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Patent Searching and Data


Title:
MACROCYCLIC AMIDES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, PREPARATION METHODS AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/063615
Kind Code:
A1
Abstract:
Macrocyclic amide WH-21091 with antibacterial and antitumor activities, its analogs, preparation methods and uses thereof. The said macrocyclic amides are prepared by microbes of Xenorhabdus and Photorhabdus, or they can be prepared by other living beings through transgenic techniques. The compositions of the said macrocyclic amide and its analogs can be used as drugs and/or agricultural chemicals for treatment of microbial infections, especially for treatment of infectious diseases of Staphylococcus aureus with drug resistance. The said compositions can also be used as drugs for treatment of cancers of human beings or animals.

Inventors:
YANG CHONGREN (CN)
LI HAIZHOU (CN)
ZHAO PING (CN)
ZHANG YINGJUN (CN)
Application Number:
PCT/CN2010/001928
Publication Date:
June 03, 2011
Filing Date:
November 30, 2010
Export Citation:
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Assignee:
YUXI WINHEY BIO TECH CO LTD (CN)
YANG CHONGREN (CN)
LI HAIZHOU (CN)
ZHAO PING (CN)
ZHANG YINGJUN (CN)
International Classes:
C07D225/02; A01N43/46; A01N63/20; A01P1/00; A61K31/395; A61P31/04; A61P31/10; A61P35/00
Domestic Patent References:
WO2008143730A22008-11-27
Foreign References:
CN101735149A2010-06-16
Attorney, Agent or Firm:
LUNG TIN INTERNATIONAL INTELLECTUAL PROPERTY AGENT LTD. (CN)
隆天国际知识产权代理有限公司 (CN)
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Claims:
权利要求

1. 大环酰胺化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或 前药, 所述大环酰胺化合物具有式 II结构:

其中, RrR15分别表示氢原子、 烷基、 环烷基、 烯基、 炔基、 芳香基或含一个或多 个氧、 氮、硫和卤素原子的基团, 所述含氧的基团包括羟基、酰基、酮基和羧基; 含氮 的基团包括氨基和硝基。

2. 根据权利要求 1所述的大环酰胺化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型 物、 酯、 互变异构体或前药,. 其特征在于所述大环酰胺化合物具有式 I的结构-

3. 根据权利要求 2所述的大环酰胺化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多 晶型物、酯、互变异构体或前药,其特征在于所述大环酰胺化合物为微生物的次生代谢 产物, 该微生物选自如下组成的组: 寄生于斯氏线虫属 (Stei薩 )和异小杆线 属.

(Heterorhabditis )线虫体内并与线虫共生的致病杆菌属 Xenorhabdu 以及发光杆菌 属 iPhotorhabdus 中的杆菌。

4.根据权利要求 3所述的化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药, 其中所述的致病杆菌属中的杆菌选自伯氏致病杆菌

(Xenorhabdus bovienii) ^ 嗜线虫杆菌 CX. nematopMa 、 X. ehlersii X. budapestensis ο

5. 权利要求 2-4所述的大环酰胺化合物的制备方法, 其特征在于:

1 )将寄生杆菌的线虫幼虫侵染大蜡螟 GaUeria mellonella ) 的终龄幼虫, 对死去 的幼虫进行消毒、 解剖、 取淋巴放置于琼脂培养基上, 室温下黑暗培养, 分离杆菌;

2)杆菌的培养: 对上述杆菌进行发酵培养, 接种到含有碳源和氮源的液体培养基 中, 在 23-27°C条件下进行有氧培养, 培养时间持续 24-96小时, 在培养过程中, 定时 测定培养液的抗菌活性, 直到培养液产生所述大环酰胺化合物所具有的抗菌活性;

3 )大环酰胺化合物的制备: 培养结束后, 过滤或离心, 除去菌体, 清液用酯酸调 节 pH至 7.0, 用氯仿或乙酸乙酯萃取, 合并萃取液, 过滤, 40-50'C减压浓缩, 得到的 提取物,在柱层析上进行分禽,通过溶剂梯度洗脱, 分离得到具有抗菌活性的所述大环 酰胺化合物。

6. 根据权利要求 5所述的大环酰胺化合物的制备方法, 其特征在于在柱层析上进 行分离时, 以硅胶、树脂或凝胶的任何一种作为层析材料, 在应用硅胶柱层析时, 硅胶 为 200-300目的柱层析用硅胶, 提取物与硅胶的比例为 1 :15。

