La présente invention concerne une nouvelle famille de canaux ioniques de mammifère, notamment humain, sensible à l'acidité. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation moléculaire, chez 1'homme et le rat, d'un nouveau canal cationique activé par les protons, dénommé ci-après"ASIC"pour désigner les termes anglais"Acid Sensing Ionic Channel". Le canal ASIC constitue le premier membre d'un groupe de canaux cationiques, appartenant à la famille des canaux sodium de dégénérine sensible à l'amiloride (6, 11-14), qui est activé transitoirement par une acidification extracellulaire.

La sensibilité à l'acide est associée à la fois à la nociception (1) et à la transduction du goût (2). La stimulation de neurones sensoriels par les acides revêt une grande importance, car l'acidité accompagne de nombreuses situations inflammatoires et ischémiques douloureuses. La douleur causée par les acides est interprétée comme étant médiée par des canaux cationiques présents au niveau des neurones sensoriels, et qui sont activés par les protons (3-5). Les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux ASIC de l'invention sont proches de celles des canaux cationiques activés par les protons décrits dans les neurones sensoriels (3, 15, 16).

Toutefois, comme cela apparaîtra dans la description ci- après, il n'a été à ce jour jamais décrit de canaux ioniques activés par un ligand plus simple que les canaux ASIC.

La présente invention a donc pour objet une protéine constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons. Plus

particulièrement l'invention concerne la protéine constituant le canal ASIC dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.

De tels dérivés sont ceux dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou supression et/ou addition ne modifie pas les propriétés fonctionnelles et structurelles du canal ASIC, principalement son activation par les protons. De tels dérivés peuvent être analysés par 1'homme du métier selon les techniques décrites dans les exemples donnés ci-après qui ont permis de mettre en évidence les propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal ASIC.

Un exemple d'un tel dérivé fonctionnellement équivalent, est la protéine ASIC humaine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2, et qui est sensiblement identique à celle du canal ASIC de rat, désigné ASIC1A, représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1.

Un autre exemple d'un tel dérivé fonctionnellement équivalent, est la protéine constituant un canal cationique de dégénérine dénommé"MDEG" (14) ou "BNaCI" (20) ou encore désigné ci-après"ASIC2A"ou "MDEG1"dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3. MDEG a été décrit comme un canal cationique de mammifère sensible à l'amiloride qui est activé par des mutations responsables de neurodégénéréscence avec les dégénérines de C. elegans. Le canal MDEG est un parent structural du canal ASIC, dont la séquence en acides aminés présente environ 67% d'homologie avec la séquence du canal ionique MDEG. Toutefois, les propriétés

électrophysiologiques de ces deux canaux sont différentes car ils ne sont pas activés par les mêmes changements de pH. Ainsi, la gamme de sensibilité de MDEG (ECso = 4, 05) est différente de celle de ASIC (ECso = 6, 2).

Il a été montré que le canal MDEG est activé par les mêmes mutations que celles causant une dégénérescence neuronale chez C. elegans. Ainsi, comme les mutants de dégénérine de C. elegans hyperactifs, les mutants actifs de MDEG sont responsables d'une mort cellulaire, indiquant que l'acquisition de fonction par ce canal ionique neuronal serait impliquée dans plusieurs formes de dégénérescence neuronale de mammifère et notamment humaine. Mais aucune fonction physiologique normale de MDEG n'était connue jusqu'à la mise en évidence de son activation par les protons conformément aux canaux cationiques de la présente invention.

D'autre exemples de protéines constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons selon l'invention sont donnés ci-après : -Un canal désigné ASIC1B dont la séquence de 559 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4. ASIC1B est un variant dépissage du canal ASIC1A clone à partir du cerveau de rat par PCR dégénérée. Les premier 185 amino acides sont remplacés par une nouvelle séquence de 218 amino acides qui est soulignée dans la SEQ ID NO : 4.

-Un canal désigné DRASIC dont la séquence de 533 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 5. DRASIC a été clone à partir des neurones sensoriels de rat en utilisant une séquence partielle dans les banque de données ("Expressed Sequence Tag"avec le numéro d'accession W62694). Les propriétés de DRASIC sont les suivantes : -Il est exprimé dans les neurones sensoriels mais pas dans le cerveau.

-Son expression dans les oocytes de Xénope ou dans des cellules de mammifère permet d'enregistrer un courant sodium activé par le proton qui présente deux composantes : une composante s'activant et s'inactivant rapidement et une composante s'activant plus lentement et ne s'inactivant pas. Les deux composantes sont sélectives pour le Na+. Un canal cationique activé par le proton et ne s'inactivant pas a été impliqué dans la sensation de douleur prolongée causée par une acidose.

L'invention concerne aussi un canal cationique hybride constitué de l'association d'une première protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon l'invention avec une seconde protéine constituant un canal ionique activé par les protons.

Avantageusement, ladite seconde protéine est aussi une protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon l'invention. A titre d'exemple d'une telle association, on peut citer l'association de la protéine du canal ASIC1A ou ASIC2A ou DRASIC avec la protéine du canal MDEG1, permettant de former un canal hybride présentant une troisième gamme de sensibilité au pH (avec ASIC : EC50 = 4, 8). Un autre exemple d'un tel canal hybride est l'association de la protéine des canaux ASIC1A, ASIC1B, MEDG1 ou DRASIC avec la protéine du canal MDEG2.

MDEG2 est un canal qui a été clone à partir du cerveau de rat en utilisant une séquence partielle de souris accessible dans les banques de données ("Expressed Sequence Tag avec le numéro d'accession W50528") et dont la séquence de 563 acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 6.

MDEG2 est un variant d'épissage de MDEG1.

Les premier 185 amino acides sont remplacés par une nouvelle séquence de 236 amino acides qui est soulignée dans la SEQ ID NO : 6. MDEG2 est exprimé dans le cerveau

et dans les neurones sensoriels des ganglions de la racine dorsale.

MDEG2 exprimé seul dans les oocytes de Xénope ou dans des cellules de mammifères ne forme pas un canal cationique activé par le proton. Néanmoins, il peut s'associer avec MDEG1 ou DRASIC pour former des canaux hétéromultimériques activés par le proton avec des propriétés modifiées : -Le pH d'activation du canal formé après la co-expression de MDEG1 et MDEG2 est diffèrent. Après expression dans les cellules COS, le courant n'a pas atteint sa valeur maximale à pH 3 alors que le courant induit par MDEG1 seul sature à un pH compris entre 4, 5 et 4, 0.

-Les cinétiques d'inactivation et la sélectivité ionique du canal formé après la co-expression de MDEG1 et MDEG2 sont clairement différentes de celles de MDEG1 seul. Un courant s'inactivant lentement et peu sélectif pour le Na+ et le K+ apparaît.

-Le courant sodique soutenu obtenu après expression de DRASIC devient non sélectif (il ne différencie plus le sodium et le potassium) quand MDEG2 est c-exprimé avec DRASIC. Cette nouvelle propriété est similaire à celle du canal cationique activé par le proton qui a été impliqué dans la sensation de douleur prolongée causée par une acidose. Il est très probable que DRASIC et MDEG2 fassent partie de ce canal : Les homologies de séquences en acides aminés des protéines constituant les canaux ASIC1A, ASIClB, cités selon l'invention sont données dans la tableau 1 ci- dessous.

Tableau 1 Canaux ASIC 1B ASIC 1A MEDG2 MDEG1 DRASIC ASIC1B 100 80 56 61 52 ASIC1A 100 59 68 53 MDEG2 100 78 48 MDEG1 100 51 DRASIC 100

Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine constituant un canal ionique de l'invention et/ou contre un canal hybride ci-dessus, peuvent être préparés par les méthodes classiques décrites dans la littérature. Ces anticorps sont utiles pour rechercher la présence des canaux ioniques de l'invention dans différents tissus humains ou animaux, mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine thérapeutique pour inhiber ou activer in vivo, grâce à leur spécificité, un canal ASIC et/ou ses dérivés.

La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour la protéine constituant le canal ASIC dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou pour un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.

Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine ASIC est celle représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 ou sa séquence complémentaire. Une autre molécule d'ADN selon l'invention est celle représentée dans la liste de

séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2 ou sous le numéro SEQ ID NO : 3, ou leur séquence complémentaire.

Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine ASIC1B est celle de 3647 pb représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement l'invention concerne la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 109 et 1785 de la séquence représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 4 ou sa séquence complémentaire.

Une molécule d'ADN codant pour la protéine DRASIC est celle de 1602 pb représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 5 ou sa séquence complémentaire.

Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine MDEG2 est celle de 1602 pb représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 6 ou sa séquence complémentaire.

L'invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine constituant un canal ionique selon l'invention. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou 1'expression dans un hôte des canaux de l'invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de 1'homme du métier.

A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine constituant un canal cationique selon l'invention consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,

-à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal cationique, -à isoler, par tous moyens appropriés les protéines constituant les canaux ioniques de l'invention.

A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un canal ionique selon l'invention consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans une cellule, -à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant 1'expression de canaux ioniques de l'invention.

L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.

Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré ; il peut s'agit de tout vecteur comme un plasmide.

L'invention concerne donc aussi les cellules transformées exprimant les canaux ASIC et/ou ses dérivés comme MDEG obtenues conformément aux procédés précédents.

Ces cellules sont utiles pour le criblage de substances capables de moduler la perception de l'acidité, tant en ce qui concerne la nociception que la transduction du goût.

Ce criblage est effectué en mettant en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules exprimant les canaux ASIC, puis en mesurant, par tous moyens appropriés, les effets éventuels de ladite substance sur les courants desdits canaux. Des techniques électrophysiologiques permettent également ces études et font aussi l'objet de la présente invention dès lors qu'elles mettent en oeuvre les canaux ASIC ou leurs

dérivés. Ces criblages permettent d'identifier de nouveaux médicaments utiles dans le traitement ou la prévention de la douleur. Ils permettent également de rechercher des agents modulateurs du goût acide. En outre, ils permettent de rechercher des bloqueurs qui sont susceptibles d'inhiber des neurodégénéresences provoquées par hyperexpression de ces canaux. Ces médicaments, isolés et détectés grâce aux procédés ci-dessus, font également partie de l'invention. Les canaux ASIC ont en effet des propriétés de sélectivité ionique, notamment en ce qui concerne leur perméabilité sélective au sodium, potassium et calcium, qui les destinent à avoir des propriétés excitotoxiques lorsqu'ils sont hyperstimulés.

Une protéine constituant un canal ionique neuronal ASIC peut être aussi utile pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant la perception douloureuse de l'acidité qui intervient dans les maladies inflammatoires, les ischémies et dans un certain nombre de tumeurs. L'invention concerne donc aussi les composition pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une protéine constituant un canal ionique selon l'invention.

Une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine constituant un canal ASIC ou un dérivé de celui-ci, ou un vecteur comprenant cette molécule d'acide nucléique ou encore une cellule exprimant des canaux ASIC, sont aussi utiles pour la'préparation d'animaux transgéniques. Il peut s'agir d'animaux sur-exprimant lesdits canaux, mais surtout d'animaux dit"knock out", c'est à dire présentant une déficience en ces canaux ; ces animaux transgéniques sont préparés par des méthodes connues de 1'homme du métier, et permettent de disposer de modèles vivants pour l'étude de pathologies animales associées aux canaux ASIC.

