【발명의 명칭】 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 마커 및 이의 용도

【기술분야】 본 출원은 2017년 8월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2017- 0097726호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서들 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

본 발명은 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-lactamase class D OXA-23) , 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem— associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 ^' (TonB_dependent siderophore receptor protein) , ompE( Outer membrane protein E) , ompW(0uter membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Beta-lactamase class C Adc-73)의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 아시네토박터 바우마니 ( A://?eii?Z c e/ ^" baumannii) 감염 진단 용도와 이의 이용에 대한 것이다.

【배경기술】 아시네토박터 속의 균은 그람음성 간균으로 포도당 비발효 세균이며， 이들은 토양， 물, 하수 등을 포함한 자연환경， 사람의 피부， 구강， 호흡기계 점막 등에 상재균으로 분포한다. 이들 세균은 신생아， 비장 절제술 시행 환자， 장기간 스테로이드를 투여한 환자， 항암 치료 중인 암환자， 장기 이식 환자, 집중치료실 환자와 같은 면역력이 저하된 고위험군에서 내인성 기회감염의 주요 원인균이다 (Patrick PR, et al.eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th eds. ASM press. 2003) . 아시네토박터 바우마니 C4c//7e o&ac er baumannii)는 주요한 병원감염 병원균 (nosocomial pathogen)으로 이에 의한 감염증은 다양한데, 주로 폐렴과 균혈증이 발생하는 것으로 알려져있으며， 다 (약)제 내성 균주의 증ᅳ가 때문에 큰 문제가 되고 있다 (Bergogne-Berezin and Towner , CI in Microbiol Rev. 19969:148-65； Kolenti and Rello, Expert Op in Pharmacol; her · 2006 Aug;7(12): 1555-69). 이들은 다양한 항생제 내성 (resistance)을 나타낼 뿐이 아니라 치료기간 중에도 항생제에 대해 새로운 내성을 발달시킨다. 이런 내성을 갖는 박테리아에 의한 감염은 치료에 있어 선택할 수 있는 항생제의 종류가 매우 적거나 없기 때문에 더 높은 치사율을 갖는다.

현재 아세토박터 바우마니의 진단은 주로 세균배양 진단법에 의존하고 하고 있는 실정이나, 이러한 방법은 결과 도출까지 시간이 많이 소요되기 때문에 검사결과가 나오는 기간 동안에는 의료진의 경험에 의존하여 치료 약물 및 방법을 결정하여야 하고 이에 기인한 치료 실패율이 상당하다는 문제점이 있다. 따라서 감염 초기의 신속한 대응 및 적절한 치료를 위해서는 아시네토박터 바우마니 신속진단 기술개발이 절실히 필요한 실정이다. 이러한 신속진단 기술 개발을 위해서는 검출 대상 생물의 특성을 면밀히 파악하여， 해당 감염원에 목적하는 검출 특성에 특이적이면서도 검출이 용이한 지표 물질들을 선별하는 것이 최우선으로 수행되어야 한다. 뿐만아니라 상기 지표물질의 선별은 감염원에 감염된 환자의 임상적 특성 측면에서도 고려되어야 실질적 실효성을 거둘 수 있기 때문에, 정확하면서도 신속하게 진단결과를 도출할 수 있는 지표물질을 설정하는 것에는 실질적으로 많은 시간， 비용 및 노력이 소요되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 이에 본 발명자들은 아시네토박터 바우마니， 특히 다제내성 아시네토박터 바우마니의 신속 진단기술 개발을 위해 연구하던 중， 본 발명에서 제공하는 6종의 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 마커로서 이용할 때 목적하는 검출 특성에 대한 특이성이 높을 뿐만 아니라 상기 균의 감염에 대한 임상적 특성과 밀접히 연관되어있어 마커로서 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은， 베타 -락타메이즈 클래스 D OXA-23 (Bet a- lactamase class D OXA-23) , 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associated resi stance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB_dependent siderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E) , omp (0uter membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc—73 (Beta-lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는， 아시네토박터 바우마니 baumannii) 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 또는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 단백질 또는 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은， 아시네토박터 바우마니 baumannii) 감염 진단용 제제를 제조하기 위한， 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta- lact mase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem- associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB_dependent siderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E) , ompW(0uter membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 베타- 락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-lactamase class D OXA-23) , 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem— associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB一 dependent siderophore receptor protein) , ompE(0uter membrane protein E) , ompW(0uter membrane protein W) 및 베타一 락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출하는 단계; b) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 c) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준이 대조군 수준보다 높으면 아시네토박터 바우마니에 감염된 것으로 판단하는 단계를 포함하는 아시네토박터 ^^ ^v \^< j ^' netobacter baumaimii) 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-lactamase class D OXA-23) , 카바페넴—연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem— associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 ( nB—dependent siderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E), ompW(0uter membrane protein W) 및 베타一락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는， 아시네토박터 바우마니 C4c/7e oAac er baumannii) 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 단백질 또는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는아시네토박터 바우마니 감염 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 아시네토박터 바우마니 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 단백질 또는 유전자를 검출하는 방법올 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아시네토박터 바우마니 ( "//2 ac er baumannii) 감염 진단용 제제를 제조하기 위한， 베타- 락타메이즈 클래스 D OXA-23 (Bet a- lactamase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem—associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB一 dependent siderophore receptor protein) , ompE( Outer membrane protein E), ompW( Outer membrane protein W) 및 베타一 락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 베타 -락타메이즈 클래스 D OXA-23 (Bet a- lactamase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB-dependent siderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E), ompW(0uter membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출하는단계 ; b) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준을 대조군과 비교하는 단계 ; 및 c) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준이 대조군 수준보다 높으면 아시네토박터 바우마니에 감염된 것으로 판단하는 단계를 포함하는 아시네토박터 바우마니 (A je ofec er baumannii) 감염 진단 방법을 제공한다.

이하본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 '발현 (expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드 (polypeptide)' 또는

'펩타이드 (peptide)'와 호환성 있게 사용되며， 예컨대， 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)' 또는 '핵산 '은 단일 -또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한， 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보 (유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다. 본 발명에서 용어 "마커" 또는 "바이오마커" 란 아시네토박터 바우마니를 다른 균과 구분하여 검출할 수 있는 물질.을 의미하는 것으로서， 아시네토박터 바우마니에서만 특이적으로 존재하는 폴리펩 이드 또는 핵산 (예: mRNA 등)， 지질， 당지질， 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류， 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 또한 바람직하게, 본 발명에서 상기 마커의 역할은 항생제 내성 아시네토박터 바우마니 균을 항생제 감수성 아시네토박터 바우마니 균과 구분하여 진단할 수 있는 물질로서 이해될 수 있으며, 항생제 감수성 균에 비하여 항생제 내성 균에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA둥)， 지질， 당지질， 당단백질 또는 당 (단당류， 이당류， 을리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다.

본 발명에서 용머 "진단" 은， 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 진단은 아시네토박터 바우마니 감염 여부를 확인하는 것일 수 있으며， 바람직하게는 항생제 내성 아시네토박터 바우마니, 특히 다제내성 아시네토박터 바우마니 (Mul t idrug-res i stant Acinetobacter baumannii, MRAB) 감염여부를 확인하는 것일 수 있다. 또한 가장 바람직하게, 본 발명에서 상기 진단은 아시네토박터 바우마니가 특정 항생제에 대한 내성을 획득했는지 여부를 확인하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 이하에서 기재하는 6종 유전자 및 이로부터 발현된 단백질들의 아시네토박터 바우마니 (특히， 항생제 내성이 있는 아시네토박터 바우마니)균의 검출, 또는 상기 균의 감염 진단 마커로서의 용도를 확인하였다.

