Bekannt sind Verfahren zur Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose, die eine enzymatische Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und anschließend ei- ne chemische Hydrierung der erhaltenen Isomaltulose zu den beiden Stereoisomeren 1,6-GPS und 1-0-a-D- Glucopyranosyl-D-mannit (im folgenden 1,1-GPM) um- fassen.

Aus der DE 44 14 185 Cl ist eine Saccharose- Isomerase bekannt, die die Umwandlung von Saccharo- se zu Isomaltulose katalysiert.

Schiweck (alimenta 19 (1980), 5-16) offenbart die enzymatische Umsetzung von Saccharose zu Isomaltu- lose und die anschließende Hydrierung der Isomaltu- lose an Raney-Nickel-Katalysatoren zu Palatinit@ (auch Isomalt genannt), einem nahezu äquimolaren Gemisch aus 1,6-GPS und 1, 1-GPM. Die Druckschrift beschreibt die Herstellung von Isomaltulose durch Transglucosidierung von Saccharose durch Protamino- bacter rubrum. Außerdem wird offenbart, wie in Ge- genwart von Raney-Nickel-Katalysatoren die durch Mikroorganismen gewonnene Isomaltulose mittels Hyd- rierung in 1,6-GPS und 1,1-GPM umgewandelt und an-

schließend durch Verdampfungs-und Kühlungskristal- lisationen angereichert werden kann.

Die DE 197 01 439 AI offenbart Verfahren zur Hyd- rierung von Isomaltulose mittels eines trägergebun- denen Nickelkatalysators, wobei Gemische aus 1,6- GPS und 1,1-GPM erhalten werden.

Die DE 197 05 664 Al beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 1,6-GPS- oder 1,1-GPM- angereicherten Gemischen. In dieser Druckschrift wird ein Verfahren offenbart, bei dem 1,6-GPS- und/oder 1,1-GPM-angereicherte Gemische aus hyd- rierter Isomaltulose oder aus Gemischen, die hyd- rierte Isomaltulose enthalten, hergestellt werden.

Mittels dieses Verfahrens ist es möglich, 1,6-GPS rein herzustellen, indem 1,6-GPS-reiche Mutterlauge unter bestimmten Bedingungen aufkonzentriert und kühlungskristallisiert wird.

Die DE 195 23 008 Al offenbart ein Verfahren zur Herstellung von 1,1-GPM und 1,6-GPS. Das Dokument beschreibt, wie bei Drücken von unter 50 Atmosphä- ren verschiedene Katalysatoren so zum Einsatz kom- men, dass durch die Hydrierung von Isomaltulose Ge- mische aus 1,6-GPS und 1,1-GPM erhalten werden. Die offenbarten Katalysatoren, an denen Isomaltulose umgesetzt wird, enthalten Ruthenium, Nickel und de- ren Mischungen.

Aus der EP 0 625 578 B1 gehen Verfahren zur Gewin- nung von 1,1-GPM und 1,6-GPS-haltigen Zuckeralko- holgemischen durch enzymatische Umlagerung von Sac- charose zu Isomaltulose und Trehalulose sowie an-

schließende Hydrierung zu 1,1-GPM, 1,6-GPS und 1-0- a-D-Glucopyranosyl-D-sorbit (1,1-GPS) hervor.

Die Verfahren nach dem Stand der Technik werden vor allem aus zwei Gründen als nachteilig angesehen.

Zum einen können mit den bisherigen Methoden nur Gemische aus 1,6-GPS und 1,1-GPM gewonnen werden, aus denen dann mittels aufwendiger chemischer und physikalischer Trennverfahren der interessierende Stoff (1,6-GPS oder 1,1-GPM) isoliert werden muss.

Zum anderen ist es nicht möglich, das gesamte Ver- fahren der Umwandlung von Saccharose zu den ge- wünschen Endprodukten in einem einzigen Verfah- rensschritt durchzuführen. Im Stand der Technik sind also recht komplizierte Verfahrensabfolgen für die Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose erfor- derlich, wobei verschiedene physikalische, chemi- sche und biologische Verfahrensschritte in ver- schiedenen Reaktoren zum Einsatz kommen. Für die Hydrierung der Isomaltulose sind nach gegenwärtigem Stand der Technik Katalysatoren, spezielle Hydrier- reaktoren und technischer Wasserstoff notwendig.

Ein wesentlicher Nachteil der bekannten Hydrierung von Isomaltulose zu 1,6-GPS und 1,1-GPM besteht al- so in dem erforderlichen technischen Aufwand. Oft sind für die Hydrierung Drücke von ungefähr 50 bis über 100 Atmosphären erforderlich, was einen spezi- fischen apparativen Aufbau erzwingt. Da die erhal- tenen Produkte in der Regel in der Lebensmittelin- dustrie zum Einsatz kommen, muss der Verfahrensgang außerdem so gewählt sein, dass kein toxisches Mate- rial, zum Beispiel der Katalysatoren, in die End- produkte der Hydrierungsreaktion gelangt. Das ge- bildete Produkt ist ein Gemisch aus den wesentli-

chen Bestandteilen 1,6-GPS und 1,1-GPM, aus dem der interessierende Stoff jeweils durch chemische und chemisch-physikalische Reinigungsmethoden abge- trennt werden muss. Um chemisch reines 1,6-GPS oder 1,1-GPM zu gewinnen, sind nach der erfolgten chemi- schen Hydrierung also aufwendige Anreicherungs-und Isolierungsprozeduren erforderlich. Die Ausbeute dieser Verfahrensschritte ist häufig nicht befrie- digend.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, ein Verfah- ren und Mittel zu dessen Durchführung bereitzustel- len, das eine einfache, kostengünstige und selekti- ve Herstellung von 1,6-GPS aus Isomaltulose ermög- licht.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur enzymatischen Herstellung von 1,6-GPS aus Iso- maltulose, wobei die Isomaltulose in eine wässrige Reaktionslösung enthaltend eine Sorbitol-Dehydro- genase (SDH)-Aktivität aufweisende Einheit gegeben, inkubiert und 1,6-GPS aus der Reaktionslösung ge- wonnen wird. Die Erfindung ermöglicht es also, Iso- maltulose biochemisch oder enzymatisch zu 1,6-GPS mittels einer SDH-Aktivität aufweisenden Einheit zu hydrieren. Die erfindungsgemäß eingesetzte SDH- Aktivität aufweisende Einheit reduziert Isomaltulo- se spezifisch zu 1,6-GPS. Die SDH-Aktivität aufwei- sende Einheit ist dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage ist, Isomaltulose oder diese enthalten- de Gemische enzymatisch zu 1,6-GPS oder dieses ent- haltende Gemische umzusetzen. Der Vorteil der enzy-

matischen Umwandlung von Isomaltulose zu 1,6-GPS liegt neben der dadurch ermöglichten einfachen Ver- fahrensweise in der hohen Reaktions-, Substrat-und Stereospezifität, in der Einheitlichkeit des Reak- tionsproduktes, in der Einsparung von Energie und Rohstoffen und in ihrer Umweltverträglichkeit.

Die Erfindung betrifft also die überraschende Leh- re, dass mittels eines spezifischen enzymatischen Verfahrens aus Isomaltulose ganz gezielt 1,6-GPS hergestellt werden kann. Erfindungsgemäß wird in eine wässrige Reaktionslösung, die eine Sorbitde- hydrogenase (SDH)-Aktivität aufweisende Einheit enthält, das Edukt Isomaltulose gegeben und solange inkubiert, bis 1,6-GPS gebildet wird und aus der Reaktionslösung mittels herkömmlicher Verfahren, zum Beispiel Kristallisation, gewonnen werden kann.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer wässrigen Reaktionslösung ungepuffertes oder mittels herkömmlicher Puffersysteme gepuffer- tes Wasser verstanden, in dem je nach Ausgangs-und Zielbedingungen Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Indikatorsysteme, Reduktionsäquivalente, Regenera- tionsmittel, Nährmediumsbestandteile, Salze, Zu- cker, Zuckeralkohole etc. enthalten sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die SDH-Aktivität aufweisende Einheit das Enzym SDH. Für die erfindungsgemäße enzymatische Umset- zung von Isomaltulose zu 1,6-GPS ist es möglich, die SDH-Aktivität aufweisende Einheit, also das En- zym SDH, in gereinigter, angereicherter und/oder isolierter Form in die Reaktionslösung einzubrin-

