Magnetische Zelldetektion

Die vorliegende Erfindung betrifft die magnetische Zelldetek ^¬ tion, wofür die zu detektierenden Zellen mittels magnetischer Marker markiert werden.

Im Bereich der Zelldetektion sind zum einen Durchflussmessungen bekannt. Diese können auf magnetischer Detektion beruhen jedoch häufiger auf optischen Messmethoden, z.B. der Streulicht- oder Fluoreszenzspektroskopie. Zum anderen sind als Nachweisverfahren Assays bekannt, in denen eine Reaktion abläuft um eine spezifische Substanz nachzuweisen. Für die Durchflusszytometrie sowie für chemische Nachweisverfahren sind verschiedene Markierungsmethoden bekannt. Fluoreszenz- marker oder nachzuweisende Antigene werden über Antikörper an die zu detektierenden Zellen angebunden. Im Gegensatz zur im- munomagnetischen Detektion wie sie beispielsweise aus Mujika et al., Phys. Stat. Sol. (a) 205, No . 6, 1478-1483 (2008) "Microsystem for the immunomagnetic detection of Escherichia coli 0157 :H7" bekannt ist, bei der eine Selektion der zu de ^¬ tektierenden Substanz durch Immobilisation auf einer funktio- nalisierten Oberfläche stattfindet, stellen magnetische

Durchflussmessungen höhere Anforderungen an das Messsignal. Neben den magnetisch markierten Zellen fließen nämlich auch ungebundene Marker sowie Agglomerate von ungebundenen Markern im Fluss mit und lösen ein Signal über den Sensor aus. Auch ist die Eindeutigkeit der Markierung eines Zelltyps nicht im ^¬ mer gegeben. Besonders Zelltypen wie Tumorzellen weisen eine hohe Varianz der Epitopenkonzentration auf den Zelloberflächen auf. Somit ergibt sich ein ganzes Spektrum von MR- Signalen für einen Zelltyp. Eine magnetische Durchflusszyto ^¬ metrie wurde daher bisher nur mit Zellen durchgeführt, die eine hohe Epitopendichte auf der Zelloberfläche besitzen. In allen anderen Fällen musste auf optische Durchflussmessungen zurückgegriffen werden, die bezüglich des messapparativen Aufbaus jedoch nachteilig gegenüber magnetischer Zelldetekti on sind.

Für ein ausreichend hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei einer Detektion mit magnetoresistiven Sensoren aus einer laminaren Strömung heraus, müssen die zu detektierenden Zellen ein hohes magnetisches Moment durch die Markierung aufweisen. Das magnetische Moment einer einzelnen Zelle ist auch entschei ^¬ dend für die in-situ Anreicherung und Zellführung durch ein externes Magnetfeld.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Methode zur magnetischen Detektion und Markierung von Zellen anzugeben, die ein ausreichend hohes magnetisches Moment der Zellen be ^¬ wirkt. Des Weiteren soll eine dafür geeignete Messvorrichtun angegeben werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 sowie durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 12.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die magnetische Zell- detektion sowie einen Markierungsschritt zur spezifischen Markierung von Zellen. Die zu detektierenden Zellen sind einem Zelltyp zugeordnet, der zellspezifische Epitope auf der Oberfläche der Zellen aufweist. Die magnetischen Marker werden über Antikörper an die Epitope auf der Oberfläche der Zellen angebunden. Zur spezifischen Markierung werden die magnetischen Marker über Antikörper eines ersten Antikörpertyps angebunden, die an Epitope eines ersten zellspezifischen Epitoptyps anbinden. Zusätzlich werden weitere magnetische

