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Patent Searching and Data


Title:
LYME DISEASE VACCINES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/022470
Kind Code:
A2
Abstract:
The present invention relates to Lyme disease vaccines, in particular to vaccines including one or more isolated polypeptides of Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii or Borrelia garinii.

Inventors:
JAULHAC BENOÎT (FR)
BOULANGER NATHALIE (FR)
SABATIER LAURENCE (FR)
SCHNELL GILLES (FR)
Application Number:
PCT/FR2014/052085
Publication Date:
February 19, 2015
Filing Date:
August 12, 2014
Export Citation:
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Assignee:
UNIV STRASBOURG (FR)
CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
NOVAGRAAF TECHNOLOGIES (FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1 . Composition vaccinale comprenant :

au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss choisi parmi SEQ ID NO: SEQ ID NO: 10, 13, 2, 8, 9, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85.

2. Composition vaccinale selon la revendication 1 , dans laquelle l'au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss est choisi parmi SEQ ID NO: 10.

3. Composition vaccinale selon la revendication 1 ou 2, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1 , au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 7, 1 1 , 12, 14 à 18, 20 à 24, 26 à 28, 30 à 32, 34, 36 à 42, 44, 46 à 84 et 86 à 92.

4. Composition selon l'un quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en plus de l'au moins un polypeptide de la revendication 1 , au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),

ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,

ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86,

ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92,

à condition que si ladite au moins un polypeptide de la revendication 1 est :

- est SEQ ID NO: 19 et 25, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c2) ou (c3), ou

- est SEQ ID NO: 29, 33, 35, 43, 45 ou 85, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c1 ) ou (c3), ou

- est SEQ ID NO: 2, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou - est SEQ ID NO: 10 ou 13 ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3).

5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

6. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant un adjuvant.

7. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant au moins un autre principe actif.

8. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour utilisation comme médicament.

9. Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme.

Description:
VACCINS CONTRE LA MALADIE DE LYME

Domaine technique

La présente invention se rapporte à des vaccins contre la maladie de Lyme, en particulier des vaccins comprenant un ou plusieurs polypeptides isolés de Borrelia bu rgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.

La présente invention trouve des applications dans les domaines vétérinaire et médical. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin des exemples.

Etat de la technique

La borréliose de Lyme, également appelée maladie de Lyme, est une maladie à transmission vectorielle transmise par une tique dure du genre Ixodes. Elle sévit principalement dans l'hémisphère Nord où elle constitue la maladie à transmission vectorielle la plus fréquente. Des données récentes laissent également entrevoir que son aire de répartition s'étend également dans l'hémisphère sud avec des cas humains en Australie (Mayne et al., 201 1 [1]) et des tiques infectées avec Borrelia identifiées en Amérique du Sud (Barbieri et al., 2013 [2]).

La bactérie responsable de la borréliose est un spirochète appartenant au groupe Borrelia burgdorferi sensu lato avec environ 20 espèces identifiées.

La borréliose de Lyme se développe habituellement dans la faune sauvage chez une large gamme d'hôtes vertébrés et se manifeste accidentellement chez l'homme d'abord par une inflammation cutanée, l'érythème migrant, puis par des manifestations cliniques très variées : articulaires, cardiaques, neurologiques et cutanées (Radolf et al., 2012

[3] ; Stanek et al., 2012 [4]). La peau constitue donc une interface essentielle dans la transmission lors de la piqûre de tique et le développement de la maladie. Les symptômes cliniques de la borréliose observés chez le chien sont très proches de ceux observés chez l'Homme, mais plus spécifiquement elle induit chez le chien une glomérulonéphrite (Little et al., 2010 [5]).

Bien que des traitements antibiotiques soient efficaces à un stade précoce de l'infection, de nombreux patients développent une borréliose en raison d'une absence ou d'une non-observation d'érythème migrant, ou en raison d'un traitement inapproprié ou trop tardif. Une approche vaccinale apparaît être plus prometteuse pour prévenir ou traiter la maladie de Lyme, notamment chez l'animal chez qui le stade précoce cutané ne peut être observé en raison du pelage.

Il existe actuellement plusieurs vaccins sur le marché pour prévenir la borréliose canine. Aux Etats-Unis, ils ne sont dirigés que contre une seule espèce, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Par ailleurs, basé sur le concept du « transmission blocking vaccine », un vaccin a été commercialisé aux Etats-Unis pour l'Homme, le LYMErix (marque de commerce), mais sa commercialisation a été arrêtée en 2002 suite à des effets secondaires chez certains patients (Hanson and Edelman, 2003 [6]). Utilisant un antigène recombinant, OspA (Outer surface protein A), deux vaccins sont actuellement utilisés chez le chien aux Etats-Unis (Nobivac (marque déposée) commercialisé par Intervet et Recombitek (marque déposée) commercialisé par Merial et ont montré une certaine efficacité mais seulement contre l'espèce B. burgdorferi ss (Lafleur et al., 2009 [7]). En effet, la population de Borrelia transmise par les tiques est en Europe très hétérogène, et les vaccins actuellement sur le marché ne sont pas efficaces contre les autres espèces virulentes de Borrelia qui sont majoritaires en Europe. Un troisième vaccin est commercialisé utilisant un lysat bactérien de B. burgdorferi ss (Fort Dodge). En Europe, seules deux compagnies (Merial et Bioveta) commercialisent un vaccin également basé sur des lysats de Borrelia, B. burgdorferi ss pour Merial et B. afzelii et B. garinii pour Bioveta. Pour ces différents vaccins, en général trois injections sont nécessaires pour obtenir une protection suffisante, généralement contrôlée par la mesure des anticorps par ELISA (Topfer et Straubinger, 2007 [8]). Toutefois, l'utilisation de lysat bactérien comme base vaccinale n'est pas satisfaisante pour une production en masse.

Ainsi, les vaccins existants utilisent soit des lysats bactériens dont la production de masse est difficilement réalisable, soit la protéine recombinante OspA, peu immunogène et peu exprimée au début de l'infection chez l'homme, soit OspC dont la preuve de concept sur un plan vaccinal n'est pas avérée.

II existe donc de réels besoins de mettre au point de nouveaux vaccins palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier des vaccins qui soient fortement immunogènes et efficaces sur diverses populations de Borrelia, et qui puissent être produits en masse à faible coût.

Exposé de l'invention

La présente invention répond précisément aux besoins précités de l'art antérieur, en fournissant des compositions vaccinales pour la prévention de la maladie de Lyme.

A cet effet, les inventeurs ont développé une approche protéomique afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme. Cette approche a été réalisée sur la base de trois espèces de Borrelia que les inventeurs ont déterminé comme étant les plus impliquées en pathologie humaine et animale, en particulier chez le chien, à savoir Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et

Borrelia garinii.

Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences décrites ci-après. Notamment, on décrit les séquences SEQ ID NO: 1 à 92 présentées dans le tableau 1 ci-dessous, dans lequel figurent les numéros des séquences du listage de séquences annexé, les noms des polypeptides correspondants et les noms des loci correspondants dans le génome de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii.

En d'autres termes, le Tableau 1 décrit les polypeptides isolés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 92 susceptibles d'être utilisés dans la composition vaccinale de l'invention.

Tableau 1 : Séquences des polypeptides utilisables dans une composition vaccinale selon l'invention

Dans la présente invention, sauf indication contraire « Borrelia burgdorferi » signifie « Borrelia burgdorferi ss » ou « Borrelia burgdorferi sensu stricto», en opposition à l'indication « Borrelia burgdorferi sensu lato » qui couvre environ 20 espèces différentes.

En outre, sauf indication contraire, les lettres déterminant les séquences des polypeptides décrites dans la présente correspondent à l'abréviation à une lettre proposée par Leder (Leder et al. Introduction to molecular medicine, Ed Scientific American, 1994 [9]).

Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 1 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO: 10 à 92, de préférence, 10 à 18, de préférence, 10 à 15.

Tout polypeptide de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, ou toute combinaison d'au moins deux des polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, peut être utilisé(e) dans la composition vaccinale selon l'invention.

Par exemple, la combinaison de polypeptides peut comprendre 2 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 voire plus de 9 polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92. Une combinaison des polypeptides différents de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 peut en effet permettre d'augmenter l'effet thérapeutique et/ou prophylactique de la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre une combinaison de deux polypeptides comme présentée dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Combinaison de polypeptide dans la composition vaccinale selon l'invention

Polypeptide

de Combinaison possible avec les poiypeptides de séquence SEQ NO: séquence suivants

SEQ ID NO:

Au moins une parmi : 2 à 92,

1

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 et 3 à 92,

2

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 , 2 et 4 à 92,

3

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 3 et 5 à 92,

4

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 4 et 6 à 92,

5

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 5 et 7 à 92,

6

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 6 et 8 à 92,

7

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 7 et 9 à 92,

8

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 8 et 10 à 92,

9

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18, 47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 9 et 1 1 à 92,

10

de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18

Au moins une parmi : 1 à 10 et 12 à 92,

1 1

de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18

Au moins une parmi : 1 à 1 1 et 13 à 92,

12

de préférence au moins l'une parmi : 13 à 18

Au moins une parmi : 1 à 12 et 14 à 92,

13

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18

Au moins une parmi : 1 à 13 et 15 à 92,

14

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18

Au moins une parmi : 1 à 14 et 16 à 92,

15

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 12 et 16 à 18

Au moins une parmi : 1 à 15 et 17 à 92,

16

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15

Au moins une parmi : 1 à 16 et 18 à 92,

17

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15

Au moins une parmi : 1 à 17 et 19 à 92,

18

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 15

Au moins une parmi : 1 à 18 et 20 à 92,

19

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 19 et 21 à 92,

20

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 20 et 22 à 92,

21

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 21 et 23 à 92,

22

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 22 et 24 à 92,

23

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 23 et 25 à 92,

24

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92 Au moins une parmi : 1 à 24 et 26 à 92,

25

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 25 et 27 à 92,

26

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 26 et 28 à 92,

27

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 27 et 29 à 92,

28

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 18 et 29 à 92

Au moins une parmi : 1 à 28 et 30 à 92,

29

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 29 et 31 à 92,

30

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 30 et 32 à 92,

31

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 31 et 33 à 92,

32

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 32 et 34 à 92,

33

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 33 et 35 à 92,

34

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 34 et 36 à 92,

35

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 35 et 37 à 92,

36

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 36 et 38 à 92,

37

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 37 et 39 à 92,

38

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 38 et 40 à 92,

39

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 39 et 41 à 92,

40

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 40 et 42 à 92,

41

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 41 et 43 à 92,

42

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 42 et 44 à 92,

43

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 43 et 45 à 92,

44

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 44 et 46 à 92,

45

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 45 et 47 à 92,

46

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 46 et 48 à 92,

47

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 47 et 49 à 92,

48

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 48 et 50 à 92,

49

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 49 et 51 à 92,

50

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 50 et 52 à 92,

51

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86 Au moins une parmi : 1 à 51 et 53 à 92,

52

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 52 et 54 à 92,

53

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 53 et 55 à 92,

54

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 54 et 56 à 92,

55

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 55 et 57 à 92,

56

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 56 et 58 à 92,

57

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 57 et 59 à 92,

58

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 58 et 60 à 92,

59

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 59 et 61 à 92,

60

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 60 et 62 à 92,

61

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 61 et 63 à 92,

62

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 62 et 64 à 92,

63

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 63 et 65 à 92,

64

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 64 et 66 à 92,

65

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 65 et 67 à 92,

66

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 66 et 68 à 92,

67

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 67 et 69 à 92,

68

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 68 et 70 à 92,

69

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 69 et 71 à 92,

70

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 70 et 72 à 92,

71

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 71 et 73 à 92,

72

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 72 et 74 à 92,

73

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 73 et 75 à 92,

74

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 74 et 76 à 92,

75

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 75 et 77 à 92,

76

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 76 et 78 à 92,

77

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 77 et 79 à 92,

78

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92 Au moins une parmi : 1 à 78 et 80 à 92,

79

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 79 et 81 à 92,

80

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 80 et 82 à 92,

81

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 81 et 83 à 92,

82

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 82 et 84 à 92,

83

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 83 et 85 à 92,

84

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 84 et 86 à 92,

85

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 85 et 87 à 92,

86

de préférence au moins l'une parmi : 10 à 28,47 à 72 et 87 à 92

Au moins une parmi : 1 à 86 et 88 à 92,

87

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 87 et 89 à 92,

88

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 88 et 90 à 92,

89

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 89, 91 et 92,

90

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 90 et 92,

91

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

Au moins une parmi : 1 à 91 ,

92

de préférence au moins l'une parmi : 1 à 46 et 73 à 86

La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre, en plus de n'importe laquelle des combinaisons de deux polypeptides présentées dans le tableau 2 ci-dessus, au moins un troisième polypeptide différent de ceux de la combinaison, voire un quatrième polypeptide différent, etc. De préférence, la composition vaccinale comprend une combinaison de 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 polypeptides différents.

Les polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention ne sont pas limités aux polypeptides consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 à 92. L'homme du métier comprend bien que des séquences présentant une homologie ou une identité avec ces séquences peuvent également être utilisées, de manière équivalente, dans la composition vaccinale selon l'invention, dès lors qu'elles présentent le même effet que les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, à savoir un effet immunogène, utile dans la prévention de la maladie de Lyme. L'homme du métier est à même d'identifier des séquences homologues à partir des séquences des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention. Par exemple, une séquence utilisée peut présenter une homologie ou une identité supérieure à 80% avec une séquence décrite dans le Tableau 1 , par exemple une identité ou une homologie supérieure à 85%, ou à 90%, ou à 95%, ou à 99% avec une séquence décrite dans le Tableau 1 . Différentes méthodes, bien connues de T'homme du métier, peuvent être utilisées pour déterminer l'homologie entre plusieurs séquences. Il peut s'agir par exemple de la méthode BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) décrite dans le document Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 1990 [27].

Dans le Tableau 1 ci-dessus, les séquences de polypeptide figurant sur une même ligne représentent une même protéine dont le nom est indiqué dans la colonne de gauche. « n/a » signifie que le nom de la protéine en question n'a pas été identifié ou n'est pas encore connu.

Bien que les polypeptides figurant sur une même ligne représentent une même protéine, leurs séquences d'acides aminés ne sont pas strictement identiques. Cela peut être dû aux mutations possibles qui se sont produites distinctement chez les différentes espèces du genre Borrelia. A titre d'exemples, les séquences SEQ ID NO: 10, 1 1 et 12, isolées des espèces Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii respectivement, représentent une même protéine.

Des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon l'invention peuvent être propres à une espèce de Borrelia donnée, ou communes à deux ou trois espèces de Borrelia choisies parmi Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. Par exemple :

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9 sont des protéines propres au clone virulent de Borrelia burgdorferi ss ;

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 10 à 18 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss,

Borrelia afzelii et Borrelia garinii ; - les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 19 à 28 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et Borrelia garinii ;

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 29 à 46 sont des protéines communes aux clones virulents de Borrelia burgdorferi ss et

Borrelia afzelii ;

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 47 à 72 sont des protéines communes aux deux clones virulents de Borrelia afzelii et Borrelia garinii ;

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 73 à 86 sont des protéines communes à Borrelia burgdorferi ss et Borrelia afzelii ; et

- les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 87 à 92 sont des protéines communes à Borrelia afzelii et Borrelia garinii.

