Die Erfindung betrifft ein makroporöses Kunststoffperlenmaterial. Das Kunststoffperlenmaterial ist ein vernetztes Mischpolymerisat aus hydrophilen, vinylisch polymerisierbaren Monomeren und bindungsaktiv gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des makroporöses Kunststoffperlenmaterials durch inverse Suspensionspolymerisation einer Monomerenphase, sowie dessen Verwendungen.

Stand der Technik

Poröse polymere Trägermaterialien für Proteine, insbesondere Enzyme sind hinreichend bekannt. Anwendungsgebiete liegen im medizinischen Bereich, z. B. bei der enzymatischen Spaltung von ß-Lactamantibiotika wie Penicillin G zu 6-Aminopenicillan-Säure (6-APA) mittels der Penicillin-Acylase (Penicillinamidase). Wichtige Entwicklungsziele sind vor allem eine möglichst hohe Beladungskapazität, aber auch eine niedrige Quellbarkeit sowie möglichst geringe Restlösemittelgehalte. Halogenierte Lösungsmittel sollen bei der Herstellung grundsätzlich vermieden werden.

DE-OS 22 37 316 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung periförmiger, vernetzter Mischpolymerisate durch radikalische Polymerisation eines einen radikalbildenden Initiator enthaltenden Monomergemisches, das ein gegenüber biologischen Substanzen bindungsaktives Monomer, ein vernetzendes Comonomer und wenigstens ein weiteres Comonomer enthält, wobei das Monomerengemisch in einer unpolaren organischen Flüssigkeit zu Tröpfchen suspendiert und polymerisiert wird. Als unpolare organische Flüssigkeit eignen

sich insbesondere aliphatische Kohlenwasserstoffe, vor allem solche mit 6 und mehr C-Atomen. In den Beispielen werden Mischungen aus n-Heptan und Perchlorethylen eingesetzt. Das Verhältnis der Monomerenphase zur kontinuierlichen organischen Phase kann zwischen 1 : 1 und 1 : 10 liegen, jedoch werden Verhältnisse zwischen 1 : 1 ,5 und 1 : 4 bevorzugt.

DE-A 31 06 456 beschreibt ein gegenüber DE-OS 22 37 316 in Bezug auf die Bindungskapazität der Polymerperlen verbessertes Verfahren. Besonders hohe Bindungskapazitäten für Proteine, insbesondere für das Enzym Penicillin- Acylase (Penicillinamidase) werden erhalten, wenn die Trägerpolymere hohe Gehalte an vernetzenden Monomeren aufweisen und wenn die Monomerenphase, gebildet aus den Monomeren und dem Verdünnungsmittel, ein Lösungsmittelgemisch als Verdünnungsmittel enthält. Geeignete Gemische können z. B Wasser/Methanol oder Formamid/Methanol sein. Monomere und Verdünnungsmittel liegen etwa im Verhältnis von 1 : 2,6 vor. Für die organische, kontinuierliche Phase wird ein Gemisch aus n-Hexan und Perchlorethylen verwendet. Das Verhältnis der Monomerenphase zur kontinuierlichen organischen Phase liegt in den Beispielen bei ca. 1 : 2,8. Bei Vernetzeranteilen von 50 Gew.-% im Monomerengemisch und der Verwendung von Wasser/Methanol als Verdünnungsmittel können Trägerpolymere mit einer Bindungskapazität, gemessen als Penicillinacylase-Aktivität, von bis zu 125 U/g erhalten werden.

DE 34 04 021 A1 beschreibt makroporöse Perlpolymerisate, bei denen im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung nachträglich Epoxy-Gruppen eingeführt werden. Die u. a. beschriebene Beladung mit Penicillin-Acylase ist mit dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung vergleichbar. Es werden relativ hohe Bindungskapazitäten am nutschenfeuchten Material erreicht. Betrachtet man den jeweils ebenfalls angegebenen Wert bezogen auf das Trockengewicht, so

kann indirekt die Quellzahl errechnet werden (U/g feucht/ U/g trocken). Die dabei erhaltenen Werte liegen im Bereich von ca. 3,0.