Marker über Antikörper eines zweiten Antikörpertyps an Epitope eines zweiten zellspezifischen Epitoptyps auf den Zellen angebunden. Oder es werden die magnetischen Marker über Antikörper eines vierten Antikörpertyps an die Antikörper des ersten Antikörpertyps und diese wiederum an die Epitope des ersten zellspezifischen Epitoptyps auf den Zellen angebunden. Diese Verfahren erlauben eine spezifische Markierung von Zellen. Durch die Markierung wird das magnetische Moment gegen ^¬ über anderen Zellen erhöht. Im Fall der zusätzlichen magnetischen Marker, die über einen zweiten Antikörpertyp angebunden werden, wird die Magnetmarkerdichte um die Zelle herum er ^¬ höht, was nur für Zellen geschieht, die einen ersten und zweiten Epitoptyp in Kombination aufweisen. Eine derartige Markierung schließt demnach falsch-positive Signale durch an ^¬ dere Zellen aus, die beispielsweise nur den ersten oder nur den zweiten Epitoptyp aufweisen. Deren magnetisches Moment wäre demnach sehr viel geringer, da nur die Marker mit dem ersten oder nur die Marker mit dem zweiten Antikörpertyp an diese Zellen anbinden können. Oder die Selektivität der Markierung wird dadurch erhöht, dass eine weitere Passung über die Kombination eines vierten Antikörpertyps zu dem ersten Antikörpertyp stattfindet. Ins ^¬ besondere ist dabei der erste Antikörpertyp ein hochspezifi ^¬ scher Antikörpertyp, der an die Epitope der Zelle anbindet. Dieser hochspezifische Antikörpertyp gewährleistet z.B. eine sehr geringe Anzahl an falschen Anbindungen. Die magnetische Markierung kann dann beispielsweise über einen weniger spezifischen vierten Antikörpertyp erfolgen. Die Erkennung des ersten Antikörpertyps ist weniger fehlerbehaftet als die Er- kennung der zellspezifischen Epitope auf der Oberfläche.

Durch die erfindungsgemäße Markierung wird eine kalibrati- onsfreie magnetische Durchflusszytometrie möglich. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren das magnetische Moment der Zellen erhöht, indem zusätzlich magnetische Marker über Antikörper eines dritten Antikörpertyps an Epitope eines dritten zellspezifischen Epi- toptyps auf den Zellen angebunden werden. Dies hat den Vor- teil, eine weitere Selektion vorzunehmen gegenüber Zellen, die auch Epitope des ersten und zweiten Epitoptyps in Kombi ^¬ nation aufweisen und sich nur durch Epitope eines dritten Epitoptyps vor den zu detektierenden Zellen unterscheiden. Außerdem wird das magnetische Moment der Zellen durch die hö ^¬ here Markerdichte auf der Zelloberfläche erhöht. Dadurch kann ein höherer Schwellwert für ein positives Signal gesetzt wer ^¬ den .

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren der zweite und/oder der dritte Antikörpertyp so gewählt, dass er nicht an Epitope auf einem zweiten Zelltyp anbindet. Oder der zweite und/oder der dritte Antikörpertyp wird so gewählt, dass er nur an Epitope anbin ^¬ det, die nicht in gleicher Konzentration wie auf dem zu de- tektierenden Zelltyp vorkommen. Demnach kann über die Wahl der Antikörper eine Selektion stattfinden, die eine nahezu ausschließliche Detektion von Zellen des zu detektierenden Zelltyps gewährleistet.

Insbesondere kann eine immunomagnetische Markierung mit meh ^¬ reren Antikörpern gegen verschiedene Epitope auf einer Zelle erfolgen, um Querselektivitäten zu anderen Zellen mit gerin- gerer Epitopendichte zu unterbinden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird bei dem Verfahren das magnetische Moment der Zellen erhöht, indem in einem zweiten Markierungsschritt zusätzliche magnetische Marker über Antikörper eines vierten Antikörpertyps an die magnetischen Marker des ersten Markierungsschrittes angebunden werden. Die Markerdichte kann also auch dadurch erhöht werden, dass eine zweite Markierung der bereits an die Zelle angebundenen Magnetbeads erfolgt. Die Antikörper des vierten Antikörpertyps müssen dazu spezifisch das Magnetbead der ers ^¬ ten Markierung binden. Insbesondere sind die zusätzlichen magnetischen Marker von den magnetischen Markern des ersten Markierungsschrittes verschieden. Somit wird die Markerkon ^¬ zentration um die Zelle herum signifikant erhöht und damit das magnetische Moment der Zelle. Somit wird das durch die einzelne Zelle hervorgerufene magnetoresistive Signal erhöht und gewährleistet ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. b

In dem Verfahren zur magnetischen Zelldetektion werden die spezifisch magnetisch markierten Zellen zweckdienlicherweise über eine Magnetowiderstandsänderung erfasst. Das hohe magnetische Moment der Zellen gewährleistet insbesondere, dass ein b unterer Schwellwert für eine Magnetowiderstandsänderung so hoch gesetzt werden kann, dass das Signal-Rausch-Verhältnis mindestens zwei beträgt. Insbesondere beträgt das Signal- Rausch-Verhältnis mindestens drei.