Les polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 9, 13 à 18, 29 à 32, 37, 38, 51 , 52, 57, 58, 71 , 72 et 87 à 92 sont des protéines membranaires de Borrelia.

Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides sont des polypeptides de séquences différentes. Avantageusement encore, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides représentent des protéines différentes.

Avantageusement, lorsque la composition comprend une combinaison de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92, les polypeptides peuvent être des protéines dont l'association permet d'obtenir une immunisation simultanément contre deux espèces ou les trois espèces Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii. En d'autres termes, de manière avantageuse, la composition selon l'invention comprend une protéine commune aux trois espèces précitées ou un mélange de plusieurs protéines, par exemple, 2, 3 ou 4 protéines, voire plus, couvrant ces trois espèces. Ce mode de réalisation permet de fournir des compositions vaccinales universelles vis-à-vis des populations de Borrelia. Selon un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale selon l'invention peut comprendre au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et 85 à 92. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi SEQ ID NO: 10 à 15.

Dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 6, 16 à 18, 21 à 24, 27, 28, 31 , 32, 37 à 40, 51 , 52, 55, 56 et 73 à 84.

En outre, dans ce mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),

ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,

ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide choisi parmi SEQ ID

NO: 2, 7 à 15, 19, 20, 25, 26, 29, 30, 33 à 36, 41 à 50, 53, 54, 57 à 72 et

85 à 92 :

- est compris dans l'un des groupes (c1 ), (c2) ou (c3), ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un groupe (c1 ), (c2) ou (c3) différent, ou

- est SEQ ID NO: 2, 7, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou est SEQ ID NO: 10, 1 1 , 12, 13, 14, ou 15, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3). Selon un autre mode de réalisation, la composition vaccinale comprenant au moins un polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85. De préférence, l'au moins un polypeptide est choisi parmi SEQ ID NO: 10.

Dans cet autre mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi parmi SEQ ID NO: 1 , 3 à 7, 1 1 , 12, 14 à 18, 20 à 24, 26 à 28, 30 à 32, 34, 36 à 42, 44, 46 à 84 et 86 à 92.

En outre, dans cet autre mode de réalisation, la composition vaccinale peut comprendre en outre, au moins un autre polypeptide de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii ou Borrelia garinii choisi dans les groupes (c1 ), (c2) et (c3),

ledit groupe (d ) comprenant SEQ ID NO: 19 à 28,

ledit groupe (c2) comprenant SEQ ID NO: 29 à 46 et 73 à 86, ledit groupe (c3) comprenant SEQ ID NO: 47 à 72 et 87 à 92, à condition que si ladite au moins un polypeptide choisi parmi SEQ ID NO: 10, 2, 8, 9, 13, 19, 25, 29, 33, 35, 43, 45 et 85 :

- est SEQ ID NO: 19 et 25, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c2) ou (c3), ou

- est SEQ ID NO: 29, 33, 35, 43, 45 ou 85, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c1 ) ou (c3), ou

- est SEQ ID NO: 2, 8 ou 9, ledit au moins un autre polypeptide est compris dans le groupe (c3), ou

- est SEQ ID NO: 10 ou 13 ledit au moins un autre polypeptide est compris dans un n'importe lequel des groupes (c1 ), (c2) et (c3). Avantageusement, la composition de l'invention peut comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable

On entend dans la présente par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » toute substance permettant de diluer ou transporter au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. De préférence, le véhicule pharmaceutiquement acceptable n'affecte pas l'efficacité du polypeptide. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut, par exemple, être une solution aqueuse ou une émulsion.

Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution aqueuse, cela peut être, par exemple, une quelconque des solutions présentées dans le document Heitz et al., 2009 (Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Heitz F et al., Br J Pharmacol. 2009 May;157(2): 195-206 [10]) ou dans le document Wehrlé P. (Wehrlé P., Pharmacie galénique, Formulation et technologie pharmaceutiques, 2007 [11]).

Lorsque le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une émulsion, cela peut être une émulsion eau dans l'huile, huile dans l'eau, eau dans l'huile dans l'eau (Wehrlé P. [11]). La composition vaccinale selon l'invention peut comprendre un adjuvant. On entend par « adjuvant » toute substance capable de faciliter et d'amplifier la réponse immunitaire à l'au moins un polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. Il peut s'agir par exemple de tout adjuvant connu de l'homme du métier pour l'administration de polypeptides.

Par exemple, l'adjuvant peut être un adjuvant induisant une réponse humorale et/ou une réponse cellulaire. A titre d'exemples non limitatifs, l'adjuvant peut être choisi parmi l'hydroxyde d'alumine, les extraits de saponine, les complexes de stimulation immunitaire (aussi appelés "ISCOM"), l'inuline, les agonistes des récepteurs de type Toll

(TLR), les complexes Cytosine Phosphate Guanine (CPG), le Chitosan ou encore les acides mycoliques. Il peut s'agir également de la saponine (Roatt et al., 2012 [14]) ou de l'hydroxide d'alumine (Livey et al., 201 1

[15] ; Wressnigg et al. 2013 [16]). La composition vaccinale selon la présente invention peut être utilisée seule ou en combinaison avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme et/ou une ou plusieurs pathologie(s) distincte(s) de la maladie de Lyme. A titre d'exemple, la ou les pathologie(s) distincte(s) de la maladie de Lyme peu(ven)t être choisie(s) dans le groupe comprenant la leptospirose, la rage, la maladie de carré, la parvovirose et les infections par Bordetella.

Selon l'invention, on entend par « utilisé en combinaison », une utilisation de la composition vaccinale selon l'invention de façon conjointe ou simultanée, concomitante, ou successive, avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme. Le mode d'administration peut être identique ou différent suivant les molécules co-administrées.

On entend par « conjointe ou simultanée », l'utilisation de la composition selon l'invention avec tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme dans une seule composition les contenant.

On entend par « concomitante », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant la même période d'administration.

On entend par « successive », l'utilisation séparée de la composition vaccinale selon l'invention et de tout traitement connu permettant de prévenir la maladie de Lyme, par des voies d'administration identiques ou différentes durant des périodes d'administration différentes.

On entend par « période d'administration », la durée pendant laquelle un traitement est administré. Il peut, par exemple s'agir de plusieurs jours, par exemple deux jours, trois jours, quatre jours, etc., par exemple une ou plusieurs semaines, par exemple une semaine, deux semaines, trois semaines, etc., par exemple un ou plusieurs mois, par exemple un mois, deux mois, trois mois, etc., par exemple une ou plusieurs années, par exemple un an, deux ans, trois ans, etc.. La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation comme médicament.

La présente invention se rapporte également à une composition vaccinale selon l'invention, pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme.

La composition vaccinale selon l'invention peut donc être utilisée pour la fabrication d'un médicament, en particulier un médicament destiné à prévenir la maladie de Lyme.

La composition vaccinale pour utilisation comme médicament ou pour utilisation dans la prévention de la maladie de Lyme peut être destiné à tout mammifère susceptible de contracter ou ayant contracté la maladie de Lyme. En particulier, elle peut être destinée à l'Homme ou au chien, au cheval, aux bovins ou à d'autres ruminants. De préférence, la composition vaccinale selon l'invention est destinée à la prévention de la maladie de Lyme chez le chien.

La composition vaccinale selon l'invention, utilisée comme médicament, peut être sous toute forme d'administration appropriée. Il peut s'agir d'une des formes connues par l'homme du métier pour administrer une molécule active qui est un polypeptide (Peppas NA, Carr DA, Chemical engineering Science, 64, 4553-4565 (2009) [12] ; Morishita M,

Peppas NA, Drug Discovery Today, 1 1 , 905-910 (2006) [13]).

La composition vaccinale selon la présente invention peut, par exemple, être destinée à une administration par injection.