DE 198 04 518 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von periförmigen Mischpolymerisaten auf Acrylatbasis, danach hergestellte Trägerpolymermaterialien und deren Verwendungen. Das Trägerpolymermaterial zeichnet sich unter anderem durch eine Bindungskapazität für Penicillinamidase von mindestens 220 [U/g feucht] und gleichzeitig eine niedrige Quellzahl von höchstens 1 ,5 aus.

EP 1 352 957 A1 beschreibt bindungsaktive Trägermaterialien, enthaltend Epoxidgruppen zur Immobilisierung von Enzymen. Das beschriebene Trägermaterial bietet den Vorteil, dass Enzyme schon bei niedrigen lonenstärken kovalent gebunden werden können. Die Funktionalität wird in einem Verfahren erreicht, bei dem bei Trägerperlenmaterialien mit Epoxidgruppen an der Oberfläche ein Teil der Epoxid-Gruppen nachträglich mit verschiedenen Reagenzien umgesetzt werden. Es entstehen so zusätzliche Aminogruppen, die die Bindung der Enzyme bei niedrigen lonenstärken im umgebenden Medium begünstigen.

Aufgabe und Lösung

DE 198 04 518 C2 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von periförmigen Mischpolymerisaten auf Acrylatbasis und danach hergestellte Trägerpolymermaterialien mit hervorragenden Eigenschaften, insbesondere hoher Bindungskapazität für Penicillinamidase und gleichzeitig niedriger Quellzahl. Ein Nachteil dieses Trägerpolymermaterials wird darin gesehen,

dass die kovalente Bindung von Biomakromolekülen bei vergleichsweise hoher lonenstärke erfolgen muss.

Die Nachteile bestehen u.a. darin, dass die hierbei anfallenden Abwässer aufgrund des hohen Salzgehalts eine Belastung für die Umwelt darstellen. Auch können die zu immobilisierenden Biomakromoleküle teilweise durch einen hohen Salzgehalt in Mitleidenschaft gezogen bzw. denaturiert werden.

EP 1 352 957 A1 schlägt eine Lösung dieses Problems vor, indem ausgehend von Trägerperlenmaterialien mit Epoxidgruppen an der Oberfläche ein Teil der Epoxid-Gruppen nachträglich mit verschiedenen Reagenzien umgesetzt werden. Es entstehen so zusätzliche Aminogruppen, die die Bindung der Enzyme bei niedrigen lonenstärken im umgebenden Medium begünstigen. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass es aufwendig ist und dadurch die Herstellung der Trägerpolymermaterialien verteuert.

Ausgehend von der DE 198 04 518 sollte eine makroporöses Kunststoffperlenmaterial bereitgestellt werden, das eine kovalente Bindung von Biomakromolekülen bei vergleichsweise niedriger lonenstärke ermöglicht. Eine aufwendige nachträgliche Modifizierung, wie in der EP 1 352 957 A1 beschrieben, sollte dabei vermieden werden. Gleichzeitig soll die Quellzahl einen noch akzeptablen Wert von nicht höher als 2,5 aufweisen.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein

makroporöses Kunststoffperlenmaterial mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 bis 1000 μm, radikalisch polymerisiert aus den folgenden Monomer-Typen

a) 5 - 40 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer Wasserlöslichkeit von mindestens 1 % bei 20 ⁰ C, die keine vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe sind,

b) 5 - 50 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer Reaktion mit nucleophilen Gruppen von Liganden kovalente Bindungen eingehen kann,

c) 20 - 60 Gew.-% hydrophilen, vernetzenden radikalisch polymerisierbaren Monomeren mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen,

dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich

d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Polymerisat eingesetzt werden.

Ausführung der Erfindung

Monomere

Um die Hydrophilie des Monomerengemischs zu gewährleisten, muß dieses zum überwiegenden Teil aus hydrophilen Monomeren bestehen. Unter hydrophilen Monomeren sind solche Monomere zu verstehen, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden und vorzugsweise keine ionischen oder durch Säure- oder Basenzusatz ionisierbaren Gruppen enthalten.