10 In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren ein oberer Schwellwert für eine Magnetowiderstandsänderung so niedrig gesetzt, dass eine Einzel- zelldetektion erfolgt. Dies hat den Vorteil, dass höhere Mag- netowiderstandsänderungswerte nicht einzelnen Zellen sondern lb Agglomeraten zugeordnet werden und als falsch-positive Signa ^¬ le ausgeschlossen werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die magnetische Detektion mittels Durchflusszyto- 20 metrie. Dabei werden insbesondere die spezifisch markierten Zellen während des Flusses über einen Sensor erfasst. Bei ^¬ spielsweise werden die Zellen in einer laminaren Strömung geführt. Die Durchflusszytometrie hat z.B. den Vorteil eines hohen Probendurchsatzes.

2b

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren magnetische Marker eingesetzt, deren Durchmesser weniger als 200 nm aufweist. Die geringe Größe der magnetischen Marker, auch Magnetbeads genannt, hat den 30 Vorteil, dass es nicht zu Agglomeraten kommt, die auf Grund der Anbindung einer Vielzahl von Antikörpern an einen einzelnen großen magnetischen Marker entstehen. Die kleinen magnetischen Marker mit Durchmessern von weniger als 200 nm lassen sich einzeln um die Zellen anordnen.

3b

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren superparamagnetische magnetische Mar ^¬ ker verwendet. Diese sind hinsichtlich der Erfassbarkeit über magnetoresistive Bauteile im Vorteil gegenüber beispielsweise ferromagnetischen Beads .

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren die Zellen in einem Gradientenmagnetfeld geführt und dadurch am Sensor angereichert. Mittels eines Gradientenmagnetfeldes können die magnetisch markierten Zellen gezielt über den Sensor gelenkt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur magnetischen Zelldetek- tion weist einen Sensor und eine Auswerteeinheit auf. Die Auswerteeinheit und der Sensor sind so ausgestaltet, dass ein Spektrum von Magnetowiderstandsänderungen aufgenommen werden kann. Dabei ist in der Auswerteeinheit ein unterer Schwell- wert für eine Magnetowiderstandsänderung hinterlegt, der so hoch ist, dass das Signal-Rausch-Verhältnis mindestens drei beträgt. Zusätzlich oder alternativ ist ein oberer Schwellwert für eine Magnetowiderstandsänderung hinterlegt, der so niedrig ist, dass eine Einzelzelldetektion durchführbar ist. Die Kombination beider Schwellwerte ist besonders vorteilhaft für eine hohe Spezifität der Messung.

Ein positives MR-Signal einer Einzelzelle muss sich gegen Hintergrundeffekte, wie beispielsweise nicht gebundene Mar- ker, aggregierte Marker oder andere magnetische Störfelder abheben können. Eine Einzelzelle muss demnach eine Magnetowiderstandsänderung oberhalb eines Schwellwertes erreichen, um derartige Hintergrundeffekte auszublenden. Daneben kann auch ein oberer Schwellwert gesetzt werden um auszuschließen, dass z.B. markierte Zellaggregate oder größere Aggregate von mag ^¬ netischen Markern mitgezählt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung ein strömungsführendes System, womit die Vor- richtung zur magnetischen Durchflusszytometrie geeignet ist. Des Weiteren umfasst die Vorrichtung Mittel zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes in dem strömungsführenden System. Magnetisch markierte Zellen werden dadurch im Gradientenmag- netfeld am Sensor anreicherbar. Dementsprechend sind die Mit ^¬ tel zur Erzeugung des Gradientenmagnetfeldes ausgestaltet. Die Mittel zur Erzeugung des Gradientenmagnetfeldes können insbesondere ferromagnetische Streifen sein.

Aus führungs formen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 8 der ange ^¬ hängten Zeichnung beschrieben. Figur 1 zeigt eine einfache magnetische Markierung einer

Zelle A.

Figur 2 zeigt eine zweifache magnetische Markierung einer

Zelle A.

Figur 3 zeigt ein Diagramm mit der Verteilung der Zellen A bzgl. der von ihnen hervorgerufenen Magnetowiderstandsänderung .

