本发明涉及 Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物， 其制备 方法、含它们的药物组合物、其修饰前体及其 在治疗 II型糖尿病等疾 病中的用途。 背景技术

Exendin-4 是一种从南美产毒蜥 (Gila monster; Heloderma suspectum)的唾液分泌物中分离和鉴定出的天然� �物。 其序列为 His^Gly-Glu-Gly-Thr^Phe-Thr-Ser-Asp-Leu^-Ser-Lys-Gln-Met-Glu ¹⁵ -Glu-Glu-Ala-Val-Arg ²⁰ -Leu-Phe-Ile-Glu-Trp ²⁵ -Leu-Lys-Asn-Gly-Gl y ³⁰ -Pro-Ser-Ser-Gly-Ala ³⁵ -Pro-Pro-Pro-Ser ³⁹ -NH ₂ 的 三十九肽， Exendin-4是胰高血糖素样肽 -l(glucagon-like peptide-1 , GLP-1)的类 似物。 是 GLP-1受体激动剂， 能激活 GLP-1受体， 具有控制甘油酯、 促进胰岛素分泌、 降低循环胰高血糖素、 提高胰 P-细胞质量、 抑制胃 的排空、减少营养的摄入、增加胰岛素敏感性 等生物活性。 Exendin-4 可模拟体内自然分泌的激素， 从而帮助人体调节血糖水平， 而且在患 者不需要的时候， 就会停止该作用。 Exendin-4 的另一特点是可以恢 复制造胰岛素的 P细胞的第 1时相分泌。 第 1时相分泌指的是由摄取 食物而引发的胰^/素分泌， 而对于 II-型糖尿病患者而言，在患病初期 就已经丧失了该反应能力。 Exendin-4 不但能够降低血糖， 而且还能 加强正在丧失功能的细胞机能，对 II-型糖尿病治疗而言是一项重大进 步。

Exendin-4于 2005年 4月获美国 FDA批准， 用于改善使用二曱 双胍和磺酰脲类药物不理想的 II型糖尿病患者的血糖控制。临床结果 显示， Exendin-4用于糖尿病治疗效果明显， 且副反应较小， 但是每 天两次的皮下给药给病人带来很多不便。

Exendin-4 的效能及其内在独特的血糖依赖性作用机制使 其更适 宜制成緩释制剂， Amylin公司于 2000年 5月又和 Alkennes公司签约 合作开发品緩释型注射剂 Exendin-4 LAR,目前已完成 II期临床试验， 结果显示， 15 周后该药物的两种剂量水平都能很好耐受， 并且

Exendin-4的血药浓度均达到了预期的治疗范围 。同时由于 Exendin-4 在 II-糖尿病治疗机理方面具有明显优势，开发其 长效类似物也是很多 国外制药公司研发热点之一。

研究表明， 多肽类药物经聚乙二醇 (PEG)修饰后仍能保持好的生 物活性， 并能显著延长生物体内的半衰期。 目前， 已有对 Exendin-4 进行 PEG修饰的研究报道， 分别得到的三个位点 His ¹ Lys ¹² 、 Lys ²⁷ 的氨基 PEG修饰产物， 在大鼠的代谢研究中发现， 代谢半衰期远长于 Exendin-4(Jin Zhou 等, Eur. J Pharma. Biopharm., 2009, 72:

412-417)。 此外， 还报道了对 Exendin-4中 Lys ¹² 和 Lys ²⁷ 的 ε-氨基进行脂 肪酸或石胆酸或透明质酸修饰，分别得到单修 饰和双修饰的修饰物 (Su Young Chae等， J Control. Release, 2010, 144(1): 10-16; J Control. Release, 2010, 142: 206-213； Biomaterials, 2010, 31: 4121-4128)。

然而，本领域技术人员理解，不论是用 PEG对 Exendin-4进行修饰， 还是用脂肪酸、石胆酸或透明质酸对 Exendin-4进行修饰， 均存在修饰 位点专一性较差的问题， 从而可能造成产物呈不同单位点修饰物共存 的混合物形式， 或者可能造成产物呈不同多位点修饰物共存的 混合物 形式， 这对于后续的制药应用是不利的。

因此， 仍然期望提供一种可以对 Exendin-4定位修饰并仍然保持 Exendin-4生物学活性的方法以及 Exendin-4修饰物例如 PEG修饰物， 以克服目前对 Exendin-4进行修饰例如 PEG化修饰时专一性差的问题。 发明内容

本发明要解决的问题是以克服目前对 Exendin-4 进行修饰例如 PEG化修饰时专一性差的缺点，提供一种可以对 Exendin-4定位修饰 并仍然保持 Exendin-4生物学活性的方法以及 Exendin-4修饰物例如 PEG修饰物。 本发明人令人惊奇地发现， 对 Exendin-4肽链中的个别 氨基酸替换为其它氨基酸， 得到 Exendin-4类似物， 这些类似物在进 行 PEG的化学修饰时具有优良的反应专一性。 而且， 本发明人发现， 本发明 Exendin-4类似物经 PEG修饰后， 其 PEG修饰产物可具有 GLP-1受体激动活性。 本发明基于上述发现而得以完成。 发明概迷

本发明第一方面提供了具有以下式 (I)所示的 Exendin-4类似物的

PEG-M-X-(Ex-4) (I)

或其可药用盐， 其中各符号如本文所述。

本发明第二方面提供了以下式 (II)所示的 Exendin-4类似物：

[Aa ^p ] Exendin-4 (II)

其中各符号如本文所述。

本发明第三方面提供制备本发明第一方面所述 聚乙二醇修饰物 的方法。

本发明第四方面提供了制备本发明第二方面所 述 Exendin-4类似 物的方法。

本发明第五方面提供本发明第一方面任一项所 述聚乙二醇修饰 物在制备药物中的用途。

本发明第六方面提供一种组合物，其包括预防 和 /或治疗有效量的 本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物以及任选 的药学可接受的载体。

