La présente invention a pour objet des nano-objets magnéto-optique, leur procédé de préparation et leur utilisation en imagerie médicale.

Le traitement du cancer constitue en Europe à la fois un problème de santé et un problème économique puisque des millions de personnes sont concernées. Le cancer est la seconde cause de mortalité après les cardiopathies. Chaque jour dans le monde environ sept millions de personnes meurent des suites d'un cancer. En France et en Allemagne ce sont respectivement environ 300000 et 400000 personnes chez lesquelles on diagnostique un cancer. Le succès des thérapies en termes d'augmentation d'espérance de vie dépend de la précocité du diagnostic et du grade de la tumeur. La détection d'un ganglion sentinelle (sentinel node ou SN), qui est tout ganglion qui reçoit le drainage lymphatique depuis le site de la tumeur et contient des tumeurs malignes en cas de métastase, a récemment fait l'objet de développements chirurgicaux importants. La détection du premier ganglion de drainage lymphatique est une étape importante du pronostic puisque le diagnostic positif histopathologique d'une métastase nécessite l'exérèse totale de la chaîne des ganglions lymphatiques. Aujourd'hui, la plupart des équipes qui travaillent sur la biopsie du ganglion sentinelle dans le traitement des cancers du sein injecte soit des colloïdes radioactifs (RuS marqué au Tc99m) ou un colorant bleu vital autour de la tumeur primaire pour marquer le système lymphatique ganglionnaire en vue de sa détection peropératoire. La détection est réalisée par inspection visuelle de la couleur ou avec une sonde gamma. Habituellement la scintigraphie préopératoire permet d'obtenir des images mais celles-ci présentent malheureusement une faible résolution. Bien que l'injection de radio-isotopes soit largement utilisée aujourd'hui pour la détection des ganglions sentinelles dans les pays développés, il y a un besoin de nouvelles stratégies qui mettent en œuvre une détection et des méthodes d'imagerie non nucléaires.

C'est pourquoi les inventeurs ont développé des nanosystèmes biocompatibles ayant à la fois des propriétés magnétiques, et/ ou optiques.

Les inventeurs ont déjà synthétisé des nanoparticules de magnétite en utilisant un procédé hydrothermal (T. J. Daou et al. (2006) Chem. Mater., 18, 4399-4404) et ont étudié l'adsorption d'orthophosphate sur des nanoparticules magnétiques et recherché les mécanismes régissant cette adsorption (T. J. Daou et al. (2007) Chem. Mater., 19, 4494- 4505). Ils ont également étudié l'influence des interactions inorganiques-organiques en utilisant des nanoparticules de magnétite greffées par des molécules de stilbène en utilisant soit des carboxylates, soit des phosphonates comme agents de couplage. (T. J. Daou et al. (2008) Chem. Mater., 20, 5869-5875). Le couplage de dendrons péguylés sur des nanoparticles d'oxyde de fer de 9 nm et 39 nm de diamètre dans l'eau en utilisant un groupe phosphonate comme agent de couplage permet la stabilisation électrostatique de suspensions à un pH physiologique. En outre l'étape de greffage préserve les propriétés magnétiques des nanoparticules d'oxyde de fer (T. J. Daou et al. (2009), Dalton Trans., 4442-4449). La demande WO 2008/043911 au nom des inventeurs décrit des complexes chélatés dendritiques et leurs applications en imagerie biomédicale ; ces complexes répondent à la formule suivante :

[[MC]-En-[D]m-X _lpl X _2p2 X _3P3 X ₄ P4]z ^~ zB ⁺

dans laquelle :

- M est un cation magnétique, de préférence choisi parmi les ions Gd ³⁺ , Mn ²⁺ et 99mTc ³⁺ ,

- C est un agent chélatant du marqueur magnétique M,

- [MC] est un chélate du marqueur magnétique M, - E est un espaceur,

- n = 0 ou 1 ,

- [D] est une structure dendritique dont le cœur comprend au moins un groupe dérivé d'alcool benzylique ou d'une aminé benzylique, dont le cycle benzyle est substitué en positions 3, 4, 5 par des dendrites composés de motifs polyéthylèneglycol,

- m est un entier valant 1 ou 2 ou 4,

- Xi est un groupement augmentant la lipophilie du complexe, par exemple un groupement tertiobutyle (tBu),

- pl est un entier valant 0 à 12 inclus,

- X2 est un groupement augmentant la spécificité du complexe pour un organe particulier, de préférence pour le cerveau, tel que la L-dopamine,

- p2 est un entier valant 0, 1, 2, ou 4 inclus,

- X3 un groupement ayant une activité thérapeutique, de préférence pour les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose en plaque,

- p3 est un entier valant 0, 1, 2, ou 4 inclus,

- X4 est un groupement CH3,

- p4 est un entier valant de 0 à 12 inclus - pl + p2 + p3 + p4 = 3 lorsque m = 1 ou pl + p2 + p3 + p4 = 6 lorsque m = 2 ou pl + p2 + p3 + p4 = 12 lorsque m = 4,

- B est un contre ion, de préférence Na ⁺ ou K ⁺ ,

- z est un entier valant 0, 1, 2, 3 ou 4 En poursuivant leur recherche, les inventeurs ont montré qu'il était possible de greffer sur les dendrons des colorants biocompatibles conférant alors aux particules des propriétés optiques qui viennent s'ajouter à leurs propriétés magnétiques.

