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CN102994479A | 2013-03-27 | |||
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CAI, HONGYING ET AL., WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 27, no. 12, 3 May 2011 (2011-05-03), pages 2813 - 2819
DATABASE GENBANK REGISTRY 25 September 2013 (2013-09-25), LIAO, H. ET AL., accession no. GW24296.1
DATABASE GENBANK REGISTRY 22 July 2013 (2013-07-22), LIU, G. ET AL., accession no. PS31069.1
北京汇泽知识产权代理有限公司 (CN)
杈利要求书 1、 一种甘露聚糖酶, 其特征在于: 1) 其氨基酸序列为 SEQIDNO: 1的甘露聚糖酶; 2) 其氨基酸序列与 SEQIDNO: 1同源性高于 75%的甘露聚糖酶; 3) 在 1) 或 2) 中的氨基酸上发生取代、 缺失或添加一个或数个氨基 酸得到的, 具有甘露聚糖酶活性的酶。 2、编码权利要求 1所述的甘露聚糖酶的核酸,核苷酸序列为 SEQ ID NO: 2。 3、 一种甘露聚糖酶, 是权利要求 1所述的酶去掉信号肽后形成的, 其 氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3。 4、编码权利要求 3所述的甘露聚糖酶的核酸,核苷酸序列为 SEQ ID NO: 4。 5、 一种重组表达载体, 其包含编码权利要求 4所述的甘露聚糖酶的核 苷酸。 6、 如权利要求 5所述的重组表达载体, 其特征在于, 所述的核苷酸的 序列为 SEQ ID NO: 2。 7、 一种表达宿主细胞, 所述的宿主细胞其携带有权利要求 5所述的重 组表达载体。 8、 权利要求 7所述的宿主细胞为毕赤酵母 PichiaPastoris 。 9、 权利要求 7所述的宿主细胞为里氏木霉 Trichoderma reesef)。 10、 权利要求 3所述的甘露聚糖酶在制备饲料添加剂中的应用。 |
技术领域 本发明属于微生物工程生物技术领域, 具体涉及一种新型的甘露聚糖 酶, 及用于表达该酶的重组表达工程菌。 背景技术 甘露聚糖酶包括外切酶、 内切酶和甘露糖苷酶, 三种酶的协同作用才 能将甘露聚糖彻底降解。 其中, β -l, 4-D-甘露聚糖酶 (EC 3.2.1.78 ) 又称 为甘露聚糖酶, 属于内切酶; 它能水解含有 β -l, 4-D-甘露糖苷键, 生成甘 露寡糖或甘露多糖, 属于半纤维素酶类。 甘露聚糖是以 β -l, 4-D-吡喃甘露 糖苷键连接的线状多糖, 如果主链某些残基被葡萄糖取代, 或半乳糖通过 α -1, 6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分支, 则称为异甘露聚糖, 主要有半 乳糖甘露聚糖、 葡萄甘露聚糖、 半乳葡萄甘露聚糖 (齐军茹等, 2002, 中 国食品添加剂; 许牡丹等, 2006, 动物医学进展)。
甘露聚糖酶在饲料、 食品、 造纸、 石油开采及生物研究技术等多方面 具有广泛的应用前景; 因此, 甘露聚糖酶的研究和开发越来越多。 甘露聚 糖是仅次于木聚糖的第二大的半纤维素成分。 饲料的主要原料如豆粕、 小 麦和麸皮等的细胞壁主要成分是甘露聚糖; 一方面它是非淀粉多糖的抗营 养因子; 另一方面, 低聚甘露糖具有的保健功能 (陈小兵等, 2005, 生物 工程杂志; Chesson A, etc., 1987, In Recentt Advance in Animal Nutrition )。 因 此, 甘露聚糖酶业已是饲料酶制剂使用量最大的单 酶之一。