Les molécules d'acide nucléique de l'invention ou les cellules transformées par ladite

molécule sont donc susceptibles d'être utilisées dans des stratégies de thérapie génique afin de compenser une déficience des canaux ASIC au niveau de un ou plusieurs tissus d'un patient. L'invention concerne donc aussi un médicament comprenant des molécules d'acide nucléique de l'invention ou de cellules transformées par lesdites molécules pour le traitement de pathologie impliquant les canaux ASIC et leurs dérivés.

Outre la propriété d'être activé par les protons et les applications décrites ci-dessus qui en résultent dans le domaine de la perception de l'acidité, le canal ASIC, du fait de sa parenté structurale avec le canal MDEG, est susceptible de se comporter comme une dégénérine neuronale à la suite de mutation.

La mort de certains neurones est caractéristique de plusieurs types de dégénérescences neuronales telles que les maladies d'Alzheimer, d'Huntington, de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie cérébelleuse. Seuls quelques gènes déficients sont connus et plusieurs restent encore à identifier. Le réseau neuronal primitif du nématode C. elegans constitue un bon modèle du développement et de la mort neuronal. La dégénérescence héréditaire chez C. elegans peut être due à des mutations des dégénérines deg- 1, mec-4 et mec 10. Les homologies avec les sous-unités du canal sodium sensible à l'amiloride, le produit d'expression fonctionnel des chimères mec-4 du canal sodium épithélial, suggèrent que les dégénérines sont des canaux ioniques dont l'acquisition de fonction est la cause de dégénérescence neuronale.

La présente invention concerne donc aussi les applications du canal ASIC pour l'étude de ces modifications pathologiques susceptibles de conduire à des dégénérescences. Les techniques mises en oeuvre pour ces applications, par exemple pour le criblage de drogues,

sont similaires à celles décrites précédemment pour la recherche d'agents modulateurs du goût ou d'analgésiques.

En outre, une protéine constituant un canal ionique neuronal ASIC, un agoniste ou un antagonsite de celle-ci, peuvent être aussi utiles pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant une dégénérescence neuronale cérébrale. L'invention concerne donc aussi les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une de ces protéines éventuellement associée à un véhicule physiologiquement acceptable.

Plus particulièrement, l'invention concerne une substance chimique ou biologique capable de modifier les courants d'un canal ionique et/ou un canal hybride selon l'invention pour la préparation d'un médicament capble de moduler la perception de l'acidité, tant en ce qui concerne la nociception que la transduction du goût, chez un sujet humain ou animal.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant aux travaux de recherche ayant mené à la mise en évidence et à la caractérisation du canal ASIC, et dans laquelle il sera fait référence aux séquences et dessins en annexe dans lesquels : -SEQ ID NO : 1 représente la séquence de 526 acides aminés de la protéine du canal ASIC déduite de la séquence de l'ADNc de rat.

-SEQ ID NO : 2 représente la séquence partielle de 514 acides aminés de la protéine du canal ASIC déduite de la séquence partielle de l'ADNc humain.

-SEQ ID NO : 3 représente la séquence de 512 acides aminés de la protéine du canal MDEG déduite de la séquence de l'ADNc humain.

-SEQ ID NO : 4 représente la séquence de 559 acides aminés de la protéine du canal ASIC1B ainsi que la

séquence d'une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour cette protéine.

-SEQ ID NO : 5 représente la séquence de 533 acides aminés de la protéine du canal DRASIC et la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

-SEQ ID NO : 6 représente la séquence de 563 acides aminés de la protéine du canal MDEG2 ainsi que la séquence d'une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour cette protéine.

-La figure 1 représente l'alignement des séquences des protéines ASIC de rat (en haut) et humain (en bas) des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. La comparaison de ces séquences fait apparaître l'absence de 14 acides aminés au début de la phase codante humains par rapport à celle du rat.

La figure 2 représente la comparaison de la séquence de la protéine du canal ASIC avec la séquence d'autres canaux ioniques : -MDEG (14), un canal cationique de mammifère qui est activé par des mutations responsables de neurodégérescences avec les dégénérines de C. elegans.

-FaNaCh (10), un peptide d'un canal sodium de Helix aspersa qui est activé par la FMRFamide.

-La dégénérine MEC-4 (12) de C. elegans.

Dans cette figure, les résidus identiques ou similaires à ceux de ASIC sont imprimés respectivement en blanc sur fond noir et en noir sur fond gris. Les régions supposées transmembranaires (MI, MII) d'ASIC sont marquées par des barres noires.

La figure 3 représente l'arbre phylogénétique des protéines des sous unités aNaCh, ßNaCh, yNaCh, bNaCh du canal sodium sensible à l'amiloride et des dégénérines MEC-4, MEC-10 et DEG-1 de C. elegans.

La figure 4 représente la topologie qui est proposée pour cette dernière famille de canaux ioniques (30).

La figure 5 montre les propriétés biophysiques du canal ASIC1 activé par les protons.

-En a : les courants macroscopiques entrant enregistrés à-70 mV après des rapides changements du pH de pH 7, 4 à pH 6.

-En b : La courbe dose réponse du pH extracellulaire. Le pH initial était de 7, 4 et les points représentent les valeurs moyennes de 6 expériences.

L'encart dans cette figure montre les réponses typiques à -70 mV.

-En c : les relations Q-V des patch "outside-out"avec 140 mM de Na+ (t) ou de Li+ (|) dans la solution du bain. Q est la charge transportée durant la transition de pH acide. L'encart dans cette figure montre les réponses typiques dans un milieu contenant du Na+.

-En d : les courants activés par les protons H+ enregistrés à différents potentiels dans un patch"outside-out"dans un milieu contenant du Na+.

-En e : les relations moyennes i-V mesurées à partir de patch"outside-out"avec 140 mM de Na+ (|), 140 mM de Li+ (|) ou 1, 8 mM de Ca2+ (), en tant qu'ions perméables majoritaires dans les solutions externes ; les potentiels d'inversion étaient respectivement de 65 mV, 58 mV et-34 mV.

-En f : le courant de protons à travers le canal ASIC1. Les relations entre le pic de courant et le voltage ont été mesurées à partir de patch"outside-out" dans une solution de Na+ libre, Ca2+ libre avec des pipettes contenant une solution de K+ libre, à pH 4 (e) et à pH 3 (1). () représentent les résultats obtenus dans les mêmes conditions que (1) mais avec du KC1 dans la pipette.

L'encart dans cette figure montre les réponses typiques enregistrées dans les conditions ().

La figure 6 montre 1'effet du Ca2+ et de l'amiloride sur le courant ASIC.

-En a : les courants activés par les protons H+ enregistrés à différents potentiels membranaires à partir d'un patch outside-out avec 1, 8 mM de Ca2+ dans une solution de Na+ libre ; les courants se sont inversés à-35 mV.

-En b : Les relations Q-V moyennes à partir d'un patch outside-out enregistrées dans des solutions de Na+ libre contenant 1, 8 mM de Ca2+ (o, potentiel d'inversion-34 mV) ou 0, 1 mM de Ca2+ potentiel d'inversion-80 mV).

-En c : L'effet du Ca2+ externe sur le pic macroscopique de courant entrant enregistré à-70 mV et activé par un changement rapide de pH de pH 7, 4 à pH 6.

L'encart dans cette figure montre les réponses typiques.

Les points représentent les valeurs moyennes se de 5 oocytes.

-En d : L'effet de l'amiloride sur les courants activés par les protons H+ enregistré à 0 mV à partir d'un patch outside-out.

-En e : L'inhibition du courant macroscopique (induit par un changement de pH de pH 7, 4 à pH 6) à-70 mV par l'amiloride et dérivés. Les points représentent les valeurs moyennes se de 5 oocytes.

La figure 7 montre la distribution tissulaire de l'ARNm du canal ASIC.

-En a : L'analyse en Northern blot de 1'expression ARNm du canal ASIC dans des tissus humains.

-En b : L'analyse en RT-PCR de 1'expression de l'ARNm du canal ASIC dans le cerveau de rat et dans le ganglion de la racine dorsale (DRG). (+), (-) représentent respectivement les échantillons avec ou sans reverse transriptase. Des sections d'un gel d'agarose révélé au bromure d'éthidium 1%. Les flèches indiquent la taille escomptée (657 pb) du produit de PCR.

La figure 8 représente 1'hybridation in situ.

-En a et b : L'hybridation de sections de 6 um d'un ganglion de la racine dorsale d'un rat age de 3 mois avec la sonde E marquée à la digoxigénine. En a : Une microphotographie à faible pouvoir éclairant (grossissement de 30 fois). En b : Une image à haute résolution (grossissement de 80 fois) de a. On note le marquage intense des neurones de petit diamètre (flèches).

Des résultats similaires ont aussi été obtenus avec les sondes A, C et D.

-En c : La distribution de l'ARNm du canal ASIC dans le cerveau d'un rat adulte analysée par hybridation in situ avec l'oligonucléotide antisens C. Des résultats identiques ont été obtenus avec l'oligonucléotide B. Les couleurs indiquent l'abondance (rouge : haute expression ; bleu : non détectable). Les abréviations utilisées dans la figure sont les suivantes : Cer = Cerebellum ; Hip = Hyppocampe ; OB = Bulbe olfactif ; Cx = Cortex.

1-Matériels et Méthodes.

1) Clonage du canal ASIC.

Les séquences conservées de la famille de canaux ioniques ASIC ont été utilisées pour préparer les amorces PCR de séquences suivantes : TTYCCIGCIRTIACIITNTGYAAY, et CAIARICCIAIITGNCCNCCDAWRTC.

Une banque d'ADNc de cerveau de rat (Stratagène #936515) a été hybridée avec le produit de PCR de 1 kB de cerveau de rat et des clones partiels ont été isolés. L'extrémité 5é de l'ADNc (202 bp) a été isolée par PCR après une ligation adaptée à l'ADNc double brin.

2) Electrophysioloqie.

0, 25 ng d'ARNc a été injecté dans des oocytes de Xenopus laevis et les microélectrodes

d'enregistrement pour le voltage imposé et pour le patch- clamp ont été mises en place deux jours après l'injection. Les solutions de bains pour les enregistrements de patch outside-out et les pipettes pour les enregistrements de patch outside-out et de cellules totales, contenaient : 140 mM KCl (ou NMDG), 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7, 4 (avec KOH). Les pipettes pour les enregistrements de patch outside-out et les solutions de bains pour les enregistrements de patch outside-out et de cellules totales, contenaient : 140 mM NaCl (ou LiCl ou NMDGCl), 2 mM MgCl2, 1, 8 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7, 4 (ajusté avec HC1, NaOH, LiOH ou TMAOH). Les changements rapides de pH depuis le pH initial ont été obtenus par perfusion avec une solution de bain ajustée aux pH indiqués dans les figures. L'acidification intracellulaire des oocytes a été réalisée en injectant 50 nl de la solution interne à pH2 ou par perfusion et retrait d'un milieu de bain contenant 20 mM NH4Cl. Aucun des courants enregistrés n'était contaminé par le courant Ca2+ sensible au Cl-de l'oocyte de Xenopus. Les données ont été échantillonnées à 2 kHz et filtrées à 500 Hz pour l'nalyse (Logiciel Biopatch).

3) Analyse Nortern Blot, RT-PCR et hybridation in situ.