따라서 본 발명은， 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-l actamase c l ass D OXA-23) , 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associ ated res i stance protein precursor ) , TonB 시"이드로포어 수용체 단백질 (TonB— dependent s i derophore receptor protein) , orapE(0uter membrane protein E) , ompW( Outer membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- l actamase c l ass C Adc_73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는， 아시네토박터 바우마니 C4c// e c?bac er baumannii) 감염 진단용 조성물을 제공한다.

상기 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Bet a- l actamase c l ass D OXA-23) 단백질은 당업계에 A. baumanni i가 발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23은 서열번호 Genbank access i on no . A0X75888)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고， 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Bet a- l actamase class D OXA-23) 단백질을 코딩하는 유전자는， 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자 서열이 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associ ated res i stance protein precursor )는'당업계에 A. baumanni i7\ 발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체는 서열번호 3(Genbank access ion no . A0X78535)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 또는 상기 서열번호 3의 아미노산서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associ ated res i stance protein precursor )를 코딩하는 유전자는, 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자 서열이 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 4으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB-의존 사이드로포어 수용체 단백질， TonB-dependent s iderophore receptor protein)는 당업계에 A.

발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 TonB 사이드로포어 수용체 단백질은 서열번호 5(Genbank access ion no . A0X77361)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고， 또는 상기 서열번호 5의 아미노산서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB-dependent s iderophore receptor protein)을 코딩하는 유전자는， 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자 서열이 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 ompE(0uter membrane protein E)는 당업계에 A baumanni P\ 발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 ompE는 서열번호 7(Genbank accession no . A0X78734)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고， 또는 상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. . 상기 ompE(0uter membrane, protein E)를 코딩하는 유전자는， 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자 서열이 특별히 제한되지 않으며 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 8로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 ompW(0uter membrane protein W)는 당업계에 A. baumannii 발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 ompW는 서열번호 9(Genbank access ion no . AB010762)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고， 또는 상기 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 상기 ompW(0uter membrane protein W)를 코딩하는 유전자는， 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자서열이 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73(Beta-lactamase class C Adc-73)는 당업계에 A b mianniA 발현하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 본 발명의 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73은 서열번호 lKGenbank accession no. A0X78355)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고， 또는 상기 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73(Bet a- lactamase class C Adc-73)를 코딩하는 유전자는， 상기 단백질을 코딩하는 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 유전자 서열이 특별히 제한되지 않으며， 바람직하게는 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열일 수 있으며， 더욱 바람직하게 상기 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 아시네토박터 바우마니는， 바람직하게 항생제 내성 아시네토박터 바우마니일 수 있다. 상기 항생제는 당업계에 항생제로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 베타 -락탐 (β -Lactam)계， 세팔로스포린 (Cephalosporin)계， 카바페넴 (Carbapenem)계， 아미노글리코사이드 (Aminoglycoside)계 플루오로퀴놀론 (Fluoroquinolone)계， 테트라사이를린 (Tetracycline)계, 폴리믹신 (Polymyxin)계 및 설폰아마이드 (Sulphonamide)계 항생제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으며， 이에 제한되지 않는다. 상기 베타 -락탐 (β-Lactam)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 엠피실린 (Ampicillin), 설박탐 (Sulbactam)， 티카르실린 (Ticarcillin), 클라뷰란산 (Clavui lanic acid), 피페라실린 (Piperacillin) 및 타조박탐 (Tazobactam)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 세팔로스포린 (Cephalospor in)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 세포탁심 (Cefotaxime) , 세프타지딤 (Ceftazidime)， 세페핌 (Cefepime) 및 아즈트레오남 (Aztreonam)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 카바페넴 (Carbapenem)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 이미페넴 ( Imipenem) 및 메로페넴 (Meropenem)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 아미노글리코사이드 (Aminoglycoside)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 아미카신 (Amikacin) 및 젠타마이신 (Gentamicin)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 플루오로퀴놀론 (Fluoroquinolone)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 시프로플록사신 (Ciprof loxacin)일 수 있다. 상기 테트라사이를린 (Tetracyc l ine)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 미노사이클린 (Minocyc l ine) 및 티지사이클린 (Tigecycl ine)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 상기 폴리믹신 (Polymyxin)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 콜리스틴 (Col i st in)일 수 있다. 상기 설폰아마이드 (Sulphonamide)계 항생제는 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 트리메소프림 (Tr imethopr im) 및 설파메특사졸 (Sul famethoxazole)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '다제내성' 은 약리작용이 다른 2종 이상의 약제에 대하여 생물이 동시에 내성 (耐性)을 나타내는 것을 의미하는 것으로， 본 발명의 상기 아시네토박터 바우마니는 더욱 바람직하게 다제내성 아시네토박터 바우마니 일 수 있다. 상기 아시네토박터 바우마니는 베타 -락탐 ( β -Lactam)계, 세팔로스포린 (Cephalospor in)계， 카바페넴 (Carbapenem)계， 아미노글리코사이드 (Aminoglycoside)계 , 플루오로퀴놀론 (Fluoroquinolone)계， 테트라사이를린 (Tetracycl ine)계， 폴리믹신 (Polymyxin)계 및 설폰아마이드 (Sulphonamide)계 항생제 모두에 내성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 6종의 . 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질들을 아시네토박터 바우마니 감염에 대한 진단용 마커로서 이용하여 해당 유전자들의 발현상태를 조사하면， 아시네토박터 바우마니 균의 존재 여부에 대한 뿐만아니라 상기 균의 항생제 내성 또는 다제내성 획득 여부에 대한 특성을 있다. 이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.

본 발명의 실시예에서는 항생제에 대한 감수성이 있는 (sens i t ive) A. baumannii 와 비교실험을 통하여 본 발명의 6종 마커들이 특이적으로 다제내성 . baumannii를 검출할수 있음을 확인하였다.

상기 6종 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질들의 신규한 진단 용도에 기반하여， 본 발명은 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-l actamase c l ass D 0XA-23) , 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem— assoc i ated res i st ance protein precursor ) , TonB사이드로포어 수용체 단백질 (TonB— dependent s iderophore receptor protein) , ompE( Outer membrane protein E) , ompW (Outer membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- l actamase c l ass C Adc_73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출하는 제제를 포함하는, 아시네토박터 바우마니 감염 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 아시네토박터 바우마니 감염 진단 키트를 제공한다.

상기 6종 단백질을 검출하는 제제는, 상기 6종 단백질에 특이적으로 부착하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 예를 들어 상기 단백질에 특이적인 결합도메인을 갖는 펩타이드， 항체, 또는 앱타머일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.

상기 "항체" 란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 언급한 하나 이상의 단백질 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한， 상기 항체는 다클론 항체， 단클론 항체， 키메릭 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 "펩타이드" 란 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 (결합 도메인)를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 펩타이드는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미한다. 상기 펩타이드의 길이는 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 2 내지 100개의 아미노산을 포함하는 것 일 수 있고， 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산을 포함하는 것 일 수 있다.

상기 "앱타머" 는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는. 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식 (modi f ied) 핵산또는 이들의 흔합물일 수 있으며, 직쇄상또는 환상의 형태일 수 있다.

상기 6종 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하는 제제는 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명의 상기 6종 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 흔성화 (hybr idi zat ion)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머 쌍또는 프로브 일 수 있다.

상기 "프라이머" 는 짧은 자유 3-말단 수산화기 (free 3 ' hydroxy 1 group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍올 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완층용액 및 온도에서 중합반웅을 위한 시약 (즉， DNA폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명은 전술한 6종 단백질. 마커를 코딩하는 유전자 (mRNA)를 검출하는 프라이머쌍을 이하와 같이 제공한다. 베타 -락타메이즈 클래스 D OXA-23 (Bet a- lactamase class D OXA-23)를 코딩하는 유전자는 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다. 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associated resistance protein precursor)를 코딩하는 유전자는 서열번호 29 및 30의 염기서열로표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다，

TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB一 dependent siderophore receptor protein)을 코딩하는 유전자는 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다. ompE(0uter membrane protein E)를 코딩하는 유전자는 서열번호 37 및 38의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다. ompW (Outer membrane protein W)를 코딩하는 유전자는 서열번호 47 및 48의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다. 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)을 코딩하는 유전자는 서열번호 57 및 58의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍으로 검출될 수 있다.