本发明第七方面提供本发明第二方面所述 Exendin-4类似物在制 备本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物中的用 途。

本发明第八方面提供了在有需要的受试者中激 活 GLP-1 受体的 方法以及治疗相关疾病或症状的方法。

本发明第九方面提供作为 GLP-1 受体激动剂等或者疾病或症状 的预防和 /或治疗剂的本发明第一方面所述聚乙二醇修� �物。

本发明第十方面提供了用于在有需要的受试者 中激活 GLP-1 受 体的组合物， 或者用于预防和 /或治疗与 GLP-1 受体活性低下相关的 疾病和 /或症状的组合物， 其包含本发明第一方面所述聚乙二醇修饰 物。

发明详迷

本发明第一方面提供了具有以下式 (I)所示的 Exendin-4类似物的 聚乙二醇修饰物：

PEG-M-X-(Ex-4) (I)

或其可药用盐， 其中，

PEG 表示 RO(CH ₂ CH ₂ 0) _n -CH ₂ CH ₂ -， 其中 R为 H或 CH ₃ , n 为 25-2500的整数;

。

M 表示 , 各自的氮或疏 原子一侧与 PEG部分连接，另一侧与 X部分的巯基连接； X-(Ex-4) 表示具有如下结构的 Exendin-4 类 ^ 物： His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Aa ₂₁ -Aa ₂ 2-Aa23-Glu-Trp-L eu-Aa ₂ 7-Asn-Gly-Gly-Aa ₃₁ -Ser-Ser-Gly-Ala-Aa ₃₆ -Aa ₃₇ -Aa _{3 8} -Ser- NH ₂ , 其中

Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂₃ 、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 各白独 立地是选自下列的氨基酸： Cys、 Thp、 Ala, Arg、 Asn、 Asp, Gln、 Glu、 Gly、 His, Ile、 Leu、 Lys、 Met, Phe、 Pro, Ser、 Thr、 Trp、 Tyr、 Val, 并且 Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂ 3、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 中有一个为 Cys或 Thp;

X表示在 X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类似物中， 位于 21、 22、 23、 27、 31、 36、 8位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯基

)的氨基酸， 该氨基酸的巯基与 M基团连 另外地， 或者根据上述第一方面进一步地， 本发明第

具有以下式 (I)所示的 Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物

PEG-M-X-(Ex-4) (I)

或其可药用盐， 其中，

PEG 表示分子量为 1,000至 100,000的聚乙二醇；

一

S一 CH -CH

M 表示 O 或一 NH V , 各自的氮或破 原子一侧与 PEG部分连接，另一侧与 X部分的巯基连接；

X-(Ex-4) 表 示 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu ²¹ -Phe ²² -Ile ²³ -Glu-Trp- Leu-Lys ²⁷ -Asn-Gly-Gly-Pro ³¹ -Ser-Ser-Gly-Ala-Pro ³⁶ -Pro ³⁷ -Pro ³⁸ -Ser-NH ₂ 中第 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37或 38 基酸中的任一个被半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸 (Thp， )取代的三十九肽；

X 表示在 Χ-(Εχ-4)所示的三十九肽中，位于 21、 22、 23、 27、

31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯

HS

基脯氨酸 (Thp， )的氨基酸，该氨基酸的巯基与 M基 团连接。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 PEG表示 RO(CH ₂ CH ₂ 0) _n -CH ₂ CH ₂ -，其中 R为 H或 CH ₃ ， n为 50-2000 的整数。 在一个实施方案中， 所述 R是 H。 在一个实施方案中， 所述 R是 CH ₃ 。 在一个实施方案中， 所述 n为 50-1500的整数。 在一个实 施方案中， 所述 n为 50-1000的整数。 在一个实施方案中， 所述 n为 75-1500的整数。在一个实施方案中， 所述 n为 75-1000的整数。在一 个实施方案中， 所述 n为 75-500的整数。 在一个实施方案中， 所述 n 为 100-500的整数。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 PEG表示分子量为 1,000至 100,000的聚乙二醇。在一个实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 2,000至 80,000的聚乙二醇。 在一个实施方 案中， 所述 PEG表示分子量为 3,000至 60,000的聚乙二醇。 在一个 实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 4,000至 60,000的聚乙二醇。 在一个实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 5,000至 60,000的聚乙 二醇。 在一个实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 3,000至 50,000 的聚乙二醇。 在一个实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 4,000至 40,000的聚乙二醇。在一个实施方案中，所述 PEG表示分子量为 4,000 至 30,000的聚乙二醇。 在一个实施方案中， 所述 PEG表示分子量为 5,000至 20,000的聚乙二醇。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 M

(在本发明中， 该基团部分可以以 MAL 表示）、

~ S一 CH2~ CH2

0 或一 NH' , 各自的氮或破原子一侧与 PEG部分连接:

另一侧与 X部分的巯基连接。 例如， 三者分别形成 Peg- X-(Ex-4)

， 各式中 Peg表示本文所定

〇

义的聚乙二醇。 在一个实施方案中， 所述的 M表示 根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 Χ-(Εχ-4) 表 示 具 有 如 下 结 构 的 Exendin-4 类 乂 物 ： His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu- Gl u-Glu-Ala-Val-Arg-Aa ₂₁ -Aa ₂ 2-Aa23-Glu-Trp-Leu-Aa27-Asn-Gly-Gly-A a ₃₁ -Ser-Ser-Gly-Ala-Aa36-Aa ₃₇ -Aa38-Ser- NH ₂ > 其中 Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂₃ 、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 各自独立地是选自下列的氨基酸： Cys、 Thp、 Leu^ Phe、 Ile、 Lys Pro, 并且 Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂ 3、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 中有一个为 Cys或 Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₂₁ 选自 Cys、 Thp、 Leu, 所述 Aa ₂₂ 可选自 Cys、 Thp、 Phe, 所 述 Aa ₂₃ 可选自 Cys、 Thp、 He, 所述 Aa ₂₇ 可选自 Cys、 Thp、 Lys, 所 述 Aa ₃₁ 可选自 Cys、 Thp、 Pro, 所述 Aa ₃₆ 可选自 Cys、 Thp、 Pro, 所述 Aa ₃₇ 可选自 Cys、 Thp、 Pro, 所述 Aa ₃₈ 可选自 Cys、 Thp、 Pro; 前提条件是, Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂₃ 、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 中 有一个为 Cys或 Thp。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 X 表示在 X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类似物中， 位于 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸的 氨基酸， 该氨基酸的巯基与 M基团连接。 在一个实施方案中， 所述 X 表示在 X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类似物中， 位于 21、 22、 23、 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸的氨基 酸。 在一个实施方案中， 所述 X表示在 X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类 似物中， 位于 21、 22、 23、 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为 半胱氨酸的氨基酸。 在一个实施方案中， 所述 X表示在 X-(Ex-4)所示 的 Exendin-4类似物中， 位于 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且