Ces nouveaux outils éviteront l'utilisation de radiations ionisantes et permettront d'effectuer une imagerie du système lymphatique pré et per-opératoire avec une haute résolution spatiale.

Aussi l'invention a-t-elle pour objet des nanoparticules magnétiques sur lesquelles sont greffées, par l'intermédiaire d'une liaison phosphonate ou carboxylate, plusieurs structures dendritiques de formule (I)

dans laquelle

Ri représente -COOH ou CH ₂ P0 ₃ H ₂ et

pour la génération 1 , R4 et R _Ô représentent chacun indépendamment l'un de l'autre une chaîne composée de motifs oligoéthylèneglycol, l'une au moins desdites chaînes oligoéthylèneglycol étant fonctionnalisée à son extrémité par un colorant biocompatible et R5 représente un atome d'hydrogène ou une chaîne composée de motifs oligoéthylèneglycol, ladite chaîne pouvant être fonctionnalisée à son extrémité par un colorant biocompatible,

pour les générations supérieures, R ₅ représente un atome d'hydrogène et R4 et R _Ô représentent une structure dendritique (D)m comprenant au moins un groupement de type alcool benzylique, ledit cycle benzyle étant substitué soit aux positions 3, 4, 5, soit aux positions 3 et 5 par des chaînes composées de motifs oligoéthylèneglycol, l'une au moins desdites chaînes oligoéthylèneglycol étant fonctionnalisée à son extrémité par un colorant biocompatible et m = 1 , 2 ou 4.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les nanoparticules contiennent un cœur magnétique en fer de structure spinelle ou grenat choisi dans le groupe comprenant la magnétite, la maghémite, les ferrites de nickel, cobalt, manganèse, zinc, cuivre, titane et dans lequel un cation peut être substitué par une terre rare, comme par exemple le scandium, l'yttrium ou les lanthanides. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les nanoparticules présentent un diamètre moyen compris entre 2 et 60 nm, avantageusement entre 15 et 50 nm, encore plus avantageusement entre 20 et 35 nm.

Chaque structure dendritique, ou dendron, d'ordre supérieur à 1, greffée sur les particules comprend une structure du type dendrons de Fréchet tels que décrits dans Dendrimers and other dendritic polymers, J. M. J Fréchet, D.A. Tomalia, Wiley, New York, 2001 répondant à la formule (D) suivante :

Ainsi les composés selon l'invention comprennent une structure (D)m, où D comprend au moins un groupement de type alcool benzylique, ledit cycle benzyle étant substitué soit aux positions 3, 4, 5, soit aux positions 3 et 5 par des chaînes composées de motifs oligoéthylèneglycol, l'une au moins desdites chaînes oligoéthylèneglycol étant fonctionnalisée à son extrémité par un colorant biocompatible et m = 1, 2 ou 4.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les structures dendritiques de génération 1, ne comprennent qu'une seule structure dendritique dont la partie interne ou cœur est un groupe aromatique substitué en 3, 4, 5 (lal) ou en 3 et 5 (Ia2) par des chaînes polyéther constituant les dendrites

(Ia2)

La génération 2, comprend une structure dendritique identique au dendron de Fréchet de génération 1 décrite ci-dessus greffée sur le noyau aromatique de la structure de génération 1. Elle répond aux formules (Ibl) et (Ib2)

(Ib2)

La génération 3, comprend quatre structures dendritiques identiques au dendron de Fréchet de formule (A), liées deux à deux pour former deux structures identiques au dendron de Fréchet de la génération 2 ci-dessus. Chacune des structures identiques aux dendrons de Fréchet de génération 2 sont liées respectivement en positions 3 et 5 d'un noyau aromatique pour donner les structures de formule (Ici) et (Ic2) suivantes :

dans toutes les formules précédentes,

Ri représente un groupe -C0 ₂ H ou -CH ₂ PC"3H ₂ ,

n est un entier compris entre 1 et 10 et

R ₂ représente un colorant bio logiquement compatible porteur d'au moins un groupe -SO ₃ R ₃ où R ₃ représente un atome d'hydrogène, de sodium ou de calcium et éventuellement porteur d'un ou plusieurs groupes choisis parmi -OH et -C0 ₂ H.

Au sens de la présente invention, on entend par colorant biocompatible, tout colorant naturel ou de synthèse approuvé comme colorant alimentaire ou pour les produits pharmaceutiques ou cosmétiques comme par exemple ceux qui sont décrits par M. Perez- Urquiza et al (2001) J. Chrom. 917, 331-336. Avantageusement le colorant aura une couleur bleue afin de permettre une meilleure visualisation des cellules ou des tissus. On peut citer à titre d'exemple le colorant bleu patenté V (ou bleu CI n°5) ou bleu patente Vf répondant respectivement aux formules :

so ₃ Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la structure dendritique répond à la formule (la la)

ou (Ibla)

ou (Ialb)

Conformément à l'invention, les nanoparticules sont préparées selon des techniques connues comme celle décrite par les inventeurs (co -précipitation d'ions métalliques par une base T. J. Daou et al. (2006) déjà cité; T. J. Daou et al. (2007) déjà cité ; B. Basly et al. (2010), 46, 985-987) ou dans d'autres publications (décomposition thermique de précurseurs organométalliques J. Park et al. Nature Materials 3, 891 (2004)).