7.根据权利要求 5所述的大环酰胺化合物的制备方法, 其特征在于菌株在含有碳 源和氮源的液体培养基中培养, 先进行初级培养后, 再进行次级培养。

8.权利要求 1-4 中任意一项所述的大环酰胺化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂 化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药在制备抗菌药物中的应用, 所述抗菌药物能够 对革兰氏阳性细菌以及动物和植物的病源细菌和病源真菌具有抗菌活性。

9.根据权利要求 8所述的应用,其中所述化合物能够抑制埃希菌属 (Escherichia 、 葡萄球菌属 ( Staphylococcus ) 肠球菌属 .Enterococcus ) 链球菌属 {Streptococcus)和 假单胞菌属 wewifowowoy)中的细菌。

10.权利要求 1-4中任意一项所述的大环酰胺化合物、 其药学上可接受的盐、 溶剂 化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药在制备抗肿瘤药物中的应用。

11.根据权利要求 10所述的应用, 其中所述抗肿瘤药物能够治疗或预防脑癌、 乳 腺癌、 宫颈癌、 肺癌、 卵巢癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 肾癌、 结直肠癌或白血病。

12. 一种药物组合物, 其包含权利要求 1-4中任意一项所述的大环酰胺化合物、 其 药学上可接受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药和一种或多种药学可 接受的载体或赋形剂。

13. 根据权利要求 12所述的药物组合物, 其中所述药物组合物为抗肿瘤药物组合 物或抗菌药物组合物。

14.一种治疗或预防感染的方法, 其包括将权利要求 1-4中任意一项所述的大环酰 胺化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药施用于 所需患者。

15.根据权利要求 14所述的方法, 其中所述感染是由埃希菌属 (Escherichia) . 葡 萄球菌属 ( Staphylococcus ) 肠球菌属 (Enterococcus ) ^ 链球菌属 ( Streptococcus)和 假单胞菌属 (p^^ omw)中的细菌引起的感染。

16.一种治疗或预防癌症的方法, 其包括将权利要求 1-4中任意一项所述的大环酰 胺化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药施用于 所需患者。

17.根据权利要求 16所述的方法, 其中所述癌症选自脑癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 肺 癌、 卵巢癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 肾癌、 结直肠癌或白血病。

Description:
大环酰胺化合物、 其药物组合物、 其制备方法与应用 技术领域

本发明涉及生物医药技术领域,具体地涉及一 种有抗菌和抗肿瘤活性的新型大环酰 胺化合物及其类似物、 其组合物、 及其制备方法与应用。 背景技术

随着社会经济的发展,人类生活环境和生活习 惯的改变, 新的疾病不断产生,通过 合成化学药物控制的疾病重新出现, 并日愈泛滥。 同时,抗生素的滥用导致病原细菌产 生耐药性, 使正常剂量的药物不能发挥应有的杀菌效果。 此外, 恶性肿瘤成为导致死 亡的主要原因, 严重地威胁着人类的健康和生命。 疾病的蔓延, 给人类造成了新的灾 难。在农林方面, 人类面对着病原菌对杀菌剂和化学药物抗药性 的挑战。 因此, 不断开 发新的、有效的药物受到了广泛的重视。土壤 中存在着大量微生物,包括:细菌、真菌、 放线菌、病毒和原生生物等。土壤微生物次生 代谢产物的分子多样性是新药物和新农药 研究与开发的资源库。

土壤中昆虫病原线虫共生细菌产生具有生理活 性的次生代谢产物, 如: 抑菌物质、 杀虫蛋白和胞外酶等。其中, 产生抗生素是共生细菌的普遍特征, 作为抑制细菌、真菌 和酵母生长的抗菌物质有广阔的商业应用前景 (Webster等, 2002)。

大量的研究报道表明, 与斯氏属 (Steinernema )和异小杆属 Heterorhabditis 线 虫共生的肠杆菌科致病杆菌属 ( em wM^ )和光杵菌属 Photorhcibdus 等革兰氏阴 性细菌,其代谢产物不仅能抑制多种细菌和真 菌的生长,还具有杀虫活性和抑制肿瘤细 胞生长的活性。因此,从该类特异生境细菌中 寻找新的生理活性物质已成为国内外科学 家关注的热点 (Li, 1997; Park, 2001 ;刘卫京, 2004; Furgani, 2008)。 目前, 从其代谢产 物中已发现新的抗菌物质,例如: xenocoumacins, nematophin (Li, 1997, 1998), xenorxides (Li, 1998), benzylineacetone (Ji, 2004), xenortides和 xenematide( Lang, 2008 )等。 xenorxides 还具有显著的抗肿瘤活性。 发明内容

