POUR L'ÉLEVAGE D'ARTHROPODES IN VITRO

La présente invention s'inscrit dans le domaine des membranes de type étanches aux liquides et perméables aux gaz. Plus particulièrement, elle concerne une membrane répondant à de telles caractéristiques, ainsi qu'un procédé de fabrication d'une telle membrane. L'invention concerne également l'utilisation de cette membrane pour l'élevage in vitro d'arthropodes, en particulier d'insectes et d'arachnides, notamment des insectes dits piqueurs- suceurs, ainsi qu'un système pour cet élevage, intégrant une telle membrane.

La membrane selon l'invention trouve application dans tous les domaines dans lesquels il est nécessaire de former une barrière aux liquides tout en permettant le transfert de phases gazeuses, en particulier de molécules d'intérêt à l'état gazeux.

Un domaine d'application particulièrement préféré de cette membrane, qui sera plus particulièrement détaillé dans la présente description, bien que nullement limitatif, est celui de l'élevage in vitro d'arthropodes, notamment dits piqueurs-suceurs, entomophages ou parasitoïdes, en particulier en vue de l'utilisation d'insectes dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales.

A l'heure actuelle, le principal instrument de lutte contre les insectes ravageurs des cultures et les vecteurs de maladies humaines et animales est la mise en œuvre d'insecticides chimiques. Ces composés ont incontestablement participé à l'amélioration des rendements agricoles et au contrôle de plusieurs maladies vectorielles. Pour autant, leur utilisation massive et exclusive dans les champs est à l'origine de problèmes sanitaires et écologiques si préoccupants qu'ils ont conduit plusieurs pays à mener une politique de réduction des quantités d'insecticides utilisés. De même, l'emploi d'insecticide dans la lutte contre les maladies vectorielles montre des limites, en particulier à cause de l'apparition de résistances chez les insectes vecteurs. De telles maladies vectorielles, notamment le paludisme et la dengue, font plusieurs centaines de milliers de victimes chaque année, principalement en Afrique et en Inde. Les agents pathogènes responsables de ces maladies sont véhiculés et transmis à l'homme par des moustiques du genre Aedes, que des décennies de lutte chimique ont rendus résistants à la plupart des familles d'insecticides. Des alternatives aux insecticides ont ainsi été développées, reposant sur l'utilisation d'organismes prédateurs ou entomopathogènes, couramment appelés auxiliaires des cultures. L'utilisation de tels auxiliaires de culture dans les exploitations conduites en agriculture biologique offre plusieurs avantages. Ces auxiliaires de culture ont en effet une bonne capacité de dispersion, de découverte de l'hôte et d'établissement dans un nouvel habitat. De plus, ils sont d'une innocuité totale pour l'homme et ont une grande spécificité d'hôte, donc présentent peu de risques vis-à-vis des organismes non-cibles. Sur un plan sanitaire, des expérimentations ont montré que la lutte biologique à l'aide d'insectes parasitoïdes constituait également un moyen avantageux pour pallier l'apparition de résistances aux insecticides chez les insectes vecteurs de maladies.

L'utilisation des insectes parasitoïdes auxiliaires représente donc un potentiel considérable. Cependant, à l'heure actuelle, seules quelques dizaines d'espèces d'insectes parasitoïdes sont réellement utilisées à ces effets, car leur élevage s'avère difficile à réaliser. Dans la plupart des cas, les traitements sont en outre effectués par lâchers inondatifs consistant à disperser massivement (à raison de plusieurs centaines de milliers d'individus par hectare) et régulièrement des auxiliaires à l'état larvaire ou adulte dans la culture à protéger. Les lâchers inondatifs nécessitent par conséquent un grand nombre d'individus, faisant de l'élevage en masse de parasitoïdes un prérequis indispensable au développement de leur utilisation.

Des méthodes d'élevage en masse d'insectes parasitoïdes existent mais leur mise en œuvre implique des contraintes techniques ne permettant pas de les commercialiser à bas prix. En effet, ces méthodes de production prévoient l'élevage des insectes parasitoïdes en laboratoire sur leur hôte naturel ou sur un hôte de substitution. Or l'obtention et l'élevage des insectes hôtes présentent des difficultés techniques, qui exacerbent les coûts de production.

