Die heutigen Nachweisverfahren für Nukleinsäuren, wie Polymerase-Chain- Reaction (PCR), Ligase-chain-reaction (LCR), Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Strand Displacement Amplification (SDA) können durch Amplifikation von Nukieinsäuren mit extremer Empfindlichkeit durchgeführt werden. Durch diese Empfindlichkeit sind die Verfahren sehr anfällig gegen Kontaminationen. Die Kontaminationsgefahr wächst dabei mit der wachsenden Anzahl von Schritten und den auszuführenden Manipulationen, wie Zentrifugier- und Pipettierschritten. So sollte den Experimentatoren daran gelegen sein, die Anzahl der Schritte und Manipulationen möghchst gering zu halten. Dies ist jedoch oft problematisch, da für unterschiedliche Schritte unterschiedliche Probenvolumina eingehalten werden müssen und zwischendurch eine Konzen- trierung des Probenvolumens notwendig ist. So besteht der Bedarf nach einer Möglichkeit bei den oben genannten Verfahren Manipulationsschritte, insbeson- dere Zentrifugationsschritte, einzusparen, indem die zu bestimmende Probe aus den verschiedenen Gefäßen, wie Cups oder Mikrotiterplatten, direkt herausge- holt werden kann und überführt werden kann. Dieser Bedarf Proben auf einfache Weise von einem großen Volumen in ein kleineres Volumen zu überführen bzw. auf einfache Weise die Probengefäße wechseln zu können, beschränkt sich natürlich nicht nur auf das Gebiet der Nukleinsäuretechnik, sondern besteht in der gesamten (Bio) chemie, wo die Aufkonzentrierung von Proben notwendig ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb in der Bereitstellung einer Vorrichtung mit der Zielmoleküle auf einfache Weise aus Gefäßen her-

ausgeholt und in andere Gefäße überführt werden können, wodurch Manipula- tionsschritte, wie Zentrifugationsschritte, eingespart und in kleinen Volumina gearbeitet werden kann.

Gelöst wird diese Aufgabe durch einen Magnetstift gemäR Patentanspruch 1.

Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Um mit dem erfindungsgemäßen Magnetstift einen Vorteil bei den oben genann- ten Verfahren zu erreichen, muß natürlich eine magnetische Markierung der Zielmoleküle vorliegen. Wie dies erreicht werden kann, ist dem Fachmann bekannt. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß die Zielmoleküle selbst magnetische Eigenschaften haben oder an"magnetic beads"gebunden sind.

Eine andere Möglichkeit, falls es sich um ein Nachweisverfahren handelt, ist es, Streptavidin an Eisen zu koppeln und damit die Zielmoleküle zu binden, die ihrerseits mit Biotin markiert sind.

In einem beispielhaften Verfahrens, bei dem der erfindungsgemäße Magnetstift zum Einsatz kommt, wird das Probenmaterial, z. B. Serum, Plasma, Voliblut, Zellen oder Gewebe, einem chemischen oder chemisch-enzymatischen Auf- schluß bzw. einer Denaturierung unterworfen. Diese Lösung enthält gleichzeitig ein erstes Nukleinsäure-Oligonukleotid (Primer), das als Sonde an die Zielmolekü- le hybridisiert. Dieses Oligonukleotid ist kovalent mit einem Biotinmolekül ver- bunden, das mit hoher Affinität von Streptavidin gebunden werden kann. Dieses Streptavidin ist seinerseits wiederum an Partiel gebunden, die Eisen beinhalten.

Weil die Streptavidin-Partikel nicht in ein denaturiertes Probengemisch gegeben werden können, da sie ansonsten gleichfalls denaturieren würden und ihre Bindungseigenschaften an Biotin verlieren würden, muß das Probengemisch verdünnt werden, was zu einer Zunahme des Probenvolumens führt. Dieses große Probenvolumen wirkt sich allerdings negativ auf sich anschließende Schritte, wie z. B. Amplifikationen, aus. So werden die entstandenen Konjugate (Probe-Oligonukleotid-Biotin-Streptavidin-Eisen) mittels des erfindungsgemäßen Magnetstifts in ein anderes Gefäß überführt, wo dann in einem sehr viel kleine-

ren Volumen die weiteren Schritte des Verfahrens stattfinden können.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, die zeigen : Fig. 1a : Einzelkomponenten eines erfindungsgemäßen Magnetstifts 8 Fig. 1b : Zusammengebauter erfindungsgemäßer Magnetstift 8 Fig. 2 : Überführung von Partikeln aus einem großen Probengefäß in ein kleines Probengefäß Fig. 3a : Einzelkomponenten eines weiteren erfindungsgemäßen Magnet- stifts 22 Fig. 3b : Zusammengebauter erfindungsgemäßer Magnetstift 22 Die Einzelkomponenten einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Ma- gnetstifts sind in Fig. 1a gezeigt. Der Magnetstift 1 weist an seinem hinteren Ende einen Greifadapter 2 auf. Dieser ist so ausgestaltet, daß er von einem kommerziellen Pipettierautomaten gegriffen und bedient werden kann. Der Greifadapter 2 ist dabei bevorzugt aus einem verformbaren Material, wie z. B.