产甘露聚糖酶的微生物很多, 包括芽孢杆菌和丝状真菌等。 而工业化 生产甘露聚糖酶的菌株主要来自诱变选育的高 产菌株或高效表达的基因工 程菌, 如通过诱变选育芽抱杆菌 AM-001的甘露聚糖酶的酶活力由 36 U/ml 提高到了 430U/ml耐。美国 ChamGen公司选育的迟缓芽孢杆菌产甘露聚糖 酶活力达到了 400U/ml。但是, 随着分子生物学技术的发展, 利用工程菌异 源高效表达生产甘露聚糖酶是当前的主要手段 。 利用毕赤酵母表达生产来 自 ^^7 的甘露聚糖酶其酶活达到约 40000U/ml; 同样, 毕赤酵母 表达生产来自曲霉的甘露聚糖酶其酶活达到约 343U/ml (李松瑜等, 2009, 生物技术通讯)。
目前已商业化的甘露聚糖酶主要来自芽孢杆菌 、 木霉和青霉。 芽孢杆 菌所产甘露聚糖酶属于中性甘露聚糖酶, 最适 pH为 6.5, 不耐胃酸和胃蛋白 酶。 木霉和青霉所产甘露聚糖酶虽具有耐酸性特点 , 但是不耐受胃蛋白酶。 而甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点决定 了饲料中使用的甘露聚糖酶 必须是酸性的。
因此, 为了更好的提高单胃动物对含甘露聚糖饲料的 利用率, 就需要 获得能够在低 pH条件下具有高活性的甘露聚糖酶。 发明内容 本发明的目的是提供一种新型甘露聚糖酶及其 重组表达工程菌。 本发 明通过将来源于斜卧青霉 PeniciUum decumbens 的甘露聚糖酶基因分别 转化入里氏木霉和毕赤酵母中, 构建重组表达工程菌株。 本发明的甘露聚 糖酶可广泛用作饲料添加剂, 提高养殖动物的饲料利用率。
本发明一个方面提供一种新型的甘露聚糖酶, 其特征在于:
1 ) 其氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1的甘露聚糖酶;
2 ) 其氨基酸序列与 SEQ ID NO: 1同源性高于 75%的甘露聚糖酶;
3 ) 在 1 ) 或 2 ) 中的氨基酸上发生取代、 缺失或添加一个或数个氨基 酸得到的, 具有甘露聚糖酶活性的酶。
本发明另一方面提供了编码上述甘露聚糖酶的 基因, 其一种核苷酸序 列为 SEQ ID NO: 2。
本发明的甘露聚糖酶, 去掉信号肽后的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3。 其核苷酸的序列为 SEQ ID NO: 4。
本发明提供了一种表达载体, 其包含上述编码基酸序列为 SEQ ID NO: 3的甘露聚糖酶的核苷酸。
本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞, 其携带有表达上述去掉信 号肽的甘露聚糖酶基因的表达载体。
上述表达宿主细胞为毕赤酵母 Pichia pastoris ) . 上述表达宿主细胞为里氏木霉 ( Trichoderma聽 ei)。
本发明的甘露聚糖酶用于制备饲料添加剂。
本发明提供了一个新型甘露聚糖酶基因, 并分别构建了重组表达该基 因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。 所述毕赤酵母工程菌和里氏木霉 工程菌所产甘露聚糖酶的最适作用 pH为 4.5, 最适作用温度为 60°C。 本发 明的甘露聚糖酶耐酸, 耐高温, 可广泛用作饲料添加剂, 能有效提高饲料 的利用率, 从而减少养殖中饲料的使用量, 节约粮食资源和养殖成本, 增 加生产效益。 附图说明 图 1 : 毕赤酵母工程菌发酵上清液 SDS-PAGE电泳检测分析图, 其中 箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶。
图 2 : 里氏木霉工程菌发酵上清液 SDS-PAGE电泳检测分析图, 箭头 所指处即为重组表达的甘露聚糖酶。
图 3 : 重组表达的甘露聚糖酶最适作用 pH分析图。