Ainsi la synthèse des nanoparticules peut être réalisée par co -précipitation d'ions ferreux et d'ion ferriques, de préférence par co -précipitation d'un chlorure de fer (II) avec un chlorure de fer (III) dans un milieu aqueux comprenant une base organique choisie dans le groupe comprenant les aminés et les composés de formule (R) ₄ NOH où R4 représente un groupe (Ci-C ₄ )alkyle ou une base inorganique choisie dans le groupe comprenant NH ₄ OH, KOH ou NaOH à une température comprise entre 20 et 100°C, avantageusement à une température égale à 70 °C. Le mélange est ensuite soumis à un traitement hydrothermal à une pression autogène et à une température comprise entre 150 °C et 250 °C. Les nanoparticules ainsi formées sont recueillies, lavées et séchées à l'autoclave.

A titre d'exemple de composés de formule (R) ₄ NOH, on peut citer le tétraéthylammonium et le tétrapropylammonium.

Les dendrons dérivés de polyéthylèneglycol utilisés dans le cadre de l'invention sont synthétisés par des techniques connues de l'homme du métier et sont greffés de manière covalente par une de leur extrémité à la surface des nanoparticules par un groupement phosphate ou carboxylate, l'autre extrémité portant le colorant biocompatible. A titre d'exemple, on peut citer deux méthodes de greffage à savoir le greffage direct dans l'eau tel que décrit par Daou et al (2009) déjà cité ou par un procédé d'échange de ligand et de transfert de phase.

L'invention a également pour objet une suspension stable contenant des particules telles que définies précédemment. Avantageusement, cette suspension est une suspension avec une distribution en taille et un diamètre hydrodynamique moyen inférieur à 100 nm. La stabilité en milieux aqueux et physiologique est assurée par les longues chaînes de polyéthylèneglycol, le greffage par un phosphonate qui permet un ancrage fort du dendron sur l'oxyde, l'encombrement stérique du dendron (dendron de générations 2 et 3) et les charges électriques en surface de l'objet.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les particules d'oxyde ont une taille comprise entre 20 et 25 nm. Le champ coercitif pour des particules de cette taille est de l'ordre de 100 Oe à température ambiante alors qu'il est nul pour des particules de taille inférieure à 10 nm. Dans les produits commerciaux (SPIO Superparamagnetic Iran oxide- Sinerem-Guerbet et USPIO Ultrasmall Superparamagnetic Iron oxide Endorem-Guerbet) utilisés pour l'imagerie, les particules ont des tailles inférieures à 10 nm, ce qui permet de vaincre l'agrégation plus facilement, mais conduit à un signal magnétique plus faible qui ne permet pas l'utilisation d'une sonde magnétique manuelle par le chirurgien.

L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques ou diagnostiques comprenant des nanoparticules ou une suspension de nanoparticule telles que définies précédemment en association avec tout excipient et/ou véhicule pharmaceutiquement acceptable ou acceptable pour le diagnostic.

Les compositions selon l'invention peuvent être injectées au voisinage d'une tumeur et les nanoparticules détectées à l'aide d'une sonde magnéto-optique telle celle décrite dans le brevet français no 2 823 092 et/ou par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM).

L'invention a également pour objet l'utilisation de nanoparticules ou d'une suspension telles que définies précédemment pour la préparation d'une composition permettant la visualisation ou la détection d'une cellule ou d'un organe ou d'un tissu cancéreux.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'organe cible est le ganglion sentinelle et le cancer est le cancer du sein.

L'invention a également pour objet une méthode de visualisation ou de détection d'une cellule ou d'un organe ou d'un tissu cancéreux comprenant les étapes suivantes :

a) mettre en contact une composition ou une suspension de nanoparticules telles que définies précédemment avec la cellule ou l'organe ou le tissu cancéreux à détecter ou à visualiser,

b) mesurer par des moyens opto -magnétiques les nanoparticules pour détecter ou visualiser la cellule ou l'organe ou le tissu cancéreux.

L'invention a également pour objet une méthode pour diagnostiquer un cancer du sein comprenant les étapes suivantes

a) mettre en contact une composition ou une suspension de nanoparticules telles que définies précédemment avec le ganglion sentinelle,

b) mesurer par des moyens opto -magnétiques les nanoparticules pour localiser le ganglion sentinelle.

Les exemples 1 à 3 qui suivent et les figures 1 à 4 illustrent l'invention.

Les figures 1 et 2 illustrent la synthèse des dendrons de l'invention conformément à l'exemple 1. La figure 3 représente le spectre infra-rouge d'une nanoparticule greffée avec la molécule (Ialb) préparée selon la méthode 3 de l'exemple 2.

La figure 4 montre le spectre UV-visible avec la bande d'absorption du bleu à 650 nm.

Exemple 1 : Synthèse du composé (Ialb) - composé 24

Elle est illustrée dans la figure 1.

