PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE OVOCITOS Y/O EMBRIONES MAGNÉTICOS MEDIANTE NANOPARTÍCULAS PARA TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Y USO EN TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA DE OVOCITOS Y/O EMBRIONES NO HUMANOS PREPARADOS CON DICHO PROCEDIMIENTO

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención, tal como expresa el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a un procedimiento de preparación de ovocitos y/o embriones magnéticos mediante nanopartículas para técnicas de reproducción asistida y al uso en técnicas de reproducción asistida de ovocitos y/o embriones no humanos preparados con dicho procedimiento, todo lo cual supone una destacable novedad en el estado actual de la técnica dentro de su campo de aplicación.

Más en particular, el objeto de la invención se centra, por una parte, en un procedimiento para la magnetización de ovocitos y/o embriones basado en la utilización de nanopartículas magnéticas y una tecnología de unión proteica entre las nanopartículas y la parte externa de los ovocitos/embriones, denominada zona pelúcida (ZP), ya que dicha magnetización de ovocitos/embriones puede llegar a ser una propiedad muy útil en el uso de tales ovocitos/embriones en las diferentes técnicas de reproducción asistida en las diferentes especies animales.

Esencialmente, el proceso comprende una primera etapa en la que se conjugan las nanopartículas magnéticas con la proteína recombinante del fluido oviductal, oviductina (OVGPI r); una segunda etapa en la que dicha conjugación de nanopartículas-OVGPI r, a su vez, se une a la ZP de ovocitos/embriones mediante su incubación conjunta o co-incubación; y una tercera etapa en la que, mediante un campo magnético se evalúa que la cantidad de nanopartículas magnéticas unidas a la ZP de ovocitos/embriones sea suficiente para que sean atraídas por un campo magnético.

Asimismo, un segundo aspecto de la invención se refiere al uso concreto en técnicas de reproducción asistida de ovocitos y/o embriones no humanos preparados con dicho procedimiento.

CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El campo de aplicación de la presente invención se enmarca dentro del sector de la bioquímica y en el de la nano-biotecnología o nano-medicina, abarcando más concretamente el ámbito de las técnicas de reproducción asistida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El uso de nanopartículas magnéticas está muy extendido hoy en día en el campo de la biotecnología y la biomedicina ya que supone un procedimiento no invasivo para diagnóstico y terapia de algunas enfermedades, tales como el cáncer, el Alzheimer o en el trasplante de células madre en enfermedades como el infarto de miocardio. En la rama de la reproducción asistida, estas nanopartículas magnéticas se utilizan actualmente en células espermáticas, por un lado, para la detección de espermatozoides dañados al conjugar dichas nanopartículas con diferentes anticuerpos y lectinas que se unen a dichos gametos, y por otro lado para su uso en la transgénesis mediada por espermatozoides.

Sin embargo, la presente invención trata del uso de nanopartículas magnéticas en ovocitos y/o embriones a través de una novedosa tecnología de unión proteica entre las nanopartículas conjugadas con la proteína recombinante OVGPI r y la parte externa de los ovocitos/embriones, denominada zona pelúcida (ZP), lo que hace que dicha unión sea muy específica. De manera natural, la proteína OVGP1 presente en el fluido oviductal se une a la ZP de ovocitos y embriones.

Como referencia al estado actual de la técnica, cabe señalar que, se conocen patentes y documentos relacionados con el objeto de la presente invención, siendo los más relevantes los siguientes:

El documento EP2237039A1 , que hace referencia a una micropartícula codificada de un material biocompatible para etiquetar y/o rastrear un ovocito o un embrión aislado. Dicha micropartícula se fija a la ZP de la célula y puede ser rastreada, mediante microscopía óptica, por su forma externa la cual constituye un código de identificación particular. El documento US2016091410A1 , que divulga un método para procesar espermatozoides animales para mejorar su motilidad, viabilidad y fertilidad que comprende composiciones con partículas magnéticas.

