Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren diagnostische Verwendung samt einem Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für Multiple Sklerose - Erkrankungen mittels dieser

MarkerSequenzen . Ferner betrifft die Erfindung eine

diagnostische Vorrichtung enthaltend solche Markersequenzen für Multiple Sklerose, insbesondere einen Proteinbiochip und dessen Verwendung.

Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle

Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der

Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als

Screeninginstrumente etabliert.

Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem

einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von

Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere

Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine

Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L . , Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,

Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using

topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392;

Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreut zberger , J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)

Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,

C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, N . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,

Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,

D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome ersion 1.1:

experimental verification of the genome annotation and

resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet , 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000)

GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol , 328, 575-592) . Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund

differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-

Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G.

(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gut jähr, C, Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif. , 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte

Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten

Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische

Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.

Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus

Expressionsbibliotheken konnten darüber hinaus im

Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human

proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654- 2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening.

Analytical Biochemistry, 21Q, 103-111) . Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind

insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312. Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264) .

Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis indikationsspezifische diagnostische Vorrichtungen, wie einen Proteinbiochip,

bereitzustellen .

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Markersequenzen und deren diagnostische

Verwendung zur Behandlung von Multiple Sklerose.

Die Bereitstellung von spezifischen MarkerSequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit Multiple Sklerose, insbesondere mittels eines Proteinbiochips. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von

MarkerSequenzen zur Diagnose von Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon

(nachstehend: erfindungsgemäße Markersequenzen) an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.

Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen konnten mittels

differentiellem Screenen von Proben und zwar gesunder Probanden mit Patientenproben mit Multiple Sklerose identifiziert werden.

Hierbei konnten erstmals mittels Proteinbiochips (siehe

Beispiele) diese erfindungsgemäßen Markersequenzen

identifiziert werden.

Im Stand der Technik konnten zwar bereits MarkerSequenzen für Multiple Sklerose mit Hilfe eines Proteinbiochip identifiziert werden, siehe WO2009030225. Vorliegend wird jedoch

erfindungsgemäß eine verbesserte bioinformatorische Auswertung angestrengt und die Proben werden besonders bevorzugt aus dem Liquor cerebrospinalis (CSF) entnommen. Ferner werden speziell ausgesuchte Proben verwendet, die der hohen Empfindlichkeit eines Proteinbiochips entgegenkommen.

Der Begriff „Multiple Sklerose ((MS), auch Encephalomyelitis disseminata) " betrifft eine autoimmun-entzündliche /

demyelinisierende und degenerative Erkrankung des Erkrankung des Zentralnervensystems (Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin).

Erfindungswesentlich ist, dass die Proben nicht aus üblichen Blutbanken entnommen werden, sondern von MS-Patienten

sorgfältig ausgewählt wurden, die z.B. HIV und HCV negativ sind und insbesondere auf Infektionskrankheiten getestet wurden. Das aufwändige Probeselektionsverfahren erlaubt z.B. eine hinreichende vorteilhafte Abgrenzung von Erkrankungen wie eine zur MS Symptom-ähnlichen Neuroborelliose . Weiterhin werden falsch-positive Ergebnisse ausgeschlossen, zum einen aufgrund der strengen bioinformatorischen Auswertung (siehe Beispiele) als auch durch den Vergleich der Ergebnisse auf einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip mit z.B. Seren von Neuroborelliose-Patienten, die keine Multiple Sklerose

aufweisen .

Weiterhin erfolgt im Unterschied zur WO2009030225 die

Herstellung der Proteinbiochips mittels Normalisierung von mindestens 1.000, vorzugsweise 2.000 verschiedenen oder mehr Autoantigenen des Menschen, die nicht indikationsspezifisch für Multiple Sklerose sind. Solche Autoantigene können z.B. aus anderen Körperflüssigkeiten von Patienten anderer

Krankheiten gewonnen werden (z.B. Pankreaskrebs , Rheumatoide Arthritis, Prostata etc.) .

Daher betrifft die Erfindung auch solche erfindungsgemäßen indikationsspezifischen Proteinbiochips zur Diagnose von

Multiple Sklerose, wobei in einem weiteren Schritt, die auf dem Proteinbiochip repräsentierte Proteine oder

MarkerSequenzen mit Autoantikörpern aus Nicht-Multiple

Sklerose Patienten normalisiert werden und auf diese Weise falsch-positive Proteine entfernt werden können. Verbleibende nicht-falsch-positive Proteine können auf einem Proteinbiochip neu zusammengestellt werden, so genanntes Rearraying. Dies erlaubt ebenfalls den Ausschluss von Autoantikörpern, die auf E. coli positiv sind. Dies ist eine weitere qualitative

Verbesserung, da Autoantikörper ausgeschlossen werden können, die z.B. gegen E. coli Darmbakterien im Menschen gerichtet sind. Infolge dessen können vorteilhaft bei einem verbesserten Signal/Rausch Verhältnis neue Markersequenzen identifiziert werden .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden daher mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50

MarkerSequenzen oder 50 bis 100 oder mehr MarkerSequenzen an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarkern für diese Indikation kombiniert, ergänzt oder erweitert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der MarkerSequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung von MarkerSequenzen als Diagnostika, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon ist .

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Multiple Sklerose, wobei a.) mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon auf einem festen Träger aufgebracht wird und b.) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines

Patienten in Kontakt gebracht wird und c.) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug mit den MarkerSequenzen aus a.) erfolgt.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Diagnostika zur

Diagnose von Multiple Sklerose jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon.

Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper

erfolgen . Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für die Multiple Sklerose eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum

Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit Multiple Sklerose, wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird.

Ferner umfasst ist die Stratifizierung der Patienten mit

Multiple Sklerose in neue oder etablierte Subgruppen der

Multiple Sklerose, sowie die sinnvolle Auswahl von

Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen

Therapeutika. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht-Responder bezüglich einer Therapie oder dessen Therapieverlauf.

„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung der Multiple Sklerose mittels der

erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zur Erkrankung an Multiple Sklerose. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und

diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und

Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur

Absicherung und zum Ausschluss anderer Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die

Differentialdiagnose von Multiple Sklerose mittels der

erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sowie die Prognose der

Multiple Sklerose. „Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des

Patienten erlaubt, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die

Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die

Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Multiple Sklerose untersucht wird.

Der Begriff „MarkerSequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für Multiple Sklerose sind. Beispielsweise können die cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit Multiple Sklerose aufweisen (z.B. Antigen

(Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) . Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein oder jeweils einer Teilsequenz oder Fragment davon an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszuges eines Patienten und den erfindungsgemäßen MarkerSequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens einer erfindungsgemäßen Markersequenz oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten

Bedingungen (z.B. wie üblich definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in

Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience , N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente

Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschschritten in 1 x SSC bei Raumtemperatur . Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer

Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können jedoch die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration vorliegen, dass auf die Multiple Sklerose hinweist. Hierbei wird mittels Proteomics oder Nukleinsäureblots die relativen Expressionsraten krank / gesund der erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen für Multiple Sklerose bestimmt. Die MarkerSequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung über ein Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz adressiert ist (z.B. Antikörper,

Nukleinsäure) . Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal ein Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder

Bindungsregion .

Die erfindungsgemäßen MarkerSequenzen sind Gegenstand der Tabelle A und können durch den jeweilig zitierten

Datenbankeintrag (auch mittels Internet:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eindeutig identifiziert werden (siehe in Tabelle A: dort Accession No . ) , siehe ebenfalls das zugehörige Sequenzprotokoll.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Volllängesequenzen der erfindungsgemäßen Marker und zwar wie in Tabelle A über den bekannten Datenbankeintrag definiert, nachstehend SEQ la- 308a (cDNA) bzw. SEQ lb-308b (Protein) genannt.

Weiterhin umfasst sind daher ebenfalls analoge

Ausführungsformen von SEQ la-308a zu den MarkerSequenzen SEQ 1-308, wie z.B. in den Ansprüchen dargelegt, da die

erfindungsgemäßen SEQ 1-308 wiederum Teilsequenzen, zumindest mit hoher Homologie, darstellen. Die spezifischen

MarkerSequenzen SEQ 1-308 sind jedoch erfindungsgemäß

bevorzugt . Erfindungsgemäß umfassen die MarkerSequenzen auch solche Modifikationen der cDNA-Sequenz und der entsprechenden

Aminosäuresequenz, wie chemische Modifikation, wie

Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,

Glykosilierung oder polyA-Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind ebenfalls Teilsequenzen oder Fragmente der erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen umfasst. Insbesondere solche Teilsequenzen, die eine Identität von 95%, 90 %, insbesondere 80% oder 70 % mit den erfindungsgemäßen MarkerSequenzen aufweisen.

Teilsequenzen sind ebenfalls solche Sequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide, 70-120 Nukleotide einer Sequenz der SEQ 1-308 aufweisen, oder davon erhältliche Peptide.

„Teilsequenzen oder Fragmente" der erfindungsgemäßen

MarkerSequenzen sind funktionell definiert und umfassen solche Sequenzen, die die gleiche erfindungsgemäße diagnostische Funktion aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige

Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einen oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.

Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere

Biomarker. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche

MarkerSequenzen und ggfs. weiteren Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarker.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Anordnung von MarkerSequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein. Vorzugsweise enthält die

Anordnung mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 MarkerSequenzen oder 50 bis 100 oder mehr MarkerSequenzen .

Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung repräsentierten

MarkerSequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Proteinbindern

erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichten gespotteten Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen.

Im Rahmen dieser Erfindung umfasst jedoch der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche

Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot, immunchromatographische

Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex- Nachweisverfahren . Ein Proteinbiochip im Sinne dieser

Erfindung ist die systematische Anordnung von Proteinen auf einem festen Träger.

Die MarkerSequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert gar aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Eine oder mehrere MarkerSequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einem Spot vorliegen. Ferner können die MarkerSequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.

Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur

Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) .

Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip bestehend aus einer Anordnung enthaltend erfindungsgemäße MarkerSequenzen .

In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Clone vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken

enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer

exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA

MarkerSequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der

Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5) : 523-33) . Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die

gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden. Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.

Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.

Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert.

Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die

MarkerSequenzen als Clone vorliegen. Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches

beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende

Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes

Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten. In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein

Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter ist jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.

Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der

erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und

Charakterisieren einer Substanz für Multiple Sklerose, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird .

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren einer Substanz für Multiple Sklerose, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg

nachgewiesen wird. Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein synthetisches chemisches

Molekül, eine Mischung oder eine Substanzbibliothek sein.

Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, wird die Auswertung des Bindungserfolges

durchgeführt, die beispielsweise unter Verwendung mit

handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgen kann. Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie

Antigen/Antikörper ) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels

Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären

Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen

markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer

Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den

entsprechenden colorimetrischen, fluores zenten oder

chemolumines zenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel / Wirkstoff oder Prodrug für Multiple Sklerose entwickelt und erhältlich durch den Einsatz des

erfindungsgemäßen Assays oder Proteinbiochip. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder einem Assay zum Screenen von Wirkstoffen für Multiple Sklerose.

Daher betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ebenfalls ein Target zur Behandlung und Therapie von Multiple Sklerose, jeweils ausgewählt aus der Gruppe SEQ 1 - 308 oder jeweils ein dafür kodierendes Protein.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen

Markersequenzen, vorzugsweise in Form einer Anordnung, als

Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese bzw. iwS . einer Blutwäsche, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit Multiple Sklerose, wie Blut oder Plasma, an die erfindungsgemäßen Markersequenzen binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können.

Beispiele und Figuren:

Zehn oder mehr Patientenproben wurden individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent. Die Multiple Sklerose - spezifischen Expressionsklone wurden ermittelt durch einen Vergleich mit zehn oder mehr gesunden Proben. Die Identität der MarkerSequenzen wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt.

In Figur 1 wird das differentielle Screenen zwischen zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die

differentiellen Clone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet.

Im Rahmen der Biomarkeridentifizierung werden verschiedene bioinformatische Analysen durchgeführt. Für jedes Serum werden mittels Microarray Reaktivitäten gegen ca. 2000 unterschiedliche Antigene gemessen. Diese Daten werden für ein Ranking der gespotteten Antigene bzgl. ihrer

Differenzierungsfähigkeit zwischen gesunden und erkrankten Seren benutzt. Diese Auswertung wird mittels des nicht

parametrischen Mann-Whitney Tests auf normalisierten

Intensitätsdaten durchgeführt. Zur Normalisierung wird ein interner Standard benutzt, der auf jedem Chip mitgespottet wird. Da für jedes Antigen ein p-Wert berechnet wird, werden Methoden zur Korrektur des multiples Testens eingesetzt. Als sehr konservativer Ansatz wird eine Bonferroni Korrektur durchgeführt und zusätzlich wird die weniger restriktive False Discovery Rate (FDR) nach Benjamini & Hochberg berechnet.

Desweiteren werden die Daten zur Klassifikation der Seren benutzt. Hierbei kommen unterschiedliche multivariate Methoden zum Einsatz. Dies sind Methoden aus den statistischen

Lernverfahren wie Support Vector Machines (SVM), Neuronale Netze oder Klassifikationsbäume, sowie eine

Schwellenwertmethode, welche sowohl zur Klassifikation als auch zur visuellen Repräsentation der Daten geeignet ist. Zur Vermeidung von Overfitting wird eine lOfache Cross- Validierung der Daten durchgeführt.

Tabelle A: (gi Accession Nummer mit Geltung vom 1.10.2010)

SEQ 1 b-308b SEQ 1 a-308a

gi Acc Protein gi Acc cDNA NAME

gi 157266266 gi|157266265 WD repeat-containing protein 86 [Homo sapiens]

DDB1 - and CUL4-associated factor 6 isoform b gi|63252909

gi|63252910 [Homo sapiens]

gi 18699734 gi 20357519 uridine-cytidine kinase 2 [Homo sapiens]

calcium/calmodulin-dependent 3',5'-cyclic gi|260436978 nucleotide Phosphodiesterase 1 B isoform 1 [Homo gi|4505677 sapiens]

gi 51477716 gi 51477715 alpha-mannosidase 2x [Homo sapiens] pyrroline-5-carboxylate reductase 1 , mitochondrial gi|24797096

gi|24797097 isoform 1 [Homo sapiens]

gi 61676188 gi|195963314 E3 ubiquitin-protein ligase HUWE1 [Homo sapiens] gi 307951 19 gi 307951 18 F-box only protein 18 isoform 2 [Homo sapiens] gi 33469964 gi|33469963 splicing factor 4 [Homo sapiens]

gi 83035136 gi|217272875 F-box only protein 31 [Homo sapiens]

gi 6005747 gi 54792140 E3 ubiquitin-protein ligase RING2 [Homo sapiens] lipid phosphate phosphatase-related protein type 4 gi|261278365

gi|33636722 isoform 1 [Homo sapiens]

gi 145199237 gi|145199236 RNA exonuclease 1 homolog [Homo sapiens]

adipocyte plasma membrane-associated protein gi|41327713

gi|24308201 [Homo sapiens]

DNA replication licensing factor MCM2 [Homo gi|33356546

gi|33356547 sapiens]

zinc finger and BTB domain-containing protein 5 gi|209413745

gi|7662074 [Homo sapiens]

downregulated in renal cell Carcinoma [Homo gi|1 15583673

gi|6005924 sapiens]

pyruvate dehydrogenase E1 component subunit gi|291084749 alpha, somatic form, mitochondrial isoform 1 gi|4505685 precursor [Homo sapiens]

gi 20070228 gi 39725676 nucleobindin-1 precursor [Homo sapiens]

hematological and neurological expressed 1 -like gi|46361989

gi|21700763 protein [Homo sapiens]

general transcription factor 3C Polypeptide 6 [Homo gi|221 139831

gi 119923927 sapiens]

nuclear pore complex protein Nup133 [Homo gi|26051234

gi|26051235 sapiens]