Ainsi, la composition vaccinale selon l'invention peut être conditionnée sous toute forme connue de l'homme du métier en vue d'être administrée par injection. Il peut s'agir par exemple d'un flacon ou d'une ampoule.

Par exemple, l'injection peut être une injection intramusculaire, intradermique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation, l'injection est réalisée par voie intradermique. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'injection est réalisée par voie intramusculaire ou sous- cutanée.

La composition vaccinale de la présente invention peut être administrée comme médicament, de préférence en quantité suffisante pour prévenir la maladie de Lyme, en particulier pour prévenir celle chez le chien. Par exemple, les polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention peuvent être inoculés à des doses comprises entre 1 et 500 g, de préférence entre 10 à 100 g (Wressnigg ef a/.,2013 [16]). La synthèse des polypeptides utilisables dans la composition vaccinale selon la présente invention peut être réalisée par tout procédé connu de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'une synthèse par génie génétique.

Lorsque la synthèse des polypeptides de la composition vaccinale selon l'invention est réalisée par génie génétique, on peut par exemple construire un polypeptide de grande taille comprenant le polypeptide de la composition vaccinale de la présente invention et le digérer avec des enzymes de restriction afin de recueillir ledit polypeptide de la composition vaccinale selon l'invention. On peut par exemple utiliser le protocole décrit dans F. Cordier-Ochsenbein et al. J. Mol. Biol. 279,1 177-1 185 [17].

La composition vaccinale selon l'invention peut être produite selon toute méthode bien connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un simple mélange des différents constituants de la composition vaccinale. Le document de Ramamoorthi et Smooker (2009) [18] décrit un procédé de fabrication de composition vaccinale utilisable dans le cadre de la présente invention. Ainsi, la présente invention fournit des solutions efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme.

D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif.

Brève description des figures

- La figure 1 représente la quantification par PCR de B. burgdorferi, souche native 297 et de son clone virulent 297c4, dans la peau de souris, par rapport au temps après inoculation de la souche. « N Fia / 10 4 GAPDH » signifie nombre de flagelline par 10 4 de Glyceraldehyde 3-phosphate déshydrogénase.

- La figure 2 représente un profil d'expression par RT-PCR d'une protéine commune aux trois espèces de Borrelia : B. burgdorferi ss, B. afzelii et B. garinii, à savoir BB0566 (SEQ ID NO: 10) dans la peau de souris au cours de la transmission précoce de la bactérie.

EXEMPLES

Exemple 1 : Stratégie d'identification de candidats vaccins de Borrelia pour la maladie de Lyme

Les inventeurs ont développé une approche protéomique afin d'identifier et sélectionner des polypeptides efficaces pour la prévention de la maladie de Lyme.

Ils ont sélectionné par clonage en milieu solide (De Martino et al., 2006 [19]), des souches de Borrelia burgdorferi ss, Borrelia afzelii et Borrelia garinii virulentes et non virulentes sur la souris. Une stratégie Gel- LC-MS/MS a été utilisée pour comparer les protéines dans chaque culture de Borrelia. 1.1 Matériel et méthodes

1 .1 .1 Souris, souches bactériennes et conditions de culture

Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'ArbresIe, France).

Trois souches de Borrelia burgdorferi sensu lato ont été analysées :

- Borrelia burgdorferi ss, souche 297 (A. Steere, USA), isolé du liquide céphalorachidien (LCR) d'un patient,

- B. garinii, souche PBi (B. Wilske, Allemagne) isolé du LCR d'un patient, - B. afzelii, souche 163/98 (E. Ruzic-Sabljic, Slovénie) isolé du LCR d'un patient.

Pour chaque espèce, les bactéries ont été clonées sur BSK-S. Les clones bactériens ont ensuite été cultivés sur milieu BSK-H (Sigma) et testé sur un modèle de souris selon le protocole décrit dans De Martino et al. [19]. Les clones bactériens ont été sélectionnés pour leur virulence chez la souris. Toutes les souches ont été cultivées en milieu BSK-H complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir.

1 .1 .2 Identification de protéines, après digestion à la trypsine et nanoLC- MS/MS

Pour chaque souche et son clone, les protéines ont été extraites par un tampon de Laemmli [20]. Après sonication et centrifugation, le culot a été éliminé et la concentration en protéines du surnageant a été déterminée. Les protéines (75 g) ont subi une étape de préfractionnement sur gel d'électrophorèse monodimensionnel (électrophorèse) SDS-PAGE

(12% acrylamide). Les pistes résultantes ont été colorées avec du bleu de Coomassie [21]. Des bandes de gel de 2 mm ont été excisées manuellement et de manière systématique. La digestion des protéines contenues dans le gel a été effectuée comme décrit dans Villiers et al.

[22], et les peptides (trypsiques) obtenus ont été extraits par l'addition de

35 μΙ de 60% (v/v) d'acétonitrile (ACN) et de 0,1 % (v/v) d'HCO 2 H. L'analyse nanoLC-MS/MS a été réalisée en utilisant un système de type nanoLC-Chip/MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) couplé à un piège à ions amaZon (Bruker, Bremen, Allemagne). Le système chromatographique était composé d'une pré-colonne (40 nL, 5 μιτι) et d'une colonne (150 mm x 75 μιτι, 5 μιτι) comportant la même phase stationnaire Zorbax 300SB-C18. Le système de solvant se composait de 2% d'ACN, 0,1 % HCO 2 H dans l'eau (solvant A) et de 2% d'eau, 0,1 % HCO 2 H dans de l'ACN (solvant B). 1 μΙ d'extrait peptidique (1/20 du volume total) a été chargé en duplicat sur la pré-colonne (dans la colonne d'enrichissement) à un débit de chargement de (une vitesse d'écoulement fixée à) 3,75 μΙ/min avec le solvant A (à 100% de solvant A). L'élution a été effectuée à un débit de 300 nl/min par application d'un gradient linéaire de 8-40% en solvant B pendant 30 minutes suivi d'une étape de 4 min à 70% de solvant B avant le reconditionnement de la colonne à 8% de solvant B. Les paramètres d'acquisition des spectres MS et MS/MS sont les suivants : température de la source réglée à 145°C et débit de gaz à 4 L/min. La tension appliquée sur l'aiguille du sprayer (de nanoélectronébulisation) a été réglée à -1900 V. L'acquisition des spectres MS a été réalisée en mode (ions) positif sur une gamme de masses de 250 à 1500 m/z à une vitesse de balayage de 8100 m/z par s. Le nombre maximum d'ions (contrôle de la charge ionique) et le temps maximum d'accumulation ont été respectivement fixés à 200 000 et 200 ms, avec une moyenne sur deux scans. L'acquisition des spectres MS/MS a été réalisée en sélectionnant séquentiellement les 8 ions précurseurs les plus intenses (abondantes), avec une préférence pour les ions dichargés. Le seuil de sélection d'un ion pour la fragmentation (seuil absolu) a été fixé à 100 000. La fragmentation a été réalisée en utilisant de l'argon comme gaz de collision. Les ions sélectionnés ont été exclus pendant 0.6 min. Les spectres MS/MS ont été réalisés sur une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Le nombre d'ions maximum accumulables en MS/MS (contrôle de la charge ionique) a été fixé à 400 000, avec une moyenne sur 5 scans. Le système complet a été piloté par le logiciel Hystar 3.2 (Bruker).