Pour pallier ces difficultés et diminuer les coûts de productions, il a été proposé par l'art antérieur d'élever des insectes parasitoïdes in vitro sur des hôtes synthétiques permettant l'oviposition et/ou le nourrissage des larves. De tels hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur consistent principalement en des capsules contenant un milieu nutritif dans une membrane de Parafilm ^® ou dans des gangues constituées par un mélange hydrophobe incluant divers matériaux tels que de la cire, du Paraplast ^® , de la vaseline, des alcènes ou du polyéthylène. On peut citer, à titre d'exemple, le système décrit dans le document de brevet WO 03/000047, qui se présente sous forme de billes biopolymères, notamment en chitosan, contenant une solution nutritive. Aucun de ces systèmes synthétiques reproduisant l'hôte naturel ne présente cependant de performance satisfaisante. En effet, aucun ne combine l'ensemble des caractéristiques nécessaires à la mise en place de conditions d'élevage optimales, c'est-à-dire ne permet à la fois : d'isoler de l'environnement extérieur, par une barrière étanche, le milieu nutritif adapté au nourrissage, de sorte à préserver son degré d'hydratation et sa stérilité ; d'autoriser le transfert à travers cette barrière de composés olfactifs, stimulateurs de l'oviposition pour la fondatrice et/ou appétants pour la larve, que doit contenir ce milieu, pour permettre que le système soit reconnu comme hôte potentiel ; d'autoriser la pénétration à travers cette barrière d'un appareil ovipositeur ou piqueur-suceur de faible puissance et de petite longueur, pouvant être aussi faible que 10 μιτι. Il a en particulier été constaté que des membranes présentant une épaisseur importante ne pouvaient être percées par les chélicères de certains arthropodes.

La présente invention vise à proposer une membrane étanche aux liquides et perméable aux gaz, qui permette en outre, mise en œuvre dans un système synthétique d'élevage des arthropodes, en particulier d'insectes ou d'arachnides, pour séparer un milieu nutritif de l'environnement extérieur dans lequel se trouve l'arthropodes, de remédier aux inconvénients des systèmes d'hôtes synthétiques proposés par l'art antérieur, notamment à ceux exposés ci-avant. En particulier, la présente invention vise à ce que cette membrane permette l'oviposition et/ou le nourrissage d'arthropodes, y compris pour les espèces dont l'appareil ovipositeur et/ou piqueur-suceur est de faible puissance et de petite longueur.

Un objectif supplémentaire de l'invention est que cette membrane présente un coût de production faible, en particulier de sorte à permettre que le coût de production d'un système synthétique pour l'élevage in vitro des arthropodes dans lequel elle est mise en œuvre, soit inférieur à celui d'un hôte naturel ou de substitution.

A cet effet, il est proposé selon la présente invention une membrane étanche aux liquides, en particulier aux solutions aqueuses, et perméable aux gaz, qui comporte un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μιτι imprégné, de préférence sensiblement entièrement, d'au moins un composé hydrophobe, cette imprégnation étant de préférence sensiblement continue, sur toute la surface du film de chitosan.

On entend dans la présente description, par le terme « imprégné », le fait que le film de chitosan a été soumis à imprégnation par le composé hydrophobe. L'imprégnation est ici définie de manière classique en elle-même, comme le fait de faire pénétrer dans une substance un produit qui s'y répand de manière diffuse. Ainsi, selon l'invention, le composé hydrophobe est réparti de manière sensiblement homogène et diffuse dans l'épaisseur du film de chitosan, sur toute la surface de ce dernier, conférant ainsi à ce film des propriétés d'hydrophobie et d'imperméabilité aux liquides. Le taux d'imprégnation du film polymère de chitosan par le ou les composés hydrophobes est de préférence compris entre 5 et 10 μο de composé(s) hydrophobe(s) / mm ³ de film.

Le chitosan, copolymère de N-acétylglucosamine et glucosamine, est un polysaccharide linéaire, dérivé désacétylé de la chitine, un biopolymère présent notamment dans les carapaces de crustacés tels que les crabes ou les crevettes. Ce biopolymère présente notamment les avantages d'être naturel, non-toxique, biodégradable et inoffensif pour l'environnement. Dans le contexte particulier de l'application préférentielle de la membrane selon l'invention pour l'élevage d'insectes, il présente en outre l'avantage d'une composition chimique proche de celle de composés entrant dans la constitution des cuticules des insectes. Le terme chitosan est utilisé dans la présente description aussi bien pour désigner le chitosan en lui-même, que ses dérivés tels que des esters, éthers, aminés, amides ou tous autres dérivés formés par interaction avec les groupements hydroxyle ou aminé du chitosan. Le chitosan mis en œuvre pour l'obtention du film polymère selon l'invention présente préférentiellement un degré de désacétylation élevé, notamment supérieur ou égal à 70 %.

Ce film polymère de chitosan, imprégné, sans greffage chimique, du composé hydrophobe, est avantageusement imperméable aux solutions aqueuses et perméable aux gaz, si bien qu'il est apte à permettre le transfert à son travers de molécules volatiles à l'état gazeux.