本发明提供了一种大环酰胺化合物 WH-21091 (自命名)、 其类似物、 其药学上可 接受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药; 还提供了所述大环酰胺化合 物的制备方法及用途以及含有上述各物质的药 物组合物。所述大环酰胺化合物及其类似 物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药具有抗菌和 抗 肿瘤活性, 可用于治疗或预防感染、 癌症等病症。

根据本发明的一个方面, 本发明提供了一种大环酰胺化合物 WH-21091、其药学上 可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药, 所述大环酰胺化合物 WH-21091具有如下式 I表示的结构:

其中, -R 15 中的一个或多个可以是氢原子, 也可以是烷基、环垸基、烯基、炔基、 芳香基、或含一个或多个氧、氮、硫和卤素等 原子的基团或杂环基, 所述含氧的基团包 括羟基、 酰基、 酮基和羧基, 所述含氮的基团包括氨基和硝基。

根据本发明的又一个方面,本发明提供了所述 大环酰胺化合物 WH-21091的制备方 法。所述大环酰胺化合物 WH-21091为微生物的次生代谢产物,所述微生物 括但不限 于: 寄生于斯氏线虫属 (S/« zer«ewa)和异小杆线虫属.(HeterortoM to)线虫体内并 与线虫共生的伯氏致病杆菌 ( e«ortobiiks 6oview7)、 嗜线虫杆菌 (X. atopMa X. ehlersii和 X. budapestensis等致病杆菌属 (J¾«or ja6i¾« 以及发光杆菌属 (_P zotor¾3bi/¾s) 寄生杆菌。 该大环酰胺化合物可从上述微生物的次生代谢 产物中分离得到。

所述的大环酰胺化合物 WH-21091的制备方法例如可以是:

1 )将寄生杆菌的线虫幼虫侵染大蜡螟 i Galkria meUonella 的终龄幼虫, 对死去 的幼虫进行消毒、 解剖、 取淋巴放置于琼脂培养基上, 室温下黑暗培养, 分离杆菌;

2 )杆菌的培养: 对上述杆菌进行发酵培养, 接种到含有碳源和氮源的液体培养基 中, 在 23-27Ό条件下进行有氧培养, 培养时间持续 24-96小时, 在培养过程中, 定时 测定培养液的抗菌活性,直到培养液产生 WH-21091所具有的抗菌活性。菌株在含有碳 源和氮源的液体培养基中培养时, 先进行初级培养后, 再进行次级培养。

3 ) WH-21091 的制备: 发酵培养结束后, 过滤或离心, 除去菌体, 清液用酯酸调 节 pH至 7.0, 用氯仿或乙酸乙酯萃取, 合并萃取液, 过滤, 40-50Ό减压浓缩, 得到的 提取物,在柱层析上进行分离,通过溶剂梯度 洗脱,分离得到具有抗菌活性的大环酰胺 化合物 WH-21091。用薄层层析法和抗菌活性检测指导分 纯化, 也可用高压液相色谱 法进行分离和纯化。在柱层析上进行分离时, 以硅胶、树脂或凝胶的任何一种作为层析 材料, 在应用硅胶柱层析时, 硅胶为 200-300目的柱层析用硅胶, 提取物与硅胶的比例.

'为 1 : 15。用层析法分离纯化杆菌产生的次生代谢产 时,应用氯仿和甲醇或石油醚或丙 酮或它们的混合物作为洗脱剂。 - 大环酰胺化合物 WH-21091 也可经过转基因方法由其他生物体产生, 其基本方法 是: 人工分离产生 WH-21091的目的基因,进行修饰, 通过载体连接到包括大肠杆菌在 内的其他生物体基因组中, 由于导入基因的表达, 引起生物体性状的可遗传修饰,从而 生产 WH-21091。 本发明的式 II化合物可以通过对式 I化合物进行结构修饰而获得。例如,可以通 本领域常规的方法, 如通过在 Comprehensive Organic Synthesis)), By B. M. Trost, I. Fleming; , Publisher: Pergamon, Publication Date: 1991-12-01中记载的方法对式 I化合物 进行结构修饰而获得式 II的化合物。