Die Monomere a), b), c) und d) addieren sich jeweils zu 100 Gew.-%.

Monomere a)

Die Monomere a) sind 5 - 40, bevorzugt 5 - 20, insbesondere 6 - 10 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden. Monomere a) sind keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe. Die Monomere a) sind deshalb stets von den Monomeren d) verschieden.

Als Monomere a) sind insbesondere Acrylamid und/oder Methacrylamid geeignet, wobei Methacrylamid bevorzugt wird. Weitere Beispiele sind Hydroxyalkylester von ungesättigten polymerisierbaren Carbonsäuren, wie Hydroxyethylacrylat und Hydroxyethylmethacrylat oder N-Vinylpyrrolidon.

Monomere b)

Monomere b) sind 5 - 50, bevorzugt 32 - 40 Gew.-% radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann. Insbesondere Oxirangruppen sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden.

Bevorzugte Monomere b) sind Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether. Besonders bevorzugt werden gleichzeitig beide Monomere in etwa gleichen Mengen eingesetzt, so dass sie zusammen einen Anteil von 30 - 50, bevorzugt 32 - 40 Gew.-% ergeben.

Monomere c)

Monomere c) sind 20 - 60, insbesondere 25 - 55, besonders bevorzugt 40 - 55 Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen. Bevorzugte Monomere c) sind N,N ^' -Methylen-bis-Acrylamid oder N, N ^' - Methylen-bis-Methacrylamid. N.N ^' -Methylen-bis-Methacrylamid wird besonders bevorzugt. Gegebenenfalls können auch 0 - 10 Gew.-% weiterer vernetzender, radikalisch polymerisierbarer Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen eingesetzt werden. Geeignet sind hydrophile Di(meth)acrylate, wie z. B. Polyethyenoxid-Di(meth)acrylate.

Monomere d)

Monomere d) sind 1 bis 20, bevorzugt 5 bis 15, insbesondere 8 bis 12 Gew.-% vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quaternären Aminogruppe, bevorzugt Alkyl(meth)acrylat-Monomere mit einer quaternären Aminogruppe in Alkylrest. Monomere d) sind bevorzugt Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw. Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid.

Bevorzugte Monomerzusammensetzungen

Das makroporöse Kunststoffperlenmaterial ist bevorzugt ein Mischpolymerisat aus den folgenden Monomeren:

a) Acrylamid und/oder Methacrylamid b) Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether c) N,N ^' -Methylen-bis-Acrylamid oder N,N ^' -Methylen-bis-Methacrylamid d) Trimethylammoniumethylmethacrylat bzw./oder Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid

Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung ist, wobei sich die Anteile der fünf genannten Monomere der Monomeretypen a), b), c) und d) zu 100 Gew.-% addieren:

a) 6 bis 10 Gew.-% Methacrylamid b) 16 bis 20 Gew.-% Glycidylmethacrylat und 16 bis 20 Gew.-% Allylglycidylether c) 46 bis 50 Gew.-% N,N ^' -Methylen-bis-Methacrylamid d) 8 bis 12 Gew.-% Trimethylammoniumethylmethacrylat-Chlorid

Verfahren zur Herstellung des Mischpolymerisats

Das Verfahren entspricht weitgehend dem der DE 198 04 518 C2, mit der Maßgabe, dass das Monomere d) ein zwingend erforderlicher Bestandteil der Monomerenmischung ist.

Die Erfindung betrifft somit ein

Verfahren zur Herstellung eines periförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisats durch an sich bekannte inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase, die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel bestehen, wobei als Monomere

a) 5 bis 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wäßrige Lösungen bilden und die keine vinylisch polymerisierbaren Monomere mit einer quatemären Aminogruppe sind,

b) 5 bis 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann und

c) 20 bis 60 Gew.-% hydrophile vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen sowie

d) 1 bis 20 Gew.-% eines vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quaternären Aminogruppe für das Mischpoylmerisat enthalten sind,

mit der Maßgabe, daß sich a), b) c) und d) zu 100 Gew.-% addieren und das Verhältnis der Monomeren zum Verdünnungsmittel 1 : 1 ,5 bis 1 : 2,5, bevorzugt 1 : 1 ,7 bis 1 : 2,3, beträgt und als Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1 ,0 bis 1 : 4,0 verwendet wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus einem organischen Lösungsmittel aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 bis 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt ist, wobei das Verhältnis Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase

1 : 1 ,5 bis 1 : 4,0, bevorzugt 1 : 2,0 bis 1 : 3,0, beträgt, und in dieser Form in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden.

