COMPOSITIONS DE MARQUAGE à BASE DE MATéRIAUX BIOLOGIQUES

D'ORIGINE VéGéTALE

La présente invention se rapporte au domaine du marquage pour l'identification et l'authentification de produits divers. Elle concerne tout particulièrement la préparation et l'utilisation d'empreintes végétales à base de matériaux biologiques d'origine végétale telles que les grains de pollen, les spores, -les grains d'aleurone et les métabolites secondaires.

La lutte contre la contrefaçon est un enjeu majeur des sociétés modernes tant en ce qui concerne la santé publique pour le suivi des médicaments qu'en ce qui concerne l'industrie dans le cadre des produits manufacturés. De nombreuses solutions ont été proposées, mais aucune n'a encore prouvé une efficacité totale. En effet, il est nécessaire de disposer d'un système de marquage remplissant les critères suivants : capacité de marquage de la plupart des produits solides ou liquides,

- résistance dans le temps, aux manipulations des produits, et aux différents aléas environnementaux,

- non ou peu visible à l'œil infalsifiable, - capable d'un décryptage immédiat avec des expertises de confirmations multiples, permettant de déterminer la durée entre le marquage d'un produit et son décryptage.

Les Inventeurs ont maintenant conçu un système d'empreinte végétale capable de remplir tous les objectifs ci-dessus.

Les grains de pollen comme les spores assurent la reproduction de presque tous les végétaux. Seules les

plantes à fleurs, les Phanérogames, produisent des grains de pollens ou gamétophyes mâles.

Les spores interviennent dans la reproduction des

Cryptogames, plantes sans fleurs tels que les ptéridophytes et les bryophytes. Les spores sont des corpuscules unicellulaires ou pluricellulaires pouvant donner naissance sans fécondation à de nouveaux individus.

L'intérêt des grains de pollens et des spores végétales réside d'une part dans leurs caractéristiques particulières permettant l'identification du végétal qui les a produits et d'autre part dans leurs très grandes résistances aux conditions extrêmes:

- les grains de pollens et les spores végétales présentent des caractères morphologiques particuliers et spécifiques d'une espèce végétale permettant des combinaisons infinies de taille, de forme, d'épaisseur, d'ornementation de l'enveloppe, et de la nature et de la répartition des apertures (pores, colpus). Ils sont de très petites tailles (entre 5 et 500 μm) et constituent la « poussière végétale ». Ces caractères morphologiques particuliers permettent l'identification des grains de pollen et des spores par des techniques de microscopie. les grains de pollens et les spores végétales possèdent à leur surface des cavités qui renferment des protéines pouvant constituer des allergènes très puissants et spécifiques de chaque espèce végétale, lesquelles peuvent être relâchées en quelques secondes. La nature peptidique de ces allergènes permet l'identification des grains de pollen et des spores par des méthodes immunologiques. - les grains de pollens et les spores végétales possèdent une enveloppe ou exine très résistante, formée de molécules de type polyterpène, qui peut se conserver dans les sédiments. Ainsi, des grains de pollen et des spores se sont conservés depuis le primaire géologique.

Les grains d'aleurone constituent des cellules de réserve que l'on rencontre en particulier dans l'albumen et les cotylédons de certaines graines mûres telles que les graines de Ricin, de Haricot et de Pois. Ils proviennent de la transformation, par déshydratation, d'une vacuole cellulaire lors de la maturation des graines. Un grain d'aleurone se présente sous la forme de globules dont le diamètre peut varier de 0,1 à 25 μm. L'intérêt des grains d'aleurone réside dans le fait qu'ils peuvent contenir une grande diversité de substances variant d'une espèce végétale à une autre. On peut citer comme substances contenues dans les grains d'aleurone, les enzymes hydrolytiques, les protéines, les lipides, les sucres, les alacaloïdes ou enfin les pigments. Ces substances peuvent être identifiées par des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que des méthodes de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) et des méthodes immunologiques de type ELISA.