根据本发明的再一方面,本发明提供了上述式 I和式 II化合物、其药学上可接受的 盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药在制备药物 中的应用。优选地, 所述 药物是治疗或预防感染的药物, 或是治疗或预防癌症的抗肿瘤药物。

根据本发明的其它方面, 本发明涉及治疗哺乳动物疾病、病状或病症的 方法,所述 方法包含向所述哺乳动物施用治疗有效量的式 I或 II化合物或其在药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药。 所述哺乳动物优选为人类。

根据本发明的一个实施方式,本发明所述的疾 病、病状或病症包括例如由细菌导致 的感染、 癌症等。

本发明的式 I和式 II化合物、 其在药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药对大多数革兰氏阳性病源细 菌和真菌具有显著的抗菌活性,特别是对 耐药性细菌(例如: 耐药性金色葡萄球菌等)引发的感染, 活性高于目前市场上的一般 抗生素。其可用于预防和治疗由这些病原菌引 发的感染,是用于替代现有抗生素的新一 代新型广谱抗生素, 可治疗的宿主包括植物和动物, 如狗、猫和其它家养动物等哺乳动 物, 尤其是人。 例如, 可以抑制埃希菌属 Escherichia^ 葡萄球菌属 iStaphylococcus 肠球菌属 iEnterococcus )链球菌属 .Streptococcus)假单胞菌属 (/wew^fowo疆)的细菌。

本发明的式 I和式 II化合物、 其在药学上可接受的盐、 溶剂化物、 多晶型物、 酯、 互变异构体或前药具有抗肿瘤活性,可抑制癌 细胞的生长,例如可用于预防或治疗脑癌、 乳腺癌、 宫颈癌、 肺癌、 卵巢癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 肾癌、 结直肠癌或白血病。

本发明的上述化合物或其在药学上可接受的盐 、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异 构体或前药的剂型、给药方式以及剂量, 可以由熟练的技术人员进行选择。成年人的示 例剂量为每日大约 2 5 mg到大约 2.000 mg。 对哺乳动物的给药方式可以是口服, 肠胃 外或者局部给药,对植物宿主的给药方式可以 通过施与种子、树叶或其他植物部分, 或 者施与土壤中来实现。

本发明的上述化合物或其在药学上可接受的盐 、溶剂化物、多晶型物、.酯、互变异 构体或前药可以被单独使用或者以药学上合适 的制剂形式使用,所述制剂含有活性成分 以外的一种或多种常规的载体。 根据疾病的性质和 /或给药途径, 本发明的所述的衍生 物可以用已知的方法来制备。

根据本发明的再一个方面,本发明提供了含有 式 I和式 II化合物、其在药学上可接 受的盐、溶剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体或前药和一种或多 种药学上可接受的载 体或赋形剂的药物组合物。药物组合物的形式 包括适于口服、局部或肠胃外给药的任何 固体化合物(片剂、丸剂、胶囊、颗粒、粉末 等)或液体化合物 (溶液、悬浮液或乳剂), 它们可以仅包含本发明的式 I和式 Π化合物、其在药学上可接琴的盐、溶剂化物 多晶 型物、酯、互变异构体或前药, 也可以与任何的药学可接受的载体或赋形剂或 其他药学 活性化合物组合在一起。 当用于肠胃外施用时, 需要进行灭菌配制。

给药剂量取决于疾病的种类、 宿主的类型 (包括其年龄, 健康状况和体重)、 同时 进行的其它类型的治疗(如果有其他类型的治 疗)、 以及治疗的频率和治疗比、 使用的 活性成分的剂量水平, 在静脉给药时是 0.1到约 200 mg/kg宿主体重; 肌肉给药时是 1 到约 500 mg/kg宿主体重; 口服给药时是 5到约 1000 mg/kg宿主体重; 滴鼻给药时是 5 到约 1000 mg/kg宿主体重; 喷雾给药时是 5到约 1000 mg/kg宿主体重。 .以浓度表示, 用于皮肤、 鼻腔、 咽喉、支气管、 阴道、直肠或者眼睛局部用药, 本发明的化合物含有 浓度约 0.01到约 50% (w/w), 优先约 1到约 20% (w/w)。 同样地, 对于肠胃外给药, 使 用的浓度约 0.05到约 50% (w/w),优先约 5到约 20% (w/w)。在动物和人的疾病治疗中, 用作抗菌药物和 /或抗肿瘤药物的活性成分的本发明化合物或 在药学上可接受的盐、 溶剂化物、多晶型物、酯、互变异构体或前药 , 可以利用现有技术中的药用物质和确定 的工艺容易地制成单位制剂。可以选择合适的 固体或液体赋形剂或者稀释剂,通过本领 域技术人员已知的方法制备。