gen, wobei das Enzym zum Beispiel natürlichen Ur- sprungs sein kann. Selbstverständlich kann die er- findungsgemäß eingesetzte SDH auch eine rekombinant hergestellte erfindungsgemäße SDH aus einem gen- technisch veränderten Organismus sein. Es ist vor- teilhaft, isolierte SDH dann zu verwenden, wenn Un- tersuchungen zur Kinetik des Umsatzes von Isomaltu- lose zu 1,6-GPS zwecks Optimierung dieser Reaktion erfolgen sollen. Insbesondere alle Fragestellungen, die sich mit dem chemischen Gleichgewicht der Um- setzung von Isomaltulose zu 1,6-GPS beschäftigen, erfordern es, mit isolierten Enzymen zu arbeiten, da sonst Stöchiometrie, Dissoziationskonstanten, Fragen zur Hemmung oder Aktivierung des Enzyms, Probleme der Kooperativität, der Initialgeschwin- digkeit, der Konformation, der Liganden und aller anderen Probleme der Enzymkinetik und der interes- sierenden Bindungsdaten nicht präzise genug analy- siert werden können. Vor allem um die Reaktion ge- zielt zu beeinflussen, ist es vorteilhaft, dass die SDH-Aktivität aufweisende Einheit in isolierter Form vorliegt, da sonst nicht ausgeschlossen werden kann, dass durch Wechselwirkungen mit anderen Be- standteilen der Reaktionslösung die Resultate der pH-Wert-, Ionenkonzentration-und Temperatur- Modifikationen nicht reproduzierbar sind, da gerei- nigte, partiell gereinigte und an Zellen gebundene Enzyme in der Analytik divergierende Werte zeigen.

Die Erfindung betrifft demgemäss auch ein Verfahren zur partiellen oder vollständigen Isolierung einer SDH aus Mikroorganismen, insbesondere aus Mikroor- ganismen der Gattung Gluconobacter, besonders be- vorzugt der Art Gluconobacter suboxidans, wobei in

einem ersten Schritt die Mikroorganismen mittels üblicher Verfahren aufgeschlossen und zu einem Roh- extrakt homogenisiert werden, in einem zweiten Schritt eine Separation des Rohextraktes mittels Anionentauscherchromatografie, in einem dritten Schritt eine Gelfiltration und in einem vierten Schritt eine Farbstoff-Affinitätschromatografie stattfindet. In bevorzugter Weise ist es erfin- dungsgemäß vorgesehen, dass nach der Farbstoff- Affinitätschromatografie erhaltene partiell aufge- reinigte Enzym mittel Chromatofocussierung oder in einer anderen bevorzugten Ausgestaltung mittels ei- ner weiteren Farbstoff-Affinitätschromatografie mit anschließender Affinitätselution mit mindestens ei- nem Reduktionsäquivalent zur Homogenität aufzurei- nigen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von SDH aus einem Mikroor- ganismus, wobei der Mikroorganismus in einem ersten Verfahrensschritt aufgeschlossen und zu einem Roh- extrakt homogenisiert, in einem zweiten Verfahrens- schritt der erhaltene Rohextrakt einer Anionentau- scherchromatograpie, in einem dritten Verfahrens- schritt einer ersten Farb-Liganden-Affinitäts- chromatographie und in einem vierten Verfahrens- schritt eine zweiten Farb-Liganden-Affinitäts- chromatographie unterzogen wird. In einer ganz be- sonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei nach der ersten und vor der zweiten Farb-Liganden- Affinitätschromatographie eine Ultrafiltration durchgeführt wird. In besonders bevorzugter Ausfüh-

rungsform wird im Anschluss an das vorgenannte Ver- fahren, also nach der zweiten Farb-Liganden- Affinitätschromatographie eine Affinitätselution der reinen SDH durchgeführt, wobei dazu ein Reduk- tionsäquivalent, insbesondere NADH, eingesetzt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die SDH-Aktivität aufweisende Einheit ein SDH- enthaltender toter oder lebender Mikroorganismus oder ein Rohextrakt oder Homogenat davon. Die er- findungsgemäß in bevorzugter Weise vorgesehene Um- setzung mit toten, besonders bevorzugt getrockne- ten, Mikroorganismen erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nach der Rehydratisierung dieser in Gegenwart einer SDH- Enzymlösung nach Standardmethoden zum Beispiel un- ter Zusatz von Tannin und/oder Glutaraldehyd und ist deshalb vorteilhaft, da das lösliche Enzym den Mikroorganismus in hoher Konzentration fest umla- gert. Selbstverständlich kann die Rehydratisierung auch mit Wasser durchgeführt werden oder aber ganz auf eine gesonderte Rehydratisierung verzichtet werden, so dass die toten Organismen direkt in die wässrige Reaktionslösung eingebracht werden. Die erfindungsgemäß auch vorgesehene Umsetzung von Iso- maltulose mit vitalen Mikroorganismen hat unter an- derem den Vorteil, dass sie mit verhältnismäßig ge- ringem Aufwand erfolgen kann.

Bioreaktoren, in denen Mikroorganismen zum Einsatz kommen, sind in der Regel überall einsetzbar und erfordern im Vergleich zu den chemisch- katalytischen Umsetzungen von Isomaltulose zu 1,6-

GPS einen geringeren Energie-und Wartungsaufwand.

Selbstverständlich müssen die Reaktionsbedingungen (pH-Wert, Ionenkonzentration, Sauer- stoff/Kohlendioxidbedarf, Spurenelemente, Tempera- turen und ähnliches) so gewählt sein, dass die Mik- roorganismen zu einer optimalen Umsetzung von Iso- maltulose zu 1,6-GPS befähigt sind. Unter diesen Verfahrensbedingungen kann die SDH im natürlichen Mikro-Milieu-also innerhalb der Zelle-eine höhere Stabilität und Effektivität aufweisen als das iso- lierte Enzym. Außerdem kann unter geeigneten Bedin- gungen eine Zellvermehrung und somit eine Erhöhung der SDH-Konzentration möglich sein. Gegenüber dem Stand der Technik, gemäß dem mit aufwendig herzu- stellenden Katalysatoren und technischem Wasser- stoff gearbeitet werden muss, bedeutet die enzyma- tische Umsetzung mittels Mikroorganismen also einen bedeutenden Vorteil, was Zuverlässigkeit, Automati- sierung und Einfachheit sowie Qualität und Ausbeute des Endprodukts des Verfahrens angeht.

Erfindungsgemäß ist es in bevorzugter Ausführungs- form der Erfindung vorgesehen, bestimmte Zellkom- partimente oder Teile davon voneinander zu trennen oder zu vereinigen. Kohlenhydratstrukturen, Lipide oder Proteine und/oder Peptide sowie Nucleinsäuren, die in der Lage sind, die SDH-Aktivität aufweisende Einheit beziehungsweise das Enzym positiv oder ne- gativ zu beeinflussen, können so vereinigt oder ge- trennt werden. Um diese Beeinflussung zu umgehen oder gezielt zu nutzen, werden aus den Mikroorga- nismen Rohextrakte hergestellt. Dies kann mittels Beschallung, durch Pressen, Homogenisieren, Mixen mit Glaskugeln, durch Detergenzien, Einfluss elekt-

rischer Felder, mechanisches Bearbeiten in flüssi- gem Stickstoff oder durch enzymatischen Verdau der Zellmembran und-wände erfolgen. In einem weiteren Schritt kann in bevorzugter Ausführungsform der ge- wonnene Extrakt zentrifugiert werden, um die erfin- dungsgemäße Umsetzung mit dem Überstand oder dem Sediment durchzuführen. Die Herstellung des Rohex- traktes hat weiterhin den Vorteil, dass mittels einfacher Messung der Extinktion das Verhältnis von Nucleinsäuren zu Enzym bestimmt werden kann. Unter bestimmten Verfahrensbedingungen kann es nämlich notwendig sein, die Nucleinsäuren abzutrennen, da diese Komplexe mit der SDH-Aktivität aufweisenden Einheit eingehen können und so die Effizienz der Umwandlung von Isomaltulose zu 1,6-GPS herabsetzen.