El documento“Barcode tagging of human oocytes and embryos to prevent mix-ups in assisted reproduction technologies” publicado en 2014 por Novo Sergi; Nogues Carme; Penon Oriol; Barrios Leonardo; Santalo Josep; Gomez-Martinez Rodrigo; Esteve Jaume; Errachid Abdelhamid; Antonio Plaza José; Perez-Garcia Lluisa; Ibanez Elena, que describe la aplicación en las tecnologías de reproducción asistida de ovocitos y embriones humanos etiquetados en la zona pelúcida con códigos de barras de polisilicio biofuncionales.

El documento “Direct embryo tagging and identification system by attachment of biofunctionalized polysilicon barcodes to the zona pellucida of mouse embryos”, publicado en 2013 por Novo Sergi; Penon Oriol; Barrios Leonardo; Nogues Carme; Santalo Josep; Duran Sara; Gomez-Matinez Rodrigo; Samitier Josep; Antonio Plaza José; Perez-Garcia Luisa; Ibanez Elena, que describe un sistema directo de etiquetado e identificación de embriones mediante el acoplamiento de códigos de barras de polisilicio biofuncionales a la zona pelúcida de embriones de ratón.

El documento “Biomolecule screening for efficient attachment of biofunctionalized microparticles to the zona pellucida of mammalian oocytes and embryos", publicado en 2013 por Novo S; Ibañez E; Barrios L; Castell O; Nogues C, que describe la selección de biomoléculas para la fijación eficiente de micropartículas biofuncionales a la ZP de ovocitos y embriones de mamíferos. El etiquetado individual de ovocitos y embriones mediante la fijación de códigos de barras de polisilicio a la ZP es una técnica que se aplica en la reproducción asistida humana y en los programas de producción animal. Para proporcionar códigos de barras con la capacidad de fijarse a la ZP, éstos deben ser sometidos primero a un proceso de biofuncionalización mediante su conjugación a una biomolécula capaz de fijarse a la ZP de ovocitos y embriones. Las biomoléculas analizadas son un anticuerpo anti-ZP2, las dos lectinas de germen de trigo aglutinina (WGA) y fitohemaglutinina-l.

El documento “Bioluminescent magnetic nanoparticles as potential imaging agents for mammalian spermaiozoa” , publicado en 2016 por Vasquez E S; Feugang J M; Willard S T; Ryan P L; Walters K B, que describe nanopartículas magnéticas bioluminiscentes como potenciales agentes para la bioimagen de espermatozoides de mamíferos. Los compuestos bioluminiscentes que comprenden nanopartículas magnéticas y la luciferase de la luciérnaga (Photinus pyralis) son analizados como potenciales agentes emisores de luz para la proyección de imagen, detección y seguimiento de los espermatozoides de mamíferos.

El documento “Lectin-Functionalized Magnetic ¡ron Oxide Nanoparticles for Reproductive Improvemenf’, publicado en 2015 por Feugang J M; Shengfa F L; Crenshaw M A; Clemente H; Willard S T; Ryan P L, describe la utilización de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro biofuncionalizadas mediante lectinas como una nueva estrategia de purificación y selección de células espermáticas para incrementar la fertilidad del semen en métodos de reproducción asistida.

El documento“The C-terminal región of OVGP1 remodels the zona pellucida and modifies fertility parameters”, publicado en 2016 por Algarra B; Han L; Soriano-Ubeda C; Aviles M; Coy P; Jovine L; Jimenez-Movilla M. analiza la función de la región C-terminal de la proteína OVGP1 (Oviduct-specific glycoprotein T) en el proceso de unión de OVGP1 a la zona extracelular pelúcida del ovocito y en la actividad de la proteína durante la fecundación.

No obstante, no se observa que ninguna de las patentes o documentos anteriores, tomadas por separado o en combinación, describa la presente invención, según se reivindica.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El procedimiento de preparación de ovocitos y/o embriones magnéticos mediante nanopartículas para técnicas de reproducción asistida y al uso en técnicas de reproducción asistida de ovocitos y/o embriones no humanos preparados con dicho procedimiento que la invención propone se configuran, pues, como destacable novedad dentro de su campo de aplicación, estando los detalles caracterizadores que los distinguen convenientemente recogidos en las reivindicaciones finales que acompañan a la presente descripción.