作为农业应用,该抗菌化合物、其在药学上可 接受的盐、溶剂化物、多晶型物、酯、 互变异构体或前药可以置于惰性载体内制成。 如果制成固体,活性成分可以与例如漂白 土、高岭土、硅藻土或其他可湿润的污迹稀释 剂等常用载体混合。也可以使用流动性粉 尘制剂,其通过将干燥的活性成分与诸如滑石 粉、叶蜡石、粘土和硅藻土等的细微固体 混和而制得。

根据其在液体载体中的溶解性,粉末可以以悬 浮液或溶液形式施用。可以使用压力 喷雾剂,特别是活性成分弥散于低沸点的分散 剂溶剂载体的气雾剂。重量百分比可以根 据该化合物被应用的方式和所使用的制剂进行 调整,通常,该抗菌制剂中包括 0.005 wt% 到 95 wt%的活性成分。 该抗菌活性物质可以与其它成分一起使用, 所述其它成分包括 生长调节因子、 杀虫剂和肥料等, 这些成分有助于应用、 易于操作、维持化学稳定性和 增强效力。根据活性成分的溶解性、乳化度、 比重和经济因素选择溶剂。可加入佐剂以 增强活性,还可以加入包括阴离子、阳离子或 非离子的表面活性剂。稳定剂和防冻剂可 以延长保藏时间。另外, 可以加入增效剂、粘结剂、铺展剂和除臭剂化 合物以改善商业 制剂的处理特性。该活性成分可与诸如碳酸钙 等惰性载体组合制成丸,或制成其他可消 耗的给药器, 包括用于定量传输话性成分的控释给药器。

本发明的化合物、其在药学上可接受的盐、溶 剂化物、 多晶型物、酯、互变异构体 或前药还可以用作抗菌药物,用于抑制现存微 生物的生长或者根除活宿主表面上或活宿 主外媒介内的微生物。本发明的化合物、其在 药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、 酯、互变异构体或前药可用作消毒剂,对多种 易于微生物生长的固体或液体媒介进行消 毒。 本发明化合物的合适用量可根据本领域技术人 员已知的方法来确定。

某些术语的解释

本文单独或组合使用的术语 "烷基 "是指任选取代的直链或任选取代的支链的一 饱和烃, 其具有 1-10个碳原子, 更优选 1-6个碳原子。

本文单独或组合使用的术语 "烯基 "是指任选取代的直链或任选取代的支链的一 烃基, 其具有一个或多个 C=C双键并具有 2-10个碳原子, 更优选 2-约 6个碳原子。 这 些基团中的双键可以为顺式或反式构象, 并应被理解为包含所述两种异构体。

本文单独或组合使用的术语"炔基"是指任选取 的直链或支链的一价烃基,其具有 一个或多个 C≡C三键并具有 2-10个碳原子, 更优选 2-6个碳原子。

本文单独或组合使用的术语"芳香基(或芳基 "是指任选取代的芳香烃基, 其具有 6-约 20个成环碳原子, 并包括稠合环和非稠合芳环。 稠合芳基包含 2-4个芳环稠合的 环, 其它独立环可以为脂环、 杂环、 芳环、 芳香杂环或其任意组合。此外, 术语芳香基 还包括含 6至约 12个成环碳原子的稠合环和非稠合环,以及含 6至约 10个成环碳原子 的稠合环和非稠合环。