Sa faible épaisseur, inférieure à 1 μιτι, de préférence comprise entre 90 et 200 nm, de préférence encore comprise entre 90 et 130 nm, et préférentiellement sensiblement égale à 100 nm, associée aux propriétés mécaniques du film de chitosan, lui permet notamment de pouvoir être facilement transpercé par des chélicères peu puissants et de courte taille, aussi faible que 10 μιτι.

Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le film polymère de chitosan peut en outre être imprégné d'un ou plusieurs composés d'intérêt, par exemple stimulant l'oviposition et/ou appétants, tels que des alcanes, des acides gras, des produits du métabolisme des insectes, etc.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le composé hydrophobe est choisi parmi les polymères styréniques, en particulier le polystyrène, et les alcanes, de préférence les alcanes en C20 à C40. Préférentiellement, le film polymère de chitosan est imprégné d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de cire d'abeille, ou d'un mélange de paraffines tel que commercialisé sous le nom Paraplast®.

La membrane selon l'invention peut être conformée sous toute forme souhaitée, aussi bien plane que courbe. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le film polymère de chitosan est superposé sur une couche support en matériau absorbant apte à interdire sa rétraction, de préférence à base de fibres cellulosiques. Elle présente de préférence un maillage suffisamment lâche pour permettre la pénétration d'un appareil ovipositeur et/ou piqueur suceur d'un arthropode. Une telle couche support, qui peut par exemple être constituée par une feuille du papier commercialisé sous le nom Whatman®, permet notamment tout à fait avantageusement d'éviter une rétraction du film de chitosan sous l'effet d'une éventuelle déshydratation. La membrane ainsi obtenue est en outre facilement manipulable, et ce malgré la très faible épaisseur du film de chitosan.

La membrane selon l'invention peut avantageusement être fabriquée à bas coût, et elle présente une bonne stabilité dans le temps.

Un objet supplémentaire de l'invention est un procédé de fabrication d'une membrane présentant l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant. Une membrane selon l'invention est susceptible d'être obtenue par un procédé de fabrication comprenant les étapes de :

- formation d'un film polymère de chitosan à partir d'une solution aqueuse acide de chitosan contenant un agent tensioactif, ou un mélange d'agents tensioactifs, dans une concentration suffisante pour obtenir, après traitement en conditions basiques, entraînant la déprotonation des groupements aminés du chitosan et conférant ainsi à ce dernier un caractère insoluble dans la solution aqueuse, un film polymère de chitosan d'épaisseur inférieure à 1 μιτι,

- et imprégnation du film de chitosan ainsi obtenu par une solution, de préférence une solution liquide, contenant ledit/lesdits composé(s) hydrophobe(s).

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la solution aqueuse, par exemple une solution d'acide acétique, comprend une concentration comprise entre 2 et 30 mg/ml, de préférence sensiblement égale à 2,5 mg/ml, de chitosan. Elle présente de préférence une faible viscosité, préférentiellement inférieure à 200 mPa.s.

L'agent tensioactif, ou le mélange d'agents tensioactifs, est avantageusement mis en œuvre dans une concentration apte à permettre une diminution de la tension de surface de la solution aqueuse suffisante pour assurer que lorsque la solution est étalée sur une surface, et séchée pour former le film de chitosan, la quantité de chitosan déposée par unité de surface soit suffisamment faible pour que le film présente la très faible épaisseur conforme à l'invention. Il est du ressort de l'homme du métier de déterminer une telle concentration, de manière théorique ou expérimentale, en fonction de la concentration en chitosan dans la solution aqueuse acide et des caractéristiques particulières du ou des agent(s) tensioactif(s) mis en œuvre.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'agent tensioactif est de type non-ionique. Il peut notamment consister en un éthoxylate d'octylphénol, par exemple tel que commercialisé sous le nom Triton X-100®. Cet agent tensioactif abaisse la tension superficielle de l'eau de 33 dynes/cm à une concentration de 1 % à 25 °C. Un tel agent tensioactif est préférentiellement mis en œuvre dans une concentration comprise entre 50 et 100 ng/ml de solution, de préférence d'environ 60 ng/ml. Le choix d'un tel agent tensioactif particulier n'est cependant nullement limitatif de l'invention, et d'autres agents tensioactifs ou mélanges d'agents tensioactifs peuvent être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. Pour l'application préférentielle de la membrane pour l'élevage d'arthropodes, le ou les agent(s) tensioactif(s) sont avantageusement choisis pour ne présenter aucune toxicité, à l'état de traces, pour l'arthropode à élever. Le traitement en conditions basiques peut notamment être réalisé par une solution d'hydroxyde de sodium. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, la solution contenant le ou les composé(s) hydrophobes contient une concentration totale en lesdits composés comprise entre 1 et 10 mg/ml. L'imprégnation, qui constitue un traitement en masse du film de chitosan, peut notamment être réalisée par immersion du film de chitosan dans un bain de solution contenant le ou les composé(s) hydrophobe(s), pendant une durée de quelques minutes, par exemple d'environ 2 minutes, suffisamment longue pour assurer une répartition homogène du ou des composé(s) hydrophobe(s) qui se diffusent dans toute l'épaisseur du film de chitosan, sur toute la surface de ce dernier, et pour conférer au film de chitosan un caractère étanche aux liquides.