Die Herstellung eines Rohextraktes im Sinne der Er- findung schließt auch alle Maßnahmen ein, die den Rohextrakt stabilisieren, beziehungsweise in seiner katalytischen Wirkung optimieren. Hierzu kann der Zusatz von Protaminsulfat, Manganchlorid und Lyso- zym ebenso gehören wie die Veränderung der Io- nenstärke und alle Maßnahmen, die dazu dienen, die Protease-Aktivität des erfindungsgemäßen Rohextrak- tes so zu modifizieren, dass die SDH-Aktivität auf- weisende Einheit stabilisiert und in ihrer Wirkung optimiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der SDH enthaltende Mikroorganismus oder der Orga- nismus, aus dem die vollständig oder partiell ge- reinigte SDH stammt, ein Organismus der Gattung Gluconobacter, insbesondere Gluconobacter suboxi- dans, besonders bevorzugt Gluconobacter suboxidans DSM 2003. Insbesondere in der erfindungsgemäß be-

vorzugt vorgesehenen Kombination mit dem Coenzym- Regenerationssystem SDH/FDH (Formiat-Dehydrogenase) ist mit den genannten Stämmen eine sehr gute Aus- beute an 1,6-GPS zu erzielen. Jedoch ist die enzy- matische Umsetzung durch Mikroorganismen keines- falls auf diese beiden Stämme beschränkt. Sämtliche Organismen, insbesondere Mikroorganismen, die in der Lage sind, Isomaltulose in einem oder mehreren Schritten zu 1,6-GPS umzusetzen, können erfindungs- gemäß eingesetzt werden, zum Beispiel auch Pilze, Hefen, Zellkulturen etc.. Dazu können Mutanten, gentechnisch geänderte oder sonstwie hergestellte oder isolierte Abwandlungen der vorgenannten Orga- nismen zählen, zum Beispiel Organismen, die auf- grund des Einführens einer SDH-codierenden Nucleo- tidsequenz SDH-Aktivität aufweisen. Bevorzugt sind Organismen, die auch eine Saccharose-Mutase- Aktivität aufweisen, so dass mittels eines einzigen Organismustyps Saccharose enzymatisch zu 1,6-GPS umgewandelt werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen SDH-Aktivität aufweisenden Einheiten, insbesondere Mikroorganismen, Rohextrak- te, Teile davon und/oder die angereicherten oder isolierten Enzyme immobilisiert. Durch Immobilisie- rung werden Enzyme, Zellorganellen und Zellen in einen unlöslichen und reaktionsraumbegrenzten Zu- stand versetzt. Erfindungsgemäß wird die SDH- Aktivität aufweisende Einheit unter Bedingungen, unter denen sie möglichst hohe SDH-Enzymaktivitäten aufweist, immobilisiert. Erfindungsgemäß ist auch der Einschluss von vitalen Zellen in Polymere vor- gesehen. Die Immobilisierung kann durch (i) Bindung

wie auch mittels (ii) Einschluss erfolgen. Bei ei- ner Bindungs-Immobilisierung der SDH-Aktivität auf- weisenden Einheit sind Trägerbindungen (ionisch o- der kovalent) und Quervernetzungen (Vernetzung un- tereinander oder Vernetzung mit anderen Polymeren) vorhanden. Bei einer Einschluß-Immobilisierung der SDH-Aktivität aufweisenden Einheit wird der Ein- schluss in Gelstrukturen (Kugeln, Fasern und ähnli- ches) und in Membranen (Mikrokapseln und Membranre- aktoren) vorgesehen. Unter Immobilisierung werden demgemäss alle Methoden verstanden, die zur Ein- schränkung der Beweglichkeit und Löslichkeit der SDH-Aktivität aufweisenden Einheit auf biologi- schem, chemischem oder physikalischem Wege dienen.

Dies kann insbesondere durch Adsorption an inerte oder elektrisch geladene, anorganische oder organi- sche Trägermaterialien erfolgen, wobei die anorga- nischen Materialien zum Beispiel poröse Gläser, Si- licagel, Aluminiumoxid und Hydroxylapatit oder Me- talloxide sind ; die natürlichen Polymere können zum Beispiel Cellulose, Stärke, Dextran oder Agarose sein und die synthetischen Polymere können Polyac- rylamid, Polyvinylalkohol, Nylon oder andere sein.

Es ist erfindungsgemäß auch vorgesehen, die SDH- Aktivität aufweisende Einheit in ein dreidimensio- nales Netzwerk einzuschließen ; in einer Ausfüh- rungsform der Erfindung kann dies Gelatine oder A- gar sein. Weiterhin kann vorgesehen sein, die Immo- bilisierung mittels Quervernetzung mit bifunktio- nellen Agenzien wie Glutardialdehyd oder Benzidin durchzuführen. Es ist auch eine Mikroverkapselung der SDH-Aktivität aufweisenden Einheit möglich, die zur Eingrenzung des Reaktionsraums mit Hilfe von künstlichen oder biologischen Membranen führt. Die

Erfindung erfasst auch eine Immobilisierung ohne Träger durch Flockung und"cross-linking"ebenso wie eine Coimmobilisierung lebender und/oder toter Zellen mit freien oder immobilisierten Enzymen.

Auch die Molekulargewichtsvergrößerung beispiels- weise durch die Bindung an Dextran dient der Immo- bilisierung im Sinne der Erfindung. Bei dem immobi- lisierten Enzym kann es sich um ein Enzym handeln, welches an Kompartimente eines Mikroorganismus oder an einem vollständig erhaltenen vitalen oder ge- trockneten Mikroorganismus gebunden ist, im Sinne der Erfindung kann immobilisiert jedoch auch bedeu- ten, dass das Enzym alleine oder das Enzym in Ver- bindung mit Kompartimenten des Organismus an einen Träger gebunden ist. Von Bedeutung ist, dass die beladene Matrix mit der Isomaltulose so in Berüh- rung gelangen kann, dass die gewünschte enzymati- sche Reaktion zu 1,6-GPS abläuft. Selbstverständ- lich betrifft die Erfindung jedoch auch die Verwen- dung der genannten SDH-Aktivität aufweisenden Ein- heit in freier, das heißt nicht immobilisierter Form.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße enzymatische Umwandlung mit oder ohne pH-Wert-Regulierung durchgeführt. Insbe- sondere, da in besonders bevorzugter Ausführungs- form Reduktionsäquivalente in Form von Wasserstoff- überträgern zum Einsatz kommen, hat die Wahl des pH-Wertes Einfluss auf das Gleichgewicht der chemi- schen Reaktion wie auch auf die Gesamtausbeute an 1,6-GPS. Demgemäss lässt sich die enzymatische Um- setzung von Isomaltulose zu 1,6-GPS in die Reaktio- nen einteilen, bei denen keine Regulierung des pH-

Wertes erfolgt und die, bei denen eine Regulierung des pH-Wertes erfolgt. Die Regulierung des pH- Wertes kann durch Zu-oder Abgabe von Stoffen er- folgen, die in der Lage sind, den pH-Wert anzuhe- ben, zu senken oder zu stabilisieren. Erfindungsge- mäß können Säuren oder Basen nach der Lowry- Brönsted-oder Lewis-Pearson-Definition verwendet werden, wobei Protonen, Hydronium-Ionen, Hydroxid- Ionen, oder freie Elektronenpaare abgegeben bezie- hungsweise zur Verfügung gestellt oder aufgenommen werden können. Beispielsweise kann eine Begasung der wässrigen Reaktionslösung mit C02 vorgesehen sein, die-als Einleitung einer Säure-eine Maß- nahme zur pH-Wert-Regulierung ist. Es kann in vor- teilhafter Weise angestrebt sein, dass sich der pH- Wert in einem Bereich einstellt, der als optimal für die Aktivität des Enzyms anzusehen ist. Dieses pH-Optimum kann durch verschiedene Puffer oder durch die Zugabe von pH-Wert-absenkenden oder erhö- henden Substanzen erfolgen. Insgesamt ist jedoch die pH-Wert-Regulierung keinesfalls auf chemische Verfahren wie zum Beispiel Komplexbildungsvorgänge, Titrationen oder ähnliches beschränkt. Jeder Ein- griff in das System, der dazu führt, dass der pH- Wert in irgendeiner Weise reguliert oder stabili- siert werden kann, gilt im Sinne der Erfindung als Durchführung einer PH-Wert-Regulierung. In vorteil- hafter Ausgestaltung der Erfindung liegt der pH- Wert der wässrigen Reaktionslösung bei etwa 6,0 bis 8,0, vorzugsweise bei pH 7,0.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden der wässrigen Reaktionslösung neben der SDH- Aktivität aufweisenden Einheit auch Reduktionsäqui-