상기 "프로브" 는 mRNA외 특이적으로 결합을 이를 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무， 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는， 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브， RNA 프로브 또는 PNA(Pept ide nucleic acid) 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 흔성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 키트는 당업계에 특정 결합 도메인을 갖는 펩타이드， 항체 또는 앱타머를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사성면역분석법， 방사면역확산법， 오우크테로니 면역확산법, 로케이트 면역전기영동， 조직면역염색， 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법， FACS또는 단백질 칩용 키트 등을 포함한다. 일례로, 상기 키트는 상기 6종 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체， 다클론 항체 또는 재조합 항체 (키메릭 항체)이다. 또한 상기 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면， 표지된 2차 항체 , 발색단( (±1 ^" 01110 110^3 )， 효소 (항체와 컨주게이트된 형태로서 ) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 당업계에 프라이머 (프라이머쌍) 또는 프로브를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 PCR(polymerase chain react ion, 중합효소연쇄반웅)， RNase 보호 분석법， 노던 블랏팅， 서던 블랏팅 또는 DNA마이크로어레이 칩용 키트 등을 포함한다. 일례로， 상기 진단 키트는 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 중합효소반웅 키트는 마커 유전자 (mRNA)에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자 (mRNA)의 핵산서열에 특이적인 서열올 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 ^' 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 중합효소반웅 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반웅 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양)， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs) , DNA 폴리머라아제 (예를 들어 Taq-폴리머라아제) 및 역전사효소， DNAse , RNAse 억제제 DEPC-수 (DEPOwater)， 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 아시네토박터 바우마니 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA- 23 (Bet a- lactamase class D OXA-23) , 카바페넴—연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem— associated resi stance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB—dependent s iderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E) , ompWCOuter membrane protein W) 및 베타一락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출하는 방법을 제공한

상기 '검체' 는 아시네토박터 바우마니에 감염이 되었는지에 대한 정보가 없어서 본 발명의 방법에 따라 감염 여부를 판별해야 하는 분석 대상 개체를 의미한다. 바람직하게 항생제 내성 (특히 다제내성) 아시네터박터 바우마니에 감염이 되었는지에 대한 정보가 없는 분석 대상 개체를 의미하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료''는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료， 생검 표본， 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나， 조직， 추출물， 세포 용해물， 전혈 (혈액) , 혈장, 혈청， 침， 안구액， 뇌척수액， 땀， 뇨 (소변)， 젖, 복수액， 활액， 복막액， 객담， 폐포세척액 등일 수 있다. 바람직하게 상기 시료는 침， 객담， 폐포세척액， 소변, 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며， 가장 · 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어， 균질화 (homogeni zat i on) , 여과 증류， 추출， 농축, 방해 성분의 불활성화， 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

아시네토박터 바우마니 감염 진단 방법은, 당업자에게 있어 마커 단백질 또는 이의 유전자들의 검출을 통해 아시네토박터 바우마니 감염 여부 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로서 이해될 수 있다.

본 발명에서 용어 '검출' 은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하며, 상기 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다. ^" 상기 검출 단계 ( 1 단계)는 상기 6종 단백질을 검출하는 것일 수 있고， 또는 상기 6종 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하는 것일 수 있다.

상기 단백질 검출은， 본 발명에서 마커로 제공하는 6종 단백질의 존재 여부 검출， 또는 상기 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 확인하는 것을 포함하는 의미이다. 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 항원 -항체 결합반응 방식에 의한 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 단백질 검출은 효소면역분석법 (ELISA) , 방사면역분석법 (radioimmunoassay, RIA) , 방사면역확산법 (Radi al Immunodi f fusion) , 샌드위치 ELISA법， 웨스턴 블롯， 면역침전법， 면역조직화학염색법, 면역전기영동법， 오우크테로니 면역확산법 (Ouchter lony immunodi f fusion) , 면역형광법， 효소기질발색법， 항원 -항체 응집법， SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것일 수 있다.

상기 유전자 검출은， 본 발명에서 마커로 제공하는 6종 단백질을 코딩하는 각각의 유전자에서 전사된 mRNA의 존재 여부 검출， 또는 상기 mRNA의 발현량 증가 또는 감소를 확인하는 것을 포함하는 의미이다. 당업계에 공지된 mRNA 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 PCR, RNase 보호 분석법， 노던 블랏팅 (northern blott ing) , 서던 블랏팅 (southern blott ing) 및 DNA칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.

상기 아시네토박터 바우마니 감염 진단 방법은， 상기 단백질 또는 유전자를 검출하는 단계 ( 1단계)에서 검출된 단백질 발현 수준 또는 유전자의 mRNA 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계 (2 단계)를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 용어 '대조군' 이란， 아시네토박터 바우마니에 감염되지 않은 정상 또는 상기 정상 개체로부터의 시료를 의미하는 것 일 수 있다. 바람직하게 항생제 내성 아시네토박터 바우마니에 감염되지 않은 개체 (균 자체에 감염되지 않은 정상 개체 또는 항생제 감수성이 있는 균에 대해서만 감염된 개체) 또는 상기 개체로부터의 시료를 의미하는 것 일 수 있다.

상기 2단계의 '검출된 수준을 대조군과 비교하는 단계' 에서 베타 -락타메이즈 클래스 D OXA-23 (Bet a- lactamase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 (TonB-dependent siderophore receptor protein) , ompE (Outer membrane protein E) , ompW( Outer membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 검출 수준이 대조군 수준보다 높으면 (즉， 대조군보다 상향 발현 조절되면) 아시네토박터 바우마니에 감염된 것으로 판단할 수 있으며, 바람직하게는 항생제 내성 (특히， 다제내성) 아시네토박터 마우마니에 감염된 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 6종의 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 상향 발현 (up— regulating expression)은 기존에 항생제 감수성 아시네토박터 바우마니가 감염된 환자에서, 항생체 치료 중 상기 균이 내성을 획득함을 나타내는 지표로 작용할 수 있다.

본 발명은 아시네토박터 바우마니 ( c/ o^c er bau annii) 감염 진단용 제제를 제조하기 위한， 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA-23(Beta-lactamase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenem-associated resistance protein precursor) , TonB사이드로포어 수용체 단백질 (TonB一 dependent siderophore receptor protein) , ompE(0uter membrane protein E), ompW( Outer membrane protein W) 및 베타 -락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet a- lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 a) 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 베타 -락타메이즈 클래스 D 0XA- 23 (Bet a- lactamase class D OXA-23), 카바페넴 -연관 저항성 단백질 전구체 (Carbapenenrassociated resistance protein precursor) , TonB 사이드로포어 수용체 단백질 ( nB一 dependent siderophore receptor protein) , ompE( Outer membrane protein E) , ompW(0uter membrane protein W) 및 베타—락타메이즈 클래스 C Adc-73 (Bet - lactamase class C Adc-73)로 이루어지는 단백질군에서 선택되는 하나 이상의 단백질; 또는 상기 단백질군을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 검출하는 단계; b) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준을 대조군과 비교하는 단계; 및 c) 상기 검출된 단백질 또는 유전자의 수준이 대조군 수준보다 높으면 아시네토박터 바우마니에 감염된 것으로 판단하는 단계를 포함하는 아시네토박터 바우마니 (Ar/ ^' je obac e/" baumannii) 감염 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 아시네토박터 바우마니 감염의 개선， 치료， 예방， 검출， 진단 또는 아시네토박터 바우마니 감염의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한환자 (patient) 일 수 있다. 본 발명의 상기 '치료' 는 아시네토박터 바우마니 감염 또는 퇴행성 아시네토박터 바우마니 감염의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 이러한 질환을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 아시네토박터 바우마니 감염으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 '〜을 포함하는 (comprising)' 이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는' 과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서， 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '~로 구성되는 (consisting of)' 이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소， 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 구성되는 (essent i al ly cons i st ing of ) ' 이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서， 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것올의미한다.