La mise en présence du film de chitosan avec cette solution est préférentiellement précédée d'une étape de déshydratation progressive de ce film, par exemple par trempage dans des bains successifs de solutions alcooliques, puis dans un bain d'un solvant organique apolaire, tel que l'hexane.

Dans des modes de mise en œuvre particulièrement avantageux de l'invention, le procédé de fabrication de la membrane comporte en outre des étapes ultérieures de :

- déploiement du film de chitosan imprégné par le/les composé(s) hydrophobe(s), par immersion dans une solution aqueuse ;

- dépôt du film ainsi déployé sur la couche support, cette étape étant réalisée en immersion dans la solution aqueuse,

- et séchage de la membrane ainsi obtenue.

Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'immersion du film dans la solution aqueuse est suivie par l'addition dans cette dernière d'un composé de densité inférieure à celle de l'eau, de préférence inférieure d'au moins 0,14. Une telle caractéristique a avantageusement pour effet d'accélérer le déploiement du film de chitosan imprégné du/des composé(s) hydrophobe(s). Un tel composé de plus basse densité que l'eau est de préférence choisi pour présenter une bonne miscibilité avec l'eau. Il peut par exemple s'agir d'un alcool, tel que l'éthanol, en solution aqueuse à 50 à 70 % (v/v). Lors de son addition dans la solution aqueuse, il se crée avantageusement, et de manière transitoire, une interface eau/alcool dans la solution, qui a pour effet d'amener très rapidement le film de chitosan à la surface de solution, dans un état totalement déployé, facilitant ainsi son dépôt sur la couche support.

Un tel procédé de préparation est avantageusement simple et rapide à réaliser, qui plus est de manière bien reproductible, et à faible coût.

Le séchage peut le cas échéant être suivi d'une étape de chauffage à une température comprise entre 70 et 75 °C, pendant une durée comprise entre 30 secondes et 20 minutes environ, puis, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, d'une étape de refroidissement à la température ambiante, avant son stockage à l'abri de la lumière.

La membrane conforme à l'invention présente un large champ d'applications.

Ainsi, un objet de la présente invention est l'utilisation d'une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, dans le domaine de la chimie séparative, pour l'extraction de molécules volatiles contenues dans un liquide. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, pour l'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, en vue notamment de produire une grande quantité d'insectes dits auxiliaires utilisables dans la lutte contre les insectes ravageurs de cultures et/ou vecteurs de maladies humaines et animales. Autrement, cet élevage peut par exemple être réalisé pour l'étude des interactions entre un parasite et son hôte, visant notamment à développer des moyens pour rendre le parasite inoffensif vis-à- vis de son hôte naturel.

On entend dans la présente description, par le terme élevage, aussi bien l'obtention de larves à partir d'une fondatrice, que le nourrissage de cette fondatrice et/ou des larves, jusqu'à les amener au stade de développement souhaité, notamment au stade adulte. Les individus ainsi élevés peuvent notamment être utilisés pour la réalisation de lâchers inondatifs sur des zones de culture et/ou dans lesquelles sont susceptibles de se développer des insectes vecteurs de maladies.

Selon l'invention, la membrane est alors interposée entre une chambre de contention de l'arthropode et un milieu nutritif pour cet arthropode, de sorte à assurer un confinement étanche du milieu nutritif. Elle joue ainsi un rôle de barrière hydrique et antimicrobienne préservant le degré d'hydratation et la stérilité du milieu nutritif. Elle permet toutefois avantageusement aux molécules volatiles contenues dans ce milieu nutritif, notamment aux molécules olfactives stimulantes de l'oviposition et/ou appétantes, de parvenir à l'arthropode contenu dans la chambre de contention. Enfin, les caractéristiques mécaniques et la grande finesse du film de chitosan permettent à tout arthropode contenu dans la chambre de contention de le transpercer pour accéder au milieu nutritif.

Le milieu nutritif peut avantageusement être complémenté par toute molécule d'intérêt, en vue d'étudier son action vis-à-vis de l'arthropode contenu dans la chambre de contention.

La présente invention concerne ainsi un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode, en particulier d'un insecte ou d'un arachnide, comportant une membrane répondant à l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-avant, interposée entre une chambre de contention de l'insecte et un milieu nutritif.

