Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Prostatakarzinom (syn. : Prostatakrebs) unter Ausschluss von Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität und deren diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für solche Prostata - Erkrankungen mittels dieser MarkerSequenzen . Ferner betrifft die Erfindung eine diagnostische Vorrichtung

enthaltend solche Markersequenzen für Prostatakarzinom, insbesondere ein Proteinbiochip und dessen Verwendung. Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle

Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der

Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als

Screeninginstrumente etabliert.

Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem

einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von

Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere

Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine

Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L . , Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,

Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using

topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A.,

Kreut zberger , J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003) Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,

C. M., Li, S., Jacotot, L . , Bertin, N . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute,

J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,

Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,

D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome ersion 1.1:

experimental verification of the genome annotation and

resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet , 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods

Enzymol , 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund

differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-

Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G.

(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Gut jähr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte

Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten

Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische

Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.

Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus

Expressionsbibliotheken konnten darüber hinaus im

Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human

proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654- 2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening.

Analytical Biochemistry, 270, 103-111) . Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind

insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312. Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of produetion parameters, Proteomics, 3, 254-264) . Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis indikationsspezifische diagnostische Vorrichtungen, wie einen Proteinbiochip, bereitzustellen .

Zu den Laborparametern für die Diagnose des Prostatakarzinom gehören die saure Phosphatase (SP) und das prostataspezifische Antigen (PSA) . Vor allem das PSA hat derzeit einen hohen

Stellenwert in der Diagnostik. Es ist spezifisch für die

Prostata, allerdings nicht für ein Tumorleiden, sondern kann auch bei Entzündungen, benigner Prostatahyperplasie, einem Harnverhalt oder ohne ersichtlichen Grund erhöht sein. Ein Wert über 4 ng/ml gilt bereits als abklärungsbedürftig.

W02010 / 000874 der Anmelderin beschreibt bereits die Diagnose von Prostatakarzinom und Prostataent Zündungen mittels einem Proteinbiochip und stellt bestimmte diagnostische

MarkerSequenzen zur Verfügung.

Nachteilig ist jedoch, dass diese Marker ebenfalls für die Diagnose von Prostataent zündung geeignet sind, so dass mit diesen im Stand der Technik bekannten Markersequenzen keine Diskriminierung innerhalb der Patientengruppe der

Prostatakrebspatienten möglich ist. Ferner ist im Stand der Technik nachteilig, dass aufgrund anderen Indikationen, wie Prostataent Zündungen oder Diabetes, Falsch-positive

MarkerSequenzen identifiziert werden können.

WO 2009/080017 offenbart Markersequenzen für neurodenenerative Erkrankungen und deren Verwendung. Die in WO 2009/080017 offenbarten Sequenzen wurden entsprechend durch ein Verfahren ohne Verwendung von Proben von Prostatakrebspatienten

erhalten . US 2004/259086 betrifft Zusammensetzungen, Kits und Verfahren zur Detektion, Charakterisierung, Prävention und Behandlung von Prostatakrebs beim Menschen. Dabei wurden eine Reihe von Markersequenzen, deren Expressionslevels mit Prostatakrebs korrelieren, verwendet. US 2004/259086 offenbart aber keine Markersequenzen, zur Diagnose von Prostatakarzinom unter Ausschluss von Prostataentzündungserkrankungen, Diabetes, Polymorbidität . Die Markersequenzen in US 2004/259086 wurden durch Subtraktion von cDNA Libraries - hergestellt aus der mRNA von Patienten mit benigner Prostatahyperplasia und der cDNA hergestellt aus der mRNA von Patienten mit Prostatakrebs - erhalten ([0339] ff. in US 2004/259086) . Eine weitere

Validierung erfolgte nicht. Diese Markersequenzen sind somit nicht für eine Identifizierung von Patienten Subgruppen innerhalb der Gruppe der Prostatakrebspatienten geeignet.

Die DNA-Probenarrays HG-U95, HG-U133 und HG-U133 (Affymetrix) offenbaren bereits die in der vorliegenden Anmeldung

verwendeten Sequenzen SEQ ID No . 1 und 247. Die DNA- Probenarrays HG-U95, HG-U133 und HG-U133 wurden jedoch nicht für spezifische diagnostische Verwendungen validiert.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung zur Behandlung von Prostatakarzinom, wobei

insbesondere eine Diskriminierung bzw. Ausschluss einer

Prostataent zündung und / oder Diabeteserkrankung erfolgt.