Como se ha apuntado anteriormente, lo que la invención propone es un procedimiento para la magnetización de ovocitos y/o embriones de las diferentes especies animales basado en la utilización de nanopartículas magnéticas conjugadas con proteína OVGP1 presente en el fluido oviductal y en este caso expresada de manera recombinante (OVGPI r) que presenta afinidad por la parte externa de los ovocitos/embriones, denominada zona pelúcida (ZP), lo cual proporciona una propiedad muy útil en el manejo de tales ovocitos/embriones en las diferentes técnicas de reproducción asistida.

De manera concreta, el procedimiento que la invención propone comprende, al menos, las siguientes etapas:

- Una primera etapa en que se conjugan (proceso de unión) las nanopartículas magnéticas con la proteína recombinante oviductina (OVGPI r). Dicha proteína se utiliza por su capacidad de interactuar con la matriz extracelular, ZP, del ovocito/embrión de manera natural cuando se produce el tránsito de los ovocitos y embriones por el oviducto.

Concretamente, se utiliza una proteína recombinante OVGPI r truncada, es decir, que carece de la región D del extremo C-terminal, región responsable de la endocitosis de esta proteína, ya que esta forma truncada de OVGPI r se une mejor a la zona externa de la ZP del ovocito/embrión que la proteína completa y además no es endocitada.

A través de diferentes experimentos, se comprueba que dicha conjugación (unión entre las nanopartículas y la proteína OVGPI r) es una unión fuerte y estable en el tiempo.

- Una segunda etapa en que se comprueba si dicha conjugación nanopartículas-OVGPI r, a su vez, se une a la ZP de ovocitos/embriones tras su incubación conjunta.

Para ello, se co-incuban los ovocitos/embriones con las nanopartículas-OVGPI r a diferentes concentraciones a lo largo del tiempo (hasta 24 h de co-incubación).

- Y, una vez transcurrido el tiempo correspondiente de co-incubación, una tercera etapa en que, tras comprobar el número de ovocitos/embriones que tienen unidas las nanopartículas y que éstas se encuentran distribuidas, de manera más o menos homogénea, alrededor de la ZP sin ser endocitadas, se evalúa si la cantidad las nanopartículas magnéticas unidas a la ZP de ovocitos/embriones son suficientes para que dichos ovocitos/embriones sean atraídos por un campo magnético. Para ello, se utiliza un dispositivo magnético donde se comprueba que, aproximadamente, el 80% de ovocitos/embriones con las nanopartículas adheridas sean atraídos por el campo magnético.

Cabe mencionar que, preferentemente, el diámetro de las nanopartículas está comprendido entre 1 y 500 nanómetros y que, también de modo preferido, la temperatura de conjugación entre las nanopartículas y la OVGPI r se encuentra comprendida entre los 4°C y los 38°C.

En cualquier caso, esta capacidad magnética supone un gran avance en la manipulación de ovocitos y embriones, ya sea para su desplazamiento hacia lugares específicos a través de la aplicación de un campo magnético móvil o para mantenerlos inmóviles mediante un campo magnético fijo. El uso de esta tecnología es de gran interés en técnicas de reproducción asistida en las diferentes especies animales. Una de las grandes limitaciones en las técnicas de reproducción consiste en el propio manejo y manipulación de ovocitos y embriones, ya que requieren unas condiciones de máximo control para preservar su calidad fecundante en el caso del ovocito o de desarrollo en el caso del embrión. Procesos como la maduración in vitro de ovocitos, inseminación artificial, fecundación in vitro, cultivo y desarrollo embrionario o vitrificación requieren la manipulación de los ovocitos y embriones, tanto para desplazarlos y proporcionar las modificaciones de medios y reactivos o para inmovilizarlos en soportes que permitan su traslado. Por otro lado, la determinación de la mejor calidad embrionaria para la elección del embrión que va a ser implantado requiere la observación de su desarrollo durante varias horas mediante técnicas de visualización ( time-lapse ) donde la inmovilización del embrión es fundamental para su enfoque durante largo tiempo. Por último, la naturaleza magnética de las partículas adheridas a la ZP podría utilizarse para la localización del embrión en el tracto genital de la hembra mediante resonancia magnética u otras técnicas de diagnóstico por imagen.