、 根 ί本发明第一^面任一项所述的聚乙二醇修饰物 ， 其中所述 Χ-(Εχ-4) 表 示

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G lu-Gl u-Glu-Ala-Val-Arg-Leu ²¹ -Phe ²² -Ile ²³ -Glu-Trp-Leu-Lys ²⁷ -Asn-Gly-Gly -Pro ³¹ -Ser-Ser-Gly-Ala-Pro ³⁶ -Pro ³⁷ -Pro ³⁸ -Ser-NH ₂ 中第 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37或 38 酸中的任一个被半胱氨酸 (即， Cys)或 4- 巯基脯氨酸 (即， Thp 在一个实施方案中， 所述 Aa ₂₁ 选自 Cys、 Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₂₂ 选自 Cys、 Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₂₃ 选自 Cys、 Thp。 在一个实施方 案中， 所述 Aa ₂₇ 选自 Cys、 Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₃₁ 选自 Cys, Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₃₆ 选自 Cys、 Thp。 在一个实 施方案中， 所述 Aa ₃₇ 选自 Cys、 Thp。 在一个实施方案中， 所述 Aa ₃₈ 选自 Cys、 Thp。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其中所述 X 表示在 X-(Ex-4)所示的三十九肽中， 位于 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸的氨基酸， 该氨基酸的巯基与 M基团连接。 在一个实施方案中， 所述 X表示在 X-(Ex-4)所示的三十九肽中， 位于 21、 22、 23、 31、 36、 37或 38位 的任一个位点并且为半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸的氨基酸。 在一个实施 方案中，所述 X表示在 X-(Ex-4)所示的三十九肽中，位于 21、 22、 23、 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为半胱氨酸的氨基酸。 在一个 实施方案中，所述 X表示在 X-(Ex-4)所示的三十九肽中，位于 31、 36、 37或 38位的任一个位点并且为 4-巯基脯氨酸的氨基酸。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其是 Exendin-4 类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐 。 根据本发 明第一方面任一项所述的聚乙二醇修饰物， 其是 Exendin-4类似物的 定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐， 并且其中所述的聚乙二醇修饰 为单聚乙二醇修饰。

根据本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇修 饰物， 其选自：

[Cys ²¹ (mPEG ₅₀₀ o-MAL)] Exendin-4,

[Cys ²² (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Cys ²³ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Cys ³¹ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Cys ³⁶ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Cys ³⁷ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Cys ³⁸ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Thp ³¹ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4,

[Thp ³⁶ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4,

[Thp ³⁷ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4,

[Thp ³⁸ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4, 和

[Cys ³¹ (mPEG ₂₀ 麵 -MAL)】 Exendin-4，

或其药学可接受的盐。

以上各式所示化合物中， 例如对于 [Cys ²¹ (mPEG ₅ 麵 -MAL)】 Exendin-4所示化合物， 其中 Cys ²¹ 表示 Exendin-4的第 21位氨基酸 Leu替换为 Cys,使该三十九肽为 21位氨基酸为 Cys的 Exendin-4类 似物； 其中 mPEG ₅ 麵表示末端为曱基 (以 m表示)的分子量约为 5000

的聚乙二醇； MAL 表示 。 即， [Cys (mPEG ₅ 麵 -MAL)】

Exendin-4表示这样的化合物： 21位氨基酸被 Cys取代的 Exendin-4 类似物通过 MAL与分子量为约 5000的聚乙二醇连接的 Exendin-4类 似物的聚乙二醇修饰物， 其中 MAL的氮原子一侧与 PEG部分连接， 另一侧与 Cys的巯基连接。 其它化合物亦有类似含义。

本发明第二方面提供了以下式 (II)所示的 Exendin-4类似物：

[Aa ^p ] Exendin-4 (II)

其中，

Exendin-4 表 示 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln- Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu ²¹ -Phe ²² -Ile ²³ -Glu-Trp- Leu-Lys ²⁷ -Asn-Gly-Gly-Pro ³¹ -Ser-Ser-Gly-Ala-Pro ³⁶ -Pro ³⁷ -Pro ³⁸ -Ser-NH ₂ 的三十九肽；

Aa ^p 表示取代 Exendin-4所示三十九肽 p位的氨基酸， 其选自 半胱氨酸 (即， Cys)或 4-巯基脯氨酸 (即， Thp、 ; p 表示 Exendin-4所示三十九肽的 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37或 38位。

根据本发明第二方面任一项所述的 Exendin-4类似物， 其中： Aa ^p 表示取代 Exendin-4所示三十九肽 p位的半胱氨酸； p 表示 Exendin-4所示三十九肽的 21、 22、 23、 31、 36、 37 或 38位。

根据本发明第二方面任一项所述的 Exendin-4类似物， 其中： Aa ^p 表示取代 Exendin-4所示三十九肽 p位的 4-巯基脯氨酸； p 表示 Exendin-4所示三十九肽的 31、 36、 37或 38位。 才艮据本发明第二方面任一项所述的 Exendin-4类似物， 其选自： [Cys ] Exendin-4,