valente zugegeben, insbesondere dann, wenn gerei- nigte und isolierte SDH verwendet wird. Reduktions- äquivalente im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Wasserstoffüberträger oder Elektronen-Carrier, die in Form von Coenzymen oder prosthetischen Grup- pen vorliegen können. Solche Reduktionsäquivalente können beispielsweise NAD+/NADH, NADP+/NADPH, FMN/FMNH2 oder FAD/FADH2 sein. Coenzyme und prosthetische Gruppen von Oxidoreduktionsreaktionen dienen als dissoziierbare und/oder fest an Proteine gebundene Wasserstoff-und/oder Elektronenüberträ- ger. Als Reduktionsäquivalente können jedoch auch andere Coenzyme/prosthetische Gruppen dienen, die in der Lage sind, Wasserstoffatome bzw. Elektronen zu übertragen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind ins- besondere cyclische Tetrapyrrole, Glutathion, Li- ponsäure, Chinone, Eisen-Schwefel-Proteine, Flavo- Proteine, Flavin-Nucleotide und alle anderen, die während der enzymatischen Katalyse Protonen, Atome und/oder Elektronen beziehungsweise funktionelle Gruppen übertragen können.

In bevorzugter Weise werden zur enzymatischen Her- stellung von 1,6-GPS lebende SDH-Aktivität aufwei- sende Zellen verwendet, so dass sich die Zugabe von Reduktionsäquivalenten erübrigt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform erfolgt die enzymatische Umsetzung von Isomaltulose zu 1,6-GPS in Gegenwart von Regenera- tionsmitteln wie Formiat-Dehydrogenase (FDH) und/oder Formiat, insbesondere dann, wenn gereinig- te und isolierte SDH verwendet wird. Durch die Zu- gabe von SDH und FDH in die wässrige Reaktionslö-

sung ist eine chemische Reaktion möglich, während der ständig Formiat zu COs umgewandelt wird und I- somaltulose zu 1,6-GPS. Die Umwandlung des Formiats in COz erfolgt über die FDH. Die bei dieser Oxida- tion von einem ebenfalls in der Reaktionslösung vorhandenen Reduktionsmittel, zum Beispiel NAD+, aufgenommenen Wasserstoffatome werden bei der pa- rallel ablaufenden Reduktion von Isomaltulose zu 1,6-GPS eingesetzt. Selbstverständlich können an- stelle der FDH auch völlig andere Dehydrogenasen oder Enzyme mit anderen Substratspezifitäten als Coenzym des Regenerierungssystems, also als Regene- rationsmittel, in Frage kommen. Beispielsweise sind andere Carbonsäuren beziehungsweise deren Salze als Regenerationsmittel einsetzbar. Von Bedeutung ist, dass die zugegebenen Substanzen, insbesondere FDH/Formiat, in der Lage sind, mit Wasserstoffüber- trägern, Coenzymen oder prosthetischen Gruppen so zu reagieren, dass Elektronen und/oder Wasserstoff- atome so übertragen werden, dass die kontinuierli- che Bildung von 1,6-GPS möglich ist. Im Falle der Verwendung lebender Zellen als SDH-Aktivität auf- weisender Einheit kann die Zugabe von Regenerati- onsmittels und Reduktionsäquivalenten unterbleiben.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform erfolgt die Umwandlung von Isomaltulose in 1,6-GPS im Rahmen eines kontinuierlichen Verfah- rens. Das kontinuierliche Verfahren der Erfindung kann in einem durchströmten Reaktor durchgeführt werden, in dem mikrobielles Wachstum und somit die Produktbildung, die Synthese von 1,6-GPS, stattfin- det. Auf diese Weise können sehr große Mengen von 1,6-GPS hergestellt werden. Durch die Verwendung

des kontinuierlichen Verfahrens sind die Reini- gungs-und Vorbereitungszyklen frei wählbar und nicht durch die Parameter von spezifischen Fermen- tatoren oder bestimmte physiologischen Eigenschaf- ten der Mikroorganismen vorgegeben, da sich in kon- tinuierlichen Systemen das die Mikroorganismen um- gebende Milieu nicht durch die verbrauchten Sub- strate und entstehenden Produkte ändert, weil die Produkte ständig abgeführt und die Substrate stän- dig zugeführt werden. Außerdem können die Bioreak- toren oder Anlagen im kontinuierlichen Verfahren viel kleiner und kostengünstiger ausgelegt werden.

Unter einem kontinuierlichen Verfahren versteht man im Sinne der Erfindung auch alle ergänzenden Maß- nahmen, die dazu dienen, die Gefahr der Infektion mit anderen Organismen, die sich durch die Sub- stratdurchschleusung schnell im System ausbreiten können, zu verhindern. Dies kann sterile wie auch nicht-sterile Bedingungen einschließen. Die vorlie- gende Erfindung betrifft auch Verfahrensmaßnahmen und Mittel, die dazu dienen, die kontinuierliche Fermentation durch Extrembedingungen so zu gestal- ten, dass sie gegen mögliche Infektionen aufgrund der gewählten extremen Bedingungen (zum Beispiel puffern bei einem sehr niedriger pH-Wert oder Anti- biotika-Einsatz) stabil sind. Dabei können erfin- dungsgemäß Abwandlungen oder Modifikationen der vorgenannten SDH-Aktivität aufweisenden Einheiten eingesetzt werden, die diesen infektionsfeindlichen Bedingungen angepasst sind, zum Beispiel Antibioti- ka-resistente Mikroorganismen. Unter einem kontinu- ierlichen Verfahren im Sinne der Erfindung kann je- doch auch jedes System wachsender Zellen und kata- lysierender Enzyme verstanden werden, dem einer-

seits Nährlösung zugeführt wird und aus dem ande- rerseits Kulturlösung, einschließlich des enzyma- tisch gebildeten 1,6-GPS, abgezogen wird ; hierbei kann es sich um homogene wie auch inhomogene Syste- me handeln.

Die Erfindung betrifft selbstverständlich auch se- mikontinuierliche oder batchweise Verfahrensführun- gen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Isomaltulose, die der Ausgangsstoff für die Um- wandlungsreaktion zu 1,6-GPS ist, durch enzymati- sche Umwandlung von Saccharose hergestellt. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Isomal- tulose kann durch enzymatische Umwandlung (Trans- glucosidierung) mittels gereinigter oder angerei- cherter Enzyme, Rohextrakte oder Mikroorganismen aus Saccharose hergestellt werden, die eine Saccha- rose-Mutaseaktivität aufweisen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Saccha- rose-Mutase also ein Enzym verstanden, dass zur I- somerisierung von Saccharose zu Isomaltulose in der Lage ist und auch als Saccharose-Isomerase bekannt ist.

Beispiele für Zellen, die für ein Protein mit Sac- charose-Mutase-Aktivität codierende Nucleotidse- quenzen enthalten, sind insbesondere Mikroorganis- men der Gattungen Protaminobacter, Erwinia, Serra- tia, Leuconostoc, Pseudomonas, Agrobacterium, Kleb- siella und Enterobacter. Spezifische Beispiele für solche Mikroorganismen sind Protaminobacter rubrum (CBS 547,77), Erwinia rhapontici (NCPPB 1578), Ser-

ratia plymuthica (ATCC 15928), Serratia marcescens (NCIB 8285), Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f (ATCC 10830a), Pseudomonas mesoacidophila MX-45 (FERM 11808 beziehungsweise FERM BP 3619), Agrobac- terium radiobacter MX-232 (FERM 12397 beziehungs- weise FERM BP 3620), Klebsiella subspecies und En- terobacter species.

Spezifische Beispiele für Proteine mit Saccharose- Mutase Aktivität und dafür codierende Nucleinsäuren aus P. rubrum, E. rhapontici, Enterobacter spec.

SZ62 und P. mesoacidophila sind in PCT/EP 95/00165 beschrieben.