Es importante destacar el hecho diferenciador de la técnica de adhesión de las nanopartículas a los ovocitos y embriones. A diferencia de metodologías utilizadas en el mareaje de ovocitos en la que se usa como elemento de unión una lectina (proteínas exógenas provenientes de plantas) o anticuerpo, en este caso usamos una proteína recombinante endógena propia de la especie y que se encuentra en condiciones naturales unida a la parte externa de ovocitos y embriones in vivo. El hecho de que sea una proteína recombinante hace que la metodología sea fácilmente trasladable a cualquier especie, ya que solo se tendría que usar la proteína recombinante OVGPI r propia de la especie. Por otro lado, este mismo hecho, hace que esta proteína se pueda generar fácilmente unida a proteínas fluorescente lo que permitirá su fácil detección.

Por todo ello, un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de ovocitos y/o embriones magnéticos no humanos, preparados según el procedimiento descrito anteriormente, en técnicas de reproducción asistida en las diferentes especies animales, como son la manipulación de gametos o maduración in vitro de ovocitos, inseminación artificial, fecundación in vitro en tratamientos de fertilidad, vitrificación o cultivo, seguimiento y desarrollo embrionario, por la capacidad magnética que adquieren los ovocitos y/o embriones con dicho procedimiento, permite su desplazamiento hacia lugares específicos a través de la aplicación de un campo magnético móvil o para mantenerlos inmóviles mediante un campo magnético fijo, su inmovilización para su visualización mediante técnicas de microscopía e imagen ( time-lapse ), por la capacidad de retención del campo magnético de los ovocitos y/o embriones magnetizados, así como su detección, seguimiento y visualización a través del tracto genital femenino mediante resonancia magnética, por la naturaleza férrica y magnética de las nanopartículas.

Visto lo que antecede, se constata que el procedimiento de preparación de ovocitos y/o embriones magnéticos mediante nanopartículas para técnicas de reproducción asistida y al uso de dichos ovocitos y/o embriones no humanos en técnicas de reproducción asistida representan una innovación de características desconocidas hasta ahora para el fin a que se destina, razones que unidas a su utilidad práctica, la dotan de fundamento suficiente para obtener el privilegio de exclusividad que se solicita.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

A continuación, se describen ejemplos concretos del procedimiento de la invención aplicados en ovocitos porcinos.

- Conjugación de la OVGPI r con las nanopartículas magnéticas (MNPs):

En este experimento se utilizó un modelo de MNPs Small Carboxyl-Modified Paramagnetic Microspheres (-COOH) (Estapor®). Estas MNPs férricas presentan una alta capacidad magnética, con un diámetro de 0.365 pm y una concentración de 1 mg/ml. Para su manejo se utilizó un rack magnético (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido).

Para la conjugación de la OVGPI r con las MNPs se utilizaron 10 mI (1 mg MNPs/ml) de MNPs. Primero, las MNPs se lavaron dos veces en 500 mI de agua milli-Q y se resuspendieron en 240 mI de buffer de activación (Fosfato Sódico 100 mM, pH 6.2), 30 mI de buffer de conjugación 1-(3-dimetilaminopropil)-3-ethylcarbodiimide HCI o EDC (50 mg/ml diluidos en agua) y 30 mI de buffer de conjugación Sulfo NHS (50 mg/ml diluidos en agua). A continuación, se mantuvieron 20 minutos en agitación a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, las MNPs se lavaron dos veces en 500 mI de buffer de acoplamiento (Bicarbonato Sódico 0.1 M, pH 8) y se incubaron con 15 mI (correspondiente a 6 pg) de OVGPI r (0.4 mg/ml) en 300 mI de buffer de acoplamiento (Bicarbonato Sódico 0.1 M, pH 8) durante toda la noche a 4°C o a temperatura ambiente durante 2 horas.

Al día siguiente (o pasadas las 2 horas) las MNPs se lavaron dos veces en PBS (buffer de fosfato sódico 20 mM). Todos los experimentos se realizaron con una batería de buffers para mejorar las condiciones de conjugación y almacenaje del complejo MNPs-OVGP1 r.