[Cys ²² ] Exendin-4,

[Cys ²³ ] Exendin-4,

[Cys ³¹ ] Exendin-4,

[Cys ³⁶ ] Exendin-4,

[Cys ³⁷ ] Exendin-4,

[Cys ³⁸ ] Exendin-4,

[Thp ³¹ ] Exendin-4,

[Thp ³⁶ ] Exendin-4,

[Thp ³⁷ ] Exendin-4, 和

[Thp ³⁸ ] Exendin-4。

以上各式所示化合物中，例如对于 [Cys ²¹ 】 Exendin-4所示化合物， 其中 Cys ²¹ 表示 Exendin-4的第 21位氨基酸 Leu替换为 Cys, 使该 Exendin-4所示三十九肽成为 21位氨基酸为 Cys的 Exendin-4类似物。 即， [Cys ²¹ ] Exendin-4表示这样的化合物： 21位氨基酸被 Cys取代的 Exendin-4 ₀ 其它化合物亦有类似含义。

本发明第三方面提供制备本发明第一方面任一 项所述聚乙二醇 修饰物的方法， 其包括使发明第二方面任一项所述 Exendin-4类似物 与 PEG-M反应的步骤。 在一个实施方案中， 所述反应是在磷酸盐緩 沖液中进行的。 在一个实施方案中， 所述反应是在 10-40 Ό (例如 15-35 , 例如约室温)下进行的。在一个实施方案中， 所述 PEG-M是

在本发明第三方面任一项所述方法的一个实施 方案中， 所述 Exendin-4类似物是按以下步骤制备的： （1)以 Rink-酰胺树脂为固相 载体， 以 HBTU-HOBt为缩合剂， 根据待获得的 Exendin-4类似物的 氨基酸序列， 以 Fmoc保护的相应氨基酸为原料， 按标准的 Fmoc固 相多肽合成方法合成肽树脂；（2)然后以三氟� ��酸：苯曱硫醚： 间曱酚： 乙二疏醇： 水的混合物（例如此五者的体积比为 8.25:0.5:0.5:0.25:0.5) 为裂解液,在 0-40。C下使肽脱除保护基并从树脂上裂解 (例如在约 0。C 下反应约 30分钟， 然后在室温下反应 90分钟)； 和 (3)任选的纯化步 骤。

为此， 本发明第四方面提供了制备本发明第二方面任 一项所述

Exendin-4类似物的方法， 其包括以下步骤： （1)以 Rink-酰胺树脂为 固相载体， 以 HBTU-HOBt为缩合剂， 根据待获得的 Exendin-4类似 物的氨基酸序列，以 Fmoc保护的相应氨基酸为原料，按标准的 Fmoc 固相多肽合成方法合成肽树脂； （2)然后以三氟乙酸： 苯曱硫醚： 间曱 酚： 乙二硫醇： 水的混合物（例如此五者的体积比为 8.25:0.5:0.5:0.25:0.5)为裂解液，在 0-40°C下使肽脱除保护基并从树脂 上裂解 (例如在约 0°C下反应约 30分钟，然后在室温下反应 90分钟)； 和 (3)任选的纯化步骤。

本发明第五方面提供本发明第一方面任一项所 述聚乙二醇修饰 物在制备作为 GLP-1受体激动剂的药物中的用途。

本发明第五方面还提供本发明第一方面任一项 所述聚乙二醇修 饰物在制备用于预防和 /或治疗与 GLP-1受体活性低下相关的疾病和 / 或症状的药物中的用途。 在一个实施方案中， 本发明聚乙二醇修饰物 可以用于控制甘油酯、 促进胰岛素分泌、 降低循环胰高血糖素、 提高 胰 P-细胞质量、抑制胃的排空、减少营养的摄入� ��增加胰岛素敏感性， 以预防和 /或治疗与 GLP-1受体活性低下相关的疾病和 /或症状。

本发明第五方面还提供本发明第一方面任一项 所述聚乙二醇修 饰物在制备用于预防和 /或治疗与糖代谢相关的疾病和 /或症状的药物 中的用途。在一个实施方案中， 所述与糖代谢相关的疾病和 /或症状选 自 II型糖尿病、 肥胖和 /或肥胖症、 p细胞功能低下等糖代谢疾病。

本发明第五方面还提供本发明第一方面任一项 所述聚乙二醇修 饰物在制备用于控制 II型糖尿病患者体内血糖的药物中的用途。

本发明第六方面提供一种组合物，其包括预防 和 /或治疗有效量的 本发明第一方面任一项所述聚乙二醇修饰物以 及任选的药学可接受 的载体。

本发明第七方面提供本发明第二方面任一项所 述 Exendin-4类似 物在制备本发明第一方面任一项所述聚乙二醇 修饰物中的用途。

本发明第八方面提供了在有需要的受试者中激 活 GLP-1 受体的 方法，其包括给所述受试者施用预防和 /或治疗有效量的本发明第一方 面任一项所述聚乙二醇修饰物。 本发明第八方面还提供了在有需要的受试者中 预防和 /或治疗与

GLP-1受体活性低下相关的疾病和 /或症状的方法，其包括给所述受试 者施用预防和 /或治疗有效量的本发明第一方面任一项所述� �乙二醇 修饰物。 在一个实施方案中， 本发明提供了在有需要的受试者中控制 甘油酯、促进胰岛素分泌、降低循环胰高血糖 素、提高胰 P-细胞质量、 抑制胃的排空、 减少营养的摄入、 和 /或增加胰岛素敏感性的方法， 其 包括给所述受试者施用预防和 /或治疗有效量的本发明第一方面任一 项所述聚乙二醇修饰物。本发明方法可以用于 预防和 /或治疗与 GLP-1 受体活性低下相关的疾病和 /或症状。

本发明第八方面还提供了在有需要的受试者中 预防和 /或治疗与 糖代谢相关的疾病和 /或症状的方法，其包括给所述受试者施用预� �和 /或治疗有效量的本发明第一方面任一项所述� �乙二醇修饰物。在一个 实施方案中， 所述与糖代谢相关的疾病和 /或症状选自 II型糖尿病、 肥胖和 /或肥胖症、 p细胞功能低下等糖代谢疾病。