Die Bereitstellung von spezifischen MarkerSequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit

Prostatakarzinom, insbesondere mittels eines Proteinbiochips.

Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von

MarkerSequenzen zur Diagnose von Prostatakarzinom, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils eine Teilsequenz oder Fragment davon

(nachstehend: erfindungsgemäße Markersequenzen) an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird. Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen konnten mittels differentiellem Screenen von Proben und zwar gesunder

Probanden mit Patientenproben mit Prostatakarzinom auf einem Proteinbiochip identifiziert werden. Zur Abgrenzung und

Diskriminierung von Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Diabetes werden die erfindungsgemäßen Markersequenzen mit Patientenproben von Prostataentzündungserkrankungen (z.B. alle Formen der Prostata-Hyperplasie, Prostatitis) oder Diabetes auf einem Proteinbiochip gegengeprüft. Dabei könne ein oder mehrere verschieden Prostataentzündungserkrankungen bzw.

Formen von Diabetes ausgeschlossen werden. Lediglich solche erfindungsgemäßen MarkerSequenzen bleiben als MarkerSequenzen für Prostatakarzinom berücksichtigt, die nicht zugleich ebenfalls als Markersequenzen für

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes identifiziert wurden .

Dieses Vorgehen erlaubt ebenfalls vorteilhaft den Ausschluss einer Komorbidität bzw. Polymorbidität , z.B. bei vorliegender Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes. Andererseits werden im Zuge dieses Vorgehens Falsch-positive

MarkerSequenzen ausgeschlossen.

Hierbei konnte erstmals mittels Proteinbiochips (siehe

Beispiele) diese erfindungsgemäßen Markersequenzen sensitiv identifiziert werden. Damit stellt die vorliegende Erfindung erstmals

MarkerSequenzen zur Verfügung, mit der eine spezielle

Patientengruppe innerhalb der Gruppe der Prostatakrebs

Patienten bestimmt werden kann (nachfolgend „Subgruppe" ) . Mit diesen Markersequenzen kann selektiv die Subgruppe - d.h. die Patienten innerhalb der Gruppe der Patienten mit

Prostatakrebs, bei denen keine Diabetes und / oder

Prostataentzündungserkrankung vorliegt - identifiziert

(diagnostiziert) werden. Im Rahmen der individualisierten Medizin können damit Patienten Subgruppen innerhalb der Gruppe der Prostatakrebs Patienten gefunden und die geeignete Behandlung/Therapie für diese Subgruppe ausgewählt werden, während Patienten mit Prostatakrebs, die nicht dieser

Subgruppe angehören von ungeeigneten Therapien ausgeschlossen werden . Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine Verwendung der

MarkerSequenzen zur Identifizierung einer Subgruppe von

Patienten mit Prostatakrebs, wobei die Subgruppe keine

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder kein Diabestes hat, und wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247-452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils eine Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu

untersuchenden Patienten bestimmt wird

Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung der MarkerSequenzen zur Diagnose von Prostatakarzinom unter

Ausschluss von Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder Polymorbidität , wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247- 452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils eine Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird und wobei die

Markersequenz ( en ) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips, aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs , b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels

Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes. Die zur Validierung verwendeten Proben stammen dabei von

Patienten, die eine oder mehrere

Prostataentzündungserkrankungen und / oder Diabetes haben, aber kein Prostatakrebs. Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen MarkerSequenzen zur Diagnose von

Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität wobei 2 oder 3, vorzugsweise 4 oder 5,

besonders bevorzugt 6, 7 oder 8 oder mehr verschiedene

Markersequenzen, beispielsweise 10 bis 20 oder 30 oder mehr verschiedene Markersequenzen an oder von einem zu

untersuchenden Patienten bestimmt werden.

Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von

Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität , wobei mindestens eine der Markersequenzen ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID No . 247, SEQ ID No . 250, SEQ ID No. 290 oder ein durch SEQ ID No . 247, SEQ ID No . 250, SEQ ID No . 290 kodiertes Protein oder einer Teilsequenz oder eines Fragments von SEQ ID No . 247, SEQ ID No . 250, SEQ ID No . 290. Weiterhin bevorzugt sind daher die entsprechenden

MarkerSequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No . 1, SEQ ID No. 4 und SEQ ID No . 44. oder ein durch SEQ ID No . 1, SEQ ID No . 4, SEQ ID No . 44 kodiertes Protein oder einer Teilsequenz oder eines Fragments von SEQ ID No . 1, SEQ ID No . 4, SEQ ID No. 44.

Weiterhin bevorzugt sind die erfindunsggemäßen Markersequenzen SEQ ID No. 249, SEQ ID No . 255, SEQ ID No . 271, SEQ ID No .

301, SEQ ID No . 341, wobei mindestens eine der MarkerSequenzen ausgewählt ist aus der Gruppe SEQ ID No . 249, SEQ ID No . 255, SEQ ID No. 271, SEQ ID No . 301, SEQ ID No . 341 oder ein durch SEQ ID No. 249, SEQ ID No . 255, SEQ ID No . 271, SEQ ID No . 301, SEQ ID No . 341 kodiertes Protein oder einer Teilsequenz oder eines Fragments von SEQ ID No . SEQ ID No . 249, SEQ ID No . 255, SEQ ID No . 271, SEQ ID No . 301, SEQ ID No.341. Weiterhin bevorzugt sind daher die entsprechenden Markersequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No . 3, SEQ ID No . 9, SEQ ID No. 25, SEQ ID No . 55, SEQ ID No . 95 oder ein durch SEQ ID No . 3, SEQ ID No. 9, SEQ ID No . 25, SEQ ID No . 55, SEQ ID No . 95 kodiertes Protein oder einer Teilsequenz oder eines Fragments von SEQ ID No . 3, SEQ ID No . 9, SEQ ID No . 25, SEQ ID No . 55, SEQ ID No. 95. Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von

Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität , wobei mindestens eine Markersequenz eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe Neuro-onkologisches

ventrales-Antigen 2 (NOVA2), Syntaxin 18 (STX18), Hitzeschock (Heatshock) 105kDa/110kDa Protein 1 (HSPH1) oder eine dafür kodierende Nukleinsäure oder eine Teilsequenz oder ein

Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird und wobei die Markersequenz (en) mit einem

Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips, aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs , b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die

Verwendung der erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur

Diagnose von Prostatakarzinom unter Ausschluss von Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels in-vitro Diagnose erfolgt . Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die

Verwendung mindestens einer Markersequenz einer cDNA jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247-452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon als Diagnostikum, wobei die Markersequenz ( en ) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs , b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität , wobei

a. ) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247-452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird

(werden) und

b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird (werden) und

c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit der (den) Markersequenz (en) aus a.) erfolgt .

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum

Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Prostatakarzinom unter Ausschluss von Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder Polymorbidität , wobei mindestens eine

Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247 - 452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird und wobei die Markersequenz (en) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips, aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs , b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels

Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Assay, Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung enthaltend mindestens eine

Markersequenz einer cDNA jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247-452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenz (en) auf einem festen Träger aufgebracht ist (sind) und wobei die

Markersequenz ( en ) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips, aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs , b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Diagnostika zur Diagnose von Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität enthaltend mindestens eine Markersequenz jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 und / oder SEQ 247 - 452 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon, wobei die

Markersequenz ( en ) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch differentielles Screening mit Proteinbiochips, beispielsweise zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit

Prostatakrebs und einem Probanden ohne

Prostatakrebs, b) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit

Prostataent Zündungserkrankung ( en ) und / oder Proben von Patienten mit Diabetes. Der Begriff „Prostatakarzinom" umfasst ausschließlich die Indikation Prostatakarzimon bzw. Prostatakrebs unter

Ausschluss einer Ko- bzw. Polymorbidität (Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin). Die ggfs. überlappenden Erkrankungen einer Prostataentzündung oder Diabetes sind erfindungsgemäß strikt ausgeschlossen.

Der Begriff „Prostataentzündungserkrankungen" umfasst

sämtliche Formen einer Prostatitis bis hin zu chronischen Formen einer Prostataent zündung, einschließlich einer

Prostata-Hyperplasie, insbesondere benignen Prostata- Hyperplasie. Erfindungsgemäß umfasst ist das vorliegen von ein oder mehreren verschiedenen Prostataentzündungserkrankungen.