图 4 : 重组表达的甘露聚糖酶最适作用温度分析图。 具体实施方式 以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容 , 本领域相关的技术人 员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。 但是, 本发明的保护和权利 要求范围不限于所提供的案例。
实施例 1斜卧青霉甘露聚糖酶基因的克隆
1.1 总 DNA的提取
将斜卧青霉 i ecw bera )过夜培养,取适量菌体置于离心管中, 13000 rpm离心 5 min, 弃上清; 加入 400μ1抽提缓冲液 (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1 %SDS); 然后加 lOOmg石英砂或玻璃珠, 在珠打仪 剧烈振荡 2min左右; 65 °C水浴 20min后, 加入 200μ1 10M NH 4 AC , 冰浴 lOmin; 13000rpm离心 10min, 取上清; 加入 2倍体积的无水乙醇, -20 °C 放置 30min; 13000 rpm离心 lOmin, 弃上清; 用 70%乙醇洗涤 2次; 晾干, 加入水溶解, 于 -20°C保存。
1.2 总 RNA的制备
OMEGA公司的 E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的 mRNA, 其 制备过程参照试剂盒的操作手册。
1.3基因克隆
以 1.1 中提取的基因组总 DNA 为模板, 分别利用引物对 (ATGTTGTACT CATCGGCG和 TCAGATCGCAGCGACATG ) 进行 PCR 扩增。 PCR扩增条件为 95 °C 4min; 94 °C 40S ; 58 °C 35S , 72 °C 1.2min 25 个循环; 72°C 7min。 利用凝胶回收试剂盒回收 PCR扩增产物。
以 1.2中提取的基因组总 RNA为模板,扩增其 cDNA序列。采用 TaKaRa 公司的 PrimeScript RT-PCR Kit扩增 cDNA基因序列。
1.4测序分析
将 1.2中回收的扩增产物分别连接到 pMD18 T-载体, 相应的克隆载体 分别命名为 pMDT-Manl和 pMDT-Man2; 最后把阳性克隆送至北京华大基 因研究中心进行测序分析。测序经比对发现 DNA序列和 cDNA序列间完全 同源, 这说明该基因序列没有内含子序列。 该甘露聚糖酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1, 其编码核苷酸序列为 SEQ ID NO: 2。
经 NCBI的 BLAST比对分析显示, SEQ ID NO: 1与 Neosartorya fischeri 菌的甘露聚糖酶基因(序列号: XM— 001262743.1 )核苷酸序列同源性最高, 同源性为 73%;而蛋白序列分析显示,该酶属于糖水解酶 2家族, SEQ ID NO: 1与 Penicimum chrysogenum菌的甘露聚糖酶序列同源性最高, 二者的 同源性为 72%。
经 SignalP4.0 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ) 预测分析显示, 前 16aa残基为信号肽序列, 去掉信号肽的甘露聚糖酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3, 其编码基因序列为 SEQ ID NO: 4。
实施例 2表达序列为 SEQ ID NO: 3甘露聚糖酶基因的工程菌的构建
2.1 毕赤酵母工程菌的构建