本发明第八方面还提供了在有需要的受试者中 控制血糖的方法， 其包括给所述受试者施用预防和 /或治疗有效量的本发明第一方面任 一项所述聚乙二醇修饰物。在一个实施方案中 ， 所述受试者罹患 II型 糖尿病。

本发明第九方面提供作为 GLP-1 受体激动剂的本发明第一方面 任一项所述聚乙二醇修饰物。

本发明第九方面还提供了用于预防和 /或治疗与 GLP-1受体活性 低下相关的疾病和 /或症状的本发明第一方面任一项所述聚乙二� �修 饰物。 在一个实施方案中， 本发明提供了用于控制甘油酯、 促进胰岛 素分泌、 降低循环胰高血糖素、 提高胰 P-细胞质量、 抑制胃的排空、 减少营养的摄入、和 /或增加胰岛素敏感性的本发明第一方面任一� �所 述聚乙二醇修饰物。

本发明第九方面还提供用于预防和 /或治疗与糖代谢相关的疾病 和 /或症状的本发明第一方面任一项所述聚乙二� �修饰物。在一个实施 方案中， 所述与糖代谢相关的疾病和 /或症状选自 II型糖尿病、 肥胖 和 /或肥胖症、 p细胞功能低下等糖代谢疾病。

本发明第九方面还提供用于控制 II型糖尿病患者体内血糖的本 发明第一方面任一项所述聚乙二醇修饰物。 本发明第十方面提供了用于在有需要的受试者 中激活 GLP-1 受 体的组合物， 其包含本发明第一方面任一项所述聚乙二醇修 饰物。

本发明第十方面还提供了用于预防和 /或治疗与 GLP-1受体活性 低下相关的疾病和 /或症状的组合物，其包含本发明第一方面任� �项所 述聚乙二醇修饰物。 在一个实施方案中， 本发明提供了用于控制甘油 酯、 促进胰岛素分泌、 降低循环胰高血糖素、 提高胰 P-细胞质量、 抑 制胃的排空、 减少营养的摄入、 和 /或增加胰岛素敏感性的组合物， 其 包含本发明第一方面任一项所述聚乙二醇修饰 物。

本发明第十方面还提供了用于在有需要的受试 者中预防和 /或治 疗与糖代谢相关的疾病和 /或症状的组合物，其包含本发明第一方面任 一项所述聚乙二醇修饰物。 在一个实施方案中， 所述与糖代谢相关的 疾病和 /或症状选自 II型糖尿病、 肥胖和 /或肥胖症、 p细胞功能低下 等糖代谢疾病。

本发明第十方面还提供了用于在有需要的受试 者中控制血糖的 组合物， 其包含本发明第一方面任一项所述聚乙二醇修 饰物。 在一个 实施方案中， 所述受试者罹患 II型糖尿病。

本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有 的特征同样适用 于其它任一方面或该其它任一方面的任一项， 只要它们不会相互矛 盾， 当然在相互之间适用时， 必要的话可对相应特征作适当修饰。 在 本发明中， 例如， 提及"本发明第一方面任一项"时， 该"任一项 "是指 本发明第一方面的任一子方面； 在其它方面以类似方式提及时， 亦具 有相同含义。

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描 述。

本发明所引述的所有文献， 它们的全部内容通过引用并入本文， 并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一 致时， 以本发明的表述 为准。 此外， 本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术 人员公知 的一般含义， 即便如此， 本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更 详尽的说明和解释， 提及的术语和短语如有与公知含义不一致的， 以 本发明所表述的含义为准。

本文中使用的术语"约"， 例如在修饰制备产物的产率时， 其通常 是指本领域允许的误差范围， 例如 ±10%， 例如 ±5%, 例如 ±2%。

如本文所述的，术语"有效量 "是指可在受试者中实现治疗、预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病或病症的剂量。

如本文所述的， 术语"药物组合物"， 是指可用于在受试者中实现 治疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病、 病症、 症状的物质。

如本文所述的， 术语"受试者，，或 "患者，，， 可以指接受本发明组合 物和提取物以治疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病、 病症、 症 状的动物， 特别是哺乳动物， 例如人、 狗、 猴、 牛、 马等。

如本文所述的， 术语"疾病或症状"是指所述受试者的一种身体� �� 态， 该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。

如本文所述的， "％", 如未特别指明， 对于总物料是固体时一般 是指重量 /重量的百分比， 对于总物料是液体时一般是指重量 /体积的 百分比。 当然， 对于总物料是液体并且溶盾是液体时， 表征该液态溶 质的百分比一般是指体积 /体积的百分比。

如 本 文 所 述 的 ， 术 语 "Exendin-4" 是 指 序 列 为 His^Gly-Glu-Gly-Thr^Phe-Thr-Ser-Asp-Leu^-Ser-Lys-Gln-Met-Glu ¹⁵ -Glu-Glu-Ala-Val-Arg ²⁰ -Leu-Phe-Ile-Glu-Trp ²⁵ -Leu-Lys-Asn-Gly-Gl y ³⁰ -Pro-Ser-Ser-Gly-Ala ³⁵ -Pro-Pro-Pro-Ser ³⁹ -NH ₂ 的三十九肽。 术语 "Exendin-4类似物，，是指上述 Exendin-4三十九肽中任一个或多个 (优 选其中的一个)位于任意位置 (优选位于 21、 22、 23、 27、 31、 36、 37 或 38位)氨基酸被其它氨基酸 (优选半胱氨酸或 4-巯基脯氨酸)取代的 三十九肽。

如本文所述的， 术语" PEG"是指聚乙二醇， 其规格可以以聚合度 表示 (例如在本文中， PEG可以表示为 RO(CH ₂ CH ₂ 0) _n -CH ₂ CH ₂ -， 其 中的 n为 25-2500的整数)， 亦可以以分子量表示 (例如在本文中 PEG 可以表示分子量为 1,000至 100,000的聚乙二醇）。 上述二种不同表述 形式是本领域技术人员公知的， 并且相互之间不会矛盾。