【발명의 효과】 본 발명에서 제공하는 6종의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 마커들을 이용하면， 다제내성 아시네토박터 바우마니의 감염 여부를 차별적으로 검출가능할 뿐만 아니라， 기존의 혈액배양법 (세균배양 진단법) 등에 의한 진단보다 신속하고 정확한 검사결과를 제공하므로， 패혈증 등 다제내성 아시네토박터 바우마니 감염 질환의 초기에 신속한 대웅에 있어 매우 유리한 장점을 지닌다.

【도면의 간단한 설명】 도 1은 다제내성 A baumannii 균주들인 KAB01 내지 KAB08의

보여준다.

도 2는 KAB 균주들에서 막단백질 (MEM)과 분비단백질 (SEC , 0鮮로 부터의 단백질도 포함됨)을 분리한 방법을 나타낸 개요도이다.

도 3a는 다재내성 균주 KAB03(3가지 타입의 복합 항생제에 내성을 가진 균주)대상으로 항생제가 없는 조건 (KAB03— S)과 복합항생제 첨가조건 (KAB03-R)에서 균주 전체 단백질, 및 복합항생제 존재 조건에서의 막단백질 (KAB03-MEM) 및 분비체 (KAB03-SEC , 0MV로 부터의 단백질도 포함되는 개념)의 개수를 특성별로 분석한 결과를 나타낸다.

도 3b는 다재내성 균주 KAB03(3가지 타입의 복합 항생제에 내성을 가진 균주)대상으로 항생제가 없는 조건 (KAB03-S)과 복합항생제 첨가조건 (KAB03-R)에서 균주 전체 단백질， 및 복합항생제 존재 조건에서의 막단백질 (KAB03-MEM) 및 분비체 (KAB03-SEC)의 세포내 존재 위치를 분석한 결과를 나타낸다. 도 4는 Imipenem 항생제가 있는 조건과 항생제가 없는 조건 (Normal , LB 배지) 각각에서 배양된 다재내성 A bai/roa/ //(DU202)로부터 분리한 0MV(0uter Membrane Vehi cl es)를 Bi o-TEM으로 촬영하여 수득한 이미지이다. ^'

도 5는 Imipenem( IM) 항생제가 있는 조건과 항생제가 없는 조건 (Normal , LB 배지) 각각에서 배양된 다재내성 . baumannii로부^ 분리한 0MV(0uter Membrane Vehi c les) 파쇄물을 SDS-PAGE를 이용하여 전개하여 단백질을 분자량 별로 분리한 결과를 나타낸다.

도 6a는 Imipenem 항생제가 있는 조건과 항생제가 없는 조건 (Normal , LB 배지) 각각에서 배양된 다재내성 . baimannii로부 Έᅳ] 분리한 0MV 단백질 종류를 동정한 결과로， LB(control ) 조건에서는 332개, IM( Imipenem)조건에서는 290개의 단백질이 동정되었으며， 이들 단백질 중 양 조건에서 공통적으로 발현된 단백질은 191개인 것으로 나타났다.

도 6b는 Imipenem 항생제가 있는 조건과 항생제가 없는 조건 (Normal , LB 배지) 각각에서 배양된 다재내성 . wu/ra/ //로부터 분리한 0MV 단백질들의 세포내 분포를 CELLO v2.5 소프트웨어를 이용하여 확인해 본 결과를 나타낸다.

도 7a는 Imipenem 항생제가 있는 조건에서 배양된 다제내성 A baumannii로 지 수득된 막단백질체들을 2차원 겔 전기영동 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽) 방법을통하여 면역활성 분석한 결과를 나타낸다.

도 7b는 Imipenem 항생제가 있는 조건에서 배양된 다제내성 baumannii로^^ 수득된 분비단백질체들을 2차원 겔 전기영동 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽) 방법을 통하여 면역활성 분석한 결과를 나타낸다. 도 8은 검체 수집대상 환자들의 확보 현황을 월별로 나타낸다 (true infection: 내성균 진성 감염， colonization: 내성균 집락화， sensitive: 감수성균 집락화， negative control： 비감염 환자)

도 9는 다제내성 . baumannii 진정 감염 (true infect ion)군 및 내성균 집락군 (colonization)에서 다양한 항생제에 대한 감수성을 비교한 결과를 나타낸다.

도 10은 진정 감염 (true infection)군 및 내성균 집락군 (colonizat ion)에 있어서， 다제내성 A baumanni ― 다른 균들의 공동 감염 유형 (Co—infect ion style)을 조사한 결과를 나타낸다.

도 11은 최종 후보 마커 23 종에 대하여 다재내성 A baumannii 특이적 검출능을 비교 평가한 결과를 나타내는 것으로서， 각 마커에 특이적으로 제작된 프라이머를 이용하여 여러 가지 균종들 (KAB03(Resistant AB), AC19606(Sensitive AB) , Ε. co J /(Gram negative) , S. pneumonia (Gram positive), Burkholderia sp. 24(Gram negative))의 유전체를 대상으로 PCR을 수행하고, 이렇게 제작된 각 PCR product들을 전기영동한 결과를 나타낸다 (후보 마커 23종 중에서 도 11에 도시되지 않은 것은 PCR이 안되어서 표시하지 않음).

【발명의 실시를 위한 형태】 이하본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 주 특성 및 감염 환자에 대한 분석을 통한 다제내성 Acinetobacter baumannii진단 이"커의 선별

1-1. Acinetobacter baumannii균주 수집 2015년 ~2016년 서울 /경기， 대전 /층정, 대구 /경북， 부산 /경남， 전주 /전라의 국내 5군데 거점 병원 중환자실의 폐렴 환자에게서 분리한 36개의 A baumannii 균주 중 imipenem 내성 균주 8종을 선택하였다. 이들의 균주 이름은 KAB(Korean Acinetobacter baumannii)^. 명명하였다. gl tA , gyrB , gdhB , recA, cpn60 , GPI , rpoD 등의 유전자 시뭔싱을 이용한 Pasteur MLST법을 통해 A baumannii 균주임을 확인하였다 (표 1 참조) . 하기 표 1에서 A baumannii DU202 균주는 2006년 부산 (동아대병원)에서 수집된 균주이다.

【표 11 g!tA gyrB gdhB recA cpn60 6Pi rpoD ST 지역

DU202 46 3 2 2 142 3 423 부산 AB01 3 3 2 2 142 3 451 대전

KAB02 3 3 2 2 106 3 369 대전

KAB03 3 3 2 2 142 3 451 대전

KAB04 3 3 2 2 94 3 191 부산

KAB05 3 3 2 2 106 3 369 대구

KAB06 3 3 2 2 106 3 369 대구

KAB07 3 3 2 2 94 3 191 전주

KAB08 1 3 3 2 2 97 3 208 경기

1-2. 수집 균주의 항생제 내성 확인 (MIC test ) 상기 실시예 <1-1>에서 수집된 . baumannii균주들에 대하여 항생제 내성을 확인 하였다. 구체적으로 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 8종 항생제 c l ass에서 총 17개의 항생제를 이용하여 Mi crobiologi cal ly Inf luenced Corroson(MIC) test를 수행하였다. 상기 MIC test는 하기 표 2에 기재된 항생제들에 대하여 '의료관련감염균 검사실 표준진단법 (국립보건연구원 및 대한 임상미생물학회 발간) ' 의 방법을 활용하여 dist 확산 법으로 실시하였다. 하기 표 2에 기재된 항생제들 중， 특히 Imipenem(Carbapenem계, 16ug/ml이상 내성)， Amikacin(Aminoglycoside계, 16ug/ml이상 내성)， Col ist in(Polymyxin계, lug/ml이상 내성)의 3가지 항생제에 대하여는 단백질 실험을 위하여 Imipenem과 Amikacin은 4ug/ml , Col ist in은 0.25ug/ml에서부터 배수로 농도를 높여가며 l iquid culture를 실시하여 균주가 자라지 못하는 농도를 확인하였다. 하기 표 2에서 각 항생제 내성 기준 농도 이상에서 자라는 균추는 Resistance로 R 로 표기하며， 상기 최초 농도에서도 자라지 못하는 균주는 Sensi t ive균주로 S, 그 사이 농도에서 자라는 균주 (약한 내성을 가진 균주)는 intermediated resi stance로 I 로 표기하였다.