Die genannten Zellen oder Proteine oder Nucleotid- sequenzen aus diesen Zellen können zusammen mit ei- ner SDH-Aktivität aufweisenden Einheit der vorlie- genden Erfindung zur Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose verwendet werden, zum Beispiel, indem SDH-codierende Nucleotidsequenzen unter Kontrolle regulatorischer Einheiten in die vorgenannten Zel- len eingeführt und exprimiert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die enzymatische Umsetzung von Saccharose zu Iso- maltulose mittels, vorzugsweise immobilisierter, P. rubrum-Zellen (Protaminobacter rubrum) oder eines Zellaufschlusses oder Rohextraktes von P. rubrum oder mittels partiell oder vollständig gereinigter Saccharose-Mutase (auch Saccharose-Isomerase) durchgeführt. Diese Umsetzung geschieht bevorzug- terweise zusammen in einer Reaktionslösung mit der SDH-abhängigen Umsetzung von Isomaltulose zu 1,6- GPS.

Die enzymatische Umlagerung von Saccharose zu Iso- maltulose wird beispielsweise in der DE 195 23 560 AI oder der DE 44 14 185 Cl beschrieben, die hin- sichtlich der dort offenbarten Mikroorganismen, DNA-Sequenzen, Enzyme und Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose durch enzymatische Umwandlung aus Saccharose vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung einbezogen sind.

Die Immobilisierung von Saccharose-Mutase aufwei- senden Zellen, zum Beispiel P. rubrum, von Zellauf- schlüssen davon oder von dem isolierten Enzym (Saccharose-Mutase) dient der Einschränkung der Be- weglichkeit und Löslichkeit der eingesetzten Bioka- talysatoren auf biologischem, chemischem und/oder physikalischem Wege. Die Immobilisierung im Sinne der Erfindung kann durch unterschiedliche Methoden erfolgen, wie zum Beispiel die Bindung der Biokata- lysatoren untereinander oder an Trägerstoffe, durch Fixieren im Netzwerk einer polymeren Matrix oder durch das Umschließen mit artifiziellen oder natür- lichen Membranen, was selbstverständlich den Ein- satz inverser Micellen einschließt. Durch die Immo- bilisierung der Zellen, der Zellaufschlüsse o- der/und der Saccharose-Mutase werden die so erzeug- ten Biokatalysatoren nicht nur wiederverwendbar, sie können vor allem nach oder während des Prozes- ses leicht abgetrennt werden, um sie gegebenenfalls durch andere Katalysatoren, die andere Reaktionen, wie die Umsetzung von Isomaltulose zu 1,6-GPS, ka- talysieren, zu ersetzen. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass Zellen oder Enzyme durch die Immobilisie- rung in viel höheren lokalen Konzentrationen und

vor allem in kontinuierlichen Durchflusssystemen eingesetzt werden können. Die Immobilisierung kann hierbei auf keramischen Trägern, auf Polymeren, auf verschiedenen Gelen und Gelatinen, durch Einschluss in Polyacrylamid oder andere Verfahren erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform er- folgt die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose und von Isomaltulose zu 1,6-GPS in einem einzigen Verfahrensschritt, das heißt die beiden enzymati- schen Umwandlungsreaktionen laufen gleichzeitig o- der leicht zeitversetzt in ein und derselben wäss- rigen Reaktionslösung ab. Die Umwandlung von Sac- charose zu 1,6-GPS kann deshalb in einem Verfah- rensschritt erfolgen, da die beiden einzelnen Um- wandlungsreaktionen enzymatisch unter gleichen oder ähnlichen Verfahrensbedingungen ablaufen können.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform er- folgt die Umsetzung von Saccharose zu 1,6-GPS in einem einzigen Bioreaktor (sogenannte"Eintopf- reaktion").

Diese Ausgestaltungen der Erfindung umfassen die direkte enzymatische Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose, wobei sowohl für die Umsetzung von Sac- charose zu Isomaltulose als auch von Isomaltulose zu 1,6-GPS vorgenannte nicht-immobilisierte und im- mobilisierte Zellen, Rohextrakte und/oder Enzyme zum Einsatz kommen können, die also jeweils SDH- und Saccharose-Mutase-Aktivitäten aufweisen.

Erfindungsgemäß ist die Umwandlung auch in einer Batch-und/oder Fed Batch-Fermentation (einer dis-

kontinuierliche Fermentation) möglich, wobei das Nährmedium zu einem definierten Zeitpunkt beimpft wird und die Fermentation nach Verbrauch des limi- tierenden Substrates, was zum Beispiel Saccharose, andere Substrate oder Enzyme/Coenzyme sein können -oder zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt-been- det wird. Die Reaktionsbedingungen können jedoch auch so gewählt sein, dass der limitierende Ein- fluss eines Substrates weitgehend ausgeschlossen wird. Batch-Reaktionen können in einem sogenannten geschlossenen System durchgeführt werden. Diese Systeme sind erfindungsgemäß auch als geschlossen aufzufassen, wenn der geschlossenen flüssigen Phase kontinuierlich Sauerstoff, Luft oder ein anderes Gas oder Gasgemisch zugeführt wird. In einem Batch- Verfahren ändert sich die Umgebung der Zellen stän- dig, da es zu einer Abnahme des Substrates und un- ter anderem zu einer Zunahme von 1,6-GPS und unter gewissen Umständen auch zu einer Zunahme der Zell- konzentration kommen kann. Das vorgenannte "Eintopfverfahren"kann im Sinne der Erfindung auch unter Einhaltung eines Fließgleichgewichtes-unter ständiger Abfuhr von 1,6-GPS- als kontinuierliche Enzymkatalyse durchgeführt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform be- trägt die Temperatur der wässrigen Reaktionslösung bei der enzymatischen Umwandlung 20°C bis 40°C, insbesondere 25°C. Bei Temperaturen von 25°C weist die gereinigte SDH eine Stabilität von ca. einer Woche auf. Somit sind Temperaturen in diesem Be- reich gut geeignet, um längerfristige enzymkataly- tische Verfahren durchzuführen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform be- trifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose, wobei die Saccharose erst enzymatisch zu Isomaltulose umgewandelt und anschließend die Isomaltulose enzymatisch zu 1,6- GPS umgesetzt wird. Dieser gesamte Vorgang kann kontinuierlich, semi-kontinuierlich oder nicht- kontinuierlich, in einem oder mehreren Verfahrens- schritten und in einem oder mehreren Bioreaktoren ablaufen.

Die Erfindung betrifft auch ein Nucleinsäuremolekül codierend ein Enzym mit der Aktivität einer Sorbi- tol-Dehydrogenase (SDH), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codie- ren, das die unter SEQ ID Nr. 1 angegebene A- minosäuresequenz aufweist oder ein komplemen- tärer Strang davon ; b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nr. 2 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder ein komplementärer Strang davon ; c) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem unter a) oder b) genannten Nucleinsäuremolekül hybridi- seren ; d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Co- des von der Sequenz der unter b) oder c) ge- nannten Nucleinsäuremoleküle abweicht.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Enzym mit einer Sorbitol-Dehydrogenase- Aktivität ein Protein oder Peptid verstanden, das in der Lage ist, die Umwandlung von Isomaltulose zu 1,6-GPS zu katalysieren. Dabei kann die umzuwan- delnde Isomaltulose aus der enzymatischen Umsetzung von Saccharose stammen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugs- weise aus Gluconobacter spec., oder sie können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich, verschiedenartige Mutationen in die erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzufügen, wo- durch es zur Synthese von Enzymen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt, die ebenfalls von der Erfindung erfasst werden. Mutati- onen im Sinne der Erfindung betreffen auch alle De- letionsmutationen, die zu verkürzten Enzymen füh- ren. Durch andere molekulare Mechanismen wie Inser- tionen, Duplikationen, Transpositionen, Genfusion, Nucleotidaustausch aber auch durch Gentransfer zwi- schen verschiedenen Mikroorganismenstämmen und an- dere kann es beispielsweise zu Modifikationen der Enzymaktivität und/oder der Regulierung des Enzyms kommen. Auf diese Weise können beispielsweise mut- ante Enzyme hergestellt werden, die einen veränder- ten Km-Wert, Ki-Wert oder Ka-Wert besitzen und/oder den normalerweise in den Zellen vorliegenden Regu- lationsmechanismen nicht mehr oder in veränderter Form unterliegen. Des weiteren können erfindungsge- mäß mutante Enzyme hergestellt werden, die eine veränderte Stabilität, Substrat-, Produktspezifität

oder ein verändertes Effektorenmuster oder ein mo- difiziertes Aktivitäts-, Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrations-Profil aufweisen. Weiterhin bezieht sich die erfindungsgemäße Lehre auf Enzyme, die eine veränderte aktive Enzymkonzentration, ei- nen modifizierten Aufbau der Untereinheiten, prä- und posttranslationelle Modifikationen zum Beispiel Signal-und/oder Transportpeptide und/oder andere funktionelle Gruppen aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die mit den vorgenannten erfindungsgemäßen Nuclein- säuremolekülen hybridisieren. Hybridisierung bedeu- tet im Rahmen der Erfindung eine Hybridisierung un- ter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A labo- ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989) beschrieben ist, vorzugsweise un- ter stringenten Bedingungen. Gemäß vorliegender Er- findung spricht man von einer Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0, 1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 Stunde in 0,2 x SSC und 0, 1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein po- sitives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in den Sequenzprotokollen angegebenen Nucleotidsequen- zen hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine er- findungsgemäße Nucleotidsequenz.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nuc- leinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder von