Verdünnungsmittel

Die Monomerenphase besteht aus den Monomeren a), b), c) und d), die in einem Verdünnungsmittel, das ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1 ,0 bis 1 : 4,0 sein muß, gelöst sind. Besonders günstige Mischungsverhältnisse für Methanol und Wasser liegen bei 1 : 1 ,2 bis 1 : 2,5, insbesondere bei 1: 1 ,3 bis 1 : 1 ,7.

Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel

Besonders kritisch ist das Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel. Dieses muß im Bereich von 1 : 1 ,5 bis 1 : 2,5, bevorzugt 1 : 1 ,7 bis 1 : 2,3, besonders bevorzugt im Bereich von 1 ,9 bis 2,1 liegen.

Kontinuierliche Phase

Als kontinuierliche Phase eignet sich ein organisches Lösungsmittel, das ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 4 bis 7 C-Atomen ist. Bevorzugt ist n- Heptan und besonders bevorzugt Cyclohexan.

Verhältnis Monomerenphase/kontinuierlicher Phase

Das Verhältnis von der Monomerenphase zur kontinuierlichen Phase, gebildet durch das organische Lösungsmittel muß bei 1 : 1 ,5 bis 1 : 4,0, bevorzugt 1 : 2,0 bis 1 : 3,0 liegen.

Weitere Verfahrensbedinqunqen

Als weitere Bestandteile enthält die suspendierte Monomerphase in an sich bekannter Weise Polymerisations-Initiatoren, bevorzugt sind schwefelfreie Initiatoren, besonders bevorzugt ist 4,4 ^* -Azobis-(4-Valeriansäure), sowie Schutzkolloide (Emulgatoren), wie z. B. ein Mischpolymerisat aus 95 Teilen n- Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlylmethacrylat-Chlorid mit Molekulargewichten (Gewichtsmittel) im Bereich von 30.000 bis 80.000.

Die Perl Polymerisation (auch als Suspensionspolymerisation bezeichnet) wird ansonsten in bekannter Weise ausgeführt, indem z. B. die kontinuierliche Phase mit dem Schutzkolloid vorgelegt wird und die Monomerenphase, in der sich auch der Initiator befindet, unter Rühren z. B. bei 40 bis 60 ⁰ C in der organischen Phase verteilt und anschließend auf 60 - 70 ⁰ C erhitzt wird. Das Wasser/Methanol-Gemisch kann z. B. über einen Zeitraum von 6 Stunden nahezu vollständig azeotrop ausgekreist werden. Man lässt den Ansatz für ca. 3 - 5 Stunden zu Ende reagieren und kühlt anschließend auf Raumtemperatur ab. Die entstandenen Perlen werden abgesaugt und z. B. für 12 Stunden im Vakuum getrocknet. Alternativ dazu können die Perlpolymerisate auch abfiltriert und mit Wasser gewaschen und dann wasserfeucht verwendet oder getrocknet werden. Bevorzugt wird die Trocknung in einem Wirbelschichttrockner vorgenommen, da sich auf diese Weise Lösungsmittelreste besonders effektiv entfernen lassen. Die erhaltenen Polymerperlen (= Trägerpolymermaterial) haben eine Größe im Bereich von 50 bis 500 μm, insbesondere von 120 bis 250 μm.

Bindungskapazität

Ein wichtiges Anwendungsgebiet des erfindungsgemäßen Trägerpolymermaterials ist die Spaltung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillan- Säure (6-APA) mittels gebundener Penicillinamidase aus E. coli.