그 결과 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 수집된 균체 8종은 모두 기준 항생제인 carbapenem 종류에 대하여 내성을 가지고 있고， 특히 KAB01 , KAB03, KAB04, KAB08은 병원에서 마지막으로 사용한 항생제인 col ist in에도 내성을 가지는 것으로 확인하였다.

【표 2】

Susceptibility

Drug class Antimicrobial DU

ABOl KAB02 AB03 KBA04 KAB05 KAB06 AB07 AB08 202

Ampicillin &

R R R R I I S I R

Sulbactam

Ticarcillin &

R R R R R R R R R

(3— Lactams Clavulanic acid

Piperacillin R R R R R R R R R

Piperacillin &

R R R R R R R R R

Tazobactam

Cefotaxime R R R R R R R R R

Ceftazidime R R R R R R R R R

Cephalosporins

Cefepime R R R R R R R R R

Aztreonam R R R R R R R R R Imipenem R R R R R R R R R

Carbapenems

eh R R R R R R R R R

Amikacin R R S R S S S S R

Aminoglycosides

Gentamicin R R R R R R R R R

Fluoroquinolone Ciprofloxacin R R R R R R R R R

Minocycline I I S I S S S S I

Tetracyclines

Tigecycline S s S I S S S s S

Polymyxin Colistin s R S R R s S s R

Trimethoprim &

Sulphonamide R S R R R R R R R

Sulfamethoxazole

1-3. 다제내성 Acinetobacter baumannii병원균의 유전체 해독 상기 . baumannii 균주들에 대한 전장유전체 정보는 PacBi o RSI I 시스템으로부터 제조사의 프로토콜대로 수득하였으며， 전장 유전체를 시각화여 비교분석해 해본 결과 표 3에서 보는 바와 같이, 8개 KAB 균주 genome 크기는 3.96-4.00 Mb 이고, 총 3 , 919~4 , 026(gene+pl asmid)개의 유전자를 암호화하고 있고， 각 KAB균주는 70.8~121.4 Kb 의 플라스미드를 가지고 있고 이들 플라스미드는 94-152 개의 유전자를 암호화 하고 있음을 확인하였다. 상기 실시예 1-1에서 수집된 KAB 균주들의 계통수를 분석하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.

【표 3】

Chromoso

mm m KMS03 w mm KA807

^178,9S8 3 63 17 3^67,717

393 39Λ 39.1 39.0 39.1 39.1 39.1 39.1 39

4140 382S 3830 »7 3893 3^2 3854 3843

404S 3733 378$ 3738 3782 3801 37$4 3761 3751 纖 18 18 18 18 18 18 18 18 18 tRNA 7β 73 n n 73 73 73 74 73 tmrWA 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OU202 KA801 ΚΑ8Θ2 KA803 XA80 KA80S KABOe KM07 KA808

• 7W75 73^91 mm 70884 70JBU njn 10 06

GCH - ».S 33.9 31.7 s 33.$ 33,5 Ϊ3.4 346

Cene - 94 113 101 1S2 94 96 95 117 cos 94 113 101 1S2 94 96 95 11?

1-4. Acinetobacter bawnannii 5 ^" ·^ ¾： 체 상기 KAB 균주들을 이용해 다제내성 마커를 발굴하기 위하여 막단백질 (MEM)과 분비단백질 (SEC, 0MV로 부터의 단백질도 포함되는 개념)을 분리하여 각각 단백질체 분석을 수행하였다. 항생제의 존재 여부에 따른 A b nni 막단백질과 분비단백질의 분리 기술을 확보하여， 항생제 내성에 관여하는 단백질을 분석할 수 있는 기반기술을 확보하였으며, 이러한 분리 기술의 개요를 도 2에 나타내었다. 먼저 모든 KAB 균주를 항생제 내성에 따라 Imipenem(16ug/ml), Amikacin (16ug/ml), Colistin(2ug/ml)을 단독 또는 흔합하여 배지에 포함시켜 배양하였다. 구체적으로 KAB02, KAB05, KAB06, KAB07은 Imipenem단독으로， KAB04는 Imipenem 및 Colistin과 함께, KAB01, KAB03, KAB08은 상기 3가지 항생제가 모두 첨가된 LB 배지 (LPS solution, LB-05)에 접종하고 37 ^° C, 180rpm 으로 0D ₆₀₀ 에서 1.0까지 배양하였다. 상기 배양 후 8000rpm에서 원심 분리하여 균체를 ^' 제거한 배지 (cell media)를 수득하였다. 상기 배지를 quick-stand system을 활용하여 0.22um필터를 통과한 후， 황산암모늄을 이용하여 배지의 단백질을 침전시키고 8000rpm에서 30분간 원심 분리한 후 투석방법을 이용하여 황산암모늄을 제거한 한 후 분비 단백질 (SEC, 0MV로 부터의 단백질도 포함됨)을 분리하였다. 또한 분리된 균체를 이용하여 세포파쇄 후 원심분리하여 세포파쇄분획을 획득하고， 획득된 세포분획에 탄산나트륨을 처리한 후 초고속 (150, 000 X g, 1시간)으로 원심분리를 실시하여 막 단백질 (MEM)을 분리하였다. 분리된 단백질들은 SDS-PAGE 이용하여 단백질올 분자량별로 분리하고 trypsin을 이용하여 peptide화 한 후 LC—MS/MS를 이용하여 분석하였으며， Mascot version 2.2 소프트 웨어를 사용하여 단백질 동정을 실시하였다.

【표 4】 AB03-S AB03- AB03-MEM KAB03-SEC

Significance threshoM 0.01 0.01 0.01

FDR 0,43 0.51 0.42 0.2!

Protetas 118? 1120 629 776

SwnofemPAI 2905.81 2427.84 163S.87 2224.61 cello 2.S IOVB03-S AB03-R KAB03-MEM A803-SEC

Cytoplasmic 884(74,47) 833(7438) 288(45.79) 478(61.60)

Periplasmic 143(12.05) 133(11.88) 126(20.03) 147(18.94)

Extracellular 31(2.61) 33(2.9S) 24(3.82) 44(5.67)

OuterMembrane 64iS,39) 59Ϊ5.27) 79(12.56) 68(8.76)

Inner embrane 65(5.48) 62iS.S4) 112(17.81) 39(5.03)

Total 1187 1120 629 776

KAB01 ~ KAB08 균주들의 막단백질의 단백질체 실험 결과 440— 791개의 단백질을 각각 동정하였고， 분비단백질의 단백질체 실험 결과 418-799개의 단백질이 각각 발현되는 것을 확인하였다. 구체적으로 상기 표 4， 도 3a 및 도 3b는 다재내성균주 중 가장 항생제 내성이 강력한 KAB03에 대하여 복합항생제 (3가지 항생제 첨가)가 있는 조건 (KAB03- R)과 항생제가 없는 조건 (KAB03-S)에서 균주 전체 단백질， 및 복합항생제가 있는 조건에서 분비단백질 (KAB03— SEC)과 막단백질 (KAB03-MEM)을 서로 비교 분석한 결과를 나타낸다. 상기 실험에서 확인된 단백질들 중 각 균주에서 상위 20%의 단백질 발현량을 가지면서 공통적으로 발현되는 단백질을 분류하여 리스트를 만들어 마커 발굴을 위한 잠재 후보군으로 설정하였다.