NFU1 iron-sulfur Cluster scaffold homolog, gi|50593020

gi|50593021 mitochondrial isoform 2 [Homo sapiens]

gamma-tubulin complex component 4 [Homo gi|38454193

gi|38454194 sapiens]

gi 5902122 gi 197381953 spectrin beta chain, brain 2 [Homo sapiens] gi 62739181 gi|62739180 rhotekin isoform c [Homo sapiens]

cyclin-D-binding Myb-like transcription factor 1 gi|215599980

gi|215599981 isoform b [Homo sapiens]

gi 134288890 gi 148596939 DIS3-like exonuclease 2 [Homo sapiens]

SR-related CTD-associated factor 1 [Homo gi|32698749

gi I32698750 sapiens]

gi 4501887 gi 1 1038618 actin, cytoplasmic 2 [Homo sapiens]

gi 47581 12 gi|93588182 spliceosome RNA helicase BAT1 [Homo sapiens] gi 58331 179 gi 58331 178 rho GTPase-activating protein 39 [Homo sapiens] gi 274771 1 1 gi|1 19393888 pre-mRNA-splicing factor SLU7 [Homo sapiens] gi 145309326 gi 145309325 laminin subunit gamma-1 precursor [Homo sapiens] gi 4507145 gi 231 1 1044 sorting nexin-4 [Homo sapiens] CMP-N-acetylneuraminate-beta-1 ,4-galactoside gi|284055255 gi|284055254 alpha-2,3-sialyltransferase isoform a

DNA replication licensing factor MCM2 [Homo gi|33356546

gi|33356547 sapiens]

gi 13259508 gi|13259507 dynactin 1 isoform 2 [Homo sapiens]

gi 24797103 gi 24797102 RAS guanyl releasing protein 2 [Homo sapiens] gi 20070228 gi 39725676 nucleobindin 1 [Homo sapiens]

gi 4502101 gi|4502100 annexin I [Homo sapiens]

gi 16975484 gi 92091602 centaurin delta 2 isoform b [Homo sapiens] gi 21707902 gi|21707901 CTTN protein [Homo sapiens]

gi 29788785 gi 34222261 tubulin, beta [Homo sapiens]

charged multivesicular body protein 4b [Homo gi|40549398

gi|28827795 sapiens]

g 149363636 gi 149363635 plexin-B2 precursor [Homo sapiens]

Plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding gi|66346680

gi|66346681 protein isoform 2 [Homo sapiens]

charged multivesicular body protein 4a [Homo gi|40548421

gi|40548422 sapiens]

gi 3005715 gi 3005714 protein 4.1 -G [Homo sapiens]

gi 22035672 gi 87196331 thioredoxin reductase 2 precursor [Homo sapiens] gi 4506723 gi|70609888 ribosomal protein S3a [Homo sapiens]

gi 34485727 gi|153792638 NCK-associated protein 1 -like [Homo sapiens] gi 6912602 gi 38569401 arfaptin-2 [Homo sapiens]

gi 4506685 gi|14591910 40S ribosomal protein S13 [Homo sapiens] gi 18104948 gi 78190465 60S ribosomal protein L21 [Homo sapiens] g 167466201 gi|167466200 WAS protein family homolog 1 [Homo sapiens] stress-70 protein, mitochondrial precursor [Homo gi|156071496

gi|24234688 sapiens]

hypothetical protein LOC1 16328 isoform 2 [Homo gi|307574659 gi|307574658 sapiens]

gi 4506619 gi|78190466 60S ribosomal protein L24 [Homo sapiens] gi 94536842 gi 94536841 ribose 5-phosphate isomerase A [Homo sapiens] gi 4505753 gi|31543395 phosphoglycerate mutase 1 [Homo sapiens]

tubulointerstitial nephritis antigen-like 1 [Homo gi|210147465

gi 11 1545918 sapiens]

cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, gi 1163644320

gi 1163644321 mitochondrial [Homo sapiens]

gi 34526674 gi 34526673 unnamed protein product [Homo sapiens]

rho guanine nucleotide exchange factor 7 isoform a gi|166064031

gi|4505573 [Homo sapiens]

gi 5902122 gi 197381953 spectrin beta chain, brain 2 [Homo sapiens] gi 23618848 gi 56676380 protein SYS1 homolog isoform a [Homo sapiens] gi 83641870 gi 262331549 nucleophosmin isoform 3 [Homo sapiens] gi 541 12429 gi 541 12428 dedicator of cytokinesis protein 7 [Homo sapiens] dnaJ homolog subfamily B member 1 [Homo gi|5453690 gi|5453689 sapiens]

X-ray repair cross-complementing protein 5 [Homo gi|10863945 gi 1195963391 sapiens]

gi 16753215 gi 94538348 profilin-2 isoform a [Homo sapiens]

gi 149363636 gi 149363635 plexin-B2 precursor [Homo sapiens]

chromosome transmission fidelity protein 18 gi|27501458 gi 1157951660 homolog [Homo sapiens]

gi 205277463 gi 306518580 transketolase [Homo sapiens]

gi 21396500 gi 3001 16295 HIRA interacting protein 3 [Homo sapiens] gi 71565154 gi 71565153 alcohol dehydrogenase class-3 [Homo sapiens] elongation factor Tu, mitochondrial precursor gi|34147630 gi 1169658370 [Homo sapiens]

membrane-associated progesterone receptor gi|5729875 gi|216547928 component 1 [Homo sapiens]

gi 50592996 gi 50592995 tubulin beta-3 chain [Homo sapiens]

gi 5802966 gi 58530846 destrin isoform a [Homo sapiens]