Le Northern blot a été obtenu auprès de la Société Clontech (Palo Alto, Ca) et contenait environ 2 ug d'ARN poly (A+) par ligne. Le blot a été hybride avec un fragment du clone partiel humain (correspondant aux bases 270 à 764 du clone de rat) marqué au 32p, à 65°C dans 6xSSC. Pour l'analyse RT-PCR, 5 ig de l'ARN total de cerveau de rat et 3 ug de ganglion de la racine dorsale ont été reverse transcrits et 1/30 de l'échantillon a été amplifié par 30 cycles de PCR avec les amorces de séquences ci-dessous : ATTGCTCTTCCCATCTCTAT, et TTCAAGGCCCATACCTAAGT.

Les contrôles négatifs ont été traités de façon identique, à l'exception de la reverse transcriptase qui n'a pas été ajoutée. Les oligonucléotides antisens correspondant aux base 70 à 114 (A), 215 à 248 (B), 1821 à 1859 (C), 1896 à 1940 (D) et l'ADN double brin correspondant aux base 1685 à 2672 ont été utilisés pour les hybridations in si tu. Les sections de cerveau de rat adulte ont été hybridées avec les oligonucléotides B ou C dont l'extrémité était marquée au 32p, pour une nuit à 37°C dans 50% formamide, 2xSSC, puis lavées à température ambiante dans lxSSC. Le signal a été aboli par un excès 500 fois d'oligonucléotides non marqués. Les sections de ganglion de la racine dorsale ont été hybridées avec les oligonucléotides A, C ou D marqués par la digoxigénine (DIG)-dUTP et avec la sonde E marquée par DIG- d-UTP par PCR. Le marquage des sondes, la préparation des échantillons, 1'hybridation et la visualisation des acides nucléiques DIG avec la phosphatase alcaline conjuguée à des anticorps anti-DIG ont été réalisés conformément aux protocoles du fournisseur (Boehringer Mannheim).

4) Analyse informatique.

L'alignement de séquences et l'arbre phylogénétique (substitution Kimura, option UPGMA) ont été réalisés avec le logiciel GCG (Genetics Computer Group, Madison WI).

II-Résultats.

L'ADNc de 35 kb isolé de cerveau de rat code pour une protéine de 526 acides aminés qui présente, comme montré sur la figure 2, des homologies avec tous les membres clones de la famille des canaux sodium de dégénérine sensibles à l'amiloride.

Comme montré sur la figure 5, l'expression de l'ARNc dans des oocytes de Xenopus a induit un courant

entrant activé par les protons H+. Les propriétés biophysiques et la pharmacologie du canal ASIC sont proches de celles décrites pour les canaux cationiques activés par les protons des neurones sensoriels (3, 15, 16). Une baisse du pH extracellulaire au dessous d'un pH de 6, 9 active un courant entrant rapidement élevé et désensibilisé (figure 5 a et b). Ce canal est activé par les protons extracellulaires, puisque, comme montré sur la figure 5 (c et d), l'application d'un acide sur la face extracellulaire de patch outside-out active le canal.

L'acidification intracellulaire d'oocytes et l'acidification de la face intracellulaire de patch outside-out n'active pas le canal ASIC ni n'altère le courant ASIC induit par les protons extracellulaires.

L'analyse des courbes I-V de la figure 5 (c et e) enregistrées avec différents cations extracellulaires montre que Na+ est l'ion perméable majoritaire (canal de conductance simple 14, 3 pS). Comme le canal ionique sensible aux protons des neurones sensoriels (15, 16), le canal ASIC discrimine faiblement entre les cations (figure 5 c, e, f). En effet, le canal est aussi perméable à Li+, K+, Ca2+ et H+, avec des rapports pNa+/pLi+ = 1, 3 (figure 5 c, e), pNa+/pK+ = 13 (figure 5 c, e), pNa+/Ca2+ = 2, 5 (figure 5 e) et pNa+/H+ = 0, 8 (figure 5 f). La perméabilité au Ca2+ de ASIC pourrait être un chemin d'entrée voltage indépendant de Ca2+ dans la cellule. Un courant entrant de Ca2+ dans la cellule à travers les canaux ASIC peut être détecté en l'absence de Na+ extracellulaire (figure 6 a, b). Comme indiqué sur la figure 5 (e) la conductance unitaire pour Ca2+ était de 5, 2 pS. En présence de 140 mM de Na+ extracellulaire, l'augmentation des concentrations en Ca2+ externe, a diminué l'amplitude du courant activé par les protons (figure 6c), démontrant ainsi que Ca2+ inhibe la perméabilité au Na+. Un blocage par le Ca2+ externe est caractéristique du I (H+) des neurones sensoriels (17). Le

courant entrant activé par H+ dans les neurones sensoriels est inhibé par l'amiloride (18) et l'éthylisopropylamiloride (EIPA) (19). Comme montré à la figure 6 (d, e) le canal ASIC présente la même pharmacologie et est bloqué de façon réversible (Kd = 10 uM) par l'amiloride et ses dérivés benzamil et EIPA.

Par ailleurs, la protéine du canal ASIC présente environ 67% d'homologie de séquences avec le canal ionique de dégénérine dénommé"MDEG" (14) ou"BNaCI" (20). Toutefois, les propriétés électrophysiologiques de ces deux clones exprimés dans les oocytes de Xenopus sont clairement différentes : -Comme montré sur la figure 5a, le canal MDEG n'est pas activé par les mêmes changements de pH que le canal ASIC.

-La substitution du résidu glycine en position 430 de MDEG par un acide aminé encombrant acide, comme la valine ou la phénylalanine active le canal (14), tout comme la mutation de l'alanine en position 704 de la dégénérine MEC-4 cause une neurodégéréscence chez C. elegans (12). Des mutations identiques d'ASIC (glycine en position 431 remplacée par la valine ou la phénylalanine) n'entraînent pas d'activité et les mutants ne peuvent pas être activés par les protons.

Les canaux cationiques activés par les protons ont été décrits dans les neurones sensoriels mais aussi dans les neurones du système nerveux central (21).

La distribution tissulaire de 1'expression de l'ARNm du canal ASIC est en accord avec cette observation. Comme rapporté dans la figure 7a, un transcrit de 4, 3 kb a été détecté dans le cerveau par analyse en Northern blot, et les résultats de la RT-PCR rapportés à la figure 7b montrent que le ganglion de la racine dorsale exprime l'ARNm de ASIC. La figure 8 (a, b) montre que l'ARNm de ASIC est bien exprimé dans les petits neurones du ganglion de la racine dorsale, ce qui supporte le fait que ASIC est

le canal cationique activé par les protons rapidement désensibilisant décrit dans les neurones sensoriels nociceptifs. Alors que la présence de canaux cationiques activés par les protons dans le ganglion de la racine dorsale est en accord avec leur fonction de détecteur de l'acidité dans la nociception, leur rôle dans le cerveau reste à établir. Les résultats d'hybridation in si tu de la figure 8c montrent une expression large et hétérogène de l'ARNm du canal ASIC. Les niveaux d'expression les plus élevés ont été observés dans le bulbe olfactif principal, le cortex cérébral, l'hyppocampe, l'habenula, le noyau amygdaloide basolatéral et le cerebellum. L'activité synaptique s'accompagne de changements du pH extracellulaire (22, 23) et les changements localisés rapides de pH dans ou à proximité de la fente synaptique sont sensiblement plus saturés et forts que les fluctuations macroscopiques du pH rapportées.

Les canaux cationiques activés par les protons sont les seuls canaux ioniques connus qui sont directement activés par un changement du pH et il a été envisagé que les fluctuations extracellulaires du pH jouent un rôle neuromodulateur (23). L'expression de canaux cationiques dans le cerveau supporte en outre l'hypothèse que les fluctuations de pH ne sont pas seulement une activation neuronale par un produit, mais davantage un chemin de communication dans le système nerveux central.

Outre les canaux cationiques activés par les protons rapidement inactivés, il a été rapporté la présence dans les neurones sensoriels de canaux cationiques activés par les protons présentant des cinétiques plus lentes (4, 24). Les canaux cationiques activés par les protons forment probablement, comme d'autre canaux cationiques activés par un ligand (25, 26), une famille de canaux cationiques où différentes sous- unités ou combinaisons de sous-unités constituent les

canaux avec diverses propriétés pharmacologiques et biophysiques.

La sensation de l'acidité n'est pas uniquement impliquée dans la nociception, mais est aussi associée à la transduction du goût (2). Les stimulations acides activent les canaux cationiques activés par les protons dans les cellules du goût (2, 27) et l'amiloride inhibe la perception du goût acide (2). Aussi, les données tant physiologiques que pharmacologiques indiquent que ASIC et d'autres membres de cette famille sont impliqués dans la transduction du goût. Il est en effet particulièrement frappant que la même classe de canaux ioniques soit associée à différentes facettes de la perception sensorielle : -Les canaux sodium sensibles à l'amiloride sont associés à la transduction du goût salé (2).

-Les dégénérines de C. elegans sont impliquées dans la mécanotransduction et ont été proposées comme formant des canaux ioniques mécanosensibles (28, 29).

-les canaux ASIC sont impliqués dans la nociception et dans la transduction du goût acide.

Le clonage du canal ASIC permet de disposer d'un nouvel outil d'investigation de ce groupe de canaux ioniques et de développer des bloquants spécifiques trouvant leur utilisation notamment comme analgésiques.

Liste des références 1. Rang, H. P., Bevan, S. & Dray, A. Br. Med. Bull. 47, 534-548 (1991).

2. Lindemann, B. Physiol. Rev. 76, 718-766 (1996).

3. Krishtal, O. A. & Pidoplichko, V. I. Neuroscience 6, 2599-2601 (1981).

4. Bevan, S. & Geppetti, P. Trends Neurosci. 17, 509-512 (1994).

5. Akaike, N., Krishtal, O. A. & Maruyama, T. J. Neurophysiol. 63, 805- 813 (1990).

6. Canessa, C. M., Horisberger, J. D. & Rossier, B. C. Nature 361, 467-470 (1993).

7. Canessa, C. M., Schild, L., Buell, G., Thorens, B., Gautschi, I., Horisberger, J. D. & Rossier, B. C. Nature 367, 463-467 (1994).

8. Lingueglia, E., Voilley, N., Waldmann, R., Lazdunski, M. & Barbry, P.

Febs Lett. 318, 95-99 (1993).

9. Lingueglia, E., Renard, S., Waldmann, R., Voilley, N., Champigny, G., Plass, H., Lazdunski, M. & Barbry, P. J. Biol. Chem. 269, 13736-13739 (1994).

10. Lingueglia, E., Champigny, G., Lazdunski, M. & Barbry, P. Nature 378, 730-733 (1995).

11. Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., Voilley, N.

& Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 270, 27411-27414 (1995).

12 Driscoll, M. & Chalfie, M. Nature 349, 588-593 (1991).

13. Huang, M. & Chalfie, M. Nature 367, 467-470 (1994).

14. Waldmann, R, Champigny, G., Voilley, N., Lauritzen, I. & Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 271, 10433-10434 (1996).

15. Kovalchuk Yu, N., Krishtal, O. A. & Nowycky, M. C. Neurosci. Lett.

115, 237-242 (1990).

16. Konnerth, A., Lux, H. D. & Morad, M. J. Physiol. 386, 603-633 (1987).

17. Davies, N. W., Lux, H. D. & Morad, M. J. Physiol. 400, 159-187 (1988).

18. Korkushko, A. O. & Krishtal, O. A. Neirofiziologiia 16, 557-561 (1984).

19. Grantyn, R, Perouansky, M., Rodriguez-Tebar, A. & Lux, H. D. Dev.

Brain Res. 49, 150-155 (1989).