Figur 4 zeigt eine magnetisch markierte Zelle B/C.

Figur 5 zeigt ein Diagramm mit den Verteilungen der Zellen A,

B und C bzgl. der von ihnen hervorgerufenen Magneto- widerstandsänderungen.

Figur 6 zeigt eine zweifach magnetisch markierte Zelle A mit unterschiedlichen magnetischen Markern.

Figur 7 zeigt eine spezifisch markierte Zelle A.

Figur 8 zeigt eine spezifisch markierte Zelle A mit zweifa- eher Markierung durch unterschiedliche magnetische

Marker .

Die Figuren 1, 2, 4 sowie 6 bis 8 zeigen jeweils schematische Darstellungen von Zellen A, B, C, die auf der Oberfläche Epi- tope 11, 12, 13 aufweisen. Die Zelloberfläche wird durch ei ^¬ nen großen Kreis dargestellt. An die Epitope 11, 12, 13, die als kleine Kreise dargestellt sind, binden Antikörper 21, 22, 23, 24 an, die in den schematischen Zeichnungen Y-förmig dargestellt sind. Dabei bindet jeweils eines der Enden an ein Epitop 11, 12, 13 auf der Zelloberfläche an und ein anderes Ende an einen magnetischen Marker Ml, M2. Die magnetischen Marker M1,M2 sind als größere Kreise als die Epitope 11, 12, 13 dargestellt. Jedoch weisen die magnetischen Marker M1,M2 sehr viel kleinere Durchmesser auf als die Zellen A, B, C. Zwar sind die Figuren nicht maßstabsgetreu, jedoch ist ein korrektes Größenverhältnis der magnetischen Marker Ml, M2 zu den Zellen A, B, C gezeigt. Im Falle größerer magnetischer Marker M1,M2 würde es zur Aggregation und Quervernetzung kommen. D.h., mehrere Antikörper 21, 22, 23, 24 würden sich um einen magnetischen Marker Ml, M2 anordnen und an diesen anbinden und somit wäre nicht mehr die einzelne Zelle A, B, C markiert, sondern ein Agglomerat von Antikörpern 21, 22, 23, 24, Zellen A, B, C und magnetischen Markern M1,M2 um einen sehr großen magnetischen Marker erzeugt.

Die Figuren 3 und 5 zeigen jeweils ein Diagramm, in dem über der Magnetowiderstandsänderung MR die Anzahl der Zellen N aufgetragen ist, die dieses MR-Signal hervorrufen. In der Figur 3 ist die Verteilung der Zellen A gezeigt, in der Figur 5 sind die Verteilungen der Zellen A, B und C gezeigt. Dabei rufen die Zellen A ein sehr viel höheres MR-Signal hervor als die Zellen B und diese ein höheres als die Zellen C. Es gibt aber auch jeweils überlappende Bereiche, in denen nicht un ^¬ terschieden werden kann welcher Zelltyp A, B, C das MR-Signal hervorruft. Anhand von Erfahrungswerten bzw. bekannten Verteilungen werden daher Schwellwerte T für das MR-Signal ge ^¬ setzt. Dann wird anhand des Schwellwertes T in Positiv- und Negativ-Ereignisse unterschieden. Im Diagramm in der Figur 3 sind ein oberer T ₂ und ein unterer ΊΊ Schwellwert gesetzt. Oberhalb des unteren Schwellwertes ΊΊ wird ein MR-Signal als positives Signal gewertet. Unterhalb des oberen Schwellwertes T ₂ geht man von einer Einzelzelldetektion aus. Agglomerate nämlich würden ein sehr viel höheres MR-Signal hervorrufen.