- Electroforesis y Western Blot:

Con el fin de verificar que la conjugación de la OVGP1 r con las MNPs se había llevado a cabo con éxito, se realizaron una electroforesis y un Western Blot.

Primero, las MNPs se incubaron con el buffer de carga 10 minutos a 100°C. A continuación, se realizó la electroforesis a 400 miliamperios y 200 voltios durante 40 minutos. Se utilizó un gel comercial de acrilamida-bisacrilamida polimerizado: el gel NovexTM WedgeWelITM 4-20% Tris-glicina 1.0 mm x 100 Well (InvitrogenTM).

Tras la electroforesis, las proteínas del gel se transfirieron a una membrana de polivinildenedifloride (PVDF) con un tamaño de poro de 0.45 pm (Millipore Corporation, Bedford) previamente tratada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia se llevó a cabo en XCell II TM Blot Module (Invitrogen TM) a 30 voltios y 400 miliamperios durante 1 h y 6 minutos. Una vez la transferencia hubo terminado, la membrana se lavó tres veces con TBS-T (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCI y 0.1 % de Tween 20). Posteriormente, la membrana se bloqueó con TBS-T con albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich) al 1 % durante 1 hora en agitación lenta a temperatura ambiente o a 4°C durante toda la noche. Después, la membrana se lavó con TBS-T tres veces durante 10 minutos cada lavado y se incubó con el anticuerpo anti- conejo-HRP (Santa Cruz Biotechnology) a una concentración de 1 :40.000 durante 1 hora a temperatura ambiente.

Finalmente, la membrana se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T y se reveló usando el reactivo Pierce ECL-Plus (Thermo Scientific). Para detectar la proteína, se utilizó el analizador de imagen ImageQuant™ LAS 500®.

- Obtención y maduración in vitro de los ovocitos porcinos:

Los ovocitos usados se obtuvieron de cerdas pre-púberes provenientes de matadero. Los ovarios se transportaron al laboratorio en una solución salina estéril a 38.5°C dentro de la primera hora desde el sacrificio de los animales. Una vez en el laboratorio, los ovarios se lavaron con hexadeciltrimetilamonio de bromidio (CTAB) y solución salina a 38.5°C.

Para la obtención de ovocitos, se aspiraron folículos con un tamaño de entre 3 y 6 mm utilizando jeringas de 10 mi y agujas estériles de 18x40 mm. El fluido folicular se depositó en tubos cónicos de 15 mi colocados en una placa térmica a 38.5°C.

Pasados 5 min, se retiró el sobrenadante, se lavó el pellet con PBS a 38.5°C y se depositó en una placa Petri. La selección de los complejos cúmulo-ovocitos (COCs) se realizó mediante aspiración, usando un estereoscopio (Motic SMZ-168) y una pipeta Pasteur de cristal alargada por calor y conectada a una cánula de silicona. Se seleccionaron los ovocitos con un citoplasma homogéneo y por lo menos tres capas de células del cúmulo.

Los COCs seleccionados se lavaron dos veces en PBS templado antes de pasarlos al medio de cultivo NCSU-37, previamente equilibrado a 38.5°C en el incubador con un 5% de CO2 y una atmósfera saturada de humedad durante al menos 3 horas. Los COCs se cultivaron en grupos de 50-55 en un volumen de medio de cultivo de 0.5 mi. Las primeras 20-22 horas de cultivo, los COCs se cultivaron en presencia de gonadotropina sérica de yegua gestante (PMSG), gonadotropina coriónica humana (HCG) y dibutiril cAMP. Pasadas estas horas iniciales, los COCs se transfirieron a un medio NCSU-37 sin hormonas, donde primero se lavaron una vez y luego se cultivaron durante otras 20-22 horas. Cuando finalizaron las 40-44 horas del cultivo de los COCs, se decumularon mecánicamente mediante pipeteo suave hasta que las células del cúmulo se separaron. A continuación, solo los ovocitos sin células del cúmulo se seleccionaron y se lavaron en medio Tyroide's albúmina-lactato-piruvato (TALP).