serine hydroxymethyltransferase, mitochondrial gi|19923315 gi|261862340 isoform 1 precursor [Homo sapiens]

gi 31982933 gi 33946335 DNA-binding protein inhibitor ID-2 [Homo sapiens] ubiquitin-40S ribosomal protein S27a precursor gi|4506713 gi|294459919 [Homo sapiens]

gi 16753227 gi 67189547 60S ribosomal protein L6 [Homo sapiens] gi 50592996 gi 50592995 tubulin beta-3 chain [Homo sapiens]

angio-associated migratory cell protein [Homo gi|55743075 gi|96322659 sapiens]

gi 13569962 gi 1 16014337 ras-related protein Rab-1 B [Homo sapiens] gi 78395056 gi 78395055 C15orf23 protein [Homo sapiens]

gi 45439359 gi 45439358 triple functional domain protein [Homo sapiens] disks large-associated protein 4 isoform a [Homo gi|34335253 gi|25491 1094 sapiens]

nuclease-sensitive element-binding protein 1 [Homo gi|34098946 gi 1109134359 sapiens]

nasal embryonic luteinizing hormone-releasing gi 1195972909 gi 1195972908 hormone factor isoform a [Homo sapiens]

ubiquitin-associated protein 1 isoform 1 [Homo gi|8394499 gi|283945567 sapiens]

stress-70 protein, mitochondrial precursor [Homo gi|24234688 gi|296080701 sapiens]

probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 gi|4758138 gi|221 139768 [Homo sapiens]

disks large-associated protein 4 isoform b [Homo gi|34335251 gi 1109891935 sapiens]

gi 1 1342680 gi 197245402 beta-centractin [Homo sapiens]

gi 5453832 gi 169234641 hypoxia up-regulated protein 1 precursor [Homo sapiens]

nuclease-sensitive element-binding protein 1 [Homo gi|34098946 gi 1109134359 sapiens]

gi 154090959 gi 154090958 WASH complex subunit FAM21 B [Homo sapiens] gi 4506913 gi 209693454 beta-sarcoglycan [Homo sapiens]

Immunoglobulin heavy chain variable region [Homo gi|247425318 gi|247425317 sapiens]

gi 5031701 gi 95104789 follistatin-like 3 (secreted glycoprotein)

gi 13375616 gi 34304362 fatty acid desaturase 3 [Homo sapiens]

gi 13376888 gi 34147389 transmembrane protein 121 [Homo sapiens] gi 17986283 gi 17986282 tubulin alpha-1 A chain [Homo sapiens]

cyclin-dependent kinase 2-associated protein 2 gi|5031669 gi|39725675 [Homo sapiens]

gi 14249132 gi 270309185 protein BEX2 isoform 3 [Homo sapiens]

gi 22027541 gi 22027540 programmed cell death protein 7 [Homo sapiens] ubiquitin-60S ribosomal protein L40 precursor gi|4507761 gi|77539056 [Homo sapiens]

gi 19353009 gi 19353008 Similar to Elongation factor 2b [Homo sapiens] dysbindin domain-containing protein 1 isoform 2 gi 11 10815842 gi|34147354 [Homo sapiens]

elongation factor Ts, mitochondrial isoform 2 gi 1171846268 gi|291084495 precursor [Homo sapiens]

gi 4557325 gi 48762938 apolipoprotein E precursor [Homo sapiens]

amyloid beta A4 protein isoform b precursor [Homo gi|41406055 gi|228008404 sapiens].

tumor necrosis factor receptor superfamily; member gi|23510421 gi|23510420 6 isoform 2 precursor [Homo sapiens]

gi 15718706 gi 122056469 caspase 8 isoform B precursor [Homo sapiens] gi 1 19575060 Homo sapiens CD24 molecule (CD24)

Homo sapiens CD97 molecule (CD97); transcript gi 117978489 gi|68508947 variant 1

chromodomain helicase DNA binding protein 3 gi|52630326 gi 1158420733 [Homo sapiens]

eukaryotic translation elongation factor 1 gamma gi|4503481 gi|83656774 [Homo sapiens]

gi 1 16063573 gi 160420313 filamin A; alpha isoform 1 [Homo sapiens].

glial fibrillary acidic protein isoform 1 [Homo gi|4503979 gi 11961 15280 sapiens]

HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 gi 1150418002 gi 1150418001 chain precursor [Homo sapiens]

interferon alpha-inducible protein 27, mitochondrial gi|55925614 gi|55925613 isoform 2 [Homo sapiens]

gi 10835145 gi 27894305 interleukin 1 ; beta proprotein [Homo sapiens]

interleukin-7 receptor subunit alpha precursor gi|28610151 gi|28610150 [Homo sapiens] gi 1 19703755 gi 1 19703754 laminin; beta 2 precursor [Homo sapiens].

gi 5031877 gi 27436949 Lamin B1 [Homo sapiens]

gi 82534351 gi 189409155 microtubule-associated protein tau isoform 1 gi 4505241 gi 98991774 protein Mpv17 [Homo sapiens]

interferon-induced GTP-binding protein Mx1 [Homo gi|222136617 gi|222136616 sapiens]

neurofilament; light Polypeptide 68kDa [Homo gi 1105990539 gi 1197927150 sapiens]

nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3 gi|27886561 gi|27886560 isoform 1 [Homo sapiens]

gi 205360954 gi 205360953 polycystin-1 isoform 1 precursor [Homo sapiens] gi 32171249 gi 38505192 prostaglandin-H2 D-isomerase [Homo sapiens]