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter Diabetes beispielsweise „Diabetes mellitus", insbesondere der Typ II Diabetes mellitus (Insulinresistenz) verstanden, eine chronische

StoffWechselerkrankung, wobei die Insulinproduktion in den ß- Zellen der Langerhansschen Inseln in der Bauchspeicheldrüse gestört ist oder Insulin zwar vorhanden ist, an seinem

Zielort, den Zellmembranen, aber nicht richtig wirken kann. Die Folge dieser gestörten Insulinproduktion bzw. -Wirkung sind erhöhte Blutzuckerwerte ( Hyperglykämie ) . Beim

diabetischen Krankheitsverlauf unterscheidet man zwischen Prädiabetes, bei dem es erst in seinem Endstadium zu einer laborchemisch nachweisbaren „gestörten Glukosetoleranz" kommt, und dem eigentlichen manifesten Diabetes mellitus. Am Anfang der prädiabetischen Krankheitsphase steht die

Insulinresistenz. Nahezu zeitgleich entwickeln sich bereits eine endotheliale Dysfunktion, Hyperlipoproteinämie und hypertensive Kreislaufdysregulation .

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter Diabetes auch Diabetes Typ I verstanden.

Daher betrifft die Erfindung solche MarkerSequenzen die eine Ko- oder Polymorbidität mit anderen Indikationen, wie

Prostataent zündung ( en ) oder Diabetes (in allen Formen), ausschließt .

In einer weiteren Ausführungsform werden daher mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markersequenzen an oder von einem zu

untersuchenden Patienten bestimmt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarkern für diese Indikation kombiniert, ergänzt oder erweitert werden. Besonders bevorzugt sind ebenfalls solche Marker, wie in W02010 / 000874 offenbart.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der MarkerSequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung von MarkerSequenzen als Diagnostika, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon ist .

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakarzinom, wobei a.) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und b.) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines

Patienten in Kontakt gebracht wird und c.) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den MarkerSequenzen aus a.) erfolgt.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Diagnostika zur

Diagnose von Prostatakarzinom jeweils ausgewählt aus der

Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die

MarkerSequenzen SEQ 1 - 18 besonders bevorzugt und SEQ 19 - 56 bevorzugt, wobei wiederum niedere numerische Werte jeweils bevorzugt sind. Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper

erfolgen .

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für Prostatakarzinom eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum

Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit einem

Prostatakarzinom, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.

Ferner umfasst ist die Stratifizierung der Patienten mit

Prostatakarzinom in neue oder etablierte Subgruppen des

Prostatakarzinoms, sowie die sinnvolle Auswahl von

Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen

Therapeutika. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Respondern und Nicht- Respondern bezüglich einer Therapie oder dessen

Therapieverlauf .

„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung eines Prostatakarzinoms mittels der

erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zu einem Prostatakarzinom. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und diesbezügliche

Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und

Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur Absicherung und zum

Ausschluss anderer Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die Differentialdiagnose von Prostatakarzinom mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Prognose eines Prostatakarzinoms. „Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des

Patienten erlaubt, sei es die Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die

Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die

Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Prostatakarzinom untersucht wird.

Der Begriff „MarkerSequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für Prostatakarzinom sind. Beispielsweise können die cDNA oder das jeweils daraus

erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit einer Probe, z.B. Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit

Prostataentzündungserkrankungen bis hin zum Prostatakarzinom aufweisen (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop)

Wechselwirkung) . Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder

Gewebeauszuges eines Patienten und den erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens einer erfindungsgemäßen Markersequenz oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten

Bedingungen (z.B. wie üblich definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in

Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience , N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente

Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei

Raumtemperatur .

Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer

Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten.

„Proben" von Patienten oder Probanden enthalten beispielsweise Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten oder Probanden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können jedoch die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration vorliegen, dass auf Prostatakarzinom hinweist. Hierbei wird mittels Proteomics oder Nukleinsäureblots die relativen

Expressionsraten krank / gesund der erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen für Prostataentzündungserkrankungen,

Prostatakarzinom bestimmt. Die MarkerSequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung über ein Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz adressiert ist (z.B. Antikörper,

Nukleinsäure) . Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder

Bindungsregion .

Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sind Gegenstand der Tabelle A und können durch den jeweilig zitierten

Datenbankeintrag (auch mittels Internet:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eindeutig identifiziert werden (siehe in Tabelle A: dort Accession No . ) .

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Volllängesequenzen der erfindungsgemäßen Marker und zwar wie in Tabelle 1 über den bekannten Datenbankeintrag gemäß Tabelle A definiert, nachstehend SEQ 247 - 452 genannt, siehe ebenfalls das

zugehörige Sequenzprotokoll.

Weiterhin umfasst sind daher ebenfalls analoge

Ausführungsformen von SEQ 247 - 452 zu den MarkerSequenzen SEQ 1-246, wie z.B. in den Ansprüchen dargelegt, da die

erfindungsgemäßen SEQ 1-246 wiederum Teilsequenzen, zumindest mit hoher Homologie, darstellen. Die spezifischen

MarkerSequenzen SEQ 1-246 sind jedoch erfindungsgemäß

bevorzugt . Weiterhin bevorzugt sind SEQ 247 - 260 und SEQ 261 - 294.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind

MarkerSequenzen bevorzugt, die P-Werte kleiner oder gleich 0.2 aufweisen, vorzugsweise kleiner oder gleich 0.15, besonders bevorzugt kleiner oder gleich 0.1. In einer anderen

Ausführungsform der Erfindung sind die MarkerSequenzen SEQ ID No . 247, 250, 290, Teilsequenzen, Fragmente oder Homologe sowie die dadurch kodierten Peptide / Proteine bevorzugt.

Diese Markersequenzen weisen besonders geeignete P-Werte auf: SEQ ID No. 247 (P-Wert: 0.1053), SEQ ID No . 250 (P-Wert:

0.0310) und SEQ ID No . 290 (P-Wert: 0.0254). Der P-Wert gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der eine Übereinstimmung in der Datenbank gefunden wurde. Für die Definition des P-Werts siehe zum Beispiel http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK62051/.

Erfindungsgemäß umfassen die MarkerSequenzen auch solche

Modifikationen der cDNA-Sequenz und der entsprechenden

Aminosäuresequenz, wie chemische Modifikation, wie

Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,

Glykosilierung oder polyA-Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind ebenfalls

Teilsequenzen oder Fragmente der erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen umfasst. Insbesondere solche Teilsequenzen, die eine Identität von 99 % oder mehr, 98 %, 97 %, 96 %, 95%, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, insbesondere 85 %, 80% oder 70 % mit den erfindungsgemäßen MarkerSequenzen aufweisen und für die erfindungsgemäße Verwendung - den Nachweis

Prostatakarzinom unter Ausschluss von

Prostataentzündungserkrankungen oder Diabetes oder

Polymorbidität - geeignet sind. (sog. „Homologe", homologe MarkerSequenzen ) . Hiomologe können Protein- oder

Nukleinsäuresequenzen sein.

Teilsequenzen sind ebenfalls solche Sequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide, 70-120 Nukleotide einer Sequenz der SEQ 1-452 aufweisen, oder davon erhältliche Peptide.

In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige

Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker. Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere

Biomarker. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche

MarkerSequenzen und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Anordnung von MarkerSequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 452 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein. Vorzugsweise enthält die

Anordnung mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 MarkerSequenzen oder 50 bis 100 oder mehr MarkerSequenzen .

Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten

MarkerSequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Proteinbindern erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichte gespotteten Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen.

Im Rahmen dieser Erfindung umfasst jedoch der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche

Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot, immunchromatographische Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays ) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex- Nachweisverfahren . Ein Proteinbiochip im Sinne dieser Erfindung ist die systematische Anordnung von Proteinen auf einem festen Träger.

Die MarkerSequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Ein oder mehrere MarkerSequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller

MarkerSequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die

MarkerSequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.

Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur

Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) .

Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung enthaltend erfindungsgemäße MarkerSequenzen .

In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken

enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer

exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA

MarkerSequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der

Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5) : 523-33) . Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die

gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden. Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.

Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.

Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.

Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die

MarkerSequenzen als Clone vorliegen. Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches

beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende

Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes

Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten. In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein

Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.

Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der

erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und

Charakterisieren einer Substanz für Prostatakarzinom, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder

Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird .

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für Prostatakarzinom, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg

nachgewiesen wird. Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein synthetisches chemisches

Molekül, eine Mischung oder eine Substanzbibliothek sein.

Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image- Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida

(Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt. Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie

Antigen/Antikörper ) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels

Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären

Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen

markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer

Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den

entsprechenden colorimetrischen, fluores zenten oder

chemolumines zenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel / Wirkstoff oder Prodrug für Prostatakarzinom entwickelt und erhältlich durch den Einsatz des

erfindungsgemäßen Assays oder Proteinbiochip.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder einem Assay zum Screenen von Wirkstoffen für Prostatakarzinom. Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ebenfalls ein Target zur Behandlung und Therapie von

Prostatakarzinom, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 246 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen

Markersequenzen, vorzugsweise in Form einer Anordnung, als Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese bzw. iwS . einer Blutwäsche, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Prostatakarzinom, wie Blut oder Plasma, an die erfindungsgemäßen Markersequenzen binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können.

Entsprechende Vorrichtungen sind einschlägig bekannt, wie z.B. chromatographische Vorrichtungen enthaltend Beads, Kugeln oder chromatographisches Material, z.B. in einer Säule, die die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen aufweisen und daher z.B. (Auto ) Antikörper selektiv entziehen können.

Beispiele und Figuren:

Zehn oder mehr Patientenproben wurden individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent. Die Prostatakarzinom - spezifischen Expressionsklone wurden ermittelt durch einen Vergleich mit zehn oder mehr gesunden Proben. Ferner wurden die identifizierten Marker gegen Proben von

Prostataent zündungs- oder Diabetespatienten gegengeprüft.

Falsch-positive Marker wurden entfernt. Die anschließende

Identität der verbleibenden Markersequenzen wurde durch DNA- Sequenzierung ermittelt.

In Figur 1 wird das differentielle Screenen zwischen zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die

differentiellen Clone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet.

Im Rahmen der Biomarkeridentifizierung werden verschiedene bioinformatische Analysen durchgeführt. Für jedes Serum werden mittels Microarray Reaktivitäten gegen ca. 2000

unterschiedliche Antigene gemessen. Diese Daten werden für ein Ranking der gespotteten Antigene bzgl. ihrer

Differenzierungsfähigkeit zwischen gesunden und erkrankten Seren benutzt. Diese Auswertung wird mittels des nicht

parametrischen Mann-Whitney Tests auf normalisierten

Intensitätsdaten durchgeführt. Zur Normalisierung wird ein interner Standard benutzt, der auf jedem Chip mitgespottet wird. Da für jedes Antigen ein p-Wert berechnet wird, werden Methoden zur Korrektur des multiples Testens eingesetzt. Als sehr konservativer Ansatz wird eine Bonferroni Korrektur durchgeführt und zusätzlich wird die weniger restriktive False Discovery Rate (FDR) nach Benjamini & Hochberg berechnet.

Desweiteren werden die Daten zur Klassifikation der Seren benutzt. Hierbei kommen unterschiedliche multivariate Methoden zum Einsatz. Dies sind Methoden aus den statistischen

Lernverfahren wie Support Vector Machines (SVM), Neuronale Netze oder Klassifikationsbäume, sowie eine

Schwellenwertmethode, welche sowohl zur Klassifikation als auch zur visuellen Repräsentation der Daten geeignet ist.

Zur Vermeidung von Overfitting wird eine lOfache Cross- Validierung der Daten durchgeführt.

Tabelle A:

SEQ gi Name DNA

ID Accession Accession

247 gil5902723 Neuro-oncological ventral antigen 2 (NOVA2) NM_002516

248 gill 13411825 Similar to Cyclin-L2 (Paneth cell-enhanced expression protein) NM_030937

transcript variant 1 (LOC727877)

249 giß 1543652 Signal recognition particle 14kDa (homologous Alu RNA binding NM_003134

protein) (SRP14)

250 _g il42544158 Heat shock 105kDa/l lOkDa protein 1 (HSPH1) NM_006644

251 gill 13428756 Zinc finger protein 154 (pHZ-92) (ZNF154) NM_0010853

84

252 gil32490571 Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3 (EPB41L3) NM_012307

253 gil77628146 Endoplasmic reticulum protein 29 (ERP29) transcript variant 1 NM_006817