1 .1 .3 Analyse des données

Les données brutes des spectres MS et MS/MS (données de masse collectées pendant la nanoLC-MS/MS) ont été traitées, transformées en fichiers ".mgf avec le logiciel DataAnalysis 4.0 (Bruker) et interprétées en utilisant les algorithmes MASCOT 2.4.3 (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) [23] et OMSSA 2.1 .7 (Open Mass Spectrometry Search Algorithm, Maryland, USA) [24]. Les recherches ont été effectuées sans aucune restriction de poids moléculaire ou de point isoélectrique dans des banques de données de protéines composées respectivement de séquences (de protéines) de Borrelia burgdorferi ss B31 , Borrelia garinii PBi et Borrelia afzelii PKo téléchargées sur la banque de données non redondante du Centre National de l'Information en Biotechnologies (NCBInr, le 16 août 2012). Les protéines contaminantes connues comme la kératine humaine et la trypsine, ont été ajoutées à chaque banque de données et liées avec des copies inversées de toutes les séquences (B. burgdorferi ss B31 : 1758 entrées; B. garinii PBi : 1720 entrées; B. afzelii PKo : 2157 entrées). Les banques de données B. burgdorferi ss B31 et B. afzelii PKo ont été utilisées car les souches B. burgdorferi ss 297 et B. afzelii 163 respectivement n'ont pas encore été séquencées. La trypsine a été choisie comme enzyme. La tolérance sur la masse des précurseurs et des fragments a été fixée à 0,5 Da. Un maximum de 2 clivages manqués a été accepté et quelques modifications pos-traductionnelles ont été prises en compte : carbamidométhylation (C), acétylation N-terminale, oxydation

(M). Les résultats des algorithmes MASCOT et OMSSA ont été indépendamment chargés dans le logiciel Scaffold (Proteome Software, Portland, OR). Le taux de faux positifs a été fixé à 1 % avec un minimum d'un peptide par protéine.

Le nombre de spectres attribués à chaque protéine au sein de chaque duplicat a été utilisé afin de mettre en évidence des protéines sur- exprimées dans les clones virulents. Le test bêta-binomial [25] a été mis en œuvre en R pour déterminer la sur-expression des protéines (p < 0,05) dans chaque clone virulent par rapport à la souche de type sauvage. Le test a été effectué indépendamment pour chacun des moteurs de recherche car les identifications spectrales sont dépendantes des algorithmes.

1.2 Résultats

1 .2.1 Reproductibilité de l'identification de protéines bactériennes selon l'injection et l'algorithme de recherche utilisé

Chaque échantillon a été analysé en duplicat. L'identification des protéines présentes dans chaque répétition a été réalisée en utilisant une combinaison des deux moteurs de recherche : Mascot et OMSSA. Ainsi, la reproductibilité des identifications a été évaluée pour les deux algorithmes de recherche. Le nombre de protéines communes aux duplicats d'injection (chevauchement) est élevé (> 90% dans la plupart des cas) et quelques protéines ont spécifiquement été identifiées dans un réplicat. Cette proportion est plus élevée chez Mascot par rapport à OMSSA. Ces identifications spécifiques pourraient s'expliquer soit par la faible quantité de ces protéines, soit par la variabilité due au mode d'acquisition dépendant des données (DDA). Afin de comparer les identifications obtenues en utilisant les moteurs de recherche, nous avons fusionné les identifications des duplicats. Pour tous les échantillons, il y a un nombre élevé (>85%) de protéines identifiées (chevauchement) à la fois par Mascot et OMSSA. Quelques protéines sont observées spécifiquement par un seul algorithme. La combinaison des moteurs de recherche mène à plus de 5% d'identifications supplémentaires.

1 .2.2 Protéines(Polvpeptides) impliquées dans la transmission bactérienne

Pour chaque espèce, les identifications obtenues par Mascot ou OMSSA ont été fusionnées et les profils protéiques des clones sauvages et des clones virulents ont été comparés par les inventeurs. Plus de 800 protéines ont été identifiées dans chaque cas et un recouvrement (chevauchement) important entre les clones sauvages et virulents a été observé : près de 90% pour B. burgdorferi ss et B. garinii et 80% pour B. afzelii. Il a ainsi été constaté, pour chaque espèce, une proportion plus importante de protéines détectées dans les clones virulents par rapport à la souche sauvage (jusqu'à 1 10 pour B. burgdorferi ss).

Par ailleurs, des protéines présentes à la fois dans le clone virulent et la souche sauvage de Borrelia mais sur-exprimées chez le clone virulent, ont été détectées. Par conséquent, une stratégie basée sur le nombre de spectres attribués à chaque protéine (de comptage spectrale) couplée à un test statistique adéquat (bêta-binomial) [25] a été utilisée pour mettre en évidence les protéines sur-exprimées dans le clone virulent par rapport à la souche sauvage (p <0,05). Des tests statistiques ont été réalisés indépendamment pour Mascot et OMSSA car le nombre de spectres assignés est généralement variable entre les deux moteurs de recherche [26]. Une protéine avec une valeur p inférieure à 0,05 à la fois pour Mascot et OMSSA a été considérée comme sur-exprimée afin de limiter le nombre de faux positifs. Le nombre de protéines sur-exprimées dépend de l'espèce considérée. 31 protéines sur-exprimées ont été détectées pour B. burgdorferi ss, 43 pour B. garinii et 72 pour B. afzelii.

Les protéines homologues chez les trois espèces ont été déterminées en utilisant le programme blastp [27] avec un seuil de E- valeur fixé à 10 "30 . Trois protéines sont ainsi communes aux trois espèces de Borrelia analysées et 27 protéines sont communes à au moins deux des trois espèces (voir tableau 1 ci-dessus).

Quarante protéines de Borrelia ont ainsi été retenues (représentées par les 92 séquences de polypeptides de séquence SEQ ID NO: 1 à 92 dans le tableau 1 ci-dessus) parmi plus d'un millier de protéines identifiées pour les espèces appartenant à ce genre.

- Trois protéines sont communes à tous les clones virulents et n'ont pas été détectées dans des souches sauvages : la première, BB0173 (SEQ ID NO: 13) possède un domaine du facteur de von Willebrand de type A (VWA) qui est connu pour être impliqué dans l'adhésion cellulaire. La seconde, BB0566 (SEQ ID NO: 10), possède un domaine de type « Sulfate Transporter and Anti-sigma factor antagonist » (STAS). Les facteurs sigma sont des éléments clés dans l'activation de la transcription de l'ARN polymérase (ARNP) impliquée dans la régulation de Borrelia. La troisième protéine, BB0722 (SEQ ID NO: 16), n'a pas encore été décrite dans la littérature, mais semble être une protéine associée à la membrane de la bactérie.

- D'autres protéines sont liées au noyau catalytique RNAP: l'unité β

(rpoC) et le facteur sigma-54 (RpoN). Par exemple, BAPKO0873 (SEQ ID NO: 59) contient un domaine ω d'une sous-unité d'ARN polymérase (RpoZ). BB0765 (SEQ ID NO: 27) contient un domaine III de l'ADN polymérase (DNAX). Ces protéines sont liées à la voie RpoN-RpoS qui joue un rôle important dans la pathogénicité et la survie microbienne (Radolf et al., 2012 [3]). Chez B. burgdorferi, RpoN active directement la transcription de RpoS qui, à son tour, commande l'expression des lipoprotéines membranaires associées à la virulence (OspA, OspC, protéines se liant à la décorine). Une protéine associée à un nucléotide EBfC apparaît comme un régulateur global de l'expression génique dans Borrelia. L'augmentation des niveaux EBfC influence l'expression des gènes de B. burgdorferi de l'ordre de 4,5%, y compris des gènes associés à l'infection. D'autres protéines impliquées dans la réplication de l'ADN, la recombinaison et la réparation (ADN hélicase et SBCD exonucléase), ou dans le traitement ARNt ont également été identifiées.

- Quatre protéines identifiées sont relatives aux flagelles périplasmiques : FliE, FliP, FlgE et l'ATP synthase spécifique du flagelle (FIN). La mobilité est cruciale pour le cycle infectieux de B. burgdorferi et les flagelles périplasmiques sont indispensables pour assurer une mobilité suffisante aux bactéries. Il a été montré que l'inactivation de gènes codant pour des protéines de flagelles conduit à des bactéries non mobiles. Une autre étude a montré que la perte de flagelles diminue l'infection de B. garinii.