1.1. Synthèse du composé 3

1.1.1. Synthèse du composé 8

Synthèse du composé 6

Une solution de chlorure de /?ara-toluènesulfonyle (22,3 g; 105 mmol) dans le THF (35 mL) est ajoutée goutte à goutte à une solution de tétraéthylèneglycol méthyl éther (20,0 g; 96 mmol) et de NaOH (6,7 g, 166 mmol) dans un mélange de THF/H ₂ 0 (135 mL/45 mL) à 0°C. Après 1 heure sous agitation à 0°C, le milieu réactionnel est laissé réchauffer à température ambiante et est agité pendant 20 heures supplémentaires. La solution est ensuite versée dans 200 mL de saumure et les volatiles sont évaporés. Le milieu résultant est extrait plusieurs fois avec du dichlorométhane et les phases organiques sont combinées er lavées avec de la saumure, séchées sur MgS0 ₄ et filtrées. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le composé 6 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle avec un rendement de 96% et est utilisé sans autre purification.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 2,39 (s; 3H); 3,31 (s; 3H); 3,47-3,64 (m, 14H); 4,08-4,11 (m, 2H); 7,28 (AA' part of an AA'BB' System, 2H); 7,73 (BB' part of an AA'BB' System, 2H) . ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 21,78; 59,14; 68,80; 69,45; 70,66; 70,73; 70,86; 72,07; 128,10; 129,99; 133,19; 144,96.

1.1.1.2. Synthèse du composé 7

Une solution de gallate de méthyle (20,0 g, 108,6 mmol), de bromure d'allyle (9,4 mL, 108,6 mmol), de KHC0 ₃ (43,4 g, 433,4 mmol) et de Kl (0,1 g, 0,60 mmol) dans le DMF (100 mL), est agité pendant 4 jours à 30°C. Le milieu réactionnel est ajouté à IL d'eau et de l'acide sulfurique est ajouté jusqu'à obtention d'un pH neutre. La phase aqueuse est ensuite extraite 3 fois avec 150 mL d'éther. Les phases organiques sont rassemblées et lavées trois fois avec 50 mL de saumure, séchées sur MgS0 ₄ et filtrées et les volatiles sont évaporés. Le produit brut est recristallisé dans CH ₂ Cl ₂ /MeOH (60 mL/10 mL) pour obtenir 7 sous forme d'un solide iblanc avec un rendement de 85%. 1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD, 20°C): δ (ppm) = 3,86 (s, 3H), 4,64 (d, ³ J = 6,1 Hz; 2H),

4,88 (br s, 2 OH); 5,19 (dd, ² J = 11,8 Hz, ³ J = 1,5 Hz, 1H), 5,30 (dd, ² J = 18,6 Hz, ³ J = 1,5 Hz, 1H), 6,06-6,19 (m, 1H), 7,05 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, CD ₃ OD, 20°C): δ (ppm) = 53,32; 75,26; 110,89; 119,65; 127,30; 136,34; 140,27; 152,70; 169,34.

1.1.1.3. Synthèse du composé 8

Une solution de 6 (24,9 g, 68,7 mmol), de 7 (7,0 g, 31,2 mmol), de K ₂ C0 ₃ (21,6 g, 156,1 mmol) et de Kl (1,6 g, 9,4 mmol) dans l'acétone (600 mL), est agité pendant 30 heures à 65°C. Le milieu réactionnel est filtrée sur de la Célite et les volatiles sont évaporés. Le produit brut résultant est dilué dans le dichlorométhane et lave deux fois avec une solution aqueuse saturée de NaHC0 ₃ et avec de la saumure. Après séchage sur MgS0 ₄ , fïltration et évaporation des solvants, le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éthyl acétate/acétone 95/5 to 50/50) pour donner le composé 8 sous forme d'une huile jaune avec un rendement de 70%

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 3,36 (s, 6H); 3,51-3,54 (m, 4H); 3,61- 3,67 (m, 16H); 3,71-3,74 (m, 4H); 3,85-3,88 (m, 7H); 4,17-4,20 (m, 4H); 4,59 (d, ³ J = 5,9 Hz, 2H); 5,15 (dd, ² J = 10,5 Hz, ³ J = 1,5 Hz, 1H); 5,32 (dd, ² J = 17,1 Hz, ³ J = 1,5 Hz, 1H); 5,99-6,13 (m, 1H); 7,28 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 52,46; 59,33; 69,21; 69,96; 70,85; 70,96; 71,01; 71,19; 72,28; 74,34; 109,21; 117,94; 125,35; 134,73; 142,41; 152,81; 166,91. MALDI: calculé for C ₂₉ H ₄₉ 0i ₃ : 605,32; obtenu: 605,17; calculé pour C ₂₉ H ₄₈ NaOi ₃ : 627,30, obtenu: 627,13; calculé pour C ₂₉ H ₄₈ KOi ₃ : 643,27; obtenu: 643,09.