如未特殊说明， 本发明所述氨基酸均为 L-型氨基酸。

如本文所述的， 术语"与 GLP-1受体相关的疾病和 /或症状 "是指 与通过激动 GLP-1受体达到预防和 /或治疗相关疾病， 主要是指 II型 糖尿病、 肥胖和 /或肥胖症、 p细胞功能低下等糖代谢疾病。

本发明的目的在于提供一类 PEG修饰的 exendin-4类似物，有助 于开发长效的 II 型糖尿病的治疗药物及制剂。 本发明人发现， 在 Exendin-4中引入含有特异性反应功能基的氨基酸 残基，使 Exendin-4 与 PEG反应的反应专一性增加， 从而为获得精确的单一 PEG定位修 饰物提供了可能， 进而利用 PEG可延长肽类药物作用时间、 提高生 物利用度等特性， 为改善 Exendin-4在体内的行为提供了可能。

本发明的目的之一是提供 Ex-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物， 该修饰产物的结构为在 Ex-4 的氨基酸序列中改变某些氨基酸残基使 侧链只保留一个氨基、 羧基或巯基， 并在这些氨基、 羧基或巯基上完 成定位的聚乙二醇修饰。 本发明的 Ex-4类似物的聚乙二醇修饰物详 见本文所述的式 (I)结构及其定义。

本发明的另一目的是提供 Ex-4类似物的聚乙二醇化修饰物的制 备方法。

本发明还涉及到含有至少一种上述聚乙二醇化 Ex-4类似物或其 立体异构体或盐和可药用载体或赋形剂的药物 组合物。

本发明还涉及本发明化合物在制备用于治疗和 预防糖尿病的药 物中的用途。

本发明还涉及本发明化合物在治疗和预防糖尿 病及相关糖代谢 疾病或症状的用途。

在本发明的一个方面， 提供了 Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰 物， 其具有式 (I)结构：

PEG-M-X-(Ex-4) (I)

其中，

PEG为 RO(CH ₂ CH ₂ 0) _n -CH ₂ CH ₂ -， R=H或 CH ₃ , n=25-2500;

或 O 或

X-(Ex-4) 为 具 有 如 下 结 构 的 Exendin-4 类 ^ 物 ： His^Gly-Glu-Gly-Thr^Phe-Thr-Ser-Asp-Leu^-Ser-Lys-Gln-Met-Glu ¹⁵ -Glu-Glu-Ala-Val-Arg ²⁰ -Aa ₂₁ -Aa22-Aa23-Glu-Trp ²⁵ -Leu-Aa27-Asn-Gl y-Gly ³⁰ -Aa ₃₁ -Ser-Ser-Gly-Ala ³⁵ -Aa ₃₆ -Aa ₃₇ -Aa ₃₈ -Ser ³⁹ - NH ₂ ,其中： Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂ 3、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 各自独立地可选自 Cys， Thp, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val的氨基酸， 前提条件是 Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂₃ 、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 中只有一个为 Cys 或 Thp;

X表示在 X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类似物中的氨基酸， 为半胱 氨酸或 4-巯基脯氨酸 (Thp, 可位于 Εχ-4的 21、 22、 23、 27、

31、 36、 37、 38位的任一个位点， 通过巯基与 Μ基团连接。

如未特殊说明， 所述氨基酸均为 L-型氨基酸。

才艮据本发明 Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物的一个优选实 施 方式， 式 (I)中的 X-(Ex-4)部分具有如下的结构特征：

Aa ₂₁ 可选自 Cys, Thp, Leu;

Aa ₂₂ 可选自 Cys, Thp, Phe;

Aa ₂₃ 可选自 Cys, Thp, He;

Aa ₂₇ 可选自 Cys, Thp, Lys;

Aa ₃₁ 可选自 Cys, Thp, Pro;

Aa ₃₆ 为选自 Cys, Thp, Pro;

Aa ₃₇ 为选自 Cys, Thp, Pro;

Aa ₃₈ 为选自 Cys, Thp, Pro;

前提条件是, Aa ₂₁ 、 Aa ₂₂ 、 Aa ₂₃ 、 Aa ₂₇ 、 Aa ₃₁ 、 Aa ₃₆ 、 Aa ₃₇ 和 Aa ₃₈ 中只有一个为 Cys或 Thp。

如未特殊说明， 所述氨基酸均为 L-型氨基酸。

根据本发明 Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物， 其优选下列 12 个 Exendin-4类似物聚乙二醇化修饰物：

1 [Cys ²¹ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

2 [Cys ²² (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

3 [Cys ²³ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

4 [Cys ³¹ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

5 [Cys ³⁶ (mPEG ₅₀₀ o-MAL)] Exendin-4

6 [Cys ³⁷ (mPEG ₅₀₀ o-MAL)] Exendin-4 7 [Cys (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

8 [Thp ³¹ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

9 [Thp ³⁶ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

10 [Thp ³⁷ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

11 [Thp ³⁸ (mPEG誦 -MAL)】 Exendin-4

12 [Cys ³¹ (mPEG -MAL)】 Exendin-4 本发明化合物的制备釆用常规的多肽合成方法 ， 包括固相多肽合 成方法、 液相多肽合成法以及固相-液相多肽合成方法� � 氨基酸采用 Fmoc-/tBu-或 Boc-/Bzl-保护策略， 连接方式采用从 N-末端向 C-末端 顺序连接， 或先合成片段， 再将片段连接的方式， 固相合成采用各种 可形成酰胺末端的树脂为载体 (如 MBHA PAL, Rink酰胺树脂等）， 以各种常用缩合剂进行缩合反应（如 DCC/HOBT BOP/DIEA HBTU/HOBt, TBTU等）， 反应完后以三氟醋酸或无水 HF将肽从树 脂上切割下来。 肽与 PEG修饰剂的连接在水溶液或磷酸緩沖盐溶液 中进行， 适当控制反应溶液的 pH值， 以 RP-HPLC对修饰产物进行 监测， 并分离纯化， 最终产物测定 MALDI-TOF-MS