- BB0527 (SEQ ID NO: 43) homologue à Baf (facteur accessoire Bvg) a également été identifiée. Cette protéine a un effet inhibiteur sur l'activité de la phosphatase alcaline et influe donc directement sur l'expression de la protéine de la membrane externe P66. Parmi les protéines surexprimées, la 5-methylthioadenosine/S- adenosylhomocysteine (SEQ ID NO: 87) a également été identifiée. Cette protéine fait partie intégrante du cycle de méthylation. Une étude récente a montré que l'inhibition de cette enzyme peut atténuer la virulence bactérienne.

- Plusieurs protéines identifiées sont impliquées dans le métabolisme des glucides comme les protéines liées au système phosphotransférase (PTS), ou dans la biosynthèse des lipides et du métabolisme, comme la protéine porteuse d'acyle (ACP). D'autres protéines sont hypothétiques et n'ont pas de fonction définie à ce jour.

Exemple 2 : Etude de l'inflammation cutanée chez la souris, après inoculations de différents pathotypes humains de Borrelia burgdorferi sensu stricto

La peau constitue un organe essentiel dans le développement de la borréliose de Lyme puisque Borrelia y est inoculée et s'y multiplie avant de disséminer dans l'organisme pour atteindre les organes cibles : l'articulation, le système nerveux et la peau à distance.

Différents isolais cliniques humains de B. burgdorferi ss

(pathotypes), avec différents facteurs de virulence de type RSTs (16S-23S rRNA intergenic spacer type) ont été sélectionnés. Les réponses inflammatoires au niveau cutané dans un modèle murin ont été comparées selon le protocole décrit ci-après afin de déterminer si l'immunité de la peau jouait un rôle dans l'organotropisme des souches bactériennes. La souris constitue en effet un modèle de choix pour comprendre les mécanismes pathogénicité de B. burgdorferi si [28].

2.1 Matériel et méthodes

2.1 .1 Souris et souches bactériennes

Des souris C3H/HeN âgées de trois à quatre semaines ont été utilisées (Charles River Laboratories, L'ArbresIe, France). Les souches de Borrelia burgdorferi sensu stricto ont été isolées de patients atteints de différentes manifestations cliniques: la souche PBre (RST1 ) d'un érythème migrant (EM) (lésion unique - Allemagne), la souche MR726 (RST3) d'un érythème migrant multiple (Etats-Unis), la souche 1808/03 (RST1 ) de liquide céphalo-rachidien (Slovénie) et la souche 297 (RST2) de liquide céphalo-rachidien également (Etats-Unis). Le clone Borrelia c297/4 a été sélectionné par culture sur milieu BSK solide [19]. Toutes les souches ont été cultivées en BSK-H milieu complet (Sigma) à 33°C et utilisées à passage bas (<7). Les Borrelia ont été comptées et la viabilité a été vérifiée en microscopie à fond noir.

2.1 .2 Suivi de l'infection de la souris

Les souris ont été infectées avec 10 3 spirochètes dans 0,1 ml de milieu BSK par voie intradermique dans la région dorso-lombaire. Les souris témoins ont été injectées avec un volume égal de milieu BSK stérile et maintenues dans les mêmes conditions que les animaux infectés. Évaluation de l'arthrite a été réalisée toutes les semaines en mesurant l'épaisseur des deux articulations tibio-tarsiennes avec un pied à coulisse métrique. Des mesures conjointes ont fourni une indication de la gravité de l'arthrite. La sérologie a été réalisée comme décrit dans Kern et al. [29].

À différents moments après le début de l'expérience (Oh, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection) les souris ont été tuées par surdose de gaz isoflurane. Environ 1 cm de peau a été recueilli sur le site de l'inoculation et stockées dans du Trizol (marque déposée) (Invitrogen).

L'oreille, la base du cœur, la vessie et les articulations tibio-tarsiennes de chaque souris ont été recueillies de manière aseptique et divisées en deux parties, pour la PCR et la culture de Borrelia. Les organes des souris non infectées ont été collectés dans les mêmes conditions que les souris positives.

2.1 .3 Détection de B. burgdorferi dans les organes de souris

Pour la détection des spirochètes par culture, les organes prélevés ont été placés dans 6 ml de milieu BSK-H contenant 30 g de rifampicine (BioRad). Les tubes ont été maintenus à 33 °C, et la présence de spirochètes a été examinée toutes les semaines en microscopie à fond noir.

Pour la PCR, l'ADN a été extrait des organes de chaque souris sur un système MagNA Pure (Roche Diagnostics, France), en utilisant un kit d'isolation MagNA Pure LC large-volume après lyse externe. Le cœur, la vessie, l'oreille et la peau ont été placés dans 500 μΙ de tampon de lyse contenant de la protéinase K. D'autres échantillons ont été traités avec une lyse externe par la collagénase A, puis la protéinase K. Tous les échantillons d'ADN ont finalement été élués dans 100 μΙ de tampon d'élution. Dix μί d'ADN de Borrelia ont été utilisés comme témoin positif pour la détection. L'amplification qualitative a été effectuée comme décrit dans Woods et al. [30]., en ciblant le gène de la flagelline.

2.1 .4 Quantification de la charge de spirochètes et des gènes inflammatoires de la peau de la souris

Sur le site d'inoculation, la quantification du gène de la flagelline spécifique de B. burgdorferi a été réalisée sur un système LightCycler (Roche Diagnostics, France). Les amorces utilisées pour amplifier le gène fia étaient celles décrites dans Kern et al. [29].

Pour mesurer l'inflammation au site d'inoculation, l'ARN total a été extrait à partir de 10 mg de peau de souris en utilisant le réactif Trizol selon les indications du fabricant (Invitrogen). Les échantillons ont été traités par DNAse (Ambion, USA) puis un premier brin d'ADNc a été synthétisé à partir de 1 g d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen Life Technologies). La quantification de gapdh a été réalisée comme étalon interne. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant un animal infecté comme calibrateur. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7000 avec le profil thermique ci- après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 60 °C pendant 1 min. Les amorces utilisées pour tous les gènes étudiés sont décrites dans Kern et al. [29].

2.1 .5 Comparaison du profil protéique de la souche B. buradorferi 297 , de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4

Les cultures de B. burgdorferi 297, de la souche sauvage et du clone virulent c297/4, ont été mis en suspension dans du tampon de Laemmli [20]. Le protocole présenté aux exemples 1 .1 .2 et 1 .1 .3 ci-dessus a ensuite été appliqué.

2.1 .6 Dynamique des gènes de B. buradorferi 297. de la souche de type sauvage et du clone virulent c297/4, dans la peau de souris au site d'inoculation

À différents temps (Oh, 5h, 24h, 3j, 5j, 7j, 15j et 30j après l'infection), des échantillons de peau ont été prélevés chez chaque souris au site d'inoculation. L'ARN total a été purifié en utilisant le réactif Trizol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté des ARN extraits ont été déterminées par mesure de la densité optique à A260 et A280. Les échantillons ont ensuite été traités avec de la gDNAse (QIAGEN) afin d'éliminer la contamination par de l'ADN. Les ARN totaux extraits ont été soumises à la Quantiscript Reverse Transcription (QIAGEN) pour produire l'ADNc. L'ADNc a été utilisé pour quantifier les gènes ospC et bbk32. Pour B. burgdorferi C297/4, les gènes sélectionnés correspondant à des protéines de l'enveloppe cellulaire ont été retenus pour la RT-PCR. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant la méthode AACt avec la flagellin comme standard interne. L'amplification et la détection ont été réalisées avec un système ABI 7500 avec le profil thermique ci-après: 95 °C pendant 10 minutes, 50 cycles de 95 °C pendant 15 s, à 50 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 1 min. Chaque condition d'amplification a été comparée au jour 3 pour la quantification relative. Les facteurs de corrélation ont été calculés en comparant l'amplification d'ADNc de chaque point de cinétique de la souche native à l'amplification d'ADNc de chaque point du clone hypervirulent. Ensuite, la courbe obtenue pour le clone, a été normalisée par ces facteurs pour obtenir une seconde courbe, représentative de la souche sauvage, et quantitativement comparable au clone.