1.1.2. Synthèse du composé 9a

A une solution de 8 (20,4 g, 35,0 mmol) dans 100 mL de THF à 0°C, sont ajoutés doucement 17 mL (0,5 éq.) d'une solution de LiAlH ₄ 1,0 M dans du THF. Après 1 heure d'agitation à température ambiante l'hydrure métallique non réagi est neutralisé avec de l'acétate d'éthyle, du méthanol et de l'eau. Le mélange est filtré sur de la Célite et extrait avec du dichlorométhane. Les phases organiques combinées sont lavées avec de la saumure, séchées sur MgS0 ₄ , filtrées et concentrées sous pression réduite pour donner 9a avec un rendement de 97% sous forme d'une huile jaune pâle qui est utilisé ensuite sans purification supplémentaire.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 3,15 (t, 1H, ³ J = 5,6 Hz, OH); 3,24 (s, 6H); 3,40-3,43 (m, 4H); 3,50-3,62 (m, 20H); 3,71-3,74 (m, 4H); 4,00-4,03 (m, 4H); 4,39 (dd, 2H, ³ J = 5,8 Hz, ⁴ J = 1,2 Hz); 4,42 (d, 2H, ³ J = 5,6 Hz); 5,03 (1H, d, ³ J = 10,2 Hz); 5,20 (1H, dd, ³ J = 17,2 Hz, ⁴ J = 1,6 Hz); 5,91-6,04 (m, 1H); 6,48 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 58,74; 64,50; 68,54; 69,55; 70,22; 70,34; 70,42; 70,56; 71,66; 73,79; 105,79; 116,98; 134,64; 136,65; 136,96; 152,46. MALDI: calculé pour C ₂₈ H ₄₈ 0i ₂ : 576,31; obtenu: 576,17; calculé pour C ₂₈ H ₄₈ NaOi ₂ : 599,30; obtenu: 599,15; calculé pour C ₂₈ H ₄₈ KOi ₂ : 615,28; obtenu: 615,11.

1.1.3. Synthèse du composé 9b

A une solution de 9a (4,0 g, 7,7 mmol) dans 200 mL de CH ₂ C1 ₂ à 0°C, on ajoute doucement 11,5 mL (1,5 éq.) d'une solution de PBr ₃ 1,0 M dans le dichlorométhane. Après agitation à température ambiante pendant 2 heures, 100 mL d'une solution saturée de NaHC03 est ajoutée au milieu réactionnel. Les phases aqueuses et organiques sont séparées et la phase aqueuse est extraite plusieurs fois avec du CH ₂ C1 ₂ . Les phases organiques sont combinées, lavées avec de la saumure et séchées sur MgS0 ₄ , filtrées et concentrées sous pression réduite pour donner 9b avec un rendement de 99% sous forme d'une huile rouge quii est utilisée sans autre purification.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 3,28 (s, 6H); 3,43-3,47 (m, 4H); 3,53- 3,58 (m, 16H); 3,62-3,65 (m, 4H); 3,74-3,78 (m, 4H); 4,05-4,18 (m, 4H); 4,33 (s, 2H); 4,42 (dd, 2H, ³ J = 5,8 Hz, ⁴ J = 1,2 Hz); 5,07 (1H, d, ³ J = 10,2 Hz); 5,23 (1H, dd, ³ J = 17,2 Hz, ⁴ J = 1,6 Hz); 5,93-6,06 (m, 1H); 6,55 (s, 2H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 34,00; 58,84; 68,78; 69,54; 70,35; 70,46; 70,51 ; 70,70; 71,78; 73,89; 108,42; 117,15; 132,82; 134,84; 138,05; 152,60. MALDI: calculé pour C ₂₆ H ₄₆ LiOn : 541,32; obtenu: 541,16; calculé pour C ₂ 8H ₄₇ BrNaOn : 661,22; obtenu: 661,00; calculé pour C ₂₈ H ₄₉ BrNaOn : 663,23; obtenu: 663,00.

1.1.4. Synthèse du composé 9c

Une solution de 9b (3,00 g, 4,69 mmol) dans 2,0 mL de P(OEt) ₃ (2,5 éq.), est agitée pendant 2 heures à 160°C. L'excès de P(OEt) ₃ est évaporé sous pression réduite à 70°C. Le produit brut est purifié par chromato graphie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 99/1 à 95/5) pour donner 9c sous forme d'une huile jaune pâle avec un rendement de 85 >.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1,19 (t, 6H, ³ J = 7,1 Hz); 2,99 (d, 2H,

² J = 21,4 Hz); 3,32 (s, 6H), 3,47-3,71 (m, 24H); 3,80 (t, ³ J = 4,7 Hz, 4H); 3,90-4,01 (m, 4H); 4,08 (t, ³ J = 5,0 Hz, 4H); 4,45 (d, ³ J = 6,0 Hz, 2H); 5,04 (dd, ² J = 10,4 Hz, ³ J = 1,7 Hz, 1H); 5,25 (dd, ² J = 17,2 Hz, ³ J = 1,7 Hz, 1H); 5,96-6,07 (m, 1H); 6,48 (d, 2H, ⁴ J = 2,5 Hz). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 16,46 ( ³ J _C p = 5,8 Hz); 33,82 (¾ = 138,4 Hz), 59,00; 62,11 ( ² J _CP = 6,6 Hz); 68,89; 69,71; 70,52; 70,62; 70,67; 70,85; 71,94; 73,99; 109,26 ( ³ J _C p = 6,6 Hz); 117,14; 126,88 ( ² J _C p = 8,8 Hz); 134,84; 136,96 ( ⁵ J _C p = 3,6 Hz); 152,68 ( ⁴ J _CP = 2,6 Hz). ³¹ P NMR (81 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 26,33. MALDI: calculé pour C ₃₂ H ₅₈ 0i ₄ P: 697,36; obtenu: 697,11; calculé pour C ₃₂ H ₅₇ NaOi ₄ P: 719,34; obtenu: 719,07; calculé pour C ₃₂ H ₅₇ KOi ₄ P: 735,31; obtenu: 735,02.