254 gil22749232 Zinc finger protein 579 (ZNF579) NM_152600

255 gill 94097404 Peptide chain release factor 3 NM_018094

256 gil217330633 Serine/Threonine kinase 36 NM_015690

257 gill 6507207 Capicua homolog (Drosophila) (CIC) NM_015125

258 gil32261293 Protein kinase interferon-inducible double stranded RNA dependent NM_003690

activator (PRKRA)

259 gil49574506 Neugrin neurite outgrowth associated (NGRN) transcript variant 1 NM_0010330

88

260 gil89031690 Chromosome 10 genomic contig, reference assembly NM_005876

261 gill 13427652 Alveolar soft part sarcoma chromosome region candidate 1 (ASPSCRl) NM_024083

262 gil40353201 OTU domain containing 5 (OTUD5) NM_017602

263 gil66932901 SREBP cleavage-activating protein (SCAP) NM_012235

264 gil33624820 Septin 6 (SEPT6) transcript variant V NM_145800

265 gil40807365 Dihydrouridine synthase 1-like (S. cerevisiae) (DUS 1L) NM_022156 gil70609878 Ribosomal protein S2 (RPS2) NM_002952 gil83267865 Dynein, light chain, LC8-type 1 (DYNLL1), transcript variant 1 NM_0010374

94

gill 13422143 Similar to 60S ribosomal protein L21, transcript variant 2 (LOC731567) XM_0011335

19

gil 113430220 CXYorfl -related protein, transcript variant 1 (LOC376475) XM_377073 gill7986282 Tubulin, alpha 3 (TUBA3) NM_006009 gil23238232 High mobility group nucleosomal binding domain 4 (HMGN4) NM_006353 gil39725675 CDK2-associated protein 2 (CDK2AP2) NM_005851 gil46389548 Endosulfine alpha (ENSA), transcript variant 3 NM_004436 gil46389553 Endosulfine alpha (ENSA), transcript variant 4 NM_207044 gil46389549 Endosulfine alpha (ENSA), transcript variant 1 NM_207042 gil47078237 G protein pathway suppressor 1 (GPS 1), transcript variant 1 NM_212492 gil47078280 Family with sequence similarity 53, member B (FAM53B) NM_014661 gil4757715 Sperm associated antigen 7 (SPAG7) NM_004890 gil50557645 Zinc finger, FYVE domain containing 27 (ZFYVE27), transcript variant NM_0010022

1 61

gil5174742 Ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-sulfur Polypeptide 1 NM_006003

(UQCRFS 1)

gil53759121 Adenomatosis polyposis coli (APC) NM_000038 gil57242754 Calsyntenin 1 (CLSTN1), transcript variant 2 NM_014944 gil7705480 Ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1 (UFC1) NM_016406 gil82659090 Staufen, RNA binding protein, homolog 1 (Drosophila) (STAU1), NM_0010373

transcript variant T5 28

gil83641890 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) NM_002046 gil57222567 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, NM_005937

Drosophila); translocated to, 6 (MLLT6)

gill4249519 Hypothetical protein FLJ 14668 (FLJ 14668) NM_032822 gil38201669 Inhibitor of growth family, member 4 (ING4) NM_016162 gil83656775 Eukaryotic translation elongation factor 2 (EEF2) NM_001961 gil20127557 Chromatin modifying protein 5 (CHMP5) NM_016410 gil20302149 Lysophospholipase II (LYPLA2) NM_007260 gil23238257 Carnitine palmitoyltransferase 1B (muscle) (CPT1B), NM_152247

nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 4

gil33286421 Pyruvate kinase, muscle (PKM2), transcript variant 3 NM_182471 gil34147626 Zinc finger protein 447 (ZNF447) NM_023926 gil38176162 Ring finger protein 130 (RNF130) NM_018434 gil47933378 N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein, alpha (NAPA) NM_003827 gil49472815 Fascin homolog 1, actin-bundling protein (Strongylocentrotus NM_003088

purpuratus) (FSCN1)

gil67189547 Ribosomal protein L6 (RPL6), transcript variant 2 NM_000970 gil6912539 Nucleotide binding protein 2 (MinD homolog, E. coli) (NUBP2) NM_012225 gil73622128 Caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase (CASP6), transcript NM_001226

variant alpha

gil83641894 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AI (HNRPA1), transcript NM_031157

variant 2 gil94721349 Islet cell autoantigen 1, 69kDa (ICA1), transcript variant 2 NM_004968 gil42794610 6-phosphogluconolactonase (PGLS), NM_012088 gil 113420239 Similar to block of proliferation 1 (LOC727967) XM_0011262