Le milieu nutritif est de préférence gélifié.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le film de chitosan est disposé du côté de la chambre de contention, c'est-à-dire en vis-à- vis de l'arthropode, de sorte à pouvoir être facilement transpercé par l'appareil ovipositeur ou piqueur-suceur de ce dernier. La couche support est alors quant à elle disposée en vis-à-vis du milieu nutritif, de préférence en contact direct avec ce dernier. Son caractère absorbant lui permet alors de s'imprégner, par effet de capillarité, du milieu liquide. Lorsque l'arthropode n'est pas capable de transpercer entièrement cette couche support, il peut alors avantageusement absorber les éléments nécessaires à son bon nourrissage directement depuis cette couche support.

Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la chambre de contention est enduite, sur une face interne d'une paroi périphérique qui la délimite, d'un revêtement à base d'au moins un composé hydrophobe, de préférence à base d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de Paraplast®. Ce revêtement participe avantageusement à recréer pour l'arthropode un environnement proche de son environnement naturel. Dans des modes de réalisation particuliers du système selon l'invention, le milieu nutritif contient en outre un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille.

La membrane et le système selon l'invention peuvent être mis en œuvre pour l'élevage d'une grande variété d'arthropodes, par exemple, mais non limitativement, de parasitoïdes de la famille des Trichogrammes ( Trichogramma brassicae, Trichogramma cacoeciae, Trichogramma evanescens, Trichogramma voegelei, Trichogramma chilonis,...), du genre des Toxorhynchites (Toxorhynchites rutilus, Toxorhynchites brevipalpis, Toxorhynchites amboinensis), des Psyttalia lounsburyi, Venturia canescens, Lariophagus distinguendus, Torymus sinensis, Psyttalia fletcheri, Fopus arisanus, ou encore de l'acarien ectoparasite Varroa destructor, principal parasite de l'abeille.

Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 7, dans lesquelles :

- la figure 1 représente une vue en section transversale d'un film polymère de chitosan entrant dans la constitution d'une membrane conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit film de chitosan étant imprégné de Paraplast®, observé par un microscope électronique à balayage (MEB), à un grossissement de 149 773 fois ; - la figure 2 montre le film de chitosan de la figure 1 en vue de dessus, côté couche de surface, observé au MEB à un grossissement de 159 022 fois ;

- la figure 3 représente de manière schématique, en coupe selon un plan longitudinal, un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode conforme à un mode de réalisation de l'invention ;

- la figure 4 montre une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor en cours de nourrissage à travers le film de la figure 1 superposé sur une feuille de papier Whatman®, observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;

- la figure 5 montre une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor prélevée après 48 heures d'incubation à 34 °C et 65 % d'humidité relative dans la chambre de contention d'un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans lequel le milieu nutritif a été additionné de bleu brillant FCF, cette femelle étant observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;

- la figure 6 montre l'intérieur d'une chambre de contention d'un système pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans lequel le milieu nutritif a été additionné de bleu brillant FCF, et dans lequel une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor a été incubée pendant 48 heures à 34 °C et 65 % d'humidité relative dans la chambre de contention, ladite chambre de contention étant observée à la loupe, avec un grossissement de 12 fois ;

- et la figure 7 est un graphe en barres illustrant le pourcentage de femelles adultes de l'espèce Varroa destructor ayant été nourries après

48 heures d'incubation, à 34 °C et 65 % d'humidité relative, dans des systèmes pour l'élevage in vitro d'un arthropode selon différents modes de réalisation particuliers de l'invention, plus particulièrement dans lesquels : A/Po, la chambre de contention n'est intérieurement enduite d'aucun revêtement et le film de chitosan est imprégné de polystyrène ; A/Po/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille ; C/C, la chambre de contention est intérieurement enduite d'un revêtement de cire d'abeille et le film de chitosan est imprégné de cire d'abeille ; C/C/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille ; Pa/Pa, la chambre de contention est intérieurement enduite d'un revêtement de Paraplast® et le film de chitosan est imprégné de Paraplast® ; Pa/Pa/H, le milieu nutritif est en outre additionné de 25 % (v/v) d'un extrait d'hémolymphe de larve d'abeille.

1 / Préparation de la membrane Un film de chitosan imprégné de composés hydrophobes, conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, est formé de la façon suivante.

Une solution aqueuse acide de chitosan comprend, en solution dans de l'eau ultra-pure :

- 2,5 mg/ml d'une solution de chitosan extrait de carapaces de crevettes dans l'acide acétique, de viscosité inférieure à 200 mPa.s

(20 °C) (Sigma Aldrich),

- 60 ng/ml de Triton X100 ^® (Sigma).

Après dégazage sous pression réduite, cette solution est coulée dans une boîte de Pétri de 10 cm de diamètre. L'excédent de solution est rejeté de sorte à ce qu'il ne subsiste dans la boîte que le liquide qui la mouille. La boîte est ensuite maintenue sous une hotte à flux laminaire, pendant 45 min, jusqu'à séchage complet.