1.1.5. Synthèse du composé 3

A une solution de 9c (2,4 g, 3,44 mmol) dans 33 mL de THF à température ambiante on aoute 80 mg (0,07 mmol, 0,02 éq.) de Pd(PPh ₃ ) ₄ . Après 10 minutes d'agitation à température ambiante, 325 mg de NaBH ₄ (8,60 mmol, 2,5 éq.) et 5,5 mL de DMF sont ajoutés au milieu réactionnel. Après 2 heures, 200 mL d'une solution saturée de NH ₄ C1 sont ajoutés doucement et la phase aqueuse est extraite plusieurs fois avec du CH ₂ C1 ₂ . Les phases organiques sont combinées, lavées avec de la saumure, séchées sur MgS0 ₄ et filtrées. Les solvants sont évaporés sous pression réduite et le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 98/2 to 95/5) pour donner 3 sous forme d'une huile jaune sombre avec un rendement de 90%

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1.24 (t, 6H, ³ J = 7.1 Hz), 3.01 (d, 2H, ² J = 21.3 Hz), 3.63 (s, 6H), 3.52-3.55 (m, 4H), 3.62-3.73 (m, 20H), 3.81-3.84 (m, 4H), 3.93- 4.04 (m, 4H), 4.13-4.16 (m, 2H), 4.18-4.21 (m, 2H), 6.67 (d, 2H, ⁴ J = 2.5 Hz). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 16.52 ( ³ J _CP = 5.6 Hz), 33.47 ('JCP = 139.2 Hz), 59.05, 62.13 ( ² J _C p = 6.5 Hz), 69.66, 69.70, 70.56, 70.66, 70.77, 71.99, 110.70 ( ³ J _C p = 7.1 Hz), 121.84 ( ² J _CP = 9.1 Hz), 136.61 ( ⁵ J _C p = 3.1 Hz), 146.71 ( ⁴ J _C p = 2.7 Hz). MALDI: calculé pour C ₂₉ H ₅₄ 0i ₄ P: 657.33, obtenu: 657.24; calculé pour C ₂₉ H ₅₃ NaOi ₄ P: 679.31, obtenu: 679.24. 1.2. Synthèse composé (Ialb) - composé 24

1.2.1. Synthèse du composé 21

1.2.1.1. Synthèse du composé 20

To a solution of Amino-dPEG _T M ⁴ -alcohol (270 mg, 1.4 mmol) in 10 mL of CH ₂ C1 ₂ at 0°C is added 305 mg (1.4 mmol, 1.0 eq.) of Boc ₂ 0. The reaction mixture is stirred overnight at room température and then diluted with 100 mL of CH ₂ C1 ₂ . The organic phase is washed with brine, fîltered and concentrated under reduced pressure to afford a colorless oil, which can be used without further purification. The so-obtained product is dissolved in 15 mL of CH ₂ C1 ₂ at 0°C and 435 (3.2 mmol, 2.3 eq.) of NEt ₃ and 326 mg (2.31 mmol, 1.1 eq.) of /?ara-toluenesulfonyl chloride are added sequentially. After 40 hours stirring at room température, the reaction mixture is diluted with 70 mL of CH ₂ CI ₂ . The organic phase is washed with brine, dried over MgSC^, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude product is purifîed by chromatography over silica gel column (ethyl acetate/cyclohexane 75/25) to afford 20 as a colorless oil in 80% yield.1H NMR (300 MHz, CDCI ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1.42 (s, 9H), 2.43 (s, 3H), 3.28 (q, 2H, ³ J = 5.2 Hz), 3.51

(t, 2H, ³ J = 5.2 Hz), 3.57-3.59 (m, 8H), 3.68 (t, 2H, ³ J = 4.9 Hz), 4.15 (t, 2H, ³ J = 4.9 Hz), 5.00 (br s, 1H), 7.33 (m, 2H, AA' part of an AA'BB' System), 7.78 (m, 2H, BB' part of an AA'BB' System). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 21.93, 28.72, 40.69, 69.02, 69.53, 70.83, 70.87, 71.09, 79.47, 128.27, 130.12, 133.39, 145.09, 156.27.

1.2.1.2. Synthèse du composé 21

A une solution équimolaire de 20 (280 mg, 0,63 mmol) et de 3 (411 mg, 0,63 mmol) dans 32 mL d'acétone sont ajoutés 348 mg (2,52 mmol, 4,0 éq.) de K ₂ CO3 et de 31 mg (0,19 mmol, 0,3 éq.) de Kl. Le milieu réactionnel est agité à 60°C pendant 48 heures. Après fïltration sur Célite, le solvant est évaporé et le résidu est dilué dans CH ₂ CI ₂ . La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaHC0 ₃ , puis avec de la saumure, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le produit brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 95/5 to 90/10) pour donner 21 sous forme d'une huile jaune avec un rendement de 95%.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1,18 (t, 6H, ³ J = 7,1 Hz); 1,37 (s, 9H); 2,97 (d, 2H, ² J = 21,5 Hz); 3,21-3,26 (m, 2H); 3,30 (s, 6H); 3,45-3,49 (m, 6H); 3,54-3,78 (m, 34H); 3,94 (qd, ³ J = 6,9 Hz, ⁴ J = 1,8 Hz); 4,03-4,08 (m, 6H), 5,06 (brs, 1H); 6,46 (d, 2H, ⁴ J = 2,3 Hz). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 16,34 ( ³ J _CP = 5,9 Hz); 28,32; 33,63 ('JCP = 139,0 Hz); 40,27; 58,86; 61,99 ( ² J _CP = 6,7 Hz); 68,75; 69,39; 69,58; 70,10; 70,15; 70,38; 70,48; 70,54; 70,68; 70,95; 71,81 ; 72,23; 78,91; 109,33 ( ³ J _CP = 5,9 Hz); 126,79 ( ² J _CP = 9,1 Hz); 137,33 ( ⁵ J _CP = 3,1 Hz); 152,40 ( ⁴ J _CP = 2,7 Hz); 155,87. MALDI: calculé pour C ₄₂ H ₇₈ NNaOi ₉ P: 954,48; obtenu: 954,46; calculé pour C ₃₇ H ₇ iNOi ₇ P: 832,45; obtenu: 832,41 (perte du groupe protecteur).