根据本发明，部分优选化合物在细胞水平对 GLP-1受体有激动作 用。

本发明还涉及含有作为活性成分的有效剂量的 至少一种多肽修 饰物和 /或其立体异构体或其无生理毒性盐以及常规� �物赋形剂或辅 剂的药物组合物。 这里 "常规药物赋形剂或辅剂 "包括任一种或所有溶 剂， 分散介质， 包衣， 抗菌剂或抗真菌剂， 等渗及緩释试剂， 以及类 似的生理配伍制剂， 以适合静脉注射， 肌肉注射， 皮下注射， 或其它 非消化道给药方式为佳。 才艮据给药的方式， 可将活性化合物包衣以保 护化合物免受酸或其它自然条件的影响而失活 。

本发明所用术语"无生理毒性的盐"是指可保留� ��体化合物预期 生理活性而不会产生任何意料之外毒副作用的 盐， 或者含它们的组合 物， 例如： 盐酸盐， 氢溴酸盐， 硫酸盐， 磷酸盐， 硝酸盐， 以及醋酸 盐， 草酸盐， 酒石酸盐， 琥珀酸盐， 苹果酸盐， 苯曱酸盐， 双羟萘酸 盐， 海藻酸盐， 曱磺酸盐， 萘磺酸盐等。 根据盐中含有的阳离子又可 为： 钾盐， 锂盐， 锌盐， 铜盐， 钡盐， 铋盐， 钙盐等无机盐， 还可为 诸如三烷基铵盐等有机盐。

本发明中多肽修饰物及其立体异构体或含有它 的药物组合物可 以以已知的任何方式给药， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔给药等， 给药 剂型例如片剂、 胶嚢、 口含片、 咀嚼片、 酏剂、 混悬剂、 透皮剂、 微 嚢包埋剂、 埋植剂、 糖浆剂等。 可以是普通制剂、 緩释制剂、 控释制 剂及各种微粒给药系统。 为了将单位给药剂型制成片剂， 可以广泛使 用本领域公知的各种生物可降解的或生物相容 载体。 关于载体的例 子， 如盐水基及各种緩沖水溶液、 乙醇或其它多元醇、 脂质体、 聚乳 酸、 乙酸乙烯酯、 聚酐、 聚羟乙酸、 胶原、 聚原酸酯等。

本发明中多肽修饰物的给药剂量取决于许多因 素， 例如所要预防 或治疗疾病的性质和严重程度， 患者或动物的性别、 年龄、 体重， 敏 感性及个体反应， 所用的具体化合物， 给药途径， 给药次数以及所希 望达到的治疗效果等。 上述剂量可以单一剂量形式或分成几个， 例如 二、 三、 四个剂量形式给药。 本领域技术人员参考 Exendin-4的已知 剂量， 结合常规试验方法的研究结果， 无需要花费示示示示示示示示示示示创造性劳 动即可确 定本发明 PEG修饰物的具体用量。 精谷甘脯羟天錄亮苏曱色

本发明中使用的一些缩写词具有下面的含义： 疏氛冬氛氛膽氛氛氛氛氛

氨氨酸酰酸酸酸酸酸酸

Ex-4 表示 Exendin-4

PEG表示 聚乙二醇

Aa 表示 氨基酸

Ala 表示 丙氨酸 Arg

Asn 表示 天冬酰胺 Asp

Cys 表示 半胱氨酸 Gin

Glu 表示 谷氨酸 Gly

His 表示 组氨酸 Hyp

He 表示 异亮氨酸 Leu

Lys 表示 赖氨酸 Met

Phe 表示 苯丙氨酸 Pro

Ser 表示 丝氨酸 Thr

Thp 表示 巯基脯氨酸 Trp

Tyr 表示 酪氨酸 Val Fmoc 表示 芴曱氧羰基

DMF表示 二曱基曱酰胺

DCC表示 二环己基碳二亚胺

HOBt 表示 1-羟基苯并三唑

TFA 表示 三氟乙酸

EDT表示 巯基乙醇

HBTU 表示 2-(1Η-1-羟基苯并三唑 )-1，1，3，3-四曱基脲六氟磷 酸盐

RP-HPLC 表示 反相高效液相色谱

其它未标示的缩写具有本领域公知的含义。 具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的 描述， 然而， 本发 明的范围并不限于下述实施例。 本领域的专业人员能够理解， 在不背 离本发明的精神和范围的前提下， 可以对本发明进行各种变化和修 饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验 方法进行一般性和 /或具 体的描述。 虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操 作方法是本 领域公知的， 但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

实施例所用固相合成栽体 Rink-酰胺树脂为天津南开合成责任有 限公司产品； HOBT、 HBTU, DIEA以及 Fmoc-保护的天然氨基酸 由上海吉尔生化公司提供；式 (I)中" PEG-M"部分表示的聚乙二醇修饰 物 (例如实施例中所用的 mPEG ₅ 。。。-MAL)为凯正生物技术有限责任公 司产品。 实施例 1 iCvs ² VmPEG5000-MAL)lExendin-4f化合物 1)的合成 歩骤 1： 固相法合成 iC vs ²¹ l Exendin-4