以 质 粒 pT-Man2 为 模 板 , 利 用 引 物 ( agtgaattcCAGGTGGCGGAATATGGCC 和 agtgcggccgcTCAGATCGCAGCGACATG进行 PCR扩增, PCR扩增条件是 95 °C 4min; 94 °C 30S; 55 °C 40S, 72°C 1.2min 30个循环; 72°C 7min。 扩增 产物凝胶回收后,先进行 coRI和NotI双酶切。同样,对表达质粒 pPIC9K 也进行 coRI和 Notl双酶切。 用 T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表 达载体 4°C连接过夜。 最后, 把连接产物导入大肠杆菌 BL21。 相应的阳性 克隆表达质粒命名为 pPIC-Man,测序结果表明插入了序列为 SEQIDNO: 4 的片段。
表达质粒 pPIC-Man用 Sg/II酶切电泳鉴定后, 经乙醇沉淀浓縮, 测定 DNA浓度, 以 3μ § /μΙ^浓度稀释质粒片段保存备用。 制备毕赤酵母 GS115 电转化感受态细胞,最后重悬于 1 mL预冷的电泳缓冲液中 (;含 ImM MgCl 2 , lOmMHEPES, 250mM蔗糖,pH7.8)。 在 80μΙ^感受态细胞中加入 5μΙ^线性 化重组质粒; 电转化(条件为 1500V、 200 Ω、 25 F) ; 最后涂布于 MM平 板 (MM培养基组分: 1.34%YNB, 4X10_ 5 %生物素, 0.5%甲醇), 挑选重 组菌株。 所获得工程菌株命名为 Pichia pastoris CSD-2。
2.2里氏木霉工程菌的构建
(1) 表达载体构建
以质粒 pT-Man2为模板,利用引物(agtaatgccATGTTGTACTCATCGGC G 和 agtggtaccTCAGATCGCAGCGACATG)进行 PCR扩增, PCR扩增条件是 95 °C 4min; 94 °C 30S; 55 °C 40S, 72°C 1.2min 30个循环; 72°C 7min。 扩增 产物凝胶回收后, 先进行 Ncol和 Kpnl双酶切。 同样, 对木霉表达质粒 pKDN-EG也进行 Nco I和 Kpn I双酶切。用 Τ4连接酶把双酶切产物即克隆 基因和表达载体 4°C连接过夜。 最后, 把连接产物导入大肠杆菌 BL21。 相 应的阳性克隆表达质粒命名为 pKDN-Man。
(2) 原生质体制备
接种里氏木霉菌丝于 PDA平板上生长 4 天; 切取直径约 3cm的菌落 置于约 60ml YEG (0.5%酵母粉、 1%葡萄糖) 的液体培养基中, 30°C, 200 rpm振荡培养过夜; 多层纱布过滤收集菌丝; 将菌丝置于盛有 10-20 ml裂 解酶液(Sigma L1412)酶解 2-3小时; 取出酶解液, 加入 0.7 M NaCl溶液, 轻轻摇晃, 倒于三层灭菌擦镜纸过滤, 收集滤液, 3000 rpm, 离心 lOmin; 弃上清, 力 B 10-20 ml STC液 (20%蔗糖, 50mM Tris-Cl, 50mM CaCl 2 ) 悬 浮, 然后 3000 rpm, 离心 10 min; 加适量 STC悬浮分装 (150 μΐ/管, 10 8 个 /ml)。
( 3 ) 转化与验证
取 2 g pKDN-Man DNA加入到 150μ1原生质体中, 接着加入 500μ1
25%PEG轻轻混匀, 室温静置 25 min; 然后分 2-3次再加 lml 25%PEG, 轻 轻混匀,室温静置 25min,把原生质体加到 50 ml左右熔化后冷却至 45-55 °C 的上层半固体培养基(0.1%MgSO 4 , 1%KH 2 P04, 0.6%(NH 4 ) 2 SO 4 , 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇 , 0.35%琼脂糖), 轻轻混匀后倒入含 lOO g/ml潮霉素下层基础 培养基平板 (2%葡萄糖, 0.5%(NH4) 2 SO 4 , 1.5%KH 2 P0 4 , 0.06%MgSO 4 , 0.06%CaCl 2 , 1.5%琼脂), 28 °C黑暗培养数天至转化子长出。