Une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 1 M est ensuite versée sur le chitosan, puis le film ainsi formé est rincé 3 fois pendant 2 min avec un grand volume d'eau distillée et sous agitation rotative (100 tr/min) afin d'éliminer l'excédent de soude et de Triton X100 ^® .

Le film polymère de chitosan est ensuite déshydraté progressivement par une série de trempages de 2 min chacun dans des bains d'éthanol à 70 %, puis à 95 %, puis pur. Le film ainsi traité est transféré dans un bain d'hexane afin d'éliminer l'éthanol. Il est ensuite plongé soit dans un bain d'hexane contenant 10 g/l de cire d'abeille (APIREM) ou 10 g/l de Paraplast ^® (Sigma), soit dans un bain de chloroforme contenant 10 g/l de polystyrène. Le film de chitosan ainsi imprégné des composés hydrophobes entrant dans la constitution du Paraplast® est observé au microscope électronique à balayage, sous pression réduite, au moyen d'un microscope ESEM Quanta® 250 FEG (FEI), après revêtement par du platine au moyen d'un pulvérisateur d'ions JFC-1 100 (JEOL). Les images obtenues sont montrées sur les figures 1 et 2. Sur la figure 1 , en vue en section transversale obtenue par MEB, il est représenté par des traits blancs les zones dans lesquelles l'épaisseur du film a été mesurée. On observe que l'épaisseur du film est toujours comprise entre 105,9 nm (trait du bas sur la figure) et 109,6 nm (trait du haut sur la figure). Sur la figure 2, en vue de dessus, obtenue par MEB et également pour une imprégnation du film par du Paraplast®, on observe que le film est dépourvu de pores et présente à sa surface des structures cristallines caractéristiques de sels et d'alcanes.

Le film est ensuite transféré dans un bain d'eau distillée. Une solution d'éthanol à 70 % est versée sur le film afin de le déployer. Le film est alors déposé, toujours en immersion dans le bain, sur une couche support, par exemple formée par une feuille de papier Whatman ^® , qui est introduite dans le bain et remontée en direction du film. Le film ainsi superposé sur la couche support est séché sous hotte à flux laminaire et incubé à 70 °C pendant 15 min. La membrane ainsi obtenue est ensuite stérilisée, soit par immersion pendant 5 min dans de l'alcool à 70 %, soit par exposition pendant 15 min aux rayons UVC. Elle est ensuite stockée pendant environ 12 h à température ambiante et à l'obscurité, pour permettre l'évaporation des traces de solvants résiduelles. Elle est ensuite stockée à température ambiante, à l'abri de la lumière et au sec, jusqu'à utilisation. 21 Système d'élevage in vitro d'un arthropode piqueur-suceur Un exemple de système pour l'élevage in vitro d'un arthropode piqueur-suceur, conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, est illustré de façon schématique sur la figure 3.

Ce système comporte une chambre de contention 10 destinée à recevoir un arthropode 1 1 .

Cette chambre peut être formée en tout matériau compatible avec une utilisation pour l'élevage d'insectes, par exemple en polystyrène.

Elle est de préférence délimitée par une paroi périphérique 101 , de section par exemple circulaire, et ouverte à ses extrémités longitudinales opposées. Cette chambre de contention 10 peut notamment être formée par des sections de 5 millimètres de long environ et de 2,5 mm de diamètre interne, coupées dans une pipette de 1 ml en polystyrène pour culture cellulaire. Ces sections sont préalablement poncées à leurs extrémités longitudinales, pour obtenir des extrémités planes et dépolies. Sur la face interne 102 de la paroi périphérique 101 , la chambre de contention peut être enduite d'un revêtement à base d'au moins un composé hydrophobe, de préférence à base d'un mélange d'alcanes en C20 à C40, par exemple de cire d'abeille (APIREM) ou de Paraplast ^® (Sigma). Pour cela, la paroi 101 est immergée dans un bain chauffé à environ 72 °C et contenant la cire d'abeille ou le Paraplast®, ou tout autre composé hydrophobe souhaité.