- Experimento 1. Conjugación de la OVGPI r con MNPs

En el primer experimento, las MNPs se conjugaron con OVGPI r durante 2 horas a temperatura ambiente o a 4°C durante toda la noche. Para el manejo de las MNPs, es importante mezclar bien el contenido mediante agitación.

A continuación, se cogieron 10 pl de MNPs y se mezclaron con 500 mI de agua milli-Q en un Eppendorf. Usando un rack magnético (GE Healthcare) se separaron las MNPs del medio. Tras la conjugación, el volumen total de MNPs conjugadas (MNPs-OVGP1 r) era de 300 mI a una concentración final de 0.033 mg de MNPs/ml.

Una vez terminó la conjugación, se comprobó mediante electroforesis y Western Blot. Las fracciones analizadas fueron: (A) 25 mI de agua con 6 pg de OVGPI r, (B) 25 mI del medio que se recogió una vez realizada la conjugación (para evaluar la cantidad de proteína que no se había unido), (C1 y C2) 25 mI de los lavados que se realizaron tras la conjugación (para asegurar que la proteína no se estaba perdiendo en estos lavados) y (D) 25 mI del medio con la OVGPI r que se había unido a las MNPs. Se añadió el buffer de carga (8.33 mI) en cada fracción y se incubó 10 minutos a 100°C. Antes de cargar el gel de electroforesis se lavaron las fracciones con las nanopartículas de dos a cuatro veces para asegurar que el medio quedase limpio.

También se evaluó si la OVGPI r continuaba unida a las MNPs tras 72 horas almacenada a 4°C en tampón fosfato sódico (PBS) 20 mM.

- Experimento 2. Co-incubación de las MNPs OVGPI r con los ovocitos porcinos

Una vez las MNPs se conjugaron adecuadamente con la proteína OVGPI r, se procedió a la maduración in vitro de ovocitos porcinos. Los ovocitos fueron divididos en tres grupos e incubados de la siguiente manera:

• Grupo control: los ovocitos se incubaron con 20 pl (concentración de 1.33 pg MNPs/ml) de MNPs sin la OVGP1 r conjugada.

• Grupo de 10 pl: los ovocitos se incubaron con 10 mI (0.67 pg MNPs/ml) de MNPs-OVGP1 r.

• Grupo de 20 pl: se incubaron los ovocitos con 20 pl de MNPs-OVGP1 r.

Cada grupo se colocó en un pocilio con medio TALP y se guardó en el incubador a 38.5°C y un 5% de CO2.

La unión entre los ovocitos y las MNPs se evaluó a diferentes tiempos: 0.5, 1 , 6 y 24 h de co incubación. Pasados estos tiempos, se separaron algunos ovocitos de cada grupo, se lavaron en medio TALP y se transfirieron a un pocilio con 0.5 mi de medio TALP.

A continuación, se sometieron a los ovocitos a un campo magnético con el fin de evaluar el número de ovocitos magnetizados. Para ello, se transfirieron los 0.5 mi de medio TALP con los ovocitos a un tubo Eppendorf que se colocó en un rack magnético. A continuación, se recogió el medio lentamente (con una micropipeta automática de 500 pl) sin quitar el Eppendorf del rack magnético, y se volvió a colocar en el pocilio. Se contó y anotó el número de ovocitos que había en el pocilio ya que estos representan el número de ovocitos que no habían sido retenidos por el imán. Por último, se retiró el imán y se volvió a pasar el medio TALP (con los ovocitos) por el tubo Eppendorf para recuperar los ovocitos que se habían unido en presencia del imán (referido como el porcentaje de ovocitos magnetizados).

Descrita suficientemente la naturaleza de la presente invención, así como la manera de ponerla en práctica, no se considera necesario hacer más extensa su explicación para que cualquier experto en la materia comprenda su alcance y las ventajas que de ella se derivan, haciéndose constar que, dentro de su esencialidad, podrá ser llevada a la práctica en otras formas de realización que difieran en detalle de la indicada a título de ejemplo, y a las cuales alcanzará igualmente la protección que se recaba siempre que no se altere, cambie o modifique su principio fundamental.