20. Price, M. P., Snyder, P. M. & Welsh, M. J. J. Biol. Chem. 271, 7879-7882 (1996).

21. Akaike, N. & Ueno, S. Prog. Neurobiol. 43, 73-83 (1994).

22 Krishtal, O. A., Osipchuk, Y. V., Shelest, T. N. & Srnirnoff, S. V. Brain Res. 436, 352-356 (1987).

23. Chesler, M. & Kaila, K. Trends Neurosci. 15, 396-402 (1992).

24. Bevan, S. & Yeats, J. J. Physiol. 433, 145-161 (1991).

25. Lewis, C., Neidhart, S., Holy, C., North, R A., Buell, G. & Surprenant, A. Nature 377, 432-435 (1995).

26. Barnard, E. A. Trends Pharmacol. Sci. 17, 305-309 (1996).

27. Okada, Y., Miyamoto, T. & Sato, T. J. Exp. Biol. 187, 19-32 (1994).

28. Liu, J., Schrank, B. & Waterston, R. Science 273, 361 (1996).

29. Waldmann, R., Champigny, G. & Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 270, 11735-11737 (1995).

30. Renard, S., Lingueglia, E., Voilley, N., Lazdunski, M. & Barbry, P.

1. Biol Chem. 269, 12981-12986 (1994).

LISTE DE SÉQUENCES.

NOMBRE DE SÉQUENCES : 6 INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 1: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR : 3562 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : rat ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : ASIC B) LOCALISATION : 123.. 1700 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 1 : CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAGAAC CTGCGCCTGT 60 GCCTGTGCCT GTGCCTGTGC CTGTTTGAGA GCTGGAGACA CAGAAGGATC CCCTTGGCAA 120 GG ATG GAA TTG AAG ACC GAG GAG GAG GAG GTG GGT GGT GTC CAG CCG 167 Met Glu Leu Lys Thr Glu Glu Glu Glu Val Gly Gly Val Gln Pro 1 5 10 15 GTG AGC ATC CAG GCT TTC GCC AGC AGC TCC ACG CTG CAT GGT CTT GCC 215 Val Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu His Gly Leu Ala 20 25 30 CAC ATC TTC TCC TAT GAG CGG CTG TCT CTG AAG CGG GCA CTG TGG GCC 263 His Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser Leu Lys Arg Ala Leu Trp Ala 35 40 45 CTG TGC TTC CTG GGT TCG CTG GCC GTC CTG CTG TGT GTG TGC ACT GAG 311 Leu Cys Phe Leu Gly Ser Leu Ala Val Leu Leu Cys Val Cys Thr Glu 50 55 60 CGT GTG CAG TAC TAC TTC TGC TAT CAC CAC GTC ACC AAG CTT GAC GAA 359 Arg Val Gln Tyr Tyr Phe Cys Tyr His His Val Thr Lys Leu Asp Glu 65 70 75 GTG GCT GCC TCC CAG CTC ACC TTC CCT GCT GTC ACA CTG TGC AAT CTC 407 Val Ala Ala Ser Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu 80 85 90 95 AAT GAG TTC CGC TTT AGC CAA GTC TCC AAG AAT GAC CTG TAC CAT GCT 455 Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gln Val Ser Lys Asn Asp Leu Tyr His Ala 100 105 110 GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTC AAC AAC AGG TAT GAG ATC CCG GAC ACA 503 Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Asn Arg Tyr Glu Ile Pro Asp Thr 115 120 125

CAG ATG GCT GAT GAA AAG CAG CTA GAG ATA TTG CAG GAC AAG GCC AAC 551 Gln Met Ala Asp Glu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Gln Asp Lys Ala Asn 130 135 140 TTC CGG AGC TTC AAG CCC AAG CCC TTC AAC ATG CGT GAA TTC TAC GAC 599 Phe Arg Ser Phe Lys Pro Lys Pro Phe Asn Met Arg Glu Phe Tyr Asp 145 150 155 AGA GCG GGG CAC GAT ATT CGA GAC ATG CTG CTC TCG TGC CAC TTC CGT 647 Arg Ala Gly His Asp Ile Arg Asp Met Leu Leu Ser Cys His Phe Arg 160 165 170 175 GGG GAG GCC TGC AGC GCT GAA GAT TTC AAA GTG GTC TTC ACT CGG TAT 695 Gly Glu Ala Cys Ser Ala Glu Asp Phe Lys Val Val Phe Thr Arg Tyr 180 185 190 GGG AAG TGT TAC ACA TTC AAC TCG GGC CAA GAT GGG CGG CCA CGG CTG 743 Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Gln Asp Gly Arg Pro Arg Leu 195 200 205 AAG ACC ATG AAA GGT GGG ACT GGC AAT GGC CTG GAG ATC ATG CTG GAC 791 Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp 210 215 220 ATT CAG CAA GAT GAA TAT TTG CCT GTG TGG GGA GAG ACC GAC GAG ACA 839 Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr 225 230 235 TCC TTC GAA GCA GGC ATC AAA GTG CAG ATC CAC AGT CAG GAT GAA CCC 887 Ser Phe Glu Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp Glu Pro 240 245 250 255 CCT TTC ATC GAC CAG CTG GGC TTT GGT GTG GCT CCA GGT TTC CAG ACG 935 Pro Phe Ile Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr 260 265 270 TTT GTG TCT TGC CAG GAG CAG AGG CTC ATC TAC CTG CCC TCA CCC TGG 983 Phe Val Ser Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Pro Trp 275 280 285 GGC ACC TGC AAT GCT GTT ACC ATG GAC TCG GAT TTC TTC GAC TCC TAC 1031 Gly Thr Cys Asn Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Phe Phe Asp Ser Tyr 290 295 300 AGC ATC ACT GCC TGC CGG ATT GAT TGC GAG ACG CGT TAC CTG GTG GAG 1079 Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val Glu 305 310 315 AAC TGC AAC TGC CGT ATG GTG CAC ATG CCA GGG GAC GCC CCA TAC TGC 1127 Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Tyr Cys 320 325 330 335 ACT CCA GAG CAG TAC AAG GAG TGT GCA GAT CCT GCC CTG GAC TTC CTA 1175 Thr Pro Glu Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe Leu 340 345 350 GTG GAG AAA GAC CAG GAA TAC TGC GTG TGT GAG ATG CCT TGC AAC CTG 1223 Val Glu Lys Asp Gln Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro Cys Asn Leu 355 360 365

ACC CGC TAC GGC AAG GAG CTG TCC ATG GTC AAG ATC CCA AGC AAA GCC 1271 Thr Arg Tyr Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Ala 370 375 380 TCC GCC AAG TAC CTG GCC AAG AAG TTC AAC AAA TCG GAG CAG TAC ATA 1319 Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gln Tyr Ile 385 390 395 GGG GAG AAC ATT CTG GTG CTG GAC ATT TTC TTT GAA GTC CTC AAC TAT 1367 Gly Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val Leu Asn Tyr 400 405 410 415 GAG ACC ATC GAG CAG AAA AAG GCC TAT GAG ATC GCA GGG CTG TTG GGT 1415 Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly Leu Leu Gly 420 425 430 GAC ATC GGG GGC CAG ATG GGG TTG TTC ATC GGT GCC AGC ATC CTC ACC 1463 Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu Thr 435 440 445 GTG CTG GAA CTC TTT GAC TAT GCC TAC GAG GTC ATT AAG CAC AGG CTG 1511 Val Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ile Lys His Arg Leu 450 455 460 TGC AGA CGT GGA AAG TGC CAG AAG GAG GCT AAG AGG AGC AGC GCA GAC 1559 Cys Arg Arg Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser Ser Ala Asp 465 470 475 AAG GGC GTG GCG CTC AGC CTG GAT GAC GTC AAA AGA CAC AAT CCC TGC 1607 Lys Gly Val Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His Asn Pro Cys 480 485 490 495 GAG AGC CTC CGA GGA CAT CCT GCC GGG ATG ACG TAC GCT GCC AAC ATC 1655 Glu Ser Leu Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala Ala Asn Ile 500 505 510 CTA CCT CAC CAT CCC GCT CGA GGC ACG TTT GAG GAC TTT ACC TGC TAA 1703 Leu Pro His His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe Thr Cys * 515 520 526 GCCCTCGCAG GCCGCTGTAC CAAAGGCCTA GGTGGGGAGG GCTGGGGGAG CAAGGGGCCC 1763 CCAACTGCCC CCAGCTACCC TGTGGACTTA ACTGCATTCC TGGTCAGTGG TTCCCTCTTG 1823 TCTGTGGTGA GAAAGGAGTC TTGACCATAG AGTCCTCTCC CAGCCTCTAT CCCATCTTTT 1943 TATTTTAATT TAATCACATT TGCTCTGTAA TATTGCTTGA GGCTGGGGAT CGTGATTTCC 2003 CCCCAGTTCT TTTATTGTTG AGAATAGTTT TCTCTATTCT GGGTTTTCTG TTATTTCAAA 2063 TGAATCTGCA AATTGCTCTT CCCATCTCTA TGAAGAATTG CGTTGGAATT TTGATGGGGA 2123 TTGTATTGAA TCTGTAGATT GCCTTTGGTA AGATGGCCAT TTTTACTATG TTAATCCTGC 2183 CAATTCATGA GCAAGGGAGA TCTTTCTATC TCTGAAATCT ACTTCAGTTT CTTTCTTCAG 2243 AGACTTGAAG TTCTTGTCAT AAAAATCTTT TTGGTTAGAG CCACACCAAG GTATTTTATA 2303 TTGTTTGTGA CTATTGTGAA TGGTGTCATT TCCCTAATTT CCTTCTCAGC CTACTTATCC 2363

TTTGAGTAGA GGAAGGCTTC TGATTTGTTT GGGTTAATTT TATACCCAGC TGCTTTGCTA 2423 AAGTTCTTTA TCAGGTTTAG GTGTTCTCTG GTGGAACTTT TGGGGTCACG TAAGAATACT 2483 ATTATATCAT CTGCAAATAG TGATATTTCA CTTCTTCCTT TCCAATTTCT ATCCCTCTGG 2543 GGACTTTTTG TTGTCTAATT GCTCTGGCTA GGACTTCAAA TTCTATATTG AATAGATAGG 2603 GAGAGAGTGG GCAGCCTTGT CTAGTTCCTG GTTTTCGTGG GATCGCTTCA AATTTCTCTC 2663 CATTTAGTTT GATATTGGCT ACTGGTTTGC TGTATATGGC TTTTACTGTA CTTAGGTATG 2723 GGCCTTGAAT TCCTGATATT TCCAAGACTT TTAACATGAA GGGGTTTTGA AATTTGCCAA 2783 ATGCTTTCTC AGCATCTAAT GAGATGATCA TGTGCCCTCC CCCCACCTTG AGTTTGTTTA 2843 TATAGTGGGT TACATGAAAG GATCATTTCT AATAGTCCAC AAGTCTGCCA AATCTTGCTG 2903 ATTGTGACTC ATTTCCATAG CAGGCTCTAT AACTTCTCTA ACAGATTGCA TTAAACTCTG 2963 CTTGGGGAAG GCATTACCTC TTGGTTGAAG CAATGTTGTA GTTTCTATGC CTGCTGAGTA 3023 AATAGCCTCA AGTCCAAGTA CTTGCCCAGA CTAATGATCA AACGTATCCA GGAGTTCCAT 3083 ACCAGAGATG TACTCTTCTC TCCTTTGAAG TACATTGCTG GAAGAGTAAT TGTGTTTGCT 3143 AGAGATACTC CTTCGAACTG CAAAAGAAAT CTCTTGGCTA AGCATATAAT CAAGCCTCAG 3203 GTTTTCTTTT TATTAAATAG CTGCTTGTAA GAAAGTGGAC ACTAAGCATA TACCTCAAAG 3263 GGAGACAGAA TGACTCTGTG CCTTCACTGA TGGAAGTCTG GGTTACAAAT TACATCAGAA 3323 GAACCTATCA TAGTGAAACA TCTCATTCCC CTGGTATAAT CCCTTCTAGA AATACACTTG 3383 TGACTCTGAA ATGTTATAAT CGTGACAACT AGGCTGTTAC AGATACACCA AGTTAAATTT 3443 GATAGAGAAA CCAGGCTTGG AGCCTCATGT CCATAGGGCA AGAGGAAGAT GCTGAGTGTT 3503 TAAGGTTGGT TTGAGCGAAG AACAATACCT TGTGTCACAA AAATGAAAGG AAAAAAGAAA 3563 AAAGGAAAGA AGGAAAGAAA GAGAGAGAAA GAAAAAGAAA GAAAGAAAAA AAAAAAAAA 3562

INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 2: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR : 1620 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : homme ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : ASIC B) LOCALISATION : 1.. 1542 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 2 : CCG GTG AGC ATC CAG GCC TTC GCC AGC AGC TCC ACA CTG CAC GGC ATG 48 Pro Val Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu His Gly Met 1 5 10 15 GCC CAC ATC TTC TCC TAC GAG CGG CTG TCT CTG AAG CGG GCA CTG TGG 96 Ala His Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser Leu Lys Arg Ala Leu Trp 20 25 30 GCC CTG TGC TTC CTG GGC TCG CTG GCT GTG CTG CTG TGT GTG TGC ACG 144 Ala Leu Cys Phe Leu Gly Ser Leu Ala Val Leu Leu Cys Val Cys Thr 35 40 45 GAG CGT GTG CAG TAC TAC TTC CAC TAc CAC CAT GTC ACC AAG CTC GAC 192 Glu Arg Val Gln Tyr Tyr Phe His Tyr His His Val Thr Lys Leu Asp 50 55 60 GAG GTG GCT GCC TCT CAG CTT ACC TTC CCT GCT GTC ACG CTG TGC AAC 240 Glu Val Ala Ala Ser Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn 65 70 75 80 CTC AAC GAG TTC CGC TTT AGC CAA GTC TCC AAG AAT GAC CTG TAT CAT 288 Leu Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gln Val Ser Lys Asn Asp Leu Tyr His 85 90 95 GCT GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTC AAC AAC AGG TAT GAG ATA CCA GAC 336 Ala Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Asn Arg Tyr Glu Ile Pro Asp 100 105 110 ACA CAG ATG GCA GAT GAA AAG CAG CTG GAG ATA CTG CAG GAC AAA GCC 384 Thr Gln Met Ala Asp Glu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Gln Asp Lys Ala 115 120 125 AAC TTC CGC AGC TTC AAA CCC AAA CCC TTC AAC ATG CGT GAG TTC TAC 432 Asn Phe Arg Ser Phe Lys Pro Lys Pro Phe Asn Met Arg Glu Phe. Tyr 130 135 140 GAC CGA GCT GGG CAC GAC ATT CGA GAC ATG CTG CTC TCC TGC CAC TTC 480 Asp Arg Ala Gly His Asp Ile Arg Asp Met Leu Leu Ser Cys His Phe 145 150 155 160

CGG GGG GAG GTC TGC AGC GCT GAA GAC TTC AAG GTG GTC TTC ACA CGC 528 Arg Gly Glu Val Cys Ser Ala Glu Asp Phe Lys Val Val Phe Thr Arg 165 170 175 TAT GGA AAG TGC TAC ACG TTC AAC TCG GGC CGA AAT GGG CGG CCG CGG 576 Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Arg Asn Gly Arg Pro Arg 180 185 190 CTG AAG ACC ATG AAG GGT GGG ACG GGC AAT GGG CTG GAA ATC ATG CTG 624 Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu 195 200 205 GAC ATC CAG CAG GAC GAG TAC CTG CCT GTG TGG GGG GAG ACT GAC GAG 672 Asp Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu 210 215 220 ACG TCT TTC GAA GCA GGC ATC AAA GTG CAG ATC CAT AGT CAG GAT GAA 720 Thr Ser Phe Glu Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp Glu 225 230 235 240 CCT CCT TTC ATC GAC CAG CTG GGC TTT GGC GTG GCC CCA GGC TTC CAG 768 Pro Pro Phe Ile Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Glri 245 250 255 ACC TTT GTG GCC TGC CAG GAG CAG CGG CTC ATA TAC CTG CCC CCA CCC 816 Thr Phe Val Ala Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Pro Pro 260 265 270 TGG GGC ACC TGC AAA GCT GTT ACC ATG GAC TCG GAT TTG GAT TTC TTC 864 Trp Gly Thr Cys Lys Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Leu Asp Phe Phe 275 280 285 GAC TCC TAC AGC ATC ACT GCC TGC CGC ATC GAC TGT GAG ACG CGC TAC 912 Asp Ser Tyr Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr 290 295 300 CTG GTG GAG AAC TGC AAC TGC CGC ATG GTG CAC ATG CCA GGG GAT GCC 960 Leu Val Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala 305 310 315 320 CCA TAC TGT ACT CCA GAG CAG TAC AAG GAG TGT GCA GAT CCT GCT CTG 1008 Pro Tyr Cys Thr Pro Glu Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu 325 330 335 GAC TTC CTG GTG GAG AAG GAC CAG GAG TAC TGC GTG TGT GAA ATG CCT 1056 Asp Phe Leu Val Glu Lys Asp Gln Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro 340 345 350 TGC AAC CTG ACC CGC TAT GGC AAA GAG CTG TCC ATG GTC AAG ATC CCC 1104 Cys Asn Leu Thr Arg Tyr Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro 355 360 365 AGC AAA GCC TCA GCC AAG TAC CTG GCC AAG AAG TTC AAC AAA TCT GAG 1152 Ser Lys Ala Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu 370 375 380 CAA TAC ATA GGG GAG AAC ATC CTG GTG CTG GAC ATT TTC TTT GAA GTC 1200 Gln Tyr Ile Gly Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val 385 390 395 400

CTC AAC TAT GAG ACC ATT GAA CAG AAG AAG GCC TAT GAG ATT GCA GGG 1248 Leu Asn Tyr Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly 405 410 415 CTC CTG GGT GAC ATC GGG GGC CAG ATG GGG CTG TTC ATC GGG GCC AGC 1296 Leu Leu Gly Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser 420 425 430 ATC CTC ACG GTG CTG GAG CTC TTT GAC TAC GCC TAC GGG GTC ATT AAG 1344 Ile Leu Thr Val Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Gly Val Ile Lys 435 440 445 CAC AAG CTG TGC CGA CGA GGA AAA TGC CAG AAG GAG GCC AAA AGG AGC 1392 His Lys Leu Cys Arg Arg Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser 450 455 460 AGT GCG GAC AAG GGC GTG GCC CTC AGC CTG GAC GAC GTC AAA AGA CAC 1440 Ser Ala Asp Lys Gly Val Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His 465 470 475 480 AAC CCG TGC GAG AGC CTT CGG GGC CAC CCT GCC GGG ATG ACA TAC GCT 1488 Asn Pro Cys Glu Ser Leu Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala 485 490 495 GCC AAC ATC GTA CCT CAC CAT CCG GCC CGA GGC ACG TTC GAG GAC TTT 1536 Ala Asn Ile Val Pro His His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe 500 505 510 ACC TGC TGA GCCCCGCAGG CCGCCGAACC AAAGACCTAG ATGGGGAGGA CTAGGAGAGC 1595 Thr Cys * 514 GAGGGGGCCC CCAGCTGCCT CCTAA 1620

INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 3: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR : 1666 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : homme ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : MDEG B) LOCALISATION : 127.. 1663 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 3 : TCTGGCGCGA TGCTTACCTT GCGTTCTCTC CCCTGAACGT CAAGGTTTAA GCAGAGCCCG 60 AGGACTGGGA GCTCTTCTCT GAAATTCGAT CAACCTGAAG CCAGTTGCGG AACTGCACGG 120 GGTCCCG ATG GAC CTC AAG GAA AGC CCC AGT GAG GGC AGC CTG CAA CCT 169 Met Asp Leu Lys Glu Ser Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Pro 1 5 10 TCT AGC ATC CAG ATC TTT GCC AAC ACC TCC ACC CTC CAT GGC ATC CGC 217 Ser Ser Ile Gln Ile Phe Ala Asn Thr Ser Thr Leu His Gly Ile Arg 15 20 25 30 CAC ATC TTC GTG TAT GGG CCG CTG ACC ATC CGG CGT GTG CTG TGG GCA 265 His Ile Phe Val Tyr Gly Pro Leu Thr Ile Arg Arg Val Leu Trp Ala 35 40 45 GTG GCC TTC GTG GGC TCT CTG GGC CTG CTG CTG GTG GAG AGC TCT GAG 313 Val Ala Phe Val Gly Ser Leu Gly Leu Leu Leu Val Glu Ser Ser Glu 50 55 60 AGG GTG TCC TAC TAC TTC TCC TAC CAG CAT GTC ACT AAG GTG GAC GAA 361 Arg Val Ser Tyr Tyr Phe Ser Tyr Gln His Val Thr Lys Val Asp Glu 65 70 75 GTG GTG GCT CAA AGC CTG GTC TTC CCA GCT GTG ACC CTC TGT AAC CTC 409 Val Val Ala Gln Ser Leu Val Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu 80 85 90 AAT GGC TTC CGG TTC TCC AGG CTC ACC ACC AAC GAC CTG TAC CAT GCT 457 Asn Gly Phe Arg Phe Ser Arg Leu Thr Thr Asn Asp Leu Tyr His Ala 95 100 105 110 GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTG GAT GTC AAC CTG CAG ATC CCG GAC CCC 505 Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asp Val Asn Leu Gln Ile Pro Asp Pro 115 120 125 CAT CTG GCT GAC CCC TCC GTG CTG GAG GCC CTG CGG CAG AAG GCC AAC 553 His Leu Ala Asp Pro Ser Val Leu Glu Ala Leu Arg Gln Lys Ala Asn 130 135 140