2.1 .7 Analyse statistique

Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois. Pour chacune des RT-PCR, au moins deux extractions ont été réalisées pour chaque souris dans chaque expérience, avec deux à trois souris pour chaque point. 2.2 Résultats

2.2.1 Transmission et diffusion des différents pathotypes de B. buradorferi ss chez la souris

Toutes les souches étudiées ont montré une tendance similaire de diffusion. Borrelia a été détectée au jour 3 par PCR dans la peau, sur le site d'inoculation, pour toutes les souches. Elles ont diffusé rapidement dans l'articulation, où elles ont d'abord été détectées au jour 5 ou 7, puis vers le cœur et la vessie au jour 5, 7 ou 15, et la dissémination la plus lente s'est produite dans l'oreille (peau à distance du site d'inoculation),. Le pathotype PBre, isolé de l'érythème migrant (EM) a diffusé plus lentement vers le cœur et la vessie, par rapport aux autres. En ELISA, toutes les souris se sont positivées aux antigènes de Borrelia 15 jours après l'inoculation bactérienne.

2.2.2 Quantification des pathotypes de Borrelia et mesure de l'inflammation au site d'inoculation La charge bactérienne de la peau a été mesurée. Toutes les souches se sont multipliées de façon intensive au jour 7, mais sans différence significative observée entre les souches testées.

Le profil inflammatoire dans la peau des souris a été comparé pour ces différentes souches de B. burgdorferi ss. Les peptides antimicrobiens (AMPs), marqueurs de l'immunité innée des epithelia, ont été mesurés. La souche PBre (EM) a induit une quantité significative de cathelicidine avec un pic au jour 3. La souche MR726 (MEM) a induit fortement la défensine mBD-3. La souche 297 de type sauvage (CSF) a présenté un pic de mBD- 3 à 24h tandis que la souche 1808/03 (CSF) a induit une quantité négligeable de l'ensemble des trois AMPs testés. L'induction de molécules pro-inflammatoires supplémentaires a ensuite été mesurée: TNF-α, IL-6, IL-22 et la chimiokine MCP-1 . Pour chacune d'eux, un pic d'induction de TNF-α et/ou de MCP-1 a été observé au jour 7. La souche MR726 isolée d'une lésion du MEM, a induit le profil inflammatoire plus fort au niveau de la peau de souris avec un pic de MCP-1 (150 fois) au jour 7.

2.2.3 Analyse spécifique de l'inflammation induite par B. burgdorferi ss 297 souche sauvage et son clone hypervirulent

L'infection à Borrelia pourrait être initiée par une population hétérogène de Borrelia chez l'hôte vertébré. Un clone C297/4 de B. burgdorferi ss 297 a été sélectionné au laboratoire pour sa diffusion rapide et ses manifestations neurologiques chez la souris [31]. Le clone virulent C297/4 a provoqué une inflammation de la peau avec une induction plus importante des défensines, MBD-14, et de cathelicidine par rapport à la souche sauvage. Une très forte induction de MCP-1 et d'IL-6, environ 100 fois plus induction, a été observée pour le clone C297/4 par rapport à la souche sauvage.

Les résultats de la souche 297 sauvage et du clone hypervirulent ont également été comparés chez la souris C3H/HeN. Le clone hypervirulent a diffusé plus rapidement vers l'articulation, alors que la diffusion aux autres organes était semblable à celui de la souche sauvage. La quantification de la charge bactérienne dans les tissus a confirmé la multiplication intense se produisant dans la peau au jour 7 quelle que soit la souche utilisée, mais aucune différence significative n'a été observée entre le clone hypervirulent et la souche sauvage 297.

2.2.4 Caractérisation protéomique des souches B. buradorferi ss, 297 sauvage et du clone hvpervirulent

Le protocole présenté aux exemples 1 .2.1 et 1 .2.2 ci-dessus a été appliqué.

Un total de 887 protéines ont été identifiées avec 848 protéines c297/4 et 777 protéines dans la souche de type sauvage. Nous avons observé un chevauchement de 738 protéines qui représente 83% du nombre total. 1 10 protéines sont spécifiques du clone hypervirulent.

2.2.5 Expression comparative des protéines spécifiques des clones de type sauvage et hvpervirulent de B. buradorferi 297 dans la peau de la souris par RT-PCR.

La cinétique d'expression d'OspC et BBK32, deux protéines importantes dans la transmission de Borrelia a été réalisée pour les souches de type sauvage et c297/4. Les deux souches présentent un premier pic d'expression d'OspC au jour 5, tandis qu'un pic d'expression de BBK32 a été observé au jour 7. Puis, des protéines de surface de Borrelia ont été sélectionnées parmi les 1 10 protéines spécifiques du clone hypervirulent, et leur expression a été suivie au cours de l'inflammation cutanée chez la souris C3H/HeN. Trois gènes sont fortement exprimés dans les deux souches, bb0304, bb0213 et bb0347 avec un pic d'expression au jour 5 pour le clone hypervirulent et au jour 7 pour la souche sauvage.

Exemple 3 : Sélection des candidats vaccinaux et détermination de l'effet immunogène

Les différentes protéines sont testées dans un modèle murin

C3H/HeN afin de voir leur expression au niveau de la peau, lors de la transmission de la bactérie. En effet, l'interface cutanée semble jouer un rôle clef dans la sélection de certaines populations bactériennes (Brisson et al., 201 1 [32]). La peau des souris infectées par voie intradermique est prélevée à 3, 5, 7 et 15 jours. Après design des amorces spécifiques pour chacune des protéines, la technique de RT-PCR est utilisée pour suivre l'expression de ces protéines dans la peau. Les plus exprimées dans la peau sont alors retenues. Elles sont ensuite clonées (Steere et al., 1998

[33]; Ramamoorthi et Smooker, 2009 [18] ; Livey et al., 201 1 [15]) et exprimées chez E. coll. Elles sont inoculées par voie intradermique à la souris et le taux en anticorps est mesuré par Elisa. En effet, la réponse en anticorps apparaît essentielle pour mesurer un effet protecteur lors de la borréliose de Lyme (Embers et Narasimhan, 2013 [34]). Leur effet protecteur est testé par challenge avec des Borrelia inoculées à la seringue, ou mieux avec des tiques infectées par Borrelia. Les souris vaccinées et challengées sont ensuite disséquées et leurs organes cultivés ou testés en PCR afin de mesurer l'absence de Borrelia (Kern et al., 201 1

[29]).