按照实施例 1中的方法提取转化子基因组 DNA为模板,利用引物扩增 目的验证转化子。 利用实施例 2中引物进行 PCR扩增目的基因。 PCR扩增 条件为 95 °C 4min; 94 °C 30S; 55 °C 40S , 72°C lmin 30个循环; 72°C 7min。 利用凝胶回收试剂盒回收 PCR扩增产物并进行测序分析, 即经过上述两个 PCR 反应选育和验证阳性转化子。 所获得的工程菌命名为 Trichoderma reesei CSD-3。
实施例 3发酵和酶学性质测定
3.1毕赤酵母工程菌摇瓶发酵
将毕赤酵母工程菌 CSD-2接种于 5ml BMGY ( l %酵母提取物, 2 %蛋 白陈, 1. 34 % YNB, 4xl0_ 5 %生物素, 1%甘油) , 30°C 培养过夜, 离心收 集菌体, 把菌体加入 50ml BMMY诱导培养基 (1 %酵母提取物, 2 %蛋白 陈, 1.34 %YNB, 4xl0_ 5 %生物素, 0.5 %甲醇), 每 12小时补加 50μΙ^甲醇, 诱导培养 5天,取上清液(命名为 PP-Man)进行 SDS-PAGE电泳检测分析, 结果如图 1所示。 图 1 中箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶, 说明本 发明的序列为 SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶在构建的毕赤酵母工程菌 CSD-2 中得到表达。
3.2里氏木霉工程菌摇瓶发酵
将里氏木霉工程菌 CSD-3接种于 MM发酵培养基(1.5%葡萄糖, 1.7% 乳糖, 2.5%玉米浆, 0.44%(NH 4 ) 2 SO 4 , 0.09%MgSO 4 , 2%KH 2 P0 4 , 0.04%CaCl 2 , 0.018%吐温 -80, 0.018%微量元素, 0.018%聚丙二醇 -2000 ), 28°C培养 48 小时, 然后 25°C诱导培养 48 小时, 取上清液 (命名为 TR-Man ) 进行 SDS-PAGE电泳检测分析, 结果如图 2所示。 图 2中箭头所指处即为重组 表达的甘露聚糖酶, 说明本发明的甘露聚糖酶在构建的里氏木霉工 程菌
CSD-3中得到表达。
3.3酶活测定
本发明还提供了一种甘露聚糖酶的测定方法, 该方法包括:
以 0.6%槐豆胶甘露聚糖 (Sigma公司, Batch#125K0091 ) 为底物, 以 0.1M醋酸-醋酸钠 (pH5.5 ) 为缓冲液, 将甘露聚糖底物 37°C平衡 20min, 将待测酶液 37°C平衡 10min。取 4支试管, 分别加入酶液 2ml, 其中 3支作 为测定管, 分别加入 2ml底物溶液, 另一支作为空白管, 加入 5ml DNS溶 液, 在 37°C±0.5°C水浴 30分钟。 然后三支测定管分别加入 5ml DNS溶液, 空白管加入 2ml底物溶液, 在沸水浴中反应 5分钟, 冷却后定容至 25ml。 以空白管调零, 在分光光度计 540nn处测吸光度。
甘露聚糖酶酶活定义: 在 37°C、 pH5.5 的条件下, 每分钟水解底物产 生 Ιμιηοΐ甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖 活性单位。 蛋白含量测定参 照 Bradford法。
按照该方法进行酶活测定, 上述毕赤酵母工程菌 CSD-2的摇瓶发酵上 清液 PP-Man的酶活为 260U/mL, 上述里氏木霉工程菌 CSD-3的摇瓶发酵 上清液 TR-Man的酶活为 626U/mL, 说明本发明构建的两种工程菌都能高 效表达甘露聚糖酶。
下面就对本发明重组表达的序列为 SEQ ID NO:3的甘露聚糖酶的理化 性质进行描述。
3.3酶学性质分析
( 1 ) 最适 pH分析