Die Figur 1 zeigt zunächst die einfachste Form einer magneti ^¬ schen Markierung. Eine Zelle A weist eine Vielzahl von Epito- pen 11, 12, 13 auf der Zelloberfläche auf. Die Anzahl eines Epitoptyps kann ca. 500 Epitope auf einer Zelle umfassen. Bei der Markierung mittels eines Antikörpers 21, 22, 23, 24, der an einen spezifischen Epitoptyp 11, 12, 13 anbindet, werden ca. 80 % der Epitope abgedeckt. D.h. es gibt freie charakte- ristische Epitope 11, 12, 13, die noch einen magnetischen Marker M1,M2 über einen spezifischen Antikörper 21, 22, 23, 24 aufnehmen könnten. Eine derartige Markierung ist nicht ausreichend für ein Nutzsignal. D.h. die durch nur einen An- tikörpertyp 21-24 auf die Zelle A, B, C angebundenen Marker M1,M2 erhöhen das magnetische Moment der Zelle A, B, C nicht so weit, dass ein ausreichend hohes MR-Signal erzeugt wird. D.h. das Verhältnis von Signal zu Rauschen z.B. durch unge ^¬ bundene Magnetmarker Ml, M2 ist nicht ausreichend für ein eindeutiges positives Signal. D.h. die Sensitivität der Mar ^¬ kierung ist zu gering. Außerdem ist auch die Selektivität der Markierung zu gering. Eine Zelle B unterscheidet sich von ei ^¬ ner Zelle A durch die Anzahl und die Art der Epitope 11, 12, 13 auf der Oberfläche. Aber es kann auch dazu kommen, dass ein Antikörper 21-24 falsch an Epitope 11-13 anbindet. Es kommt auch vor, dass sich Zellen A, B unterscheiden, aber gerade in dem zu markierenden Epitop 11 eine große Übereinstimmung aufweisen. Beispielsweise haben Zelle A und Zelle B nur einen gemeinsamen Epitoptyp 11, der aber in annähernd glei- eher Konzentration auf der Zelloberfläche vorhanden ist. Somit wird die Zelle B gleichermaßen durch die Marker Ml mit dem Antikörper 21 gekennzeichnet und ist in der Messung nicht von der Zelle A zu unterscheiden. Die Figur 2 zeigt wiederum eine Zelle A, die nun aber über mehrere unterschiedliche Antikörpertypen 21, 22, 23 markiert ist. Es stehen magnetische Marker Ml mit unterschiedlichen Antikörpern 21, 22, 23 zur Verfügung. Diese binden an die Epitope 11, 12, 13 auf der Zelloberfläche an. Dadurch wird zunächst das magnetische Moment der Zelle A erhöht, in dem die Anzahl der Marker Ml um die Zelle A herum verdoppelt oder verdreifacht wird, d.h. die Sensitivität wird erhöht. Somit kann sich wie in Figur 5 gezeigt, das MR-Signal der Zellen A gegenüber den MR-Signalen der Zellen B oder C deutlich erhö- hen und somit durch eine Schwellwertgrenze T von den Signalen der Zellen B und C abheben. Darüber hinaus wird somit auch eine erhöhte Selektivität erzielt. Zwar können die Zellen B und C möglicherweise eine ähnliche Anzahl des ersten Epitop- typs 11 aufweisen. Jedoch den zweiten und dritten markierten Epitoptyp 12, 13 weisen die Zellen B und C nicht oder in sehr viel geringerer Konzentration auf als die Zelle A. Figur 6 zeigt wiederum eine Zelle A mit Epitopen 11, 12, 13 auf der Zelloberfläche, die die Zelle A von Zellen B, C un ^¬ terscheiden. Die magnetische Markierung erfolgt in einem ersten Schritt über die Anbindung von magnetischen Markern Ml über Antikörper 21 an die Epitope 11. Eine zweite Markierung erfolgt in diesem Fall nicht über einen zweiten Epitoptyp, sondern über zusätzliche Marker M2 mit Antikörpern 24, die wiederum an die magnetischen Marker Ml anbinden. Somit wird das magnetische Moment der Zelle A erhöht. Die Selektivität geschieht über das Antikörper-Epitop-Paar 21-11. Die Anbin- dung zusätzlicher magnetischer Marker M2 ist sehr viel besser als der Einsatz größerer magnetischer Marker. Bei Erhöhen des Markerdurchmessers bzw. Volumens werden Agglomerationseffekte verstärkt. Auf einem großen magnetischen Marker von über 200 nm Durchmesser binden mehrere Antikörper an, die dann Zellen A, B, C und magnetische Marker M1,M2 quervernetzen.