Gummi. Weiter weist der Magnetstift 1 einen Verbindungsstift 4 mit einer Ausbuchtung 3 auf, um für den Pipettierautomaten einen Angriff zu bilden.

Weiter dient die Ausbuchtung dazu, um eine Hülle 5 festzuhalten. Diese Hülle 5 ist dünnwandig (Wanddicke ca. 0,2 bis 0,7 mm, bevorzugt 0,3 mm) und besteht vorzugsweise aus polymeren Kunststoffen (z. B. Polypropylen) bzw. einem nicht- magnetisierbaren, jedoch leitfähigen, Material, z. B. Kunststoffen mit Graphit- anteil. Die Hülle 5 ist am unteren Ende vorzugsweise konisch geformt und weist eine Verengung 6 auf, die vorzugsweise so an Probengefäße angepaßt ist, daß sie bei geringgradigem Flüssigkeitsvolumen (z. B. 25, ul in einem PCR-Cup) gerade noch in einem gefüllten Probengefäß benetzt wird. Der Verbindungsstift 4 sollte aus einem nicht-magnetischen Material, wie z. B. Aluminium sein. Am vorderen Ende weist der Magnetstift einen vorzugsweise konisch geformten Magnetkopf 7 auf. Dafür kommt jeder übliche Permanentmagnet in Frage.

In Fig. 1 b ist ein mit der Hülle 5 versehener Magnetstift 1 als erfindungsgemäßer Magnetstift 8 gezeigt.

Die Konzentrierung des in den Probengefäßen vorhandenen magnetisch-markier- ten Probenmaterials wird vorzugsweise mit dem in der Hülle befindlichen Ma- gnetstift 8 ausgeführt und verläuft vorzugsweise wie in Fig. 2 gezeigt.

I) In ein großes Probengefäß 9 mit sich in einer Flüssigkeit befindlichen ma- gnetisch markierten Partikeln 10 wird der Magnetstift mit Hütte 8 einge- taucht. Stift und Hülle werden langsam nach unten bewegt. Die Partiel werden vom Magnetkopf des Magnetstiftes angezogen.

II) Der Magnetstift mit Hülle 8 wird langsam wieder aus dem Probengefäß gezogen, sodaß nur geringe Flüssigkeitsrückstände an der Hülle haften bleiben. Gegebenenfalls können die anhaftenden Partiel in einem Wasch- gefäß weiteren Behandlungen unterzogen werden, ohne daß es zu einem Verlust der anhaftenden Partiel kommt.

III) Die Spitze des Magnetstiftes einschließlich der sie umgebenden Hülle wird in ein kleineres Probengefäß 11 getaucht. Durch die Anpassung des Ma- gnetkopfes 7 einschließlich der umgebenden Halle an die Form des Pro- bengefäßes ist nur ein geringes Flüssigkeitsvolumen notwendig, um die Hülle der gesamten Spitze zu benetzen. Die Hülle wird in einem Ständer 1 2 fixiert.

IV) Der Magnetstift 1 wird durch eine schnelle Bewegung aus der Hülle her- ausgezogen. Die Partiel 16sen sich idealerweise durch die wegfallende Magnetkraft von der Hülle und verbleiben im Probengefäß 11. Sollte dies nicht genügen, werden sie von einem weiteren außen unter dem Proben- gefäß befindlichen Magneten nach unten gezogen.

V) Die Hülle 5 wird vorsichtig aus dem Probengefäß 11 entfernt.

Ergebnis : Die Partiel befinden sich nun in einem kleineren Volumen in einem anderen Probengefäß. <BR> <BR> <P>Eine andere bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Magnetstifts ist in Fig. 3 gezeigt. Die Einzelkomponenten eines solchen Magnetstifts sind in Fig. 3a gezeigt. Ebenso wie in Fig. 1 weist der Magnetstift einen Greifadapter 14, eine Ausbuchtung 15, einen Verbindungsstift 16, eine Hülle 18 und eine Verengung 19 auf. Die oben erwähnten Produkt-und Größenparameter für diese Bestandteile gelten auch für die Ausführungsform gemäß Fig. 3. Bei der in Fig.