Homo sapiens protein tyrosine Phosphatase;

gi|18641347 gi 11 15385975 receptor type; C (PTPRC); transcript variant 1 gi 4506367 gi 209915550 ras-related protein Rab-3A [Homo sapiens] gi 4506701 gi 71772514 40S ribosomal protein S23 [Homo sapiens] gi 4506841 gi 561 19169 C-C motif chemokine 2 precursor [Homo sapiens] gi 19557702 gi 157266286 surfeit 6 [Homo sapiens]

DNA-directed RNA Polymerase III subunit RPC3 gi|21359969 gi|141801742 [Homo sapiens]

gi 5803227 gi 21464103 14-3-3 protein theta [Homo sapiens]

protein kinase C and casein kinase Substrate in gi|148747351 gi|296841089 neurons 2 [Homo sapiens]

gi 1 1321634 gi 125987597 CD2-associated protein [Homo sapiens]

E3 ubiquitin-protein ligase makorin-1 isoform 1 gi|223468620 gi|223468619 [Homo sapiens]

gi 243081 13 gi 291 190751 KIF1 binding protein [Homo sapiens].

Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 [Homo gi|82617630 gi|82617629 sapiens]

HERV-W_7q21 .2 provirus ancestral Env polyprotein gi|48949851 gi|48949850 precursor [Homo sapiens]

interleukin-23 subunit alpha precursor [Homo gi|7706702 gi|28144902 sapiens]

dysbindin domain-containing protein 2 isoform b gi 11 15299754 gi 11 15299753 [Homo sapiens]

gi 70887780 gi 70887779 Homo sapiens sperm associated antigen 16

partitioning defective 3 homolog B isoform b [Homo gi 11 19120897 gi 11 19120896 sapiens]

gi 209969690 gi 209969689 hypothetical protein LOC1 19032 [Homo sapiens] gi 187960086 gi 187960086 cytochrome P450 4V2 [Homo sapiens]

g 6978649 gi 242246959 choline/ethanolamine kinase [Homo sapiens] gi 4506649 gi 76496470 60S ribosomal protein L3 isoform a [Homo sapiens]

SWI/SNF related, matrix associated, actin gi|27545326 gi|55956799 dependentregulator of chromatin, subfamily b, member 1 [Homo sapiens]

metastasis-associated protein MTA1 [Homo gi|1 15527080 gi 11 15527079 sapiens]

gi 56788399 gi 56788398 Gl:56788398

TNFAIP3-interacting protein 2 isoform 1 [Homo gi|239787092 gi 1239787091 sapiens]

gi 541 12429 gi 541 12428 dedicator of cytokinesis protein 7 [Homo sapiens] gi 4504603 gi 150593016 Interferon betal

gi 4504605 gi 4504604 Interferon omega

gi 10834984 gi |224831235 Interleukin IL-6

gi 10835141 gi 24430216 Interleukin IL-10

interleukin-12 subunit alpha precursor [Homo gi|24430218

gi|24430219 sapiens]

interleukin-12 subunit beta precursor [Homo gi|24497437

gi|24497438 sapiens]

brain-derived neurotrophic factor isoform b gi|219842281

gi|25306235 preproprotein [Homo sapiens]

gi 4758020 gi 209574322 ciliary neurotrophic factor [Homo sapiens] gi 10834978 gi|28610153 interleukin-8 precursor [Homo sapiens]

gi 89903008 gi 237858673 neurofascin isoform 4 precursor [Homo sapiens] gi 17158044 gi 17158043 ribosomal protein S6 [Homo sapiens]

Ankyrin repeat and SAM domain-containing protein gi|51476647 gi|51476646 6

splicing factor, arginine/serine-rich 7 [Homo gi|72534660 gi 1197209865 sapiens]

gi 13128968 gi 13128967 dual specificity Phosphatase 26 [Homo sapiens] proteasome (prosome, macropain) subunit, beta gi|22538467 gi|22538466 type, 4 [Homo sapiens]

gi 15055539 gi 70609878 ribosomal protein S2 [Homo sapiens]

DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box Polypeptide 50 gi|13129006 gi|13129005 [Homo sapiens]

gi 4506663 gi 72377361 ribosomal protein L8 [Homo sapiens]

suppression of tumorigenicity 13 (colon Carcinoma) gi|19923193 gi 121237722 (Hsp70 interacting protein) (ST13)

gi 4506649 gi 76496470 ribosomal protein L3 isoform a [Homo sapiens] gi 4506743 gi 4506742 ribosomal protein S8 [Homo sapiens]

gi 5031877 gi 27436949 lamin B1 [Homo sapiens]

gi 94536842 gi 94536841 ribose 5-phosphate isomerase A [Homo sapiens] gi 17157993 gi 141803509 olfactomedin 2 [Homo sapiens]

radical S-adenosyl methionine domain containing 1 gi|892291 1 gi|8922910 [Homo sapiens]

gi 4826724 gi 17105402 zygin 1 isoform 1 [Homo sapiens]

gi 6806913 gi 187960101 centaurin, alpha 1 [Homo sapiens]

gi 5454058 gi 5454057 ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 4 [Homo sapiens]

SUMO1 /sentrin/SMT3 specific protease 2 [Homo gi|54607091 gi|54607090 sapiens]

gi 166063995 gi 166063994 general transcription factor INA [Homo sapiens] gi 72534684 gi 166197669 phospholipase D family, member 3 [Homo sapiens] gi 14591909 gi 71772259 ribosomal protein L5 [Homo sapiens]

gi 1 1415026 gi 15431299 ribosomal protein L18a [Homo sapiens]