Idealerweise werden zur magnetischen Markierung superparamag- netische Partikel verwendet, die einen Durchmesser < 200 nm aufweisen . Figur 7 zeigt eine weitere Möglichkeit die Selektivität der Markierung zu erhöhen. Dabei werden zunächst die Epitope eines ersten Epitoptyps 11 auf der Oberfläche der Zelle A mit passenden Antikörpern 21 markiert. An diese Antikörper 21 wiederum binden Antikörper 24 an. Diese Antikörper 24 sind mit magnetischen Markern M2 verbunden. Zwar wird dadurch das magnetische Moment im Gegensatz zu einer Markierung wie in Figur 1 nicht erhöht, jedoch ist die Anbindung über die Kombination zweier Antikörper 21, 24 sehr viel spezifischer, was die Selektivität der MR-Messung erhöht. Zur Erhöhung der Sen- sitivität, d.h. zur Erzielung eines besseren Signal-Rausch- Verhältnisses, kann wieder eine Art Sandwichmarkierung wie schon in Figur 6 gezeigt, erfolgen. Diese Kombination ist in Figur 8 gezeigt. Dabei wird für eine hohe Selektivität die erste magnetische Markierung über Marker M2 mit Antikörpern 24 an den spezifischen Antikörper 21 durchgeführt. Das magnetische Moment wird dann durch eine zweite Markierung durch Marker Ml über Antikörper 24 erhöht, die an die magnetischen Marker M2 anbinden. Vorzugsweise wird die Markierung in zwei aufeinanderfolgenden Markierungsschritten durchgeführt.

Nachfolgend wird ein beispielhafter Ablauf einer magnetischen Durchflusszytometrie beschrieben. Diese erfolgt insbesondere in einer Mikrofluidik . Für eine effiziente Messung sind drei Arbeitsschritte essentiell:

1. Die in-situ-Anreicherung der magnetisch markierten Zellen A am Sensor,

2. die Zellführung, insbesondere die Führung der magnetisch markierten Zellen A in einer Strömung über den Sensor und 3. die Detektion der magnetisch markierten Zellen A mittels eines magnetoresistiven Bauteils. Insbesondere erfolgt der Zelltransport, d.h. der Zelldurch- fluss durch die Mikrofluidik in einer laminaren Strömung. Die magnetisch markierten Zellen A erfahren dazu eine Kraft in einem externen magnetischen Gradientenfeld. Dieses Gradientenfeld ist so ausgerichtet, dass die Zellen A am Sensor, der beispielsweise an oder in der Kanalwand angebracht ist, vor ^¬ beigeführt werden. Für die in-situ-Anreicherung und die Zellführung ist es notwendig, dass die magnetisch markierten Zellen A ein ausreichend hohes magnetisches Moment aufweisen. Nur so können sie in dem externen magnetischen Gradientenfeld beeinflusst und gelenkt werden. Das externe magnetische Gra ^¬ dientenfeld beträgt z.B. 100 mT oder einen Betrag in dieser Größenordnung. Für die Detektion der Zellen A mit einem magnetoresistiven Bauteil ist ein hohes Streufeld der magne ^¬ tisch markierten Zellen A notwendig. Nur wenn die magnetisch markierten Zellen A ein ausreichend hohes Streufeld aufwei ^¬ sen, bewirken sie eine ausreichend große Widerstandsänderung MR im Bauteil. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Zellen A, B, C unabhängig von der Epitopenkonzentration pro Zelloberfläche so markiert werden, dass eine magnetische Durchflusszyto- metrie durchgeführt werden kann. Die Epitopenkonzentration pro Zelloberfläche beträgt typischerweise 1000 oder mehr. In dem Verfahren werden insbesondere superparamagnetische Parti ^¬ kel zur Markierung verwendet und auf der Zelloberfläche so dicht angeordnet, dass das magnetische Moment, unabhängig von Zelltyp und dessen Epitopendichte, zur magnetischen Durch- flusszytometrie geeignet ist. Durch die hohe Markerdichte und das dadurch hohe magnetoresistive Signal MR kann ein ausrei ^¬ chend hoher Schwellwert T für ein positives Signal gesetzt werden um Hintergrundeffekte auszuschließen, die anderenfalls als falsch-positive Signale erfasst werden könnten. Insbeson ^¬ dere kann eine kombinierte immunomagnetische Markierung er ^¬ folgen. Dadurch ist eine Zellanreicherung auch in Medien wie z.B. Vollblut möglich und eine Zellführung in einem Gradientenfeld. Das Gradientenfeld kann insbesondere durch ferromag- netische Streifen erzeugt werden, die um die Mikrofluidik angeordnet sein können.