Teilen dieser Moleküle beziehungsweise des komple- mentären Stranges erfolgen. Als Hybrisierungsprobe können zum Beispiel Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un- ter SEQ ID Nr. 2 dargestellte Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybri- disierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt werden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines er- findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben be- schriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein erfin- dungsgemäßes Enzym codieren. Unter"Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle ver- standen, die lang genug sind, um das beschriebene Enzym zu codieren. Der Ausdruck"Derivat"bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der o- ben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer o- der mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufwei- sen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, insbesondere eine Identität von mindestens 60 %, vorzugsweise über 80 % und be- sonders bevorzugt über 90 %, 95 %, 97 % oder 99 % auf Nucleinsäureebene. Dabei weisen die durch diese Nucleinsäuremoleküle codierten Enzyme eine Sequenz- identität zu der in SEQ ID Nr. 1 angegebenen Amino- säuresequenz von mindestens 80 %, vorzugsweise 85 % und besonders bevorzugt von über 90 %, 95 %, 97 % und 99 % auf Aminosäureebene auf. Die Abweichungen

zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substi- tution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutatio- nen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutage- nese (UV-oder Röntgenstrahlen, chemische Agenzien oder andere) eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Se- quenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian- ten. Die von den verschiedenen Varianten der erfin- dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Enzyme weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Enzymaktivität, aktive Enzymkonzentration, Un- tereinheiten, posttranslationelle Modifikationen, funktionelle Gruppen, Molekulargewicht, immunologi- sche Reaktivität, Konformation und/oder physikali- sche Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gele- lektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Se- dimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektrosko- pische Eigenschaften, Stabilität, pH-Wert-Optimum, isoelektrischer pH-Wert, Temperatur-Optimum und/oder andere.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA-als auch RNA-Moleküle handeln. Erfindungsgemäße DNA-Moleküle sind bei- spielsweise genomische DNA oder cDNA-Moleküle.

Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die erfin- dungsgemäße Nucleinsäuremoleküle enthalten. Vor- zugsweise handelt es sich dabei um Plasmide, Cosmi- de, Viren, Bacteriophagen, Shuttle-Vektoren und an- dere in der Gentechnik übliche Vektoren. Die erfin- dungsgemäßen Vektoren können noch weitere Funkti- onseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsor- ganismus bewirken oder dazu beitragen.

In einer besonderen Ausführungsform werden erfin- dungsgemäß auch die Vektoren erfasst, bei denen das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül mit mindestens einem regulatorischen Element operativ verbunden ist, das die Transcription und Synthese transla- tierbarer Nucleinsäuremoleküle in pro-und/oder eu- caryotischen Zellen gewährleistet. Derartige regu- latorische Elemente können Promotoren, Enhancer, Operatoren und/oder Transcriptionsterminations- signale sein. Selbstverständlich können die Vekto- ren auch für ihre Stabilität und/oder Replikation notwendige Elemente ebenso wie Antibiotikum- Resistenzgene, also Selektionsmarker enthalten.

Die Erfindung betrifft auch die vorgenannten Vekto- ren, wobei diese neben der unter Kontrolle mindes- tens eines regulatorischen Elementes stehenden Nuc- leinsäuresequenz, welches eine SDH codiert, eine ebenfalls unter der Kontrolle mindestens eines re- gulatorischen Elementes stehende Nucleinsäurese- quenz enthält, die eine Saccharose-Mutase codiert.

Ein derartiger Vektor weist also die genetische In- formation für die beiden Enzyme auf, die für die enzymatische Umwandlung von Saccharose über Isomal-

tulose zu 1,6-GPS notwendig sind. Solche Vektoren erlauben es in besonders einfacher Weise, den Stoffwechselapparat eines einzelnen Wirtsorganis- musses zu nutzen, um Saccharose enzymatisch in ei- nem Verfahrensschritt zu 1,6-GPS umzuwandeln.

Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die eines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder ei- nen der erfindungsgemäßen Vektoren beinhalten be- ziehungsweise mit diesem transformiert sind und vorzugsweise in der Lage sind, SDH und gegebenen- falls die Saccharose-Mutase zu exprimieren sowie besonders bevorzugt 1,6-GPS aus Isomaltulose bezie- hungsweise Saccharose herzustellen. Weiterhin be- trifft die Erfindung alle Wirtszellen, die von ei- ner mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen oder den erfindungsgemäßen Vektoren transformierten Wirtszelle abstammen. Die Erfindung betrifft also Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäu- remoleküle oder Vektoren enthalten, wobei unter ei- ner Wirtszelle ein Organismus verstanden wird, der in der Lage ist, in vitro rekombinante Nucleinsäu- remoleküle aufzunehmen und gegebenenfalls die von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codier- ten Enzyme zu synthetisieren. Vorzugsweise sind dies procaryotische oder eucaryotische Zellen. Vor allem betrifft die Erfindung Mikroorganismen, die die erfindungsgemäßen Vektoren, Derivate oder Teile der Vektoren enthalten, die diese zu einer Synthese von Enzymen für die Herstellung von 1,6-GPS aus I- somaltulose oder aus Saccharose befähigen. Die er- findungsgemäße Wirtszelle kann auch dadurch gekenn- zeichnet sein, dass das eingeführte erfindungsgemä- ße Nucleinsäuremolekül entweder heterolog in bezug

auf die transformierte Zelle ist, das heißt natur- licherweise nicht in dieser Zelle vorkommt, oder aber an einem anderen Ort oder einer anderen Ko- pienzahl im Genom lokalisiert ist als die entspre- chende natürlicherweise auftretende Sequenz.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist diese Zelle eine procaryotische Zelle, vorzugsweise eine gram-negative procaryotische Zelle, besonders be- vorzugt eine Enterobakterienzelle. Dabei kann ei- nerseits eine Zelle verwendet werden, die kein ei- genes SDH-und/oder Saccharose-Mutasegen enthält zum Beispiel E. coli, andererseits können aber auch Zellen verwendet werden, die bereits ein oder zwei solcher Gene auf ihrem Chromosom enthalten. Bevor- zugte Beispiele für geeignete procaryotische Zellen sind E. coli-, Protaminobacter rubrum-, Erwinia rha- pontici-, Enterobacter spec.-oder Pseudomonas me- soacidophila-Zellen. Die Transformation procaryoti- scher Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen ist einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eucaryotische Zelle sein, wie eine Pilz- zelle (zum Beispiel Hefe) oder eine tierische Zel- le. Verfahren zur Transformation beziehungsweise Transfektion eucaryotischer Zellen mit exogenen Nucleinsäuresequenzen sind dem Fachmann auf dem Ge- biet der Molekularbiologie ebenfalls geläufig.

Die Erfindung betrifft auch Zellkulturen, die min- destens eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen auf-

weisen, wobei die erfindungsgemäße Zellkultur ins- besondere in der Lage ist, eine SDH und gegebenen- falls eine Saccharose-Mutase zu produzieren.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her- stellung einer SDH, wobei die erfindungsgemäße Wirtszelle in einem Kulturmedium unter solchen Be- dingungen kultiviert wird, die die Bildung der SDH erlaubt und diese gewonnen werden kann.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform sind Proteine, die durch erfindungsgemäße Nucleinsäure- moleküle codiert werden, sowie Verfahren zu deren Herstellung, wobei die erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlaubt, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturme- dium isoliert wird.