L'exceptionnelle diversité du monde végétal se reflète également dans la très grande variété des métabolites secondaires synthétisés par les végétaux. Les métabolites secondaires sont des composés, généralement de faible poids moléculaire, qui n'ont pas de fonction apparente et vitale pour l'organisme qui le produit, mais qui semblent avoir un rôle dans les mécanismes de défense des plantes contre les animaux prédateurs ou l'attaque des pathogènes, dans les relations plantes-microorganismes, ou encore en tant qu ' attractant sexuel pour les insectes pollinisateurs. Les métabolites secondaires peuvent être divisés principalement en trois grandes familles : les terpènes, les composés phénoliques et les substances azotées.

On peut citer comme métabolites secondaires d'origine végétale les alcaloïdes, les terpènes, les stéroïdes, les flavonoïdes, les quinones, les taxanes, les glycosides, les

acides aminés modifiés tels que la 4-hydroxyisoleucine et les triterpénoïdes tels que les iridals.

On entend par acides aminés modifiés, les acides aminés non constitutifs, lesquels sont le plus souvent sous forme libre. à titre d'exemple d'acides aminés modifiés d'origine végétale, on peut citer la 4-hydroxyisoleucine, la mimosine, la 4-méthylproline, la carnavaline, l'albizziine, l'acide azétidine 2-carboxylique, l'acide γ- hydroxyglutamique , l'hypoglycine, la N-acetyl-ornithine, la galégine et l'alliine.

Les iridals sont des molécules produites dans les bulbes d'iris qui se transforment en irones (molécules odorantes très recherchées par les parfumeurs) suivant un processus d'oxydation complexe et très lent. Aujourd'hui plus d'une trentaine d' iridals sont connus. Chaque iridal se caractérise par un profil chromatographique spécifique détectable par chromatographie liquide à haute performance (CLHP ) .

En conséquence, un premier objet de l'invention correspond à une composition comprenant une combinaison déterminée de 2 à 50, de préférence de 5 à 30 et tout préférentiellement de 5 à 10 matériaux biologiques d'origine végétale, ladite combinaison étant associée à un support.

La composition selon l'invention est remarquable en ce que les matériaux biologiques d'origine végétale mis en œuvre permettent de préparer un nombre considérable de combinaisons déterminées. Chaque combinaison associée à un support constituant une empreinte végétale extrêmement stable dans le temps et infalsifiable de par sa complexité.

Un autre avantage de la composition selon l'invention est d'offrir plusieurs types de procédés d'identification de ladite composition selon la nature des matériaux biologiques

d'origine végétale mis en œuvre. à titre d'exemples, on peut citer, les techniques de microscopie permettant l'identification des grains de pollen et des spores, les techniques immunologiques de type ELISA permettant l'identification des allergènes des grains de pollen et des spores ainsi que l'identification des substances contenues dans les grains d'aleurone et les techniques de chromatographie liquide à haute performance permettant l'identification des métabolites secondaires. Un autre avantage encore de la composition selon l'invention est de permettre la détermination de la durée écoulée entre le marquage d'un produit et l'identification dudit produit marqué, lorsque au moins un matériau biologique de type iridal est mise en œuvre dans la composition selon l'invention. En effet, les iridals se transformant en irones par un processus d'oxydation très lent, la numération des iridals lors de l'identification dudit produit marqué permet d'évaluer le temps écoulé entre le marquage d'un produit et son identification.

On entend par combinaison déterminée, le résultat du choix d'un nombre donné de matériaux biologiques. Selon l'invention, le nombre de matériaux biologiques d'origine végétale choisis pour former une combinaison déterminée peut varier de 2 à 50, de préférence de 5 à 30 et tout préférentiellement de 5 à 10.

On entend par matériaux biologiques d'origine végétale toute structure ou substance présente dans un organisme appartenant au règne végétal.à titre d'exemples de matériaux biologiques d'origine végétale, on peut citer les grains de pollen, les spores végétales, les grains d'aleurones, les métabolites secondaires.

Selon un premier mode de réalisation préférée de la composition selon l'invention, les matériaux biologiques d'origine végétale peuvent être choisis parmi un ou plusieurs groupes suivants : - les grains de pollen ;

- les spores végétales ;

- les grains d'aleurones et

- les métabolites secondaires.