Après retrait du bain, elle est placée sur du papier absorbant et chauffée à environ 72 °C pendant 5 minutes afin de permettre l'écoulement de l'excès de cire d'abeille, Paraplast® ou autre composé(s) mis en œuvre pour la formation du revêtement. A une première extrémité longitudinale, la chambre de contention 10 est fermée par une membrane 12 conforme à un mode de réalisation particulier de l'invention, notamment telle que décrite ci-avant. Pour une meilleure lisibilité de la figure, la membrane 12, de même que la paroi périphérique 101 de la chambre de contention, y ont été représentées avec une certaine épaisseur, qui ne reflète nullement leurs dimensions réelles. La membrane 12 est disposée par rapport à la paroi périphérique 101 de telle sorte que le film de chitosan imprégné des composés hydrophobes soit disposé vers l'intérieur de la chambre de contention 10, alors que la feuille de papier formant la couche support du film est disposée à l'opposé de la chambre. La fixation de la membrane 12 à l'extrémité de la chambre de contention 10 peut être réalisée par collage, par exemple par de la cire d'abeille ou du Paraplast®. De manière générale, ces matériaux participent avantageusement à ce que la chambre de contention 1 0 reproduise pour l'arthropode, en particulier de l'espèce Varroa destructor, acarien parasite de l'abeille, des conditions très proches de son environnement naturel.

La chambre de contention 10, fermée à une extrémité par la membrane 12, est de préférence stérilisée, par exemple par immersion dans un bain d'une solution d'alcool, et séchée sous hotte à flux laminaire préalablement à sa mise en œuvre. Après introduction d'un arthropode 1 1 , par exemple de l'espèce Varroa destructor, dans la chambre de contention 10, en prenant garde de ne pas contaminer la surface extérieure de cette dernière, la chambre est fermée à une deuxième extrémité longitudinale par tout moyen adéquat compatible avec l'élevage de l'arthropode, notamment apte à permettre les échanges gazeux entre le volume interne de la chambre de contention et l'environnement extérieur et à interdire toute fuite de l'arthropode. A titre d'exemple, il est utilisé pour la fermeture de la chambre de contention 10 un disque 13 de papier Whatman ^® , par exemple de 3 mm de diamètre. La fixation de ce disque de papier 13 à la paroi périphérique 101 peut être réalisée par collage, par tout moyen classique en lui-même, par exemple par un disque 14 de diamètre adéquat, par exemple d'environ 4 mm, d'adhésif tel que l'adhésif Scotch® crystal, percé en son centre par un trou d'environ 2 mm de diamètre. Pour des raisons de clarté, ce disque d'adhésif 14 a été représenté sur la figure 3 légèrement décollé de la paroi périphérique 101 et du disque de papier 13. Dans la réalité il est bien entendu plaqué contre ces derniers. Un milieu nutritif 15 adapté au nourrissage de l'arthropode, de préférence gélosé, est placé dans un réceptacle 16. La chambre de contention 10, fermée à ses deux extrémités longitudinales opposées comme décrit ci- avant, et contenant un arthropode à élever 1 1 , est déposée sur ce milieu nutritif 15, de telle sorte que la couche support soit en contact avec le milieu, si bien qu'elle absorbe le liquide qui y est contenu par effet de capillarité.

3/ Expérience 1 - Nourrissage d'une femelle Varroa destructor adulte

Une femelle adulte de l'espèce Varroa destructor est obtenue à partir d'un élevage sur des colonies d'abeilles Apis mellifera, dans des conditions classiques en elles-mêmes. Cette femelle présente un appareil piqueur-suceur d'environ 10 μιτι de long et de faible puissance.

Cette femelle est placée dans un système tel que décrit ci-avant en référence à la figure 3.

Le milieu nutritif est formé de la façon suivante. On utilise du milieu de culture développé par Hunter (Hunter, W.B.,

2010. In Vitro Cellular and Developmental Biology Animal, 46, 83-6) pour cultiver des cellules d'abeilles. Ce milieu contient 30 % de milieu de Schneider, 30 % de CMRL 1066, 0,06 M d'histidine, 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de sels de Hank et 4 % d'insect médium supplément. Ce milieu est supplémenté par 25 % (v/v) d'extrait d'hémolymphe de larve d'abeille au stade L5, obtenu par filtration centrifuge sur membrane d'une porosité de 3000 Da, la centrifugation étant réalisée pendant 15 min à 12 000 g, et récupération du filtrat. Enfin, le milieu est incubé à 45 °C et additionné de 20 % d'une solution d'agarose à 20 g/l, contenant 0,8 % (v/v) de bleu brillant FCF, préchauffée à 45 °C.

80 μΙ de ce milieu gélosé sont placés dans un réceptacle 16, par exemple dans un puits d'une plaque à 96 puits, classique en elle-même. Une chambre de contention 10, dans laquelle le film entrant dans la constitution de la membrane est imprégné à base de Paraplast®, et contenant l'arthropode, est déposée sur le milieu nutritif gélosé.

L'ensemble est incubé à 34 °C et 60 % d'humidité relative, dans l'obscurité, incliné à 60 degrés par rapport à l'horizontale.

On observe qu'il ne se produit aucun transfert de liquide du milieu nutritif vers la chambre de contention, à travers la membrane. Ceci s'avère d'autant plus avantageux que les individus de l'espèce Varroa destructor présentent un tropisme négatif vis-à-vis des surfaces humides, et se noient en quelques minutes en présence d'un environnement humide.