Unter der Bindungskapazität wird diejenige enzymatische Aktivität verstanden, die sich bei maximaler Beladung des Trägerpolymermaterials mit einem bestimmten Enzym erreichen läßt. Die Bindungskapazität wird ausgedrückt als Penicillinamidase-Aktivität in Units pro g Trägerpolymerperlen [U/g feucht]. Die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen beträgt bei dieser Meßmethode mindestens 200 [U/g feucht].

Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial weist eine Bindungskapazität für Penicillinamidase aus E. coli von mindestens 200 [U/g feucht], resultierend aus der Umsetzung von 1530 Einheiten (Units) Penicillinamidase mit 1 g Trägerpolymermaterial, in Gegenwart einer Salzkonzentration von höchstens 0,1 , bevorzugt höchstens 0,05 [mol/l], auf. Die Salzkonzentration wird rechnerisch aus dem gegebenenfalls in der Enzymlösung vorhandenen Salz und dem zur Immobilisierung zugesetzten Salz oder Puffersalz in der Immobilisierungsmischung bestimmt.

Methoden:

Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase bei verschiedenen Salzkonzentrationen

Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase ( = Penicillin G- Acylase) aus E. coli (EC 3.5.1.11)

a) Kovalente Bindung von Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial

1 g Trägerpolymermaterial werden zu 1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem Kalium-Phosphat-Puffer pH-Wert 7,5 gegeben und für 48 Stunden bei 23 ⁰ C inkubiert.

Anschließend werden die Polymerperlen auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porosität 2 oder 3) gegeben und zweimal mit entionisiertem Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt.

b) Bestimmung der Bindungskapazität

400 - 700 mg feuchtes mit Penicillinamidase gekoppeltes Trägerpolymermaterial (Polymerperlen) werden in 30 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH-Wert 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, bei 37 X gegeben.

Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem konstantem pH-Wert von 7.8 für die Dauer von 4 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet wird.

Anschließend werden die Polymerperlen wie unter a) über eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml deionisiertem Wasser gewonnen.

c) Berechnung der Bindungskapazität

Der lineare Bereich der Meßkurven (üblicherweise der Bereich von 1 - 3 min) wird für die Berechnung zugrunde gelegt. Die Bindungskapazität wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials (U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem Penicillin G pro Minute (μmol/min);

1 I 0,5M NaOH ist dabei äquivalent zu 500 μmol hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.)

Bestimmung der Penicillinamidase-Bindungsausbeute in [%]

Die Berechung der Penicillinamidase(PcA)-Bindungsausbeute erfolgt gemäß der Formel

PcA-Bindungsausbeute [%] = A [U/g] x F[g] x 100 / PcA[U]

A = Immobilisierte Aktivität PcA/g feuchtem Immobilisat

F = Feuchtausbeute = Feuchtgewicht von 1g Polymerträger-Trockenmasse

PcA = eingesetzte Units PcA pro g Polymerträger-Trockenmasse

Quellzahl

Die Quellbarkeit der Polymerperlen in Wasser wird ausgedrückt durch die Quellungszahl [ml feucht / ml trocken]. Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial weist eine Quellzahl in Wasser von größer 1 ,5 bis 2,5, bevorzugt von 1 ,7 bis 2,3 auf.

Die Quellzahl liegt somit höher als bei dem Kunststoffperlenmaterial gemäß der DE 198 04 518 C2 (< 1 ,5) und niedriger als bei dem Kunststoffperlenmaterial gemäß der DE 34 04 021 A1 (ca. 3,0).

Bestimmung der Quellzahl [ml feucht/ ml trocken]

1 g Polymerträger-Trockenmasse wird in einen 25 ml Messzylinder eingewogen. Die Füllhöhe in ml wird bestimmt (= Trockenvolumen). Der Messzylinder wird anschließend zu 2/3 mit 0,01 % wäßriger Polysorbat 80- Lösung gefüllt. Der Messzylinder wird 6-mal in 10 min Abständen geschüttelt. An der Wand hängende Perlen werden mit 5 ml wäßriger Polysorbat 80-Lösung zurückgespült. Nach 3 h wird das Feuchtvolumen der am Boden des Messzylinders abgesetzten Polymerträger-Feuchtmasse in ml abgelesen. Der Quotient aus Feuchtvolumen/Trockenvolumen ergibt die Quellzahl.