Avantageusement, selon l'invention, les grains de pollen peuvent être issus d'un végétal choisi dans la classe des phanérogames comprenant les angiospermes et les gymnospermes, de préférence les angiospermes et de manière particulièrement préférée les angiospermes dont les grains de pollen présentent une taille comprise entre 10 μm et 30 μm, tels que les grains de pollen de Corylus avellana, de Pommaderis aspera, de Cuscuta australis et de Dendrocalamus giganteus.

Avantageusement, les spores végétales peuvent être issues d'un végétal choisi dans la classe des cryptogames comprenant les ptéridophytes et les bryophytes .

Avantageusement, les grains d'aleurone peuvent être issus d'un végétal choisi dans le groupe comprenant le

Ricinus communis, le Ricinus vivace, le Ricinus euphorbiaceae, le Phaseolus Vulgaris, le Pisum sativum et les céréales telles que le blé, l'orge, de préférence le

Phaseolus Vulgaris et le blé et de manière particulièrement préférée le Phaseolus Vulgaris.

Selon un second mode de réalisation préférée de la composition selon l'invention, les matériaux biologiques

d'origine végétale peuvent être choisis parmi un ou plusieurs groupes suivants :

- les grains de pollen ;

- les spores végétales et - les grains d'aleurones.

Selon un troisième mode de réalisation préférée de la composition selon l'invention, les matériaux biologiques d'origine végétale peuvent être choisis parmi le groupe des métabolites secondaires comprenant les terpènes, les stéroïdes, les triterpénoïdes, les alcaloïdes, les taxanes, les glycosides et les acides aminés modifiés tels que la 4- hydroxyisoleucine, de préférence parmi les triterpénoïdes et de manière particulièrement préférée parmi les iridals .

Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, lesdits métabolites secondaires peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. On entend par l'expression

« métabolites secondaires d'origine naturelle » que lesdits métabolites secondaires sont obtenus à partir d'un organisme végétal telle qu'une plante, par exemple par des méthodes d'extraction. On entend par l'expression « métabolites secondaires d'origine synthétique» que lesdits métabolites secondaires sont obtenus par synthèse chimique.

Selon un quatrième mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, ladite composition peut comprendre de 1 à 10, de préférence de 1 à 5 matériaux biologiques d'origine végétale qui peuvent être choisis parmi un ou plusieurs groupes suivants : les grains de pollen ; les spores végétales et les grains d'aleurones,

de préférence parmi les grains de pollen, en combinaison avec 1 à 10, de préférence avec 1 à 5 matériaux biologiques d'origine végétale qui peuvent être choisis parmi le groupe des métabolites secondaires comprenant les terpènes, les stéroïdes, les alcaloïdes, les taxanes, les glycosides, les acides aminés modifiés tels que la 4- hydroxyisoleucine et les triterpénoxdes tels que les iridals, de préférence les triterpénoïdes et tout préférentiellement les iridals.

Selon un cinquième mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, lesdits matériaux biologiques d'origine végétale sont issus d'espèces végétales différentes. à titre d'exemples d'espèces végétales dont peuvent être issus les matériaux biologiques d'origine végétale, on peut citer l'Helianthus annuus, l'Ipomea purpurea, le Ricinus communis, l' Oenothera fructicosa, l'Iris germanica, l'Iris tectorum, l'Iris pallida. De préférence, lesdits matériaux biologiques d'origine végétale peuvent être issus d'Iris et tout préférentiellement d'Iris germanica et d'Iris pallida.

On entend par support toute matière ou substance apte à incorporer et libérer des matériaux biologiques d'origine végétale dans des conditions particulières. Ledit support selon l'invention doit être choisi de manière à ce qu'il n'y ait pas d'interférence entre ledit matériau biologique et les constituants dudit support, susceptible de provoquer une modification des caractéristiques dudit matériau biologique telles que les caractéristiques morphologiques. à titre d'exemples de support, on peut citer les capsules, les colles, les vernis et les peintures.