1-5. 다재내성 Acinetobacter baumannii OMV분리 다재내성 baiiffla //로부터 0MV(0uter Membrane Vehi cles)만의 분리는 다음과 같은 방법에 의하여 수행되었다. 대표적으로, 가장 많은 0MV 양을 얻을 수 있는 DU202 균주 (동아대병원, 부산)를 항생제가 들어가지 않은 LB 배지 (LPS solut ion, LB-05)와 Imipenem( 16ug/ml )이 첨가된 LB 배지에 각각 접종하고 37 ^° C , 180rpm 으로 0D ₆₀₀ 에서 1.0까지 배양한 후 8000rpm에서 원심 분리하여 균체를 제거한 배지를 수득하였다. 상기 배지를 quick-stand system을 활용하여 0.22um필터를 통과한 후， 5000 da I t on 필터를 사용하여 0MV분획을 농축하고 150000 X g의 초고속 원심분리기를 이용하여 3시간 원심분리를 실시하여 각각의 조건에서 OMVs를 분리하였다 (도 2 참조) .

0MV의 분리 여부를 확인하기 위하여 Bio-TEM 장비를 사용하여 image를 분석하였고， image 분석 결과 도 4에서 보는 바와 같이， 0MV 이외의 다른 물질 (불순물)없이 분리 성공하였음을 확인하였으며， 항생제 조건에서 더 많은 0MV가 발현 되는 것을 확인하였다. 두 조건에서의 OMVs의 크기 등의 물리적인 차이를 확인하기 위하여 밀도 분석을 수행 (Otsuka electronics , ELSZ-10000)하였고， 두 조건에서 분비적는 0MV들은 150nm 정도의 비슷한 크기를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

1-6. 항생제 조건에 따른 0MV분석 다제내성 baumannii 항생제 조건에 따른 0MV 발현 패턴을 분석하였다. 상기 실시예 <1-5>와 동일하게 Imipenem 항생제가 있는 조건과 없는 조건 (Normal , LB 배지)으로부터 분리된 OMVs에 계면활성제를 첨가하여 OMVs를 터트린 후 SDS-PAGE 이용하여 단백질을 분자량별로 분리하고 tryps in을 이용하여 pept i de화 한 후 LC- MS/MS를 이용하여 분석하였으며, Mascot vers i on 2.2 소프트 웨어를 사용하여 단백질 동정을 실시하였다. 수득된 0MV를 분석한 결과는 다음과 같다.

먼저， LC-MS/MS분석을 위하여 각 조건별로 동일한 양의 0MV 단백질을 SDS- PAGE를 이용하여 전개하여 image를 비교 한 결과， 도 5에서 보는 바와 같이 양 조건에서 전체적인 패턴이 유사하게 나타났으며， 단지 일부 band에서 양적인 차이를 보이는 것으로 확인되었다. 도 5에 표시된 바와 같이, 8개의 분획 ( fract ion)으로 분리하고 in-gel digest ion 수행 후， 8개 분획으로부터의 단백질에 대해 MS/MS분석을 수행하였다. MS/MS 분석 결과， 도 6a에서 보는 바와 같이 LB(control ) 조건에서는 332개， IM( Imipenem)조건에서는 292개의 단백질이 동정되었으며， 이들 단백질 중 양 조건에서 공통적으로 발현된 단백질은 191개인 것으로 나타났다. Imi enem 항생제가 있는 조건 또는 항생제가 없는 조건 (Normal , LB 배지)에서만 각각 발현된 단백질은 100여개씩 동정되어， 약 30%의 단백질이 각 조건에서만 발현되는 것으로 확인되었다. 동정된 단백질들의 분포를 CELLO v2.5 소프트웨어를 이용하여 확인해 본 결과， 도 6b에서 보는 바와 같이， 단백질들의 70% 이상이 membrane과 연관된 단백질이며 30%는 특히 outer membrane과 관련된 단백질인 것으로 분석되었다.

1-7. 면역-프로테음분석을 통한 A. baumannii진단용 마커 발굴 다제내성 A baumannii 막단백질체 및 분비단백질체에 대한 항체를 이용하여 항원단백질을 발굴하고자 하였다. 상기 실시예 1-4에 의해 항생제 조건에서 수득된 다제내성 A baumannii KAB03 의 막단백질체 및 분비단백질체 2mg를 mouse에 2주 간격으로 2회 주입하여 ant i -serum을 제작하고, 실험의 정확도를 높이기 위해 각 ant i -serum으로부터 IgG만을 분리 정제하여 사용하였다.

2차원 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 방법을 통하여 막단백질체 면역활성을 분석한 결과는 도 7a와 같으며， 이로부터 하기 표 5에서 ^' Spot NO . M_l_01 내지 M_l_10에 해당하는 항원단백질을 확인하였으며， LC-MS 분석을 이용해 이들 단백질의 동정을 수행하였다.

마찬가지 방법으로 분비단백질체의 면역활성을 분석한 결과는 도 7b와 같으며， 이로부터 하기 표 5에서 Spot N0.S— 1_01 내지 S_l_21의 항원단백질을 확인하였으며， LC-MS 분석을 이용해 이들 ^백질의 동정을 수행하였다. 상기 결과로써 발굴된 항원 단백질들을 표 5에 나타^었다.

【표 5]

Accessions

Spot NO (Genbank Description Name MW PI mol%

Accession no.)

KAB03.03220

M_1 _01 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 92.591 5

(AOX78807)

KAB03_03220

M_1 _02 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 92.4557

(AOX78807)

KAB03_03220

M_1_03 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 94.3989

(AOX78807)

KAB03.03220

_1 _04 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 80.6061

(AOX78807)

KAB03_03220

M_1_05 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 85.535

(AOX78807)

KAB03_03220

_1_06 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 85.51 38

(AOX78807)

KAB03_03220

M_1 _07 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 89.41 18

(AOX78807)

KAB03_03035

Phosphoenolpyruvatecarboxykinase [GTP] pckG 67377 5.18 23.401 6 (AOX78632)

M_1 _08

KAB03_03255

Putative TonB-dependent receptor yncD 6861 7 5.39 38.3607 (AOX78842)

KAB03.02937

hypothetical protein 26489 4.8 19.3049 (AOX78535)

_1 _09

KAB03.03667

hypothetical protein 27633 4.59 34.8605 (AOX79231 ) KAB03_00249

beta-lactamase class D OXA-23 blaOXA-23 30959 7.71 43.1952 (AOX75888)

M丄 10

KAB03_02937

hypothetical protein 26489 4.8 32.2048 (AOX78535)

KAB03_03220

S_1 _01 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 96.381

(AOX78807)

KAB03_03220

S_1 _02 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 89.21 9

(AOX78807)

KAB03_03220

S_1 _03 Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 83.7313

(AOX78807)

KAB03_02755

S_1 _04 beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 43156 9.41 99.9505

(AOX78355)

KAB03— 01862

putative protein 20999 9.2 55.6249 (AOX77475)

S丄 05

KAB03_02755

beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 431 56 9.41 31 .631 7 (AOX78355)

KAB03_01862

putative protein 20999 9.2 53.7909 (AOX77475)

S_1 _06

KAB03.02755

beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 431 56 9.41 25.21 95 AOX78355