55

gi|14149778 Chromosome 1 open reading frame 160 (Clorfl60) NM_032125 gill6306547 Seryl-tRNA synthetase (SARS) NM_006513 gil20336240 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 inhibitor (PCSK1N) NM_013271 gil22027621 TNF receptor-associated factor 4 (TRAF4), transcript variant 1 NM_004295 giß 1543190 Chromosome 10 open reading frame 58 (C10orf58) NM_032333 gil32129198 Cytokine induced protein 29 kDa (CIP29) NM_033082 gil32455235 Helicase (DNA) B (HELB) NM_033647 gil34452680 Ring finger protein 10 (RNF10) NM_014868 gil34996518 Galectin-3 internal gene (GALIG) NM_194327 gil40804743 Sema domain, Immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain NM_017789

(TM)

and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4C (SEMA4C)

gil41393582 EGF-like-domain, multiple 7 (EGFL7), transcript variant 2 NM_201446 _g il46430498 V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A, NM_021975

nuclear factor of kappa light Polypeptide gene enhancer in B-cells 3,

p65 (avian) (RELA)

gil47519746 Mi togen-activated protein kinase 11 (MAPK11) NM_002751 gil50233802 NDRG family member 4 (NDRG4) NM_020465 gil56090145 Hypothetical LOC339123 (LOC339123), NM_0010059

20

gil71164877 Ribosomal protein S 12 (RPS 12) NM_001016 gil72534683 Phospholipase D family, member 3 (PLD3), transcript variant 1 NM_0010316

96

gil7305502 Stomatin (EPB72)-like 2 (STOML2) NM_013442 gil90193629 Septin 5 (SEPT5) NM_002688 gil50592995 Tubulin, beta 3 (TUBB3) NM_006086 gill6554608 Mitochondrial ribosomal protein S 11 (MRPS 11), NM_022839

nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1

giß0581139 Proteasome (prosome, macropain) activator subunit 1 (PA28 alpha) NM_006263

(PSME1), transcript variant 1

gil31317308 Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, type I, gamma (PIP5K1C) NM_012398 gil46048184 Sterile alpha motif domain containing 10 (S AMD 10) NM_080621 gil56549124 Dynamin 2 (DNM2), transcript variant 4 NM_0010053

62

gil70166553 GRINL1A combined protein (Gcoml), transcript variant 9 NM_0010180

97

gil40795668 Solute carrier family 38, member 3 (SLC38A3) NM_006841 giß0410780 Hypothetical protein FLJ 12949 (FLJ 12949), transcript variant 2 NM_178159 giß 1361946 Stathmin-like 4 (STMN4) NM_030795 gill 13413590 Similar to deoxythymidylate kinase (thymidylate kinase), transcript XM_0011262

variant 4 (LOC727761) 11

gil 113430465 Similar to ataxin 7-like 3 (LOC392485) X _018762 gil22219473 Fas (TNFRSF6)-associated via death domain (FADD) NM_003824 gil71361681 Nuclear mitotic apparatus protein 1 (NUMA1) NM_006185 gil20336312 B-cell CLL/lymphoma 11 A (zinc finger protein) (BCLl 1 A), transcript NM_138559

variant 3

gil34147391 Coiled-coil domain containing 130 (CCDC130) NM_030818 gil 12056467 .Function plakoglobin (JUP), transcript variant 2 NM_021991 gil21464122 Methyl-CpG binding domain protein 3 (MBD3) NM_003926 _g i|42544170 Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, NM_001983

complementation group 1

(includes overlapping antisense sequence) (ERCCl), transcript variant 2 gil83523747 Hypothetical protein FLJ 13305 (FLJ 13305) NM_032180 gil46358416 Glutamate receptor, metabotropic 3 (GRM3) NM_000840 gil39812062 Mitochondrial ribosomal protein L28 (MRPL28), nuclear gene encoding NM_006428

mitochondrial protein

gil24308369 Nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 16 NM_152395

(NUDT16)