Verwendungen

Die erfindungsgemäßen Trägerpolymermaterialien können zur kovalenten Bindung von Liganden mittels der vorhandenen Oxirangruppen in Rühr- oder Durchflußreaktoren eingesetzt werden. Dies kann z. B. durch Anlagerung von Proteinen, insbesondere Enzymen, aus konzentrierten Lösungen über

kovalente Bindung unter Beibehaltung ihrer biologischen Aktivität erfolgen. Weiterhin können auch Peptide, Aminosäuren, ß-Lactamantibiotika, Lipide, Nucleotide, Polynukleotide, niedermolekulare nucleophile Verbindungen oder metalloraganische Verbindungen mit den Oxirangruppen der Trägerperlen umgesetzt werden.

Die mit Liganden beladenen Polymerperlen können in an sich bekannter Weise zur stereospezifischen Synthese von chiralen Substanzen, wie Aminosäuren (D-Phenylalanin, p-Hydroxy-D-phenylalanin, L-tert.-Leucin) oder Arzneimitteln, z. B. von Ibuprofen, eingesetzt werden. Ebenso werden sie als Träger eingesetzt in der enzymatischen Spaltung von Penicillin G zu 6- Aminopenicillinansäure (6-APA) , Cephalosporin G zu 7- Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) oder Cephalosporin C zu 7- Aminocephalosporansäure (7-ACA) . Das Verfahren ist beschrieben in DECHEMA Jahrestagung 1996 - Kurzfassungen, Bd. 1 , DECHEMA e.V.. Weitere Anwendungsgebiete sind spezifische enzymatische Synthesen an Substraten wie z. B. obigen Spaltprodukten zu Amoxicillin und Ampicillin. Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Synthesen von Feinchemikalien oder Grundprodukten für chemische Synthesen (z. B. Apfelsäure, Malat). Weitere Verwendungen sind die Hydrolyse von Lactose mit trägerfixierter ß- Galactosidase und die Zersetzung von Wasserstoffperoxid mit trägerfixierter Katalase. Die Polymerperlen können auch in der Separationstechnik zur Adsorptionchromatographie oder Gelpermeationschromatographie verwendet werden. Zur spezifischen Adsorption können die Polymerperlen mit Immunglobulin-Fraktionen aus Antiseren oder mit monoklonalen Antikörper beladen werden. Als weiteres Einsatzgebiet ist die Verwendung des mit Enzymen oder Antikörpern beladenen Trägerpolymermaterials als Adsorbens in der extrakorporalen Therapie, in der pathogene bzw. toxische Substanzen aus Vollblut entfernt werden, zu nennen.

Das erfindungsgemäße makroporöse Kunststoffperlenmaterial kann insbesondere verwendet werden:

^■ zur Bindung von Proteinen.

^■ in der Chromatographie.

^■ zur Synthese von Arzneistoffen.

^■ zur stereospezifischen Synthese zur Gewinnung von enatiomerenreinen Substanzen.

^■ zur Bindung von Enzymen.

^■ zur Bindung von Antikörpern

Vorteilhafte Eigenschaften der Erfindung

Das erfindungsgemäße makroporösen Kunststoffperlenmaterial ermöglicht aufgrund der vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quatemären Aminogruppe die physikalische Adsorption von Liganden, z. B Enzymen, über ionische Wechselwirkungen unabhängig vom pH-Wert der Immobilisierungsmischung. Im Gegensatz zur EP 1 352 957 A1 ist die Herstellung des Kunststoffperlenmaterials in einem Schritt ohne Nachbehandlungen des Polymerisats möglich. Liganden können jedoch in ähnlicher Weise wie beim Material EP 1 352 957 A1 schon bei extrem niedrigen Salzgehalt mit guter Ausbeute kovalent gebunden werden. Trotz Einführung der hydrophilen vinylisch polymerisierbaren Monomeren mit einer quatemären Aminogruppe liegt die Quellzahl des Kunststoffperlenmaterials in akzeptablen Bereichen.