Weiterhin betrifft die Erfindung monoclonale und polyclonale Antikörper, die in der Lage sind, eine Struktur einer erfindungsgemäßen SDH-Aktivität auf- weisenden Einheit zu identifizieren und gegebenen- falls zu binden. Diese Struktur kann ein Protein, Kohlenhydrat wie auch ein Lipidkomplex und/oder Glycolipid sein, die mit der SDH-aufweisenden Ein- heit spezifisch in Beziehung stehen. Auch Antikör- per, die gegen Strukturen gerichtet sind, die als posttranslationelle Modifikationen der SDH anzu- sprechen sind, werden von der Erfindung erfasst.

Von Bedeutung ist, dass eine räumliche Elektronen- wolkenstruktur mittels Antikörpern so identifiziert werden kann, dass Rückschlüsse auf biologische,

chemische und physikalische Eigenschaften der SDH- Aktivität aufweisenden Einheit möglich sind.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform be- trifft die Erfindung auch Antikörper, die mit den erfindungsgemäßen vorgenannten Antikörpern inter- agieren, insbesondere diese identifizieren und bin- den können.

Weiterhin betrifft die Erfindung die vorgenannten Antikörper, wobei diese auf biologischem, chemi- schem und physikalischem Wege modifiziert sind.

Die Erfindung soll im folgenden anhand von Beispie- len und zugehöriger Figuren erläutert werden.

Die Figuren zeigen : Figur 1 eine Plasmidkarte des Plasmids pBtac 2 und Figur 2 eine Plasmidkarte pHWG 467.

SEQ ID Nr. 1 zeigt die 262 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz der SDH, SEQ ID Nr. 2 zeigt die 789 Nucleotide umfassende Nucleotidsequenz der SDH, SEQ ID Nr. 3 zeigen partielle Aminosäuresequenzen bis 9 der SDH.

Beispiel 1 : Herstellung der SDH Die Biomasseproduktion von Gluconobacter suboxidans Um ausreichend Biomasse von Gluconobacter suboxi- dans DSM 2003 zur Verfügung zu stellen, wurde der Stamm im Labormaßstab fermentiert. Als ein Medium 1 wurde verwandt : D-Mannit (50 g/L), Pepton aus Ca- sein (10 g/L), Hefe-Extrakt (5 g/L) und CaCO3 (20 g/L). Ein Medium 2 setzte sich wie folgt zusammen : D-Mannit (75 g/L), Pepton aus Casein (16 g/L), He- fe-Extrakt (8 g/L) und CaCO3 (1 g/L). Als Vorkultur wurde eine gefriergetrocknete Konserve des Stammes Gluconobacter suboxidans DSM 2003 in 1 mL Medium 1 suspendiert, auf eine Agar-Platte mit Medium 1 aus- gestrichen und 72 h bei 25 °C kultiviert. Daraufhin wurde eine Abimpfung der Agarplatten-Kultur in 25 mL Medium 1 eingebracht und in einem Schüttelkolben 48 h bei 25 °C kultiviert. Die auch als erste Vor- kultur bezeichnete Kultur wurde dann in 250 mL Me- dium 1 in einem Schüttelkolben (Volumen 1 L) für 48 h bei 25 °C kultiviert. Die auf diesem Wege gewon- nene-auch als zweite Vorkultur bezeichnete-Kul- tur diente dann als Inoculum für die Fermentation.

Für die Fermentation wurde die zweite Vorkultur aus dem Schüttelkolben in 15 L des Mediums 2 in einen 20 L Fermenter transferiert und bei 25 °C unter folgenden Bedingungen kultiviert : pH-Wert : 6,9 (konstant gehalten durch Titration mit 5 N NaOH) Rührgeschwindigkeit : 350 U/min und Sauerstoff-Sättigung : 40 W.

Die genannten Bedingungen wurden während der Fer- mentation konstant gehalten. Die Fermentation wurde mit dem Ende des Zellwachstums-der durch Sub- stratverbrauch per HPLC festgestellt wurde-been- det.

Die so gewonnene Zellmasse wurde durch Zentrifuga- tion (8000 x g, 20 min, 4 °C) geerntet und mit ei- ner 0,9 W-igen NaCl-Lösung gewaschen und in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,0) 1 : 3 verdünnt und folgend im French-Press-Verfahren aufgeschlossen. Die entstan- denen Zelltrümmer wurden durch Ultrazentrifugation (110.000 x g, 20 min, 4 °C) entfernt. Der klare Ü- berstand-der sogenannte Rohextrakt-wurde sofort eingesetzt oder bei-30 °C gelagert.

Reinigung der SDH Für die Reinigung der SDH wurde das folgende Drei- Schritt-Schema gewählt : Schritt 1 : Der Rohextrakt wurde auf eine mit 50 mM Tris/HCl- Puffer (pH 7,0) äquilibrierte DEAE-Sepharose-Säule (2,6 x 9 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0,0-0,5 M NaCl in 50 mM Tris/HCl- Puffer (pH 7,0) und bei einer Flußrate von 50 cm/h eluiert. Die SDH konnte bei 0,2 M NaCl eluiert wer- den.

Schritt 2 : Eine Farb-Liganden-Affinitätschromatographiesäule wurde wie folgt vorbereitet : (i) ein Sepharose 4B- CL Gel wurde als Matrix eingesetzt (Boyer, P. M. und Hsu, J. T. (1993) In : Fiechter, A. (ed.), Advances in Biochemical engineering, 49,1-44) und (ii) der Farbstoff Blue 160 (Blue H-ERD) wurde nach der Me- thode Neuhauser, W. et al., 1997 (Biochem. J., 326, 683-692) immobilisiert. Dazu wurde 10 mg Farbstoff pro 1 mL Gel eingesetzt. Die gepoolten SDH-haltigen Fraktionen aus Schritt 1 wurden dialysiert und auf die Farb-Liganden-Säule (2,6 x 7,0 cm, äquilibriert mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0) aufgetragen (ca.

2-5 mg Protein/mL Gel). Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0,0-0,5 M NaCl in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0 und einer Flußrate von 2,0 mL/min eluiert. Die SDH konnte bei 0,1 M NaCl eluiert werden.

Schritt 3 : Die gepoolten, aktiven Fraktionen aus Schritt 2 wurden dialysiert und durch Ultrafiltration aufko- zentriert und nochmals auf eine Farb-Liganden-Säule aufgetragen (2,6 x 7,0 cm, äquilibriert mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0), wobei ca. 0,5 mg Protein auf 1 mL Gel aufgetragen wurden. Die Affinitätselu- tion der reinen SDH wurde mit 10 mM NADH in 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0, bei einer Flußrate von 10 cm/h durchgeführt. Die NADH wurde anschließend durch Dialyse entfernt.

Die gereinigte SDH kann bei-30 °C für ca. 8 Monate gelagert werden, bei +4 °C ist die SDH für ca. 30 Tage stabil.

Tabelle 1. Reinigungsschema für die SDH Reinigungs-Gesamt-Gesamt-spezifische Anreicherung Aus- schritt Aktivität Protein Aktivität beute (U) (mg) (U. mg-1) (fach) (%) Rohextrakt 360, 0 782,6 0, 46 1, 0 100 DE-281, 0 78,5 3,58 7,8 78 Sepharose Blue 160-174,0 15,7 11,12 24,2 48 Affigel Blue 160-120,0 4,9 24,49 53,2 33 Affigel

Mittels des dargestellten Reinigungsschemas, also Separation des Rohextraktes mittels Anionentau- scherchromatographie, anschließender erster Farb- Liganden-Affinitätschromatographie, Ultrafiltration und zweiter Farb-Liganden-Affinitätschromato- graphie, kann eine Anreicherung um das ungefähr 50fache gegenüber dem Wert des Rohextraktes er- reicht werden. Die Ausbeute beträgt dann ca. 33 %.