本文单独或组合使用的术语 "杂环基"是脂肪杂环和杂芳基的合称。本文中 出杂环 的碳原子数目时 (例如 C r C 6 杂环), 所述环中必然存在至少一个非碳原子 (杂原子)。 例如 "Cr 杂环"的命名仅涉及环中碳原子的数目,而不 及环中原子的总数。如' '4-6元杂环" 的命名译指环中所含的原子总数 (即四、 五或六元环, 其中至少一个原子为碳原子, 至 少一个原子为杂原子, 且剩余的 2-4个原子为碳原子或杂原子)。 对于具有两个或更多 杂原子的杂环而言, 所述两个或更多杂原子可以彼此相同或不同。 杂环可被任意取代。 本文单独或组合使用的术语 "酰基"或 "酮基"萆指 R-C(0)-, 其中 R为具有 1-10 个碳原子, 优选 1-6个碳原子的垸基。

本文单独或组合使用的术语 "羧基"是指 R-C(0)0-, 其中 R为具有 1-10个碳原子, 优选 1-6个碳原子的垸基。

本文所用术语 "溶剂化物"是指通过溶剂化作用形成的本发明 合物与溶剂分子的 组合。在某些情况下, 溶剂化物指水合物, 即溶剂分子为水分子, 本发明化合物与水的 组合形成水合物。

本文所用术语 "多晶型物"或"多晶形 "是指以不同的晶格形式存在的本发明化合物 本文所用术语 "酯"是指由含氧酸基团和羟基基团衍生的本发 化合物的衍生物,本 发明化合物中既可存在含氧酸基团也可存在羟 基基团。

本文所用术语 "互变异构体 "是指通过如氢原子迁移或质子迁移而易于由 发明化 合物互变得到的异构体。

本文所使用术语"前药"是指本发明化合物的任 药学上可接受的盐、酯、酯的盐或 其它衍生物,其在向受试者施用后能够直接或 间接地提供本发明的化合物或其具有药学 活性的代谢物或残基。特别优选的前药是在施 用于患者时可以提高本发明化合物生物利 用度的那些化合物 (例如, 可以使口服的化合物更易于被吸收到血液中) 或者促进母体 化合物向生物器官或作用位点 (例如脑部或淋巴系统)递送的那些化合物。 具体实施方式

下面的实施例用于进一步说明本发明, 但并不是对本发明的限定。 实施例 1: 从嗜线虫致病杆菌( nematophila)培#物中制备和分离 WH-21091。 其中, 使用的嗜线虫杆菌 (X. nematophil us) HB310保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 (CGMCC), 保藏号为 CGMCC No. 2089; 保藏日期为 2008 年 9月 5.日。

上述菌株嗜线虫杆菌 (X nematophi l us) HB310的初级培养物维持 14天后进行次 级培养。 首先用接种环将初级培养物加入到装有 50 ml胰酶大豆肉汤 (TSB )培养基的 100 ml锥形烧瓶中, 在 25 Ό, 120 rpm条件下, 培养物在 Eberbach转动震荡器上连续 培养 24小时, 将 100 ml该培养物接种到装有 900 ml TSB培养基的 2000 ml的烧瓶中, 在 25°C, 120 rpm, 黑暗条件下, 于 Eberbach转动震荡器上连续发酵培养 96小时, 发 酵液在 4°C, 12,000 X g, 条件下离心 20分钟以分离出细菌菌体。再将该菌体接种到 20 L培养基中, 接种后的培养基在 37°C下培养三天, 培养结束后, 过滤或离心, 除去菌 体, 清液用酯酸调节 pH至 7.0, 用 20 L氯仿或乙酸乙酯萃取三次, 合并萃取物, 于旋 转蒸发仪中, 在' 40°C-5(TC, 真空状态下浓缩, 得到约 20 g油性粗提物, 得到的粗提物 加入 100 ml己烷,搅拌 30分钟后,出现固体沉淀物,过滤后得到约 10 g固体,用 20 ml 氯仿充分溶解, 在硅胶柱(200-300目) J:进行分离, 提取物与硅胶的比例为 1 :15; 用 氯仿和甲醇 (9:1 ) 混合溶剂洗脱, 通过薄层层析监测分离过程。 对分离得到的物质进 行抗菌活性实验, 最后得到一个具有显著抗菌活性的化合物, 用 NMR和 MS对其进行 结构鉴定。 - — - 该化合物结构如下所示:

WH-21091的结构鉴定

用 C 5 D 5 N 5 溶剂在 Bruker WM600核磁共振光谱仪测定 1D-NMR ( 13C、 1H、 )谱和 2D-NMR (HSQC、 DQF-COSY、 HMBC)谱。通过 70eV惠普 5985 Bgc体系测定 ESI-MS 谱。 用 Kratos MS80质谱仪测定 HR-ESI-MS谱。 用配备有 Waters 996 PDA检测器的 Waters 2695高效液相仪进行 HPLC和 UV分析。