KAB03_00924

C jter membrane lipoprotein omp16 precursor 22472 9.3 25.3788 (AOX76538)

S_1 _07

KAB03_01862

putative protein 20999 9.2 20.7912 (AOX77475)

KAB03_01 1 34

Aldose 1 -epimerase 41 546 9.01 1 7.5247 (AOX76747)

KAB03_02755

S丄 08 beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 431 56 9.41 49.581 5

(AOX78355)

KAB03_02959

Protein to旧 46544 9.1 9 18.6914 (AOX78557)

KAB03_01 134

Aldose 1 -epimerase 41546 9.01 25 (AOX76747)

S丄 09

KAB03_02755

beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 431 56 9.41 51 .7366 (AOX78355)

KAB03_02755

S_1 _10 beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 43156 9.41 91 .1987

(AOX78355)

S_1 _1 1 KAB03_00939 putative protein 25544 5.47 1 3.2086 (AOX76553)

KAB03_03220

Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 28.777 (AOX78807)

KAB03_00249

oeta-lactamase class D OXA-23 blaOXA-23 30959 7J1 1 1 .4325 (AOX75888)

S_1_12

KAB03_03220

Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 21 .0848 (AOX78807)

KAB03_03359

S丄 1 3 Malatedehydrogenase 35301 5.2 76.4256

(AOX78935)

KAB03_03071

Succinyl-CoA synthetase subunit alpha 30674 5.6 35.4554 (AOX78665)

S_1 _14

KAB03_03359

Malatedehydrogenase 35301 5.2 37.0552 (AOX78935)

KAB03_00647

S_1_16 Cysteinesynthase B 331 35 5.55 61 .1 1 1 1

(AOX76276)

KAB03_01487

S_1 _1 7 Chlorideperoxidase l cpo 3071 1 5.54 56.0444

(AOX77100)

KAB03_00924

0니 ter membrane lipoprotein omp1 6 prec니 rsor 22472 9.3 27.127 (AOX76538)

S_1 _18

KAB03_02755

beta-lactamase class C ADC-25 blaADC-73 431 56 9.41 26.6034 (AOX78355)

KAB03.00924

Outer membrane lipoprotein omp16 precursor 22472 9.3 45.46 (AOX76538)

S_1 _1 9

KAB03_03220

Outer membrane protein A precursor 38427 5.32 1 2.6344 (AOX78807)

KAB03_00249

S丄 20 beta-lactamase class D OXA-23 blaOXA-23 30959 53.6972

(AOX75888)

KAB03_03425

S丄 21 putative protein 28814 4.91 32.3268

(AOX78997)

1-8. 다재내성 A baiimannii감염 환자의 임상적 특성 분석

층남대학교병원 IRB 승인 ( IRB No . 2015-02-027)을 바탕으로 Acinetobacter bamannii감염 환자의 임상정보 및 검체를 수집하였다.

검체 수집 대상 환자로는, 폐렴의 주요 원인균인 다제내성 Acinetobacter 환자 (내성균 진성 감염， true infect ion) , 기관지내 다제내성 Acinetobacter baumannii 집락화된 환자 (내성균 집락화， colonization) 및 약제 감수성 Acinetobacter baumannii 집락화된 환자 (감수성균 집락화， sensitive)를 대상으로 하였다 (도 8 참조). 검체로서는 상기 환자들의 폐포세척액， 소변， 혈액을 수집하였다. 균체는 60명으로부터, 폐포 세척액， 소변 및 혈액은 52명의 환자로부터 수득할 수 있었다. 또한 다제 내성 A. baumannii^] 약제 내성 여부 및 MIC (minimum inhibitory concentration) 수집하는 동시에 임상 data (나이 , 성별， A. baumannii 약제 내성 여부， colonization/true infection 여부를 조사하였고, co-infection 여부， Duration of ICU stay, mortality, APACHE II score, co-morbidity 등을 정리하였다 (데이터 미도시).

검체 분석 결과 도 9에서 보는 바와 같이 , 다제내성 A baumannii 진정 감염 (true infection)군 및 내성균 집락군 (colonizat ion) 사이의 항생제 감수성을 비교한 결과 Colistin, amikacin, minocyl in, 및 t igecycl ine의 항생게들에 대해서는 내성이 높게 나타났으나， Ampicillin 및 sulbactam 흔합제제， cotrimoxazole, Piperacillin 및 Tazobactam 혼합제제， Aztreonam, Cefepime 및 Cefotaxime의 항생제들에서는 내성이 낮은 것으로 나타났다. 또한 도 10에서 보는 바와 같이 다제내성 A baumannn쫘 다른 균들의 공동 감염 유형 ( )- infection style)을 조사한 결과， 다제내성 . baumanni쒜 진정 감염된 환자들은 다른 균에 대한 공동 감염 패턴이 더 많은 것으로 나타났으며， 이를 하기 표 6에 나타낸다

rotal 19 patterns 24 24 Total 16 patterns 36 36

1-9. 다제내성 A. baumannii진단용 마커 최종 후보 선정

상기 실시예들에서 A. baumannii 유전체 및 단백질체 분석 결과와 감염환자 의 임상정보 및 검체 분석에 따른 결과를 종합하여 마커를 선별한 결과， 하기 표

7과 같은 최종 마커 후보를 선별하였다.

【표 7】

Accession # log ratio

관단기준 *

유전자 명 Localization (Genbank

(mol %)

Accession no.)

Beta-lactamase class D KAB03 KAB03_00249

1 1 Extracellular

OXA-23 (1.44) (AOX75888)

Ketol-acid KAB03_00620

2 1 cytoplasmic 1.068

reductoisomerase (AOX76249)

3 Putative protein 1 ID안됨

KAB03_01808

4 Integration host factor 1 cytoplasmic 1.038

subunit beta (AOX77421)

KAB03_00342

5 DNA binding protein 1 cytoplasmic 1.463

(AOX75981)

KAB03 KAB03— 02303

6 Beta-lactamase class A 1 cytoplasmic

TEM-1D (0.489) (AOX77913)

Outer KAB03_01748

7 TonBᅳ dependent 1 0.987

siderophore receptor Membrane (AOX77361)

KAB03_03636

8 Single-stranded DNAᅳ 1 Extracellular 1.003

binding protein (AOX79200)

Carbapenemᅳ associated Outer KAB03 KAB03_02937

9 resistance 1

Membrane (0.355) (AOX78535) protein precusor

KAB03_02013

10 Putative 17 kDa surface 1 cytoplasmic 0.980

antigen (AOX77625)

KAB03_01180

11 copper homeostasis protein 1 Extracellular 1.278

(AOX76793) AB03_03492

12 D-3-phosphoglycerate 1 cytoplasmic 1.468

dehydrogenase (AOX79064)

13 ompE( 1 Outer AB03

Outer membrane KAB03ᅳ 03141 protein E ) Membrane (0.128) (AOX78734)

KAB03_00333

Argininosuccinate lyase 1 cytoplasmic 1.261

(AOX75972)

Adel family multidrug

Outer KAB03 KAB03_03104 efflux RND 1

transporter periplasmic Membrane (0.055) (AOX78698) adaptor subunit

Outer A1S_1296

Hep 4 - Membrane (ABO 11724)

Outer A1S_1655

Ferric siderophore 4 - receptor protein Membrane (ABO12082)

Outer A1S_0292

OmpW(Outer membrane 4 - protein W) Membrane (ABO10762)

Outer A1S_0255

RND efflux transporter 4 - Membrane (ABO10730)

Outer A1S_1751

AdeA 4 - Membrane (AB012178)

Outer A1S_2737

AdeK 4 - Membrane (ABO13150)

Outer A1S_1749

ABC transporter-like 4 - protein Membrane (AB012176) betaᅳ lactamase class C KAB03 (2D KAB03_02755