Beispiele

Methoden:

Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase bei verschiedenen Salzkonzentrationen

Bestimmung der Bindunqskapazität für Penicillinamidase ( = Penicillin G- Acylase) aus E. coli (EC 3.5.1.11 )

a) Kovalente Bindung von Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial

1 g Trägerpolymermaterial werden zu 1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem Kalium-Phosphat-Puffer pH-Wert 7,5 gegeben und für 48 Stunden bei 23 ⁰ C inkubiert.

Anschließend werden die Polymerperlen auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porosität 2 oder 3) gegeben und zweimal mit entionisiertem Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt.

b) Bestimmung der Bindungskapazität

400 - 700 mg feuchtes mit Penicillinamidase gekoppeltes Trägerpolymermaterial (Polymerperlen) werden in 30 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH-Wert 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, bei 37 ⁰ C gegeben.

Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem konstantem pH-Wert von 7.8 für die Dauer von 4 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet wird.

Anschließend werden die Polymerperlen wie unter a) über eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml deionisiertem Wasser gewonnen.

c) Berechnung der Bindungskapazität

Der lineare Bereich der Meßkurven (üblicherweise der Bereich von 1 - 3 min) wird für die Berechnung zugrunde gelegt. Die Bindungskapazität wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials (U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem Penicillin G pro Minute (μmol/min);

1 I 0.5M NaOH ist dabei äquivalent zu 500 μmol hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.)

Bestimmung der Penicillinamidase-Bindungsausbeute in [%]

Die Berechung der PenicillinamidaseCPcAJ-Bindungsausbeute erfolgt gemäß der Formel

PcA-Bindungsausbeute [%] = A [U/g] x F[g] x 100 / PcA[U]

A = Immobilisierte Aktivität PcA/g feuchtem lmmobilisat

F = Feuchtausbeute = Feuchtgewicht von 1g Polymerträger-Trockenmasse

PcA = eingesetzte Units PcA pro g Polymerträger-Trockenmasse

Bestimmung der Quellzahl [ml feucht/ ml trocken]

1 g Polymerträger-Trockenmasse wird in einen 25 ml Messzylinder eingewogen. Die Füllhöhe in ml wird bestimmt (= Trockenvolumen). Der Messzylinder wird anschließend zu 2/3 mit 0,01 % wäßriger Polysorbat 80- Lösung gefüllt. Der Messzylinder wird 6-mal in 10 min Abständen geschüttelt. An der Wand hängende Perlen werden mit 5 ml wäßriger Polysorbat 80-Lösung zurückgespült. Nach 3 h wird das Feuchtvolumen der am Boden des Messzylinders abgesetzten Polymerträger-Feuchtmasse in ml abgelesen. Der Quotient aus Feuchtvolumen/Trockenvolumen ergibt die Quellzahl.

Beispiele 1 bis 3

Übereinstimmende Versuchsbedinqunqen in den Beispielen 1 bis 3:

In einem 2 I Rührkolben mit Thermometer, Rückflußkühler, Stickstoffeinleitungsrohr werden ein organisches Lösungsmittel und 3 g eines Mischpolymerisats aus 95-Teilen n-Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid als Schutzkolloid vorgelegt. Unter Rühren und Durchleiten von Stickstoff wird bei 50 ⁰ C eine Monomerenphase bestehend aus Verdünnungsmittel, sowie

100 g der in Tabelle 1 angegebenen Monomermischung

sowie 2 g 4,4'-Azobis-4-cyanovaleriansäure (als Polymerisationsinitiator)

in der organischen Phase verteilt und anschließend zum Sieden bei 65 - 70 ⁰ C erhitzt. Der Ansatz wird für ca. 6 Stunden gerührt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die entstandenen Polymerperlen werden abgesaugt, gewaschen und im Wirbelschichttrockner getrocknet. Anschließend wird die Bindungskapazität für Penicillinamidase [U/g feucht] bei verschiedenen Salzkonzentrationen, die Bindungsausbeute und die Quellzahl [ml feucht/ml trocken] bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 1

Tabelle 2