TTC AAG CAC TAC AAA CCC AAG CAG TTC AGC ATG CTG GAG TTC CTG CAC 601 Phe Lys His Tyr Lys Pro Lys Gln Phe Ser Met Leu Glu Phe Leu His 145 150 155 CGT GTG GGC CAT GAC CTG AAG GAT ATG ATG CTC TAC TGC AAG TTC AAA 649 Arg Val Gly His Asp Leu Lys Asp Met Met Leu Tyr Cys Lys Phe Lys 160 165 170 GGG CAG GAG TGC GGC CAC CAA GAC TTC ACC ACA GTG TTT ACA AAA TAT 697 Gly Gln Glu Cys Gly His Gln Asp Phe Thr Thr Val Phe Thr Lys Tyr 175 180 185 190 GGG AAG TGT TAC ATG TTT AAC TCA GGC GAG GAT GGC AAA CCT CTG CTC 745 Gly Lys Cys Tyr Met Phe Asn Ser Gly Glu Asp Gly Lys Pro Leu Leu 195 200 205 ACC ACG GTC AAG GGG GGG ACA GGC AAC GGG CTG GAG ATC ATG CTG GAC 793 Thr Thr Val Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp 210 215 220 ATT CAG CAG GAT GAG TAC CTG CCC ATC TGG GGA GAG ACA GAG GAA ACG 841 Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Ile Trp Gly Glu Thr Glu Glu Thr 225 230 235 ACA TTT GAA GCA GGA GTG AAA GTT CAG ATC CAC AGT CAG TCT GAG CCA 889 Thr Phe Glu Ala Gly Val Lys Val Gln Ile His Ser Gln Ser Glu Pro 240 245 250 CCT TTC ATC CAA GAG CTG GGC TTT GGG GTG GCT CCA GGG TTC CAG ACC 937 Pro Phe Ile Gln Glu Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr 255 260 265 270 TTT GTG GCC ACA CAG GAG CAG AGG CTC ACA TAC CTG CCC CCA CCG TGG 985 Phe Val Ala Thr Gln Glu Gln Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Trp 275 280 285 GGT GAG TGC CGA TCC TCA GAG ATG GGC CTC GAC TTT TTT CCT GTT TAC 1033 Gly Glu Cys Arg Ser Ser Glu Met Gly Leu Asp Phe Phe Pro Val Tyr 290 295 300 AGC ATC ACC GCC TGT AGG ATT GAC TGT GAG ACC CGC TAC ATT GTG GAA 1081 Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Ile Val Glu 305 310 315 AAC TGC AAC TGC CGC ATG GTT CAC ATG CCA GGG GAT GCC CCT TTT TGT 1129 Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Phe Cys 320 325 330 ACC CCT GAG CAG CAC AAG GAG TGT GCA GAG CCT GCC CTA GGT CTG TTG 1177 Thr Pro Glu Gln His Lys Glu Cys Ala Glu Pro Ala Leu Gly Leu Leu 335 340 345 350 GCG GAA AAG GAC AGC AAT TAC TGT CTC TGC AGG ACA CCC TGC AAC CTA 1225 Ala Glu Lys Asp Ser Asn Tyr Cys Leu Cys Arg Thr Pro Cys Asn Leu 355 360 365 ACC CGC TAC AAC AAA GAG CTC TCC ATG GTG AAG ATC CCC AGC AAG ACA 1273 Thr Arg Tyr Asn Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Thr 370 375 380

TCA GCC AAG TAC CTT GAG AAG AAA TTT AAC AAA TCA GAA AAA TAT ATC 1321 Ser Ala Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Lys Tyr Ile 385 390 395 TCA GAG AAC ATC CTT GTT CTG GAT ATA TTT TTT GAA GCT CTC AAT TAT 1369 Ser Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Ala Leu Asn Tyr 400 405 410 GAG ACA ATT GAA CAG AAG AAG GCG TAT GAA GTT GCT GCC TTA CTT GGT 1417 Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Val Ala Ala Leu Leu Gly 415 420 425 430 GAT ATT GGT GGT CAG ATG GGA TTG TTC ATT GGT GCT AGT ATC CTT ACA 1465 Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu Thr 435 440 445 ATA CTA GAG CTC TTT GAT TAT ATT TAT GAG CTG ATC AAA GAG AAG CTA 1513 Ile Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Tyr Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu 450 455 460 TTA GAC CTG CTT GGC AAA GAG GAG GAT GAA GGG AGC CAC GAT GAG AAT 1561 Leu Asp Leu Leu Gly Lys Glu Glu Asp Glu Gly Ser His Asp Glu Asn 465 470 475 GTG AGT ACT TGT GAC ACA ATG CCA AAC CAC TCT GAA ACC ATC AGT CAC 1609 Val Ser Thr Cys Asp Thr Met Pro Asn His Ser Glu Thr Ile Ser His 480 485 490 ACT GTG AAC GTG CCC CTG CAG ACG ACC CTG GGG ACC CTG GAA GAA ATA 1657 Thr Val Asn Val Pro Leu Gln Thr Thr Leu Gly Thr Leu Glu Glu Ile 495 500 505 510 GCC TGC TGA 1666 Ala Cys * 512

INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 4: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR : 3647 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : rat ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : ASIC1B B) LOCALISATION : 109.. 1785 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 4 : CTGCCACAGA GGCTCTGGTG AGGAAGGACA GACAGCTGGA CCGGCGCAGA CCTAGCCGAA 60 GTCCAACCTC CGTCCCTTCT GGTGGCTTCT TCCTGTCTCC TGAACAAG ATG CCC ATC 117 Met Pro Ile 1 3 CAG ATC TTT TGT TCT GTG TCA TTC TCC TCT GGA GAG GAG GCC CCG GGA 165 Gln Ile Phe Cys Ser Val Ser Phe Ser Ser Gly Glu Glu Ala Pro Gly 5 10 15 TCC ATG GCA GAT ATC TGG GGT CCC CAC CAC CAC CGG CAG CAG CAG GAC 213 Ser Met Ala Asp Ile Trp Gly Pro His His His Arg Gln Gln Gln Asp 20 25 30 35 AGC TCA GAA TCG GAA GAA GAG GAA GAG AAG GAA ATG GAG GCA GGG TCG 261 Ser Ser Glu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Met Glu Ala Gly Ser 40 45 50 GAG TTG GAT GAG GGT GAT GAC TCA CCT AGG GAC TTG GTG GCC TTC GCC 309 Glu Leu Asp Glu Gly Asp Asp Ser Pro Arg Asp Leu Val Ala Phe Ala 55 60 65 AAC AGC TGT ACC TTC CAT GGT GCC AGC CAT GTG TTT GTG GAA GGG GGC 357 Asn Ser Cys Thr Phe His Gly Ala Ser His Val Phe Val Glu Gly Gly 70 75 80 CCA GGG CCA AGG CAG GCC TTA TGG GCA GTG GCC TTT GTC ATA GCA CTG 405 Pro Gly Pro Arg Gln Ala Leu Trp Ala Val Ala Phe Val Ile Ala Leu 85 90 95 GGT GCC TTC CTG TGC CAG GTA GGG GAC CGC GTT GCT TAT TAC CTC AGC 453 Gly Ala Phe Leu Cys Gln Val Gly Asp Arg Val Ala Tyr Tyr Leu Ser 100 105 110 115 TAC CCA CAC GTG ACT TTG CTA GAC GAA GTG GCC ACC ACG GAG CTG GTC 501 Tyr Pro His Val Thr Leu Leu Asp Glu Val Ala Thr Thr Glu Leu Val 120 125 130

TTC CCA GCT GTC ACC TTC TGC AAC ACC AAT GCC GTG CGG TTG TCC CAG 549 Phe Pro Ala Val Thr Phe Cys Asn Thr Asn Ala Val Arg Leu Ser Gln 135 140 145 CTC AGC TAC CCT GAC TTG CTC TAC CTG GCC CCC ATG CTA GGA CTG GAT 597 Leu Ser Tyr Pro Asp Leu Leu Tyr Leu Ala Pro Met Leu Gly Leu Asp 150 155 160 GAG AGT GAT GAC CCC GGG GTG CCC CTT GCT CCT CCT GGC CCA GAG GCT 645 Glu Ser Asp Asp Pro Gly Val Pro Leu Ala Pro Pro Gly Pro Glu Ala 165 170 175 TTC TCC GGG GAG CCT TTT AAC CTC CAT CGT TTC TAT AAT CGC TCT TGC 693 Phe Ser Gly Glu Pro Phe Asn Leu His Arg Phe Tyr Asn Arg Ser Cys 180 185 190 195 CAC CGG CTG GAG GAC ATG CTG CTC TAT TGT TCC TAC TGT GGG GGC CCC 741 His Arg Leu Glu Asp Met Leu Leu Tyr Cys Ser Tyr Cys Gly Gly Pro 200 205 210 TGT GGT CCC CAC AAC TTC TCA GTG GTC TTC ACT CGG TAT GGG AAG TGT 789 Cys Gly Pro His Asn Phe Ser Val Val Phe Thr Arg Tyr Gly Lys Cys 215 220 225 TAC ACA TTC AAC TCG GGC CAA GAT GGG CGG CCA CGG CTG AAG ACC ATG 837 Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Gln Asp Gly Arg Pro Arg Leu Lys Thr Met : 230 235 240 AAA GGT GGG ACT GGC AAT GGC CTG GAG ATC ATG CTG GAC ATT CAG CAA 885 Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp Ile Gln Gln 245 250 255 GAT GAA TAT TTG CCT GTG TGG GGA GAG ACC GAC GAG ACA TCC TTC GAA 933 Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr Ser Phe Glu 260 265 270 275 GCA GGC ATC AAA GTG CAG ATC CAC AGT CAG GAT GAA CCC CCT TTC ATC 981 Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp Glu Pro Pro Phe Ile 280 285 290 GAC CAG CTG GGC TTT GGT GTG GCT CCA GGT TTC CAG ACG TTT GTG TCT 1029 Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr Phe Val Ser 295 300 305 TGC CAG GAG CAG AGG CTC ATC TAC CTG CCC TCA CCC TGG GGC ACC TGC 1077 Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Pro Trp Gly Thr Cys 310 315 320 AAT GCT GTT ACC ATG GAC TCG GAT TTC TTC GAC TCC TAC AGC ATC ACT 1125 Asn Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Phe Phe Asp Ser Tyr Ser Ile Thr 325 330 335 GCC TGC CGG ATT GAT TGC GAG ACG CGT TAC CTG GTG GAG AAC TGC AAC 1173 Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val Glu Asn Cys Asn 340 345 350 355

TGC CGT ATG GTG CAC ATG CCA GGG GAC GCC CCA TAC TGC ACT CCA GAG 1221 Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Tyr Cys Thr Pro Glu 360 365 370 CAG TAC AAG GAG TGT GCA GAT CCT GCC CTG GAC TTC CTA GTG GAG AAA 1269 Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe Leu Val Glu Lys 375 380 385 GAC CAG GAA TAC TGC GTG TGT GAG ATG CCT TGC AAC CTG ACC CGC TAC 1317 Asp Gln Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro Cys Asn Leu Thr Arg Tyr 390 395 400 GGC AAG GAG CTG TCC ATG GTC AAG ATC CCA AGC AAA GCC TCC GCC AAG 1365 Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Ala Ser Ala Lys 405 410 415 TAC CTG GCC AAG AAG TTC AAC AAA TCG GAG CAG TAC ATA GGG GAG AAC 1413 Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gln Tyr Ile Gly Glu Asn 420 425 430 435 ATT CTG GTG CTG GAC ATT TTC TTT GAA GTC CTC AAC TAT GAG ACC ATC 1461 Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val Leu Asn Tyr Glu Thr Ile 440 445 450 GAG CAG AAA AAG GCC TAT GAG ATC GCA GGG CTG TTG GGT GAC ATC GGG 1509 Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly Leu Leu Gly Asp Ile Gly 455 460 465 GGC CAG ATG GGG TTG TTC ATC GGT GCC AGC ATC CTC ACC GTG CTG GAA 1557 Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu Thr Val Leu Glu 470 475 480 CTC TTT GAC TAT GCC TAC GAG GTC ATT AAG CAC AGG CTG TGC AGA CGT 1605 Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ile Lys His Arg Leu Cys Arg Arg 485 490 495 GGA AAG TGC CAG AAG GAG GCT AAG AGG AGC AGC GCA GAC AAG GGC GTG 1653 Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser Ser Ala Asp Lys Gly Val 500 505 510 515 GCG CTC AGC CTG GAT GAC GTC AAA AGA CAC AAT CCC TGC GAG AGC CTC 1701 Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His Asn Pro Cys Glu Ser Leu 520 525 530 CGA GGA CAT CCT GCC GGG ATG ACG TAC GCT GCC AAC ATC CTA CCT CAC 1749 Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala Ala Asn Ile Leu Pro His 535 540 545 CAT CCC GCT CGA GGC ACG TTT GAG GAC TTT ACC TGC TAA GCCCTCGCAG 1798 His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe Thr Cys * 550 55 559 GCCGCTGTAC CAAAGGCCTA GGTGGGGAGG GCTGGGGGAG CAAGGGGCCC CCAACTGCCC 1858 CCAGCTACCC TGTGGACTTA ACTGCATTCC TGGTCAGTGG TTCCCTCTTG TCTGTGGTGA 1918 GAAAGGAGTC TTGACCATAG AGTCCTCTCC CAGCCTCTAT CCCATCTTTT TATTTTAATT 1978 TAATCACATT TGCTCTGTAA TATTGCTTGA GGCTGGGGAT CGTGATTTCC CCCCAGTTCT 2038