Beispiel 2 : Herstellung von 1,6-GPS aus Isomaltu- lose Die enzymatische, kontinuierliche Herstellung von 1,6-GPS in einem Enzym-Membran-Reaktor Mit einem Edelstahlreaktor (Volumen 50 ml) wurde die kontinuierliche Herstellung von 1,6-GPS aus I- somaltulose durchgeführt. Der Enzym-Membran-Reaktor besaß einen Doppelmantel zur Temperierung mittels Wasserkühlung, Bohrungen zum Einsatz einer Leitfä- higkeits-und pH-Wert-Elektrode und Anschlüsse zur Druckmessung, Substratzufuhr, Produktabfuhr und Probenentnahme. Der im Reaktorinnenraum befindliche Magnetrührer, der extern betrieben werden kann, ga- rantiert die optimale Durchmischung der eingesetz- ten Substanzen. Der Deckel des Reaktors enthielt auf der Unterseite eine Metallsinterplatte, auf welcher eine Ultrafiltrationsmembran und ein O-Ring angebracht waren. Nach dem Befüllen des Reaktors wurde der Deckel mit dem Unterteil verschraubt. Die Zuführung des Substrates erfolgte mit einer Kolben- pumpe. Die Leitfähigkeit und der pH-Wert der Reak- tionslösung wurden kontinuierlich und direkt gemes- sen, wobei ein Regelsystem den pH-Wert titri- metrisch konstant hielt. Da Ultrafiltrationsmembra- nen keine völlige Rückhaltung des Coenzyms gewähr- leisten, wurde eine geladene Membran der Firma Nit- to (Nitto-Membran NTR-7410) eingesetzt. Diese e- lektrostatische Methode der Coenzymrückhaltung ga- rantiert den Verbleib auch von dissoziierten Coen- zymen im gewünschten Reaktionsraum.

Der beschriebene Membran-Reaktor wurde mit einer Lösung aus 250 mM Isomaltulose und Glucose in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,5 (+0, 1 % NaN3) befüllt. Bei einem Fluss von 2 ml/h wurde der Reaktor anschlie- ßend 24 Stunden im"Leerlauf"betrieben, um eventu- elle Undichtheiten oder andere Probleme zu erkennen und gegebenenfalls zu beseitigen. Anschließend wur- de SDH und das Regenerations-Enzym FDH mit einen Superloop, wie er zum Probenauftrag in der Chroma- tographie verwendet wird, eingebracht. Zu Beginn der Reaktion wurden je 1 U/ml von vollständig ge- reinigter SDH (aus Beispiel 1) und GDH (Glucose- Dehydrogenase aus Bacillus megaterium) eingesetzt.

Durch Injektion von 2,5 HM NAD+ erfolgte der Start der Reaktion. Der pH-Wert wurde durch Titration mit 1M Tris auf pH 7,0 konstant gehalten. Eine wichtige Größe beim Betrieb eines kontinuierlichen Reaktors ist die Verweilzeitverteilung. Diese errechnet sich unter der Annahme von optimaler Durchmischung der Reaktionslösung nach der Formel r= V' wobei V das Reaktorvolumen und Vo der Volumenstrom sind. Nach vier Stunden Batch-Versuch wurde die Substratzufuhr auf den Fluss von 2 ml/h einge- stellt, so dass die mittlere Verweilzeit (T) 25 Stunden betrug. Die Versuchsdauer betrug 234 Stun- den, wobei in regelmäßigen Abständen die Enzymakti- vitäten, Laugeverbrauch, Leitfähigkeit, Druck, Sub- strat und Produktvolumen bestimmt wurden. Die er- haltenen Produktproben wurden mittels HPLC auf ihre Zusammensetzung hin untersucht und die Bildung von 1,6-GPS nachgewiesen.

Beispiel 3 : Enzymatisches Ein-Bioreaktor-Verfahren ("Eintopfreaktion") zur Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose Zur direkten enzymatischen Herstellung von 1,6-GPS aus Saccharose wurde ein Batch-Versuch mit immobi- lisierten Zellen von P. rubrum sowie dem Enzym SDH aus G. suboxidans 2003 und FDH aus Candida boidinii unter nachstehend aufgeführten Bedingungen durchge- führt. Die Substrate in dieser Reaktion waren Sac- charose und Ammoniumformiat.

Volumen : 10 ml Temperatur : 25 °C Saccharose : 500 mM Formiat : 500 mM P. rubrum Zellen : 1 g SDH 5 U FDH : 10 U NAD : 1 mM Da bei dieser Reaktion der pH-Wert anstieg, wurde mit 1 M Ameisensäure konstant auf pH-Wert 7,0 gere- gelt. Der Substratsverbrauch wurde während der Re- aktion mittels DC-und DNS-Methoden (für den Umsatz von Saccharose zu Isomaltulose) sowie HPLC (für den Umsatz von Isomaltulose zu 1,6-GPS) kontrolliert.

Es konnte die direkte Bildung von 1,6-GPS innerhalb eines Reaktionsgefäßes und in einem Verfahrens- schritt aus Saccharose gezeigt werden.

Beispiel 4 : Nucleinsäure und abgeleitete Peptid- sequenz der SDH 1. Peptidsequenzermittlung Zur Ermittlung von Teilaminosäuresequenzen wurde die gemäß Beispiel 1 gereinigte SDH von Gluconobac- ter suboxidans DSM 2003 tryptisch verdaut und nach Standardmethoden getrennt. Die erhaltenen partiel- len Peptidsequenzen sind in SEQ ID Nr. 3 bis 9 dar- gestellt.

2. DNA-Sonden-Bereitstellung Basierend auf den bei der Peptidsequenzermittlung analysierten Sequenzen wurden Primer hergestellt, mit deren Hilfe die Clonierung des gesamten Gens der SDH aus Gluconobacter suboxidans DMS 2003 ge- lang.

3. Erstellung der Genbank und Clonisolierung Die vorgenannten Primer (SEQ ID Nr. 3 und 5) wurden in einer PCR-Reaktion eingesetzt und ein Fragment der SDH-codierenden Sequenz erhalten. Mit dem er- haltenen PCR-Fragment wurde eine DNA-Sonde herge- stellt. Im genomischen Southern-Blot konnten nach Markierung der Sonde hybridisierende Banden festge- stellt werden. Es wurden zwei unabhängige subgeno- mische Genbanken (nach ClaI Verdau ~9kb Fragment, nach BamHI Verdau-3, 5 kb Fragment, Reinigung der Fragmente über Saccharosegradientenzentrifugation) mit gereinigten Fragmentscharen im pBlueskrip SK erstellt. Mit der erwähnten markierten Sonde wurden

die subgenomischen Clonbanken durch Hybridisierung geprüft. Es gelang, die Identifizierung mehrerer Clone, von denen je ein Clon aus der BamHI-und ClaI-Bank weiter analysiert wurden.

4. Sequenzanalyse Die Sequenzermittlung der clonierten Fragmente er- gab in beiden Fällen eine übereinstimmende DNA- Sequenz. Aus dieser konnte die Aminosäuresequenz der SDH erstellt werden. Sie stimmt mit den Sequen- zen aus den Peptidsequenzen überein, bis auf die Position Codon 196, für die die Peptidsequenz für Peptid 5 Serin (S) statt dem nun ermittelten Tryp- tophan (W 196) ergeben hatte.

Die Nucleotidsequenz der SDH von Gluconobacter su- boxidans DSM 2003 ist unter SEQ ID Nr. 2 darge- stellt und umfasst 789 Nucleotide Die Aminosäuresequenz der Sorbitol-Dehydrogenase von Gluconobacter suboxidans DSM 2003 ist darge- stellt unter SEQ ID Nr. 1 und umfasst 262 Aminosäu- ren.

5. Expressionen in E. coli Die codierende Sequenz wurde am 5'-Ende mit der Se- quenz GAATTCTT und am 3'-Ende mit der Sequenz AAGCTT verlängert. Diese Sequenz wurde in den Vek- tor pBtac2 (Fig. 1 ; J. Bosius (1988), Biotechnology 10,205-225) der mit EcoRI und HindIII vorbereitet worden war, integriert. Das resultierende Plasmid pHWG 467 (Fig. 2) enthält ein Ampicillin-

Resistenzgen und die SDH-codierende Sequenz unter Kontrolle des tac-Promoters. Plasmid pHWG 467 wurde in E. coli JM109 transformiert. Diese Zellen produ- zieren nach Induktion mit IPTG SDH-Aktivität. Das entsprechende Protein kann in Rohextrakten in sei- ner Aktivität bestimmt werden. Im SDS-Gel dieser Extrakte ist das Protein als dominante Bande bei 28 kDa mit Coomassie Brilliant Blue färbbar.