1.2.2. Synthèse du composé 22

A une solution de 21 (485 mg, 0,52 mmol) dans 15 mL de CH ₂ CI ₂ à 0°C sont ajoutés goutte à goutte 600 (7,81 mmol, 15,0 éq.) d'acide trifluoroacétique. Le milieu réactionnel est agité pendant la nuit à la température ambiante puis les volatiles sont évaporés. Le produit brut est dilué dans CH ₂ CI ₂ et lavé deux fois avec une solution saturée de NaHC0 ₃ . Les phases aqueuses combinées sont extraites deux fois avec CH ₂ CI ₂ et les phases organiques combinées sont filtrées et concentrées sous pression réduite pour donner 22 sous la forme d'une huile jaune sombre avec un rendement de 97%.

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1,20 (t, 6H, ³ J = 7,1 Hz); 2,87 (t, 2H, ³ J = 5,2 Hz); 2,98 (d, 2H, ² J = 21,5 Hz); 3,32 (s, 6H); 3,47-3,74 (m, 38H), 3,77-3,81 (m, 4H); 3,97 (qd, ³ J = 7,1 Hz, ⁴ J = 1,9 Hz); 4,05-4,11 (m, 6H), 6,48 (d, 2H, ⁴ J = 2,3 Hz). ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 16,47 ( ³ J _C p = 5,8 Hz); 33,78 ('JCP = 138,9 Hz); 41,45; 59,00; 62,13 ( ² J _C p = 6,6 Hz); 68,84; 69,47; 69,66; 70,29; 70,41; 70,51; 70,60; 70,76; 71,76; 71,95; 72,36; 72,47; 109,33 ( ³ J _C p = 6,6 Hz); 127,16 ( ² J _C p = 8,8 Hz); 137,16 ( ⁵ J _C p = 3,8 Hz); 152,43 ( ⁴ J _C p = 2,8 Hz). MALDI: calculé pour C ₃₇ H ₇ iNOi ₇ P: 832,45; obtenu: 832,42.

1.2.3. Synthèse du composé (Ialb) - composé 24

Le composé 22 (400 mg, 0,48 mmol) est dissous dans 2 mL de CH ₂ CI ₂ et Et ₃ N (195 μί, 1,44 mmol) en présence de 4-DMAP (6,1 mg, 0,05 mmol) sous atmosphère d'argon. Le milieu réactionnel ainsi obtenu est agité à 0°C pendant 15 min. Ensuite, on ajoute goutte à goutte, en 15 minutes, le chlorure de sulfonyle de bleu patenté V (Patent Blue VF sulfonyl chloride) 23 (271 mg, 0,48 mmol) dissous dans CH ₂ CI ₂ /DMF (2mL/0,5mL). La solution est laissée réchauffer à température ambiante et agiter pendant une nuit. Le milieu réactionnel brut est concentré sous pression réduite et purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (dichlorométhane/méthanol 98/2 to 90/10) pour donner 24 sous forme d'un solide bleu foncé avec un rendement de 54% .

1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 1,21-1,30 (m, 18H); 3,02 (d, 2H, ² J = 21,5 Hz); 3,22 (q, 2H, ³ J = 5,0 Hz); 3,36 (s, 6H); 3,46-3,84 (m, 40H); 4,00 (qd, 4H, ³ J = 7,0 Hz, ⁴ J = 1,3 Hz); 4,07-4,13 (m, 6H); 5,74 (bt, 1H, ³ J = 5,8 Hz); 6,51 (d, 2H, ⁴ J = 2,5 Hz); 6,74 (m, 4H, AA' part of an AA'BB' System); 7,10 (d, 1H, ³ J = 7,9 Hz); 7,46 (m, 4H, BB' part of an AA'BB' System); 7,86 (dd, 1H, ³ J = 7,9 Hz, ⁴ J = 1,8 Hz) ; 8,75 (d, 1H, ⁴ J = 1,8 Hz), ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ , 20°C): δ (ppm) = 12,87; 16,50 ( ³ J _C p = 5,8 Hz); 33,77 ('JCP = 138,9 Hz); 43,20; 45,90; 59,03; 62,18 ( ² J _CP = 6,6 Hz); 68,89; 69,72; 70,50; 70,60; 70,66; 70,81 ; 71,96; 72,39; 109,48 ( ³ J _C p = 6,6 Hz); 113,07; 126,36; 126,94 ( ² J _CP = 8,8 Hz); 127,30; 127,57; 131,24; 137,45 ( ⁵ J _C p = 3,8 Hz); 140,58; 141,09; 141,75; 148,87; 152,54 ( ⁴ J _CP = 2,8 Hz); 155,20, 176,32. MALDI: calculé pour C ₆₄ HioiN ₃ 0 ₂₂ PS ₂ : 1358,61, obtenu: 1358,53; calculé pour C ₆₄ HiooN ₃ Na022PS ₂ : 1380,59, obtenu: 1380,52. Exemple 2 : Préparation des nanoparticules greffées