以 670mg Rink-酰胺树脂（0.25mmol)为 固相载体， 以 Fmoc-Ala-OH , Fmoc-Arg(pbf)-OH ， Fmoc-Asn(Trt)-OH ， Fmoc-Asp(OtBu)-OH , Fmoc-Cys(Trt)-OH , Fmoc-Gln(Trt)-OH , Fmoc-Glu(OtBu)-OH , Fmoc-Gly-OH , Fmoc-His(Trt)-OH , Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH为原料， HBTU-HOBt为缩合剂， 根据化合物 1的氨 基酸序列， 按标准的 Fmoc 固相多肽合成方法合成肽树脂。 以 25ml 三氟乙酸： 苯曱硫醚： 间曱酚： 乙二硫醇： 水 (8.25: 0.5: 0.5: 0.25: 0.5, 体积比)作裂解液， 0 C反应 30分钟， 室温 90反应分钟， 将肽脱 除保护基并从树脂上裂解下来。粗肽溶于 20%醋酸水溶液中， 水冻干 燥， 得白色干粉 719m _g 。 粗肽经 RP-HPLC纯化， 生物质谱测定分子 量为 4176， 保留时间为 10.365min HPLC条件， A相： 0.05%TFA/ 水； B 相 ： 0.05%TFA/70%ACN/水； 色 谱柱 ： 菲 罗 门 (phenomenex)jupiler 5u C4 300A 4.6x250mm; 梯度： 0-17分钟 B% 35-85, 17-21分钟 B%85-35, 25分钟结束； 流速： lmL/min;柱温： 25° (：。

步骤 2: 多肽与 PEG修饰物的反应

将经 RP-HPLC纯化后的 [Cys ²¹ 】Exendin-4溶于磷酸盐緩冲液中， 加入适量的 mPEG ₅ -MAL, 室温反应， 用 RP-HPLC监测反应进程 和分离产物。 经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9135, 相邻两峰分子 量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 12.925min 实施例 2 iCvs ²² (mPEG; -MAL)lExendin-4f化合物 2、的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ²² 】Exendin-4分子量为 4142, 保留时间为 10.86min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9146, 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 10.438min 实施例 3 iCvs ²³ (mPEG; -MAL)lExendin-4f化合物 3、的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ²³ ]Exendin-4分子量为 4176， 保留时间为 10.875min PEG 修饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9180, 相邻两峰分子量 相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.52min 实施例 4 『Cvs (mPEG; -MAL)lExendin-4(化合物 4)的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ³¹ 】Exendin-4分子量为 4192, 保留时间为 11.15min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9150, 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.72min 实施例 5 iCvs ³⁶ (mPEGwMAL)lExendin-4f化合物 5)的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ³⁶ 】Exendin-4分子量为 4192， 保留时间为 11.21min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9151 , 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.88min 实施例 6 『Cvs ³⁷ (mPEG; -MAL)lExendin-4i化合物 6)的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ³⁷ 】Exendin-4分子量为 4192, 保留时间为 10.92min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9150, 相邻两峰分子量相 差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.82min 实施例 7 iCvs ³⁸ (mPEG; -MAL)lExendin-4f化合物 7)的合成

合成方法参考实施例 1

[Cys ³⁸ 】Exendin-4分子量为 4192， 保留时间为 11.24min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9153, 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.90min 实施例 8 iThD ³¹ ( _m PEGw-MAL)lExendin-4(化合物 8、的合成

Thp保护氨基酸原料为 Fmoc-Thp(Trt)-OH, 合成方法参考实施 例 1

[Thp ³¹ 】Exendin-4分子量为 4218,保留时间为 11.02min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9221， 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.45min 实施例 9 iThD ³⁶ (mPEG; -MAL)lExendin-4f化合物 9)的合成

合成方法同实施例 8

[Thp ³⁶ 】Exendin-4分子量为 4218,保留时间为 10.95min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9222, 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.62min 实施例 10『ThD ³⁷ (mPEG; -MAL)lExendin-4 (化合物 10、的合成

合成方法同实施例 8

[Thp ³⁷ 】Exendin-4分子量为 4218,保留时间为 10.82min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9222, 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.43min 实施例 11『ThD ³⁸ (mPEG; -MAL)lExendin-4f化合物 11、的合成

合成方法同实施例 8

[Thp ³⁸ 】Exendin-4分子量为 4218,保留时间为 10.91min PEG修 饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 9221， 相邻两峰分子量相 差约 44 , 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC 保留时间 11.74mhi 实施例 12 iCvs ³¹ (mPEG n-MAL)lExendin-4f化合物 12)的合成

合成方法参考实施例 1, [Cys ³¹ ]Exendin-4肽类似物使用以下所述 然谱条件进行分析。

[Cys ³¹ ]Exendin-4肽类似物分子量为 4192,保留时间为 8.838min PEG修饰产物为经 MALDI-TOF-MS分析， Mn = 25682,相邻两峰分 子量相差约 44， 具有聚乙二醇的典型结构特征， RP-HPLC保留时间 9.70min HPLC条件， A相： 0.05%TFA/水； B相： 0.05%TFA/70%ACN/ 水； 色谱柱：安捷伦 (Agilent)zorbax 5u C18 300A 4.6x150mm;梯度： 0-15 分钟 B% 35-85 15-17 分钟 B%85-35 20 分钟结束； 流速： lmL/min; 柱温： 25°C。

根据以上合成和分析结果可见， 本发明获得了单一 PEG修饰的 Exendin-4类似物， 由于所述 Exendin-4类似物肽链中活性巯基的高 反应性， 使得 PEG可以定位连接于该 Exendin-4类似物上。 实验例 1: GLP-1受体激动活性评价

GLP-1受体是一个 Gs偶联的 GPCR。 在用于评价的 HEK293人 胚肾上皮细胞株中， 兼有 CRE-荧光素酶报告系统的稳定表达。 因此， 一旦受体被激活， 通过 Gs信号通路提高细胞内第二信使 cAMP的浓 度， 就会启动前述报告系统中荧光素酶基因的表达 。 通过检测荧光素 酶报告基因的表达多少，来反映待测化合物对 于 GLP-1受体刺激活化 的程度。

参照文献方法（殷菲 等， 中国药学杂志， 2007 , 42(1): 24)对 Exendin-4类似物 PEG修饰物在细胞水平测定 GLP-1受体激动活性， Exendin-4的 EC ₅₀ 为 1.93 nM。 结果见表 1。

表 1. Exendin-4类似物 PEG修饰物的 GLP-1受体激动活性结果

从表 1可以看出，本发明 Exendin-4类似物 PEG修饰物均具有有 效的 GLP-1激动活性。