GIY-YIG domain containing 2 isoform 1 [Homo gi 113129004 gi|30089943 sapiens]

gi 62414289 gi 240849334 vimentin [Homo sapiens]

MYC-associated zinc finger protein isoform 1 gi|1 10347461 gi| 1 10347460 [Homo sapiens]

gi 4758648 gi 187761329 kinesin family member 5B [Homo sapiens] gi 4502337 gi 38372939 alpha-2-glycoprotein 1 , zinc-binding [Homo sapiens] gi 6912642 gi 142383813 sex comb on midleg 1 isoform 2 [Homo sapiens] gi 4503065 gi 62241006 crystallin, mu isoform 1 [Homo sapiens]

gi 4505409 gi 66392201 nucleoside diphosphate kinase B [Homo sapiens] ubiquitin-conjugating enzyme E2M (UBC12 gi|4507791 gi 1150417997 homolog, yeast)

gi 7657015 gi 187936926 hypothetical protein LOC51493 [Homo sapiens]

28S ribosomal protein S1 1 , mitochondrial isoform a gi 116554609 gi 116554608 [Homo sapiens]

serine/threonine-protein Phosphatase 2A activator gi|2972561 1 gi|30065641 isoform b [Homo sapiens]

ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 2 gi|5902082 gi|151 101481 [Homo sapiens]

gi 29893564 gi 34222264 microspherule protein 1 isoform 1 [Homo sapiens]

60S ribosomal export protein NMD3 [Homo gi 119923796 gi 1142359942 sapiens]

gi 4506661 gi 18390348 ribosomal protein L7a [Homo sapiens]

gi 16579885 gi 16579884 60S ribosomal protein L4 [Homo sapiens] gi 40548389 gi 66346686 dickkopf homolog 3 precursor [Homo sapiens]

acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 gi|5453880 gi|221219065 family, member A [Homo sapiens]

transcription factor HIB 90 kDa subunit isoform 3 gi|22035558 gi 1148833509 [Homo sapiens]

gi 4506617 gi 78000184 ribosomal protein L17 [Homo sapiens]

gi 27545323 gi 168229166 chondroitin polymerizing factor [Homo sapiens] gi 62750347 gi 62750346 histone deacetylase 5 isoform 1 [Homo sapiens] gi 100913206 gi 100913205 ATP-dependent RNA helicase A [Homo sapiens]

SH2 domain-containing adapter protein B [Homo gi|106879210 gi 1106879209 sapiens]

gi 18152783 gi 18490985 60S ribosomal protein L10-like [Homo sapiens] gi 15431301 gi 72187675 ribosomal protein L7 [Homo sapiens] 24-dehydrocholesterol reductase precursor [Homo gi|13375618 gi|1 14155130 sapiens]

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 [Homo gi|14043070 gi|83641894 sapiens]

gi 22202633 gi 88999578 prefoldin subunit 5 isoform alpha [Homo sapiens] actin-related protein 2/3 complex subunit 1 A gi|22907052 gi|300360513 isoform 1 [Homo sapiens]

D-3-phosphoglycerate dehydrogenase [Homo gi|23308577 gi|217272837 sapiens]

nuclease-sensitive element-binding protein 1 [Homo gi|34098946 gi 1109134359 sapiens]

A-kinase anchor protein 1 precursor [Homo gi 14502015 gi 1109637793 sapiens]

gi 4502027 gi 215982788 albumin preproprotein [Homo sapiens]

gi 4506631 gi 15812218 60S ribosomal protein L30 [Homo sapiens] gi 4506667 gi 49087144 60S acidic ribosomal protein PO [Homo sapiens] gi 4508007 gi 197382778 zinc finger protein 174 isoform a [Homo sapiens] gi 5031851 gi 44889961 stathmin isoform a [Homo sapiens]

chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3 gi|52630322 gi 1158420732 isoform 2 [Homo sapiens]

LON peptidase N-terminal domain and ring finger 1 gi|87080813 gi|87080812 [Homo sapiens]

gi 9945439 gi 90193629 septin-5 [Homo sapiens]

endoplasmic reticulum protein 29 isoform 1 gi|5803013 gi|77628146 precursor [Homo sapiens]

gi 168229248 gi 168229247 asparagine synthetase [Homo sapiens]

protein tyrosine Phosphatase, non-receptor type 5 gi|90652861 gi|90652860 (striatum-enriched) isoform b [Homo sapiens]

GTP-binding protein PTD004 isoform 2 [Homo gi|58761502 gi|58761501 sapiens]

DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 2 gi|94538370 gi|94538369 isoform 1 [Homo sapiens]

synovial sarcoma translocation gene on

gi|10047104 gi 11 10227859 chromosome 18-like 2 [Homo sapiens]

gi 9951915 gi 239937553 S-adenosylhomocysteine hydrolase [Homo sapiens] gi 4507729 gi 68299771 tubulin, beta 2 [Homo sapiens]

gi 5031875 gi 153281091 lamin A/C isoform 2 [Homo sapiens]

gi 41393561 gi 41393560 leucine aminopeptidase 3 [Homo sapiens]

chromosome 12 open reading frame 51 [Homo gi 1157885806 gi 1157885805 sapiens]

gi 1 19624431 0 hCG2041 192 [Homo sapiens]

spectrin, beta, non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homo gi|1 12382250 gi 11 12382249 sapiens]

gi 93141029 gi 93141028 paralemmin isoform 2 [Homo sapiens]

gi 4501867 gi 4641 1 160 aconitase 2 precursor [Homo sapiens] gi 88758580 gi 221554513 cyclin L2 isoform A [Homo sapiens]

gi 5901922 gi 39995072 cell division cycle 37 protein [Homo sapiens] gi 21624607 gi 23510452 coactosin-like 1 [Homo sapiens]

interleukin enhancer binding factor 2 [Homo gi|24234747 gi|24234746 sapiens]

gi 160420328 gi 160420327 iron-sulfur Cluster assembly 2 [Homo sapiens]