用 pH值分别为 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0 和 7.5 的缓冲液进行稀释测定, 在温度 55 °C条件下测定酶活, 以最高酶活 为 100%,计算相对酶活,做 pH-相对酶活曲线(图 3 )。如图 3所示: PP-Man 和 TR-Man的 pH曲线基本一致, 它们的最适 pH为 4.0。 其中 PP-Man在 pH2.8-5.3的范围内,能保持 60%以上的酶活;而 TR-Man在 pH2.7-5.8的范 围内, 能保持 60%以上的酶活。
(2) 最适温度分析
分别在 30°C、 35°C、 40°C、 45 °C、 50°C、 55°C、 60°C、 65°C、 70 °C , pH4.0 的条件下测定酶活, 以最高酶活为 100%, 计算相对酶活, 做温度-相对酶 活曲线(图 4)。 如图 4所示: PP-Man和 TR-Man的温度曲线基本一致, 它 们的最适温度为 60°C, 且在 30°C-68°C范围内能保持 60%以上的酶活。
上述结果表明, 本发明构建的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程 菌重组 表达的甘露聚糖酶的最适作用 pH为 4.0, 最适作用温度为 60°C, 耐酸, 耐 实施例四低能日粮中添加本发明甘露聚糖酶对 肉鸡生产性能影响 本实验在肉鸡商品日粮基础上降低 150kcal/kg 的代谢能, 然后在日粮 中添加里氏木霉工程菌重组表达的甘露聚糖酶 (上述发酵上清液的冻干 粉)。 通过对肉鸡生产性能的评价, 探讨甘露聚糖酶对低能日粮能量利用率 的改善幅度。
试验选用 432只 1 日龄罗斯 308肉用公雏, 分为 6个处理组, 每个处 理设 4个重复, 每个重复 18只肉公鸡, 采用 3层笼养, 饲养在人工控温的 肉鸡舍。
实验分为 3组, 饲喂 21天。 正对照组: 正常商品日粮处理组; 负对照 组: 在正对照日粮基础上降低 150kcal/kg代谢能; 试验组: 在负对照日粮 基础上添加 80-120克 /吨本发明的甘露聚糖酶(400000U/g)。 正负对照组日 粮组成如下表所示。
基础日粮组成及营养水平
原料名称 510日粮 (1〜21 日龄)
正对照 负对照
玉米 56.50 50.33 玉米酒精糟 3.50 3.00
小麦 4.00 4.00 麸皮 ― 2.85 豆粕 21.50 20.50 棉粕 2.00 2.00 花生粕 5.00 5.00
玉米蛋白粉 2.00 1.45
猪油 1.00 ―
预混料 3.90 3.80
营养水平
粗蛋白 20.68 20.85
ME(kcal/kg) 2,670 2,773
钙 0.89 0.88 有效磷 0.36 0.39
总赖氨酸 0.93 0.97
实验结果如下:
(1)与正对照组和负对照组相比,试验组 7日龄个体重分别提高 2.6% (P=0.22)、 2.0% (P=0.30); 日增重比正对照组和负对照组分别高 3.4% (P=0.22)、 2.7% (P=0.33); 料重比在负对照日粮基础上降低了 3.1% (P=0.23), 育肥指数在负对照日粮基础上提高 5.9% (P=0.19), 并与正对 照组育肥指数一致。
(2) 与正对照组和负对照组相比, 试验组 14 日龄个体重在负对照组 基础上提高 2.5% (P=0.14), 8〜14d 日增重分别比正对照和负对照组提高 3.6% (P=0.12)、 4.2% (P=0.07); 育肥指数在负对照日粮基础上提高 5.7% (P=0.21), 与正对照组育肥指数基本一致。
(3) 试验组 21 日龄个体重、 日增重、 育肥指数在负对照组基础上分 别提高 4.4% (P<0.05)、 6.5% (P<0.05)、 8.2% (P<0.05)。
实验结果显示, 在减少日粮能量值的条件下, 通过在日粮中添加甘露 聚糖酶, 仍能提高 1〜21 日龄期肉鸡的个体重、 日增重和育肥指数, 降低 料重比。 说明本发明的甘露聚糖酶能有效提高饲料的利 用率, 从而减少养 殖中饲料的使用量, 节约粮食资源和养殖成本, 增加生产效益。
Next Patent: MULTIMEDIA PLAYING METHOD, DEVICE AND TERMINAL