TTTATTGTTG AGAATAGTTT TCTCTATTCT GGGTTTTCTG TTATTTCAAA TGAATCTGCA 2098 AATTGCTCTT CCCATCTCTA TGAAGAATTG CGTTGGAATT TTGATGGGGA TTGTATTGAA 2158 TCTGTAGATT GCCTTTGGTA AGATGGCCAT TTTTACTATG TTAATCCTGC CAATTCATGA 2218 GCAAGGGAGA TCTTTCTATC TCTGAAATCT ACTTCAGTTT CTTTCTTCAG AGACTTGAAG 2278 TTCTTGTCAT AAAAATCTTT TTGGTTAGAG CCACACCAAG GTATTTTATA TTGTTTGTGA 2338 CTATTGTGAA TGGTGTCATT TCCCTAATTT CCTTCTCAGC CTACTTATCC TTTGAGTAGA 2398 GGAAGGCTTC TGATTTGTTT GGGTTAATTT TATACCCAGC TGCTTTGCTA AAGTTCTTTA 2458 TCAGGTTTAG GTGTTCTCTG GTGGAACTTT TGGGGTCACG TAAGAATACT ATTATATCAT 2518 CTGCAAATAG TGATATTTCA CTTCTTCCTT TCCAATTTCT ATCCCTCTGG GGACTTTTTG 2578 TTGTCTAATT GCTCTGGCTA GGACTTCAAA TTCTATATTG AATAGATAGG GAGAGAGTGG 2638 GCAGCCTTGT CTAGTTCCTG GTTTTCGTGG GATCGCTTCA AATTTCTCTC CATTTAGTTT 2698 GATATTGGCT ACTGGTTTGC TGTATATGGC TTTTACTGTA CTTAGGTATG GGCCTTGAAT 2758 TCCTGATATT TCCAAGACTT TTAACATGAA GGGGTTTTGA AATTTGCCAA ATGCTTTCTC 2818 AGCATCTAAT GAGATGATCA TGTGCCCTCC CCCCACCTTG AGTTTGTTTA TATAGTGGGT 2878 TACATGAAAG GATCATTTCT AATAGTCCAC AAGTCTGCCA AATCTTGCTG ATTGTGACTC 2938 ATTTCCATAG CAGGCTCTAT AACTTCTCTA ACAGATTGCA TTAAACTCTG CTTGGGGAAG 2998 GCATTACCTC TTGGTTGAAG CAATGTTGTA GTTTCTATGC CTGCTGAGTA AATAGCCTCA 3058 AGTCCAAGTA CTTGCCCAGA CTAATGATCA AACGTATCCA GGAGTTCCAT ACCAGAGATG 3118 TACTCTTCTC TCCTTTGAAG TACATTGCTG GAAGAGTAAT TGTGTTTGCT AGAGATACTC 3178 CTTCGAACTG CAAAAGAAAT CTCTTGGCTA AGCATATAAT CAAGCCTCAG GTTTTCTTTT 3238 TATTAAATAG CTGCTTGTAA GAAAGTGGAC ACTAAGCATA TACCTCAAAG GGAGACAGAA 3298 TGACTCTGTG CCTTCACTGA TGGAAGTCTG GGTTACAAAT TACATCAGAA GAACCTATCA 3358 TAGTGAAACA TCTCATTCCC CTGGTATAAT CCCTTCTAGA AATACACTTG TGACTCTGAA 3418 ATGTTATAAT CGTGACAACT AGGCTGTTAC AGATACACCA AGTTAAATTT GATAGAGAAA 3478 CCAGGCTTGG AGCCTCATGT CCATAGGGCA AGAGGAAGAT GCTGAGTGTT TAAGGTTGGT 3538 TTGAGCGAAG AACAATACCT TGTGTCACAA AAATGAAAGG AAAAAAGAAA AAAGGAAAGA 3598 AGGAAAGAAA GAGAGAGAAA GAAAAAGAAA GAAAGAAAAA AAAAAAAAA 3647

INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 5: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR 1602 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : rat ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : DRASIC B) LOCALISATION : 1.. 1602 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 5 : ATG AAA CCT CGC TCC GGA CTG GAG GAG GCC CAG CGG CGA CAG GCC TCA 48 Met Lys Pro Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Gln Arg Arg Gln Ala Ser 1 5 10 15 GAC ATC CGG GTG TTT GCC AGC AGC TGC ACA ATG CAT GGT CTG GGC CAC 96 Asp Ile Arg Val Phe Ala Ser Ser Cys Thr Met His Gly Leu Gly His 20 25 30 ATC TTT GGC CCT GGA GGC CTG ACC CTG CGC CGA GGG CTG TGG GCC ACA 144 Ile Phe Gly Pro Gly Gly Leu Thr Leu Arg Arg Gly Leu Trp Ala Thr 35 40 45 GCT GTG CTC CTG TCG CTG GCG GCC TTC CTC TAC CAG GTG GCT GAG CGG 192 Ala Val Leu Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Tyr Gln Val Ala Glu Arg 50 55 60 GTT CGC TAC TAT GGG GAG TTC CAC CAT AAG ACC ACC CTG GAT GAG CGT 240 Val Arg Tyr Tyr Gly Glu Phe His His Lys Thr Thr Leu Asp Glu Arg 65 70 75 80 GAG AGC CAC CAG CTC ACC TTC CCA GCT GTG ACT CTG TGT AAT ATC AAC 288 Glu Ser His Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Ile Asn 85 90 95 CCA CTG CGC CGC TCA CGC CTC ACA CCC AAT GAC TTG CAC TGG GCT GGA 336 Pro Leu Arg Arg Ser Arg Leu Thr Pro Asn Asp Leu His Trp Ala Gly 100 105 110 ACA GCG CTG CTG GGC CTG GAC CCT GCT GAA CAT GCT GCC TAC CTT CGT 384 Thr Ala Leu Leu Gly Leu Asp Pro Ala Glu His Ala Ala Tyr Leu Arg 115 120 125 GCA CTG GGC CAG CCC CCC GCA CCA CCT GGC TTC ATG CCC AGT CCG ACC 432 Ala Leu Gly Gln Pro Pro Ala Pro Pro Gly Phe Met Pro Ser Pro Thr 130 135 140 TTT GAC ATG GCA CAA CTC TAC GCC AGA GCC GGC CAC TCC CTT GAG GAC 480 Phe Asp Met Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Ala Gly His Ser Leu Glu Asp 145 150 155 160

ATG TTG TTG GAT TGC CGA TAC CGT GGC CAG CCC TGT GGG CCT GAG AAC 528 Met Leu Leu Asp Cys Arg Tyr Arg Gly Gln Pro Cys Gly Pro Glu Asn 165 170 175 TTC ACA GTG ATC TTT ACT CGA ATG GGG CAA TGC TAC ACC TTC AAC TCT 576 Phe Thr Val Ile Phe Thr Arg Met Gly Gln Cys Tyr Thr Phe Asn Ser 180 185 190 GGT GCC CAC GGT GCA GAG CTG CTC ACC ACT CCA AAG GGT GGT GCT GGC 624 Gly Ala His Gly Ala Glu Leu Leu Thr Thr Pro Lys Gly Gly Ala Gly 195 200 205 AAC GGA CTG GAG ATT ATG CTA GAT GTA CAG CAA GAG GAG TAT CTG CCC 672 Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp Val Gln Gln Glu Glu Tyr Leu Pro 210 215 220 ATC TGG AAG GAC ATG GAA GAG ACC CCG TTT GAG GTG GGG ATC CGA GTG 720 Ile Trp Lys Asp Met Glu Glu Thr Pro Phe Glu Val Gly Ile Arg Val 225 230 235 240 CAG ATT CAC AGC CAG GAT GAG CCC CCT GCC ATT GAC CAG CTG GGC TTC 768 Gln Ile His Ser Gln Asp Glu Pro Pro Ala Ile Asp Gln Leu Gly Phe 245 250 255 GGG GCA GCC CCA GGC CAT CAG ACT TTT GTG TCC TGT CAG CAG CAG CAA 816 Gly Ala Ala Pro Gly His Gln Thr Phe Val Ser Cys Gln Gln Gln Gln 260 265 270 CTG AGT TTC CTG CCA CCA CCC TGG GGT GAC TGC AAT ACC GCA TCT TTG 864 Leu Ser Phe Leu Pro Pro Pro Trp Gly Asp Cys Asn Thr Ala Ser Leu 275 280 285 GAT CCC GAC GAC TTT GAT CCA GAG CCC TCT GAT CCC TTG GGT TCC CCC 912 Asp Pro Asp Asp Phe Asp Pro Glu Pro Ser Asp Pro Leu Gly Ser Pro 290 295 300 AGA CCC AGA CCC AGC CCT CCT TAT AGT TTA ATA GGT TGT CGC CTG GCC 960 Arg Pro Arg Pro Ser Pro Pro Tyr Ser Leu Ile Gly Cys Arg Leu Ala 305 310 315 320 TGT GAG TCT CGC TAT GTG GCT CGG AAG TGT GGC TGT CGA ATG ATG CAT 1008 Cys Glu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Lys Cys Gly Cys Arg Met Met His 325 330. 335 ATG CCT GGA AAC TCC CCA GTG TGC AGC CCC CAG CAG TAC AAG GAC TGC 1056 Met Pro Gly Asn Ser Pro Val Cys Ser Pro Gln Gln Tyr Lys Asp Cys 340 345 350 GCC AGC CCA GCT CTG GAC GCT ATG CTG CGA AAG GAC ACG TGT GTC TGC 1104 Ala Ser Pro Ala Leu Asp Ala Met Leu Arg Lys Asp Thr Cys Val Cys 355 360 365 CCC AAC CCG TGC GCT ACT ACA CGC TAT GCC AAG GAG CTC TCC ATG GTG 1152 Pro Asn Pro Cys Ala Thr Thr Arg Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Met Val 370 375 380 CGG ATT CCC AGC CGC GCG TCA GCT CGC TAC CTG GCC CGG AAA TAC AAC 1200 Arg Ile Pro Ser Arg Ala Ser Ala Arg Tyr Leu Ala Arg Lys Tyr Asn 385 390 395 400

