1， 赤 霉素 GA 5， VB ₁₂ 1.0, 叶酸 0.03， 余量为水。

液体发酵培养 成： 葡萄糖 30 g/L， NaCl 20g/L, MgS0 ₄ .7H ₂ 0 5 g/L,酵母粉 3 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0.4 g/L, NaHC0 ₃ 1.2 g/L, CoCl ₂ 2.0 g/L， MnSO ₄ 0.7 g/L， VBi 0.06mg/L, VB ₁₂ 0.005mg/L, 初始 ρΗ6·5。

发酵结束， 离心收集菌体细胞， 测定发酵液中细胞干重达 142g/L， 气相检测 DHA含量达 32.3g/L。发酵液的处理和 DHA的提取测定方法 参照中国专利 CN101638361A公开的方法进行。 提取的 DHA可作为 营养强化剂， 为人类和动物提供所需长链多不饱和脂肪酸。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的 描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。