A l'observation à la loupe, on observe que la femelle se nourrit en piquant à travers le film de chitosan, comme montré sur la figure 4. On voit parfaitement sur cette figure que ses pédipalpes sont en position physiologique, perpendiculaire à l'axe de l'appareil piqueur-suceur. Ceci démontre notamment que la membrane conforme l'invention permet le transfert des odeurs stimulant le nourrissage en provenance du milieu nutritif. Après perçage du film de chitosan, la femelle se nourrit pendant 1 à 5 minutes, ce qui est conforme à un nourrissage normal.

Après 48 heures d'incubation, la chambre de contention est ouverte. On observe que sa partie supérieure est recouverte de nombreuses fèces provenant de l'acarien, dont la plupart sont colorées au bleu brillant FCF, initialement contenu dans le milieu nutritif, comme montré sur la figure 6. Sur cette figure, les parties colorées au bleu brillant FCF, visibles en sombre, sont mises en évidence par une flèche blanche. Une image obtenue par observation à la loupe de l'insecte lui-même, montrée sur la figure 5, met également en évidence la coloration par le bleu brillant FCF (en sombre sur la figure, comme indiqué par la flèche blanche) du tube digestif de l'insecte. Ces résultats démontrent que du milieu nutritif a bien été absorbé par l'arthropode placé dans le système d'élevage in vitro conforme à l'invention. 4/ Expérience 2 - Effets de l'imprégnation du film de chitosan par des composés hydrophobes, du revêtement interne de la chambre de contention et de la composition du milieu nutritif

Cette expérience est menée sur plusieurs femelles de l'espèce Varroa destructor, selon les conditions décrites ci-avant dans l'Expérience 1 , mais en utilisant des systèmes d'élevage conformes à différents modes de réalisation particuliers de l'invention. Plus particulièrement, les différentes conditions indiquées dans le Tableau 1 ci-après sont appliquées.

Tableau 1 - Conditions d'élevage mises en œuvre - EH représente l'extrait d'hémolymphe de larve d'abeille décrit ci-avant

Pour chaque individu, l'occurrence du nourrissage est évaluée après 48 h d'incubation dans le système selon l'invention, à 34 °C et 65 % d'humidité relative, par observation à la loupe d'une part du système digestif de l'insecte, d'autre part des fèces contenues dans la chambre de contention, en vue d'y détecter la présence ou l'absence de coloration au bleu brillant FCF, comme détaillé dans l'Expérience 1 ci-avant.

Les résultats obtenus, en termes de pourcentage d'individus nourris, par rapport aux individus testés pour chaque condition, sont montrés sur la figure 7. Une étude statistique est en outre réalisée, et les différences entre les groupes d'individus testés, constitués en utilisant la procédure G-test, sont évaluées en utilisant le test du Khi-carré avec correction de Yates.

Les résultats sont montrés dans le tableau 2 ci-après.

Tableau 2 - Résultats des analyses statistiques - G-test et test du Khi carré avec correction de Yates

Ces résultats montrent une hétérogénéité importante entre les 6 différentes conditions expérimentales (Chi2 = 60,39, 5df, p<0,001 ). En suivant la procédure G-test, 3 groupes sont distingués à p=0,05 : {A/Po}; {C/C, Pa/Pa}; {Pa/Pa/H, A/Po/H, C/C/H}. On observe qu'en présence de milieu de culture seul, le pourcentage d'acariens nourris est largement plus faible qu'en présence dans le milieu nutritif d'extrait d'hémolymphe d'abeille. De même, la présence d'un revêtement interne à base d'alcanes dans la chambre de contention augmente de manière significative le pourcentage d'individus nourris. Ces résultats montrent notamment que des substances stimulantes, ici l'extrait d'hémolymphe d'abeille, peuvent être incluses dans le système d'élevage selon l'invention. Ce système présente ainsi une performance élevée en terme de nourrissage des arthropodes. En particulier, la membrane selon l'invention reproduit efficacement l'interface parasite/hôte, y compris pour l'élevage d'arthropodes parasites très exigeants en termes de spécificité d'hôte et de résistance de la membrane, que sont les individus de l'espèce Varroa destructor. La description ci-avant illustre clairement que par ses différentes caractéristiques et leurs avantages, la présente invention atteint les objectifs qu'elle s'était fixés. En particulier, elle fournit une membrane imperméable aux liquides et perméable aux gaz, facile et rapide à fabriquer et à bas coût, et qui est notamment tout à fait adaptée pour une mise en œuvre dans un système artificiel d'élevage in vitro d'arthropodes piqueurs-suceurs, en séparation de l'arthropode et de son milieu nutritif.