CGC AGC GAG TCC TAC ATT ACG GAG AAT GTA CTG GTT CTG GAT ATC TTC 1248 Arg Ser Glu Ser Tyr Ile Thr Glu Asn Val Leu Val Leu Asp Ile Phe 405 410 415 TTT GAG GCC CTC AAC TAT GAA GCG GTG GAA CAA AAG GCG GCC TAT GAA 1296 Phe Glu Ala Leu Asn Tyr Glu Ala Val Glu Gln Lys Ala Ala Tyr Glu 420 425 430 GTG TCG GAG CTG CTG GGA GAC ATT GGG GGA CAG ATG GGA CTG TTT ATT 1344 Val Ser Glu Leu Leu Gly Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile 435 440 445 GGA GCA AGC CTG CTT ACC ATC CTT GAG ATC CTC GAC TAT CTC TGT GAG 1392 Gly Ala Ser Leu Leu Thr Ile Leu Glu Ile Leu Asp Tyr Leu Cys Glu 450 455 460 GTT TTC CAA GAC AGA GTC CTG GGG TAT TTC TGG AAC AGA AGG AGC GCT 1440 Val Phe Gln Asp Arg Val Leu Gly Tyr Phe Trp Asn Arg Arg Ser Ala 465 470 475 480 CAA AAG CGC TCT GGC AAC ACT CTG CTC CAG GAA GAG TTG AAT GGC CAT 1488 Gln Lys Arg Ser Gly Asn Thr Leu Leu Gln Glu Glu Leu Asn Gly His 485 490 495 CGA ACA CAT GTT CCC CAC CTC AGC CTA GGG CCC AGG CCT CCT ACC ACT 1536 Arg Thr His Val Pro His Leu Ser Leu Gly Pro Arg Pro Pro Thr Thr 500 505 510 CCC TGT GCT GTC ACC AAG ACA CTC TCT GCC TCC CAC CGT ACC TGT TAC 1584 Pro Cys Ala Val Thr Lys Thr Leu Ser Ala Ser His Arg Thr Cys Tyr 515 520 525 CTC GTC ACA AGG CTC TAG 1602 Leu Val Thr Arg Leu * 530 533

INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO : 6: i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE : A) LONGUEUR 1948 paires de base B) TYPE : acide nucléique C) NOMBRE DE BRINS : double D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : rat ix) CARACTERISTIQUE A) NOM/CLE : MDEG2 B) LOCALISATION : 16.. 1707 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO : 6 : CCTCGGGCTG AATGA ATG AGC CGG AGC GGC GGA GCC CGG CTG CCC GCG ACC 51 Met Ser Arg Ser Gly Gly Ala Arg Leu Pro Ala Thr 1 5 10 GCG CTC AGC GGC CCG GGA CGC TTC CGT ATG GCC CGC GAG CAG CCG GCG 99 Ala Leu Ser Gly Pro Gly Arg Phe Arg Met Ala Arg Glu Gln Pro Ala 15 20 25 CCC GTG GCG GTG GCG GCA GCT AGG CAG CCC GGA GGA GAC CGG AGC GGC 147 Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Arg Gln Pro Gly Gly Asp Arg Ser Gly 30 35 40 GAT CCG GCG CTG CAG GGG CCA GGG GTC GCC CGC AGG GGG CGG CCG TCC 195 Asp Pro Ala Leu Gln Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Gly Arg Pro Ser 45 50 55 60 CTG AGT CGC ACT AAA TTG CAC GGG CTG CGG CAC ATG TGC GCG GGG CGC 243 Leu Ser Arg Thr Lys Leu His Gly Leu Arg His Met Cys Ala Gly Arg 65 70 75 ACG GCG GCG GGA GGC TCT TTC CAG CGA CGG GCG CTG TGG GTG CTG GCC 291 Thr Ala Ala Gly Gly Ser Phe Gln Arg Arg Ala Leu Trp Val Leu Ala 80 85 90 TTC TGC ACG TCC CTC GGC TTG CTG CTG TCC TGG TCC TCG AAC CGC CTG 339 Phe Cys Thr Ser Leu Gly Leu Leu Leu Ser Trp Ser Ser Asn Arg Leu 95 100 105 CTC TAC TGG CTC AGC TTC CCG TCA CAC ACA CGA GTG CAC CGT GAG TGG 387 Leu Tyr Trp Leu Ser Phe Pro Ser His Thr Arg Val His Arg Glu Trp 110 115 120 AGC CGC CAG CTG CCG TTC CCC GCC GTC ACC GTG TGC AAC AAC AAC CCC 435 Ser Arg Gln Leu Pro Phe Pro Ala Val Thr Val Cys Asn Asn Asn Pro 125 130 135 140 CTG CGC TTC CCG CGC CTC TCC AAG GGG GAC CTC TAC TAC GCG GGC CAC 483 Leu Arg Phe Pro Arg Leu Ser Lys Gly Asp Leu Tyr Tyr Ala Gly His 145 150 155

TGG CTA GGG CTG CTG CTT CCC AAC CGC ACC GCG CGC CCG CTG GTC AGC 531 Trp Leu Gly Leu Leu Leu Pro Asn Arg Thr Ala Arg Pro Leu Val Ser 160 165 170 GAG CTG CTG CGG GGC GAC GAG CCG CGC CGC CAG TGG TTC CGC AAA CTG 579 Glu Leu Leu Arg Gly Asp Glu Pro Arg Arg Gln Trp Phe Arg Lys Leu 175 180 185 GCC GAC TTC CGC CTC TTC CTG CCG CCG CGC CAC TTC GAG GGC ATC AGC 627 Ala Asp Phe Arg Leu Phe Leu Pro Pro Arg His Phe Glu Gly Ile Ser 190 195 200 GCT GCC TTC ATG GAC CGT TTG GGC CAC CAG CTG GAG GAT ATG CTG CTC 675 Ala Ala Phe Met Asp Arg Leu Gly His Gln Leu Glu Asp Met Leu Leu 205 210 215 220 TCC TGC AAG TAC CGG GGC GAG CTC TGT GGC CCG CAC AAC TTC TCC TCA 723 Ser Cys Lys Tyr Arg Gly Glu Leu Cys Gly Pro His Asn Phe Ser Ser 225 230 235 GTG TTT ACA AAA TAC GGG AAG TGT TAC ATG TTT AAC TCA GGC GAG GAT 771 Val Phe Thr Lys Tyr Gly Lys Cys Tyr Met Phe Asn Ser Gly Glu Asp 240 245 250 GGC AAG CCG CTG CTC ACC ACG GTC AAG GGG GGG ACG GGC AAC GGG CTG 819 Gly Lys Pro Leu Leu Thr Thr Val Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu 255 260 265 GAG ATC ATG CTG GAC ATT CAG CAA GAT GAG TAC CTG CCC ATC TGG GGA 867 Glu Ile Met Leu Asp Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Ile Trp Gly 270 275 280 GAG ACA GAG GAA ACA ACG TTT GAA GCA GGA GTG AAG GTT CAG ATC CAC 915 Glu Thr Glu Glu Thr Thr Phe Glu Ala Gly Val Lys Val Gln Ile His 285 290 295 300 AGT CAG TCT GAG CCG CCT TTC ATC CAA GAG CTG GGC TTT GGG GTG GCT 963 Ser Gln Ser Glu Pro Pro Phe Ile Gln Glu Leu Gly Phe Gly Val Ala 305 310 315 CCG GGG TTC CAG ACC TTC GTG GCC ACA CAA GAG CAG AGG CTC ACA TAT 1011 Pro Gly Phe Gln Thr Phe Val Ala Thr Gln Glu Gln Arg Leu Thr Tyr 320 325 330 CTG CCC CCA CCA TGG GGG GAG TGC CGG TCC TCA GAG ATG GGA CTC GAC 1059 Leu Pro Pro Pro Trp Gly Glu Cys Arg Ser Ser Glu Met Gly Leu Asp 335 340 345 TTC TTT CCT GTT TAC AGC ATC ACA GCC TGT CGG ATT GAC TGT GAG ACC 1107 Phe Phe Pro Val Tyr Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr 350 355 360 CGC TAC ATC GTG GAG AAC TGT AAC TGC CGC ATG GTC CAC ATG CCA GGG 1155 Arg Tyr Ile Val Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly 365 370 375 380

GAC GCC CCT TTC TGC ACC CCT GAG CAG CAC AAG GAG TGT GCA GAG CCT 1203 Asp Ala Pro Phe Cys Thr Pro Glu Gln His Lys Glu Cys Ala Glu Pro 385 390 395 GCC CTC GGT CTA CTG GCA GAA AAG GAC AGC AAT TAC TGT CTC TGC AGG 1251 Ala Leu Gly Leu Leu Ala Glu Lys Asp Ser Asn Tyr Cys Leu Cys Arg 400 405 410 ACA CCC TGC AAC CTG ACA CGC TAC AAC AAA GAG CTC TCC ATG GTG AAG 1299 Thr Pro Cys Asn Leu Thr Arg Tyr Asn Lys Glu Leu Ser Met Val Lys 415 420 425 ATC CCC AGC AAG ACG TCA GCC AAG TAC TTA GAG AAG AAA TTT AAC AAA 1347 Ile Pro Ser Lys Thr Ser Ala Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Phe Asn Lys 430 435 440 TCG GAA AAA TAT ATC TCA GAG AAC ATT CTT GTT CTG GAC ATA TTT TTT 1395 Ser Glu Lys Tyr Ile Ser Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe 445 450 455 460 GAG GCG CTC AAT TAC GAA ACA ATT GAA CAG AAG AAG GCG TAT GAA GTT 1443 Glu Ala Leu Asn Tyr Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Val 465 470 475 GCT GCC TTA CTT GGT GAC ATC GGT GGT CAG ATG GGA CTG TTC ATT GGT 1491 Ala Ala Leu Leu Gly Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly 480 485 490 GCT AGT CTC CTC ACA ATA CTA GAG CTC TTT GAT TAT ATT TAT GAG CTG 1539 Ala Ser Leu Leu Thr Ile Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Tyr Glu Leu 495 500 505 ATC AAA GAG AAG CTA TTA GAC CTG CTT GGC AAA GAA GAA GAG GAA GGG 1587 Ile Lys Glu Lys Leu Leu Asp Leu Leu Gly Lys Glu Glu Glu Glu Gly 510 515 520 AGC CAC GAT GAG AAC ATG AGC ACC TGT GAC ACA ATG CCA AAC CAC TCT 1635 Ser His Asp Glu Asn Met Ser Thr Cys Asp Thr Met Pro Asn His Ser 525 530 535 540 GAA ACC ATC AGC CAC ACT GTG AAC GTG CCC CTG CAG ACA GCT TTG GGC 1683 Glu Thr Ile Ser His Thr Val Asn Val Pro Leu Gln Thr Ala Leu Gly 545 550. 555 ACC CTG GAG GAG ATT GCC TGC TGA CACCTCTCAG GCAACGCAGC ACCTCCAAAC 1737 Thr Leu Glu Glu Ile Ala Cys * 560 563 AGACCTTAAA GGCCCAAGAC CTAGGACAGG AGACAGCAAG CGCAGGTGGG ATCGCCCCTG 1797 ACGACTGAAA GAAGCAGAGC CCCCCATATG CACACATTGC GAACTTCTGC CAAACCTCAC 1857 CTGGCCACAT CTGACATGAA CCGTCCCGGG CCCTGCGTCA TGTCCCTCGC AGGACCGATG 1917 AGTCGCACTC CGGAACTGTC CAAGAACTAA C 1948