Cinq protéines ont été retenues pour des essais in vivo chez la souris, à savoir les trois protéines « hypothetical protein » uniquement détectées dans les clones virulents et communes aux trois espèces de Borrelia (SEQ ID NO: 10 (BB0566), 13 (BB0173) et 16 (BB0722) de Borrelia burgdorferi ss et les séquences correspondantes respectives SEQ ID NO: 1 1 (BAPKO0596), 14 (BAPKO0175) et 17 (BAPKO0766) de B. afzelii) et 12 (BG0576), 15 (BG0172) et 18 BG0744) de B. garinii)), la protéine RpoN (SEQ ID NO: 41 (BB0450) de Borrelia burgdorferi ss et la séquence correspondante SEQ ID NO: 42 (BAPKO0472) B. afzelii)) et la protéine Gnd (SEQ ID NO: 77 (BB0561 ) de Borrelia burgdorferi ss et la séquence correspondante SEQ ID NO: 42 (BAPKO0590) B. afzelii)). Parallèlement, dans les peaux de souris infectées 7 jours après l'inoculation intradermique, toutes les protéines de Borrelia exprimées dans les peaux de souris infectées ont été analysées par une approche protéomique non ciblée. En effet, 7 jours correspond à un pic de multiplication intense des bactéries après inoculation intradermique et joue donc probablement un rôle clef dans l'initiation de l'infection bactérienne (Kern et al., 201 1 [29]). La stratégie a consisté à extraire les protéines contenues dans les peaux infectées, à les préfractionner par gel d'électrophorèse puis à les identifier par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (stratégie Ge-LC-MS/MS).

3.1 Matériels et méthode

3.1 .1 Inoculation des bactéries et prélèvement des peaux infectées

Des souris de trois à quatre semaines C3H/HeN ont été achetées auprès de Charles River Laboratories (L'ArbresIe, France).

Les inventeurs se sont particulièrement intéressés à la souche B. burgdorferi ss 297, isolée de liquide céphalo-rachidien aux États-Unis

(Sterre et al., 1893 [35])

Différents clones de B. burgdorferi ss ont été obtenus par culture sur un milieu BSK solide ([19]). Le clone 297c4 a été sélectionné pour sa vitesse de dissémination chez la souris et sa localisation cérébrale notamment.

Toutes les souches de Borrelia ont été cultivées en milieu BSK-H (Sigma) à 33°C et utilisés à passage bas (<7) pour l'infection de la souris. Les spirochètes ont été comptés et la viabilité a été vérifiée en utilisant le microscope à fond noir. Les souris ont été infectées avec 10 3 spirochètes dans 0,1 ml BSK par injection intradermique dans la région thoracique dorsale.

À différents points après l'inoculation (3j, 5j, 7j, 15j), les souris ont été tuées par isoflurane. Une surface de 1 cm de peau de souris a été recueillie au niveau du site d'inoculation et stockée dans Trizol (Invitrogen) pour les analyses RT-PCR. Pour la quantification des Borrelia dans la peau, l'échantillon est conservé à sec -80°C.

3.1 .2 Quantification par PCR des peaux infectées avec Borrelia

Au niveau du site d'inoculation, la détection de la présence de B. burgdorferi ss a été réalisée par PCR en ciblant le gène de la flagelline sur un système LightCycler (Roche Diagnostics, France). Les amorces utilisées pour amplifier le gène fia sont celles décrites précédemment ([29]).

3.1 .3 RT-PCR sur les peaux de souris pour la détection des gènes

Aux différents points de la cinétique, les échantillons de peau ont été prélevés chez chaque souris au niveau du site d'inoculation. L'ARN total a été purifié en utilisant le réactif Trizol selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN extrait ont été déterminées par mesure de la A260 et A280. Les échantillons ont été ensuite traités avec gDNAse wipeout (QIAGEN). L'ARN total extrait a été synthétisé en ADNc en utilisant Quantiscript transcription inverse (QIAGEN). L'ADNc a été utilisé pour quantifier les gènes bbk32 (contrôle positif). Pour B. burgdorferi ss 297 et 297c4, les gènes correspondant aux trois protéines communes et RpoN et Gnd ont été testés en RT-PCR à l'aide des amorces décrites dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 : Amorces utilisées pour la RT-PCR

Protéines SEQ ID NO Séquences

93 F - AGG CCT GAA GGA GAG CTT GT

BB0566

94 R - AAA CCT CAT CGG ATG GAT ACT CAA

95 F - GCT GAT TTT GCC AGC GAG CTT A

BB0722

96 R - TCG GTC CAA ATA CTT CCG TAA CC

97 F - TCG CCT AGT ATG GGG GCT GTT

BB0173

98 R - AGC AGA ACC ATT GCC AAG ATC C

99 F - AAG TGA AAA CCC CCA AAA ACA AAA A

RpoN

100 R - TTG CTC CAC CAA CAG AGC TAA AAA G

101 F - GGA ATG AAG GCG ATC TTT CAG GG

Gnd

102 R - GCT GGC AAA GGA ATC CCA ATT TCAC Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés en utilisant la méthode de la flagelline AACt comme étalon interne. L'amplification et la détection ont été effectuées avec un système ABI 7500 avec le profil thermique suivant: 95°C pendant 10 min, 50 cycles de 95°C pendant 15 s, et 60°C pendant 1 min. Chaque condition d'amplification a été comparée au jour 3 pour la quantification relative.

3.1 .4 Analyse protéomique des peaux infectées

Les biopsies ont été sélectionnées en fonction de la quantification par PCR. Des fragments d'environ 4 mg ont été découpés et les protéines ont été extraites dans 200 μί tampon de Laemmli puis dosées. Les protéines (50 g) ont été préfractionnées sur gel d'électrophorèse SDS- PAGE puis les pistes de migration ont été excisées et traitées comme décrit dans l'Exemple 1 . Les peptides tryptiques ont été analysés par nanoLC-MS/MS en utilisant le système nanoLC-Chip/MS couplé au piège à ions amaZon, comme décrit dans l'Exemple 1 . Les spectres de MS et MS/MS ont été acquis avec les mêmes paramètres et les recherches ont été effectuées de la même manière hormis pour les banques de données. Dans le cas présent, les recherches ont été effectuées dans des banques de données, composées de séquences de B. burgdorferi ss B31 et de souris, téléchargées sur la banque de données NCBInr et UniProtKB- SwissProt, respectivement (B. burgdorferi B31 : 16 août 2012 ; souris : 19 avril 2013).

3.2 Résultats

3.2.1 Pic de multiplication des Borrelia au jour 7 ;

La quantification des Borrelia dans la peau à différents points après l'inoculation intradermique révèle une intense multiplication des bactéries au jour 7 et ceci quelle que soit la souche de Borrelia testée

(Figure 1 ). 3.2.2 Cinétique d'expression de certains gènes dans la peau

Le profil d'expression par RT-PCR de la protéine BB0566 (SEQ ID NO: 10), protéine commune aux trois espèces de Borrelia : B. burgdorferi ss, B. afzelii et B. garinii, dans la peau de souris au cours de la transmission précoce de la bactérie est représenté sur la Figure 2.

Ces résultats montrent que la protéine de séquence SEQ ID NO: 10 est fortement surexprimée dans la peau de souris dès le cinquième jour après inoculation pour les deux souches 297 et 297c4.

3.2.3 Analyse protéomique des peaux de souris infectées au jour sept après inoculation intra-dermique

Dans les biopsies cutanées de souris infectées, il a été identifié en moyenne 1350 protéines de souris. Parmi les protéines de Borrelia détectées, les protéines RpoN et Gnd ont été identifiées ce qui confirme l'expression de ces protéines dans la peau sept jours après l'inoculation et leur rôle potentiel lors de la transmission précoce de la bactérie.

Exemple 4 : Essai vaccinal

La dose de protéines recombinantes à administrer est déterminée en fonction d'une étude préalable dose-effet bien connue de l'homme du métier, en général entre 1 et 500 g. Selon le protocole de vaccination chez le chien, idéalement, deux administrations seront effectuées entre 2 à 4 semaines d'intervalle puis un rappel annuel. L'adjuvant est choisi en fonction de sa capacité à stimuler la réponse humorale et/ou la réponse cellulaire. L'homme du métier sait déterminer quel adjuvant choisir pour stimuler efficacement la réponse humorale et/ou la réponse cellulaire. L'administration du vaccin est réalisée par voie intradermique, sous- cutanée ou intramusculaire, de préférence par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Listes des références

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