3 Extracellular

ADC-73 MS/MS) (AOX78355)

* 1 : Proteomi cs 결과

2 : Genomi cs 결과

3 : Immuno-proteomi cs 결과

4 : Reference 실시예 2 : 선별 마커의 다제내성 A. baumannii감염 진단능 확인 상기 표 7에서 선별된 마커에 대하여, PCR 방법으로 이들의 다제내성 A baumannii 감염 진단능을 확인하였다. 구체적으로 각 마커 단백질별로 하기 표 8에 기재된 PCR primer들을 이용해 PCR을 수행하였으며， PCR증폭 조건은 94 ^° C에서 1분， 55 ^° C에서 1분， 72 ^° C에서 2분의 30회 조건에서 Solg™ 2X Taq 중합효소 (솔젠트)를 이용하여 수행하였다. 비교를 위하여 KAB03(Resistant AB), AC19606(Sensitive AB), E. coli (Gram negative) , 5. pneumoniae (Gram positive) , sp.KT24(Gram positive)들의 유전체를 2X Agalose gel을 이용한 전기영동 방법으로 확인하였다. 실험 결과로서, AC19606( Sensitive AB)의 expression level 대비 KAB03( Resist ant AB)의 expression level의 log ratio (괄호안에 expression level 인 mol% 값을 추가로 기입)를 표 7에 나타내었다. 표 7에서 KAB03으로 표기한 것은 KAB03에서만 발현량이 측정된 것을 나타낸 것이다.

【표 8] 서열번호 PCR primer sequence

13 5' F- ATG AAT TAA ATA ΤΓΤ TAC TTG CTA TGT GGT TGC

Beta-lactamase class D

0XA-23

14 ^' 5' R一 TTA AAT AAT ATT CAG CTG TTT TAA TGA TTT CAT C

15 5' F- ATG CM ATT ΤΓΤ TAC GAT AAA GAC TGT GAC

Ketol-acid

reductoisomerase

16 5' R- TTA GTT TTT CTC ΠΤ GTC TAC GAT CTT G

17 5' F- ATG GGT CTT ΊΤΤ GAT TTT GTA AAA GGT ATT G

Putative protein

18 5' R - TTA TTG AGG AAT ACG TAA AAC TTG TCC T

19 5' F- ATG ACT ACT GAA GCT CTT AAT AAG TCT

Integration host factor

subunit beta

20 5' R- TTA TTT TCC AGA TTC ATT CAC TGC ATA

21 5' F- ATG AAA CCG GAT ATT AGT GAA TTA TCT G

DNA binding protein

22 5' R — TTA GAT TAA GAA ATC TTC AAG TTT TGC ACC

23 5' F- ATG AGT ΑΠ CM CAT TTC CGT GTC G

Bet -lactamase class A

TEM-1D

24 5' R - TTA CCA ATG CTT AAT CAG TGA GGC A

TonB-dependent 25 5' F- ATG AAT GTA AAC AAT AAG Απ GGG AAA G s iderophore receptor

26 5' R — TTA ATA GTT AAA AGT ATA ACT TAA ACC ATA AGT ACG

27 5' F- ATG CGT GGT GTA MT AAG GTT ATT TTG

Single-stranded DNA- binding protein

28 3' R- TTA GAA CGG TAA ATC GTC GTC TAA ATC

Carbapenem-associ ated 29 5' F- ATG AAA GTA TTA CGT GTT TTA GTG ACA ACT A

res i stance

prote in precusor 30 5' R- TTA CCA GAA GAA GTT CAC ACC MC TTT

31 5' F- ATG ACA GAT CM AAT ACA GAT CAT GCT

Putat ive 17 kDa sur face

ant igen

32 5' R— TTA AAT ATC ATC CCA CGC ATC ΉΤ AAT C

33 5' F- ATG AAA AAA TCA TTA TTA GCA ATT GCA CTT ATG A copper homeostas i s

prote in

34 5' R— TTA ATC TTC TTT TTT CAA MC ATA ATG TTC AGC

35 5' F- ATG AGC CAA CAT CTT TCA CTA CCT AAA

D-3-phosphog lycerate

dehydrogenase

36 5' R- TTA GAA CAA TAC GCG TAC GCG MT T

37 5' F- ATG AM TTA AAA CAT CTG AGC ACT GCA AT

Outer membrane protein

E

38 5' R— TTA GAA TTT ATA ACC AAG TTT TAA ACC GTA AG

39 5' F- ATG TGG GGT GGT CGT TTT TCT G

Argininosucc inate lyase

40 5' R- TTA AGC GTA TAA CTG TTC TAG ACG TTT AT

AdeA/Adel fami ly

41 5' F- ATG ATG TCG GCT AAG CTT TGG G

mu l t i drug ef f l ux RND

transporter per ipl asmi c

42 5' R- TTA TGC ATT TGA AGC TGC ΊΤΤ CTG TTC

adaptor subuni t

43 F- ATC CTC GAG ATA TGA AAG ATA TAT ACG TTG AGT TTC GC

Hep

44 R- TGA GGT ACC CGC TGC CTA AGA AGC TGT ATT

45 F- ATC CTC GAG ATA TGA CAC CTT GTT GTC TTG CCA TAT

Ferr i c s iderophore

R- TGA GGT ACC ATA GTT AAA AGT ATA ACG TAA ACC ATA AGT receptor prote in

46

ACG

OmpW 47 F- ATC CTC GAG ATA TGG GGG TGT CTT CAT TTA CTT TTG 48 R- TGA GGT ACC GAA TTT ATA GCT ATA GCC TAA AGT GTA MC

49 F- ATC CTC GAG ATA TGT TGG CM CAG GCG CTT TAC TA

RND ef f lux transporter

50 R- TGA GGT ACC CAG ATA CGT TAA CCA GCT GTT TAA TTC

51 F- ATC CTC GAG ATA TGT CAT GGT TGC GCC CC

AdeA

52 R— TGA GGT ACC TAG TTG TTT GAA GAT ATT AAT GTT GAC CC

53 F- ATC CTC GAG ATA TGC AAA AAG TAT GGT CTA TTT CAG G

Ade

54 R-TGA GGT ACC TTG CTT TTT AAG TTC AGC ACT AGA TG

55 F- ATC CTC GAG ATA TGC AAA AAG TAT GGT CTA TTT CAG G

ABC transporter一 l ike

protein

56 R- TGA GGT ACC TTG CTT TTT AAG TTC AGC ACT AGA TG ^'

57 F- ATG CGA TTT AAA AAA ATT TCT TGT CTA CTT TTA TC bet a- lactamase class C

ADC— 73

58 R-TTA TTT CTT TAT TGC ATT CAG CAC AGC ACA GCA TAA

실험 결과 도 11 및 도 _. 12에서 보는 바와 같이, Bet a- lactamase class D OXA-23 , Carbapenem-assoc i at ed resi stance protein precursor , T이 iB一 dependent siderophore receptor , Outer membrane protein E(OmpE) , Outer membrane protein W(OmpW) , bet a- lactamase class C ADC-73를 마커로 이용하였을 때 항생제 내성이 없는 균과 다제내성 균의 차별적 검출능력이 뛰어난 것을 확인하였다.

【산업상 이용가능성】 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명에서 제공하는 6종의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 마커들을 이용하면， 다제내성 아시네토박터 바우마니의 감염 여부를 차별적으로 검출가능할 뿐만 아니라， 기존의 혈액배양법 (세균배양 진단법) 등에 의한 진단보다 신속하고 정확한 검사결과를 제공하므로， 패혈증 등 다제내성 아시네토박터 바우마니 감염 질환의 초기에 신속한 대응에 있어 매우 유리한 장점을 지니므로， 체외진단산업 분야에 활용가능성이 매우 높다.