DEAD (Asp-Glu-Ala-As) box Polypeptide 19 isoform gi|6005743 gi|62241020 1 [Homo sapiens]

gi 15010818 gi 15010817 JKTBP1 delta6 [Homo sapiens]

gi 4502847 gi 186972139 cold inducible RNA binding protein [Homo sapiens] trinucleotide repeat containing 4, isoform CRA_a gi|71 164894 gi|71 164893 [Homo sapiens]

gi 4758206 gi 187608704 dual specificity Phosphatase 2 [Homo sapiens] gi 5730009 gi 1 15387097 ret finger protein [Homo sapiens]

gi 7657689 gi 21327683 YME1 -Iike 1 isoform 3 [Homo sapiens]

CDK5 regulatory subunit associated protein 3 gi|28872792 gi|28872791 [Homo sapiens]

gi 15147333 gi 189458899 tripartite motif-containing 37 protein [Homo sapiens] gi 29826319 gi 29826318 adducin 1 (alpha) isoform a [Homo sapiens]

F-box and leucine-rich repeat protein 15 [Homo gi|190194416 gi|190194415 sapiens]

gi 4758272 gi 46389548 endosulfine alpha isoform 3 [Homo sapiens] gi 166795250 gi 166795249 kinesin family member 2C [Homo sapiens]

widely-interspaced zinc finger motifs [Homo gi|151301 15 gi|151301214 sapiens]

gi 46048234 gi 194294559 nucleolar protein 8 [Homo sapiens]

gi 219842250 gi 219842249 periphilin 1 isoform 8 [Homo sapiens]

huntingtin interacting protein-1 -related [Homo gi|48762942 gi|48762941 sapiens]

protein Phosphatase 1 , catalytic subunit, alpha gi|4506003 gi|45827796 isoform 1 [Homo sapiens]

amyloid precursor-like protein 1 isoform 1 precursor gi|67782338 gi|67782337 [Homo sapiens]

gi 17402896 gi 17402895 RAD51 homolog C isoform 1 [Homo sapiens] gi 5453629 gi 34335254 dynactin 2 [Homo sapiens]

gi 1 1968182 gi 14165467 ribosomal protein S18 [Homo sapiens]

gi 122937289 gi 122937288 kinesin family member 18B [Homo sapiens] gi 155029542 gi 155029541 BEN domain containing 7 isoform 1 [Homo sapiens] guanine nucleotide-binding protein, beta-1 subunit gi|1 1321585 gi|20357526 [Homo sapiens]

B-cell CLL/lymphoma 1 1 B isoform 2 [Homo gi 112597635 gi 112597634 sapiens]

cyclin-dependent kinase inhibitor 2C (p18, inhibits gi|4502751 gi 117981697 CDK4), isoform CRA_b [Homo sapiens] myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4 gi|7662046 gi|7662045 [Homo sapiens]

gi 37537687 gi 37537686 zinc finger protein 444 [Homo sapiens]

gi 133922582 gi 133922581 zinc finger protein 358 [Homo sapiens]

inhibitor of growth family, member 4 isoform 3 gi|189083826 gi 1189083825 [Homo sapiens]

gi 1 10224479 gi 1 10224478 prosaposin isoform c preproprotein [Homo sapiens] gi 21264343 gi 21264342 scaffold attachment factor B [Homo sapiens] gi 14670375 gi 14670374 SCG10-like-protein [Homo sapiens]

gi 12545395 gi 94721348 islet cell autoantigen 1 [Homo sapiens]

ADP-ribosylation factor-like protein 16 [Homo gi|91 199552 gi|91 199551 sapiens]

gi 21614499 gi 161702984 ezrin [Homo sapiens]

DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1 gi|5453690 gi|5453689 [Homo sapiens]

gi 20070228 gi 39725676 nucleobindin 1 [Homo sapiens]

myosin, heavy Polypeptide 9, non-muscle [Homo gi 112667788 gi|225703132 sapiens]

gi 5902158 gi 215422343 ring finger protein 1 13A [Homo sapiens]

v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 gi|6224101 1 gi|62241010 [Homo sapiens]

gi 2773491 1 gi 27734910 DAZ interacting protein 1 -like [Homo sapiens]

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Homo gi|7669492 gi|83641890 sapiens]

gi 7657514 gi 21314660 GTP-binding protein RHO6 [Homo sapiens]

protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type I, gi|38257139 gi|38257138 beta [Homo sapiens]

gi 23503295 gi 26787971 casein kinase 2, beta Polypeptide [Homo sapiens] gi 20128774 gi 47519746 mitogen-activated protein kinase 1 1 [Homo sapiens] gi 4759274 gi 215422360 thioredoxin-like 1 [Homo sapiens]

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 gi|32189394 gi|50345985 complex, beta subunit precursor [Homo sapiens]