Méthode 1 (greffage direct dans l 'eau) :

50 mg de nanoparticules synthétisées selon la technique décrite par T. J. Daou et al. (2006) Chem. Mater., 18, 4399-4404, sont mis en suspension dans 1,5 mL d'eau. 50 mg de molécule organique (dendron portant le colorant de formule (Ialb) préparé selon l'exemple 1) sont mis en suspension dans 50 mL d'eau désoxygénée par l'argon. Le pH est ajusté à 3. Ces 2 suspensions sont mélangées et le pH est ajusté à 5. Ce mélange est maintenu dans un bain à ultrasons pendant 90 min à 35°C. Le pH est ajusté à 7. La suspension est récupérée et mise sous argon.

La suspension est purifiée plusieurs fois pour extraire les molécules en excès. La quantité de molécules greffées est déterminée soit directement par analyse chimique, soit indirectement par dosage des molécules non greffées par des méthodes spectroscopiques.

Méthode 2 (transfert de ligand et échange de phase):

Les nanoparticules synthétisées selon la technique décrite par T. J. Daou et al. (2006) Chem. Mater., 18, 4399-4404 sont transférées dans un solvant organique en utilisant des acides gras, par exemple l'acide oléique. Un volume de cette suspension contenant 50 mg de nanoparticules est mis en présence d'une solution de 50 mL d'eau désoxygénée par l'argon contenant 50 mg de molécule organique (dendron portant le colorant). Le pH est ajusté entre 3 et 4. Ce système est mis en agitation et un transfert de phase par échange de ligand a lieu conduisant à une suspension aqueuse des nanoparticules fonctionnalisées par la molécule dendrimère.

Méthode 3 (transfert de ligand et échange de phase)

Les nanoparticules (100 mg) synthétisées selon la technique décrite par T.J. Daou et al. (2006) Chem. Mater. 18, 4399-4404 sont mises en suspension dans 50 mL d'eau avec de l'acide citrique (100 mg). Le pH (3-4) est ajusté jusqu'à pH 5. La suspension est mise sous la sonde ultrasonique pendant 5 min puis sur un rouleau tournant pendant 3h. La suspension est lavée par la technique d'ultrafiltration avec 300 mL d'eau. Le pH final est 6,5.

On ajoute 25 mg de dendron (Ialb) dans une suspension de 25 mg NP@CA dans 25 mL d'eau. Le pH est 2,6. On ajuste le pH à pH 3,5 puis on met sous ultrasons à 37°C pendant 90 min. On ajuste le pH à 6,5 et on laisse 30 min sous ultrason. Le pH diminue. On recommence cette étape jusqu'à ce que le pH reste constant à 6,5. La suspension est lavée par ultrafïltration avec 150 mL d'eau. Le pH final est égal à 6,5.

Le spectre IR (figure 3) montre une bande caractéristique de citrate (1625 et 1580 cm ^{" l} ) et une bande caractéristique de la molécule la la (pics entre 1413 et 900 cm ^"1 ).

Les analyses chimiques et l'analyse par UV-visible permettent de calculer la quantité de dendron greffé : dans ce cas elle est de 8,5% en masse (figure 4).

Exemple 3 : Mesure de relaxométrie

Des mesures de relaxométrie sur des suspensions en milieu aqueux contenant des nanoparticules de magnétite greffées avec le dendron (Ialb) (1,5 mg de nanoparticules/ml) ont été effectuées et comparées à un produit commercial l'Endorem®.

La relaxivité est la capacité d'un élément à raccourcir le temps de relaxation des protons de l'eau en imagerie par résonance magnétique (IRM) (MRI contrast agents : current status and future perspectives G.J. Strijkers, W. J.M. Mulder, G. A.F. van Tilborg et K. Nicolay Anti-cancer agents in Médicinal chemistry 2007, 7, 291-305 ou Theory of proton relaxation induced by superparamagnetic particles Alain Roch and Robert N. Muller, Pierre Gillis Journal of Chemical Physics 110(11) 5403 1999). Deux constantes de relaxation, correspondant à la relaxation longitudinale (RI) et à la relaxation transverse (R2) sont mesurées. Pour les particules selon l'invention, le rapport R2/R1 qui traduit l'efficacité comme agent de contraste est supérieur au rapport obtenu avec l'Endorem® (Guerbet) comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous.

TABLEAU 1 : Valeur de R2/R1

Diamètre

Enrobage R2/R1

hydrodynamique

Nanoparticules 10 nm

selon l'invention Dendron (Ialb) 60-70 nm 46

(exemple 3)

Endorem® Dextran 120-180 nm 33