根据表 1所示的 13 C-NMR谱和 1H-NMR谱数据以及质谱数据: ESI-MS (m/z): 339: HR-ESI-MS (m/z): 339.4286 ([M-(H 2 0) 5 + ; 4H]+,理论值 339.4281), 确定该化合物的分子 式为 C 21 H 31 N0 8 , 分子量为 425。 进一步通过 HSQG谱分析对各个碳信号和氢信号进行 了归属, 进一步对氢-氢相关 DQF-COSY谱和碳-氢相关 HMBC谱进行了详细解析, 最 终确定了如图所示的 WH-21091的化学结构。

DQF-COSY

WH-21091的 DQF-COSY和 HMBC解析结果 表 1. WH-21091的 13 C-NMR谱和 1H-NMR谱数据 碳原子序号 13 C-NMR (ppm) 1H-NMR (ppm)

1 174.0

2 74.2 4.89 (d, 6.0 Hz)

3 71.8 5.03 (dd, 6.0, 4.5 Hz)

4 62.5 4.40 (m)

5 " 25.9 2.37 (m), 2.22 (m)

6 24.9 1.85 (m)

7 45.5 3.41 (m) -

8 24.7 1.94 (m)

9 39.9 1.92 (m), 1.42 (m)

10 49.4 4.66 (m)

11 81.8 4.72 (ddd, 14.4, 2.4, 2.4 Hz)

12 30.1 3.21 (dd, 15.6, 12.6 Hz),

2.95 (dd, 16.8, 3.0 Hz)

13 23.4 0.84 (d, 7.2 Hz)

14 ^ 21.8 0.92 (d, 6.6 Hz)

Γ 140.8 3 ' 162.4

4' 116.0 6.96 (d, 8.4 Hz)

5 ' 136.5 7.35 (t, 7.8 Hz)

6' 118.7 6.62 (d, 7.2 Hz)

T 170.0

CONH 8.79 (d, 9.6 Hz) 实施例 2: WH-21091的抗菌活性试验

WH-21091化合物进行了以下抗菌试验, 显示了 WH-21091的抗菌特性。采用了标 准稀释方法, 在 35°C下进行测定, 培养 24小时后, 得到了 WH-21091的最小抑制浓度 表 2显示了 WH-21091化合物对测试的微生物的 MIC。 结果表明 WH-21091具有 有效的抗菌特性。 特别是对一些有抗生素抗性的葡萄球菌菌株的 抗菌特性。 表 2. WH-21091和红霉素的抗菌活性

( MIC, μ^ιηΐ, 24hr和 48hr, 培养基: 胰蛋白胨大豆肉汤) 细菌样品 WH-21 红霉素

091

大肠杆菌 {Escherichia coli) 4 1 表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 8 0.25 金黄色葡萄球菌 MSRA* (S. aureus MSRA) 4 >32 类肠球菌 {Enterococcus faecalis) 32 >32 化脓性链球菌 {Streptococcus pyogenes) 4 0.03 绿脓杆菌 {Pseudomonas aeruginosa) >32 >32

*耐甲氧西林株的临床分离物 (clinical isolates ) 实施例 3 : WH-21091的抗肿瘤活性试验

采用 Skehan等人(1990 )所描述的方法, 对 WH-21091 的人肺癌 H460、 乳腺癌 MCF-7和宫颈癌 Hela细胞的进行了体外抗肿瘤活性的测试。 结果表明 WH-21091对这 些癌细胞都表现出显著的抗肿瘤活性 (表 3 )。 表 3. WH-21091对肿瘤细胞的抗肿瘤活性

H460 MCF-7 Hela

IC 50 ^g/ml) 0.10 0.81 0.24 尽管上述说明含有许多具体特征,然而它们不 应当被认为是对本发明的限定,只是 优选的实施方法的例子。 参考文献:

Skehan, et al. ( 1990 ) J.-X. Li, G.-H. Chen, J.M. Webster. Nematophin, A novel antimicrobial substance produced by Xenorhabdus nematophilus (Enterobactereaceae). Canadian Journal of Microbiology, 1997, 43(8): 770-773.

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