3 gezeigten Ausführungsform gehen die magnetischen Kräfte, die an der Spitze 17 gebündelt austreten sollen, von einem weiter oben angebrachten größeren Permanentmagneten 20 aus und werden durch z. B. einen Eisenkern, in die Spitze 17 geleitet. In diesem Fall kann das direkt aus dem Magneten austretende Magnetfeld durch eine metallische Halle 21, wie eine Eisenhülle, abgeschirmt sein. Der Magnet 20 kann sich auf dem Verbindungsstift 16 auf jeder beliebigen Höhe befinden. Bevorzugt befindet er sich jedoch nahe dem Greifadapter, da er weiter unten beim Eintauchen des Magnetstifts in ein Probegefäß störend sein kann. Die Spitze 17 besteht aus einem magnetisierbaren Material bzw. kann selbst magnetische Eigenschaften haben, d. h. die Fortführung des Eisenkerns sein.

In Fig. 3b ist ein mit der Hülle 18 versehener Magnetstift 13 als erfindungs- gemäßer Magnetstift 22 gezeigt.

Erfindungsgemäß soll die magnetische Kraft durch die Vermittlung anderer geeigneter Substanzen die Separation von Zielsubstanzen bewirken. Deshalb ist nicht der Magnet an sich entscheidend, sondern seine Form und seine Einrich- tung. Die Form des Magneten beeinflußt einerseits ganz entscheidend den Verlauf des Magnetfeldes und damit seine Kraft, andererseits muß die Formge- bung in diesem Fall sehr genau mit der Zielanwendung in Einklang stehen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Einsammeln von magnetischen Partikeln aus Lösungen (wie Serum) auf einem möglichst kleinen Areal (Spitze

des Magnetstiftes). Dabei soll die magnetische Kraft möglichst hoch sein, damit das Ernten der Magnetpartikel über einen geeigneten Gefäßquerschnitt erfolgen kann. Durch ein langsames Absenken des Magnetstiftes innerhalb des Gefäßes (z. B. Serum-Röhrchens) wird zusätzlich ein Ernten der Magnetpartikel aus einem wesentlich größeren Ausgangsvolumen möglich. Darüberhinaus muß die Formge- bung der Magnetspitze darauf angepaßt sein, daß beim Herausziehen des Ma- gnetstiftes möglichst wenig Flüssigkeit an ihm haften bleibt. Gleichzeitig ist bei der Formgebung der Spitze zu berücksichtigen, daß es beim Eintauchen des Stiftes in Lösungen nicht zum Übertritt von kleinsten Anteilen dieser Lösung (Tröpfchen, Aerosole) in die Luft kommen darf. Letztendlich muß die Formge- bung des Stiftes auch auf das Zielgefäß adaptiert sein, so daß dort die Vorlage eines möglichst kleinen Flüssigkeitsvolumens ausreicht, um die Stelle der an- haftenden Magnetpartikel vollständig zu benetzen. Die zum Patent gehörende Plastikhülle des Magnetstiftes hat zu diesem Zeitpunkt die Aufgabe, das Ab- stelien der magnetischen Kraft zu ermöglichen. Um dieses Ziel zu erreichen, wird der Magnetstift zügig aus der Halle gezogen, worauf die Magnetpartikel von der Außenseite der Hülle abfallen.

So bietet die erfindungsgemäße Ausführungsform mit spitzer Form des Magne- ten besondere Vorteile beim Herausziehen aus einer Lösung. Über eine Messung der Induktion beim Einsatz leitfähiger Hüllen kann dieser Vorgang zeitlich auch automatisch so gesteuert werden, daß an der aus der Flüssigkeitsoberfläche entfernten Spitze kein Tropfen mehr verbleibtj die Ausgangslösung ist maximal reduziert (Einschritt-Konzentrierung). Dies ist ein wichtiges Detail nicht nur zur Verhinderung von Kontaminationsgefahren beim Bewegen über anderen Proben, sondern auch für die Abtrennung und Konzentrierung von Magnetpartikeln, die beim Einsatz einer flachen Spitze so nicht möglich ist. Außerdem ist bei einer spitzen Form des Magneten das Magnetfeld quer ausgerichtet, wodurch eine verbess. erte Sammelwirkung eintritt.

Somit können durch eine spitze Ausformung, die an die verwendeten Gefäße anzupassen ist, die Magnetpartikel in äußerst kleinem Flüssigkeitsvolumen

abgegeben werden. Verwendet man ein entsprechendes Gefäß auf der Auf- nahmeseite, kann eine Magnetspitze auch zum Übertragen von Substanzen und Entfernen von Verunreinigung durch Waschen aus einem sehr kleinen Ausgangs- volumen benutzt werden.

Der erfindungsgemäße Magnetstift hat weiter den Vorteil, daß die Zielmoleküle der Probe auf einfache Weise ankonzentriert und separiert werden. Weiter ist dies kostengünstig, da die Hülle aus billigem Material ist und verworfen werden kann bzw. gespült werden kann, während der eigentliche Magnetstift eine lange Lebensdauer hat und ohne weitere Reinigung erneut eingesetzt werden kann, da er idealerweise keinen Kontakt mit der Probe hat.