On entend par conditions particulières , les conditions permettant la libération des matériaux biologiques du support de la composition selon l'invention. Ces conditions particulières dépendent du support utilisé et peuvent par exemple être une solution de solvant choisi parmi les hydrocarbures halogènes tels que le dichlorométhane et ces dérivés, le cyclohexane, l'éthylènebenzène, les esters d'acides dicarboxyliques tels que l'adipate de diméthyle, le glutarate de diméthyle, le triéthylamine , l'acétonitril, le diméthylsulfoxide et des mélanges de ceux-ci. Avantageusement, lorsque le support selon l'invention est du polyméthacrylate de méthyle, la libération des matériaux biologiques dudit support pourra se faire en présence d'acétone ; les conditions particulières pourront alors être la présence d'acétone.

Selon un cinquième mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, le support peut être une capsule. On entend par capsule tout matériel constitué par des globules creux, de forme variable, par exemple, cylindrique, sphérique ou ovoïde. Avantageusement, ladite capsule peut être composée d'au moins un polymère qui peut être choisi dans le groupe comprenant le polyprolactone, le polyméthacrylate de méthyle, l'Eudragit ou le Pluronic® tel que le Pluronic®P6100 ou L92, de préférence le polyméthacrylate de méthyle, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de polyprolactone, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic et encore plus préférentiellement le polyméthacrylate de méthyle.

De tels supports sont bien connus de l'Homme du Métier et peuvent être obtenus à l'aide de procédés d'encapsulation par évaporation de solvant (émulsion/précipitation) , par coacervation, par polymérisation interfaciale, par nébulisation, par séchage par pulvérisation, par enrobage en lit fluidisé, par gélification par congélation de gouttes,

de manière préférée par évaporation de solvant. Ces procédés sont décrits notamment dans les articles suivants : Abrant A et al., Eur.polym. J. ,37, 955-963, (2001) « Microencapsulation par évaporation de solvant » ; Taverdet J.L. et al., Ann. Fais. Exp. Chim. , 94, 955, 103-113 (2001) « Microencapsulation de matière active par coacervation complexe : influence de certains facteurs sur la vitesse de libération » ; Fugit J.L. et al., Polymer Int., 52, 670-675, (2003) "Treatment of a plasticized PVC to reduce plasticizer/solvent migration : optimization with an experiment design" ; Ponsart S. et al. Eur.J.Sci. 4 Suppl. S75-S76, 996 "microencapsulation of β-glucuronidase by spray-drying" . Ces procédés sont décrits également dans les ouvrages suivants: The Science and Engineering of Thermal Spray Coatings de Lech Pawlowski et Journal of Thermal Spray Technology, ASM International, vol. 13, n°l, march 2004).

Selon un sixième mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, le support peut être une colle. On entend par colle, tout matériel de fixation de type adhésif. Selon l'invention, les colles peuvent être d'origine minérale, végétale, animale ou synthétique. Avantageusement, la colle selon l'invention peut être choisie dans le groupe comprenant le néoprène, le polyuréthane , le cyanoacrylate ou un mélange de ceux-ci, de préférence le néoprène.

Selon un septième mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, le support peut être un vernis. On entend par vernis toute substance qui par application est susceptible de former une couche dure, translucide, brillante et résistante. Avantageusement, le vernis peut être choisi parmi le groupe comprenant les résines naturelles et dérivées, le polyméthacrylate de

méthyle, le Pluronic® tel que le Pluronic® P6100 ou L92, le polyéthylène , le polystyrène, le polypropylène ou un mélange de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, chaque métabolite secondaire est présent dans la composition selon l'invention à une teneur d'au moins 0,1 nmole, en particulier 1 nmole et tout particulièrement 10 nmole par litre de support, en particulier par litre de polymère composant ledit support.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, chaque grain de pollen ou spore est présent dans la composition selon l'invention à une teneur d'au moins 10, en particulier 20 et tout particulièrement 40 par nanolitre de support, en particulier par nanolitre de polymère composant ledit support.

Avantageusement, la composition selon l'invention peut contenir en outre au moins un élément choisi dans le groupe comprenant les acides aminés non modifiés, les marqueurs capables de produire un signal détectable. On entend par acide aminé non modifié les acides aminés constitutifs des protéines. Par exemple, la composition selon l'invention peut contenir en outre au moins un acide aminé non modifié tel que l'isoleucine, la glycine, la lysine. à titre d'exemple encore, la composition selon l'invention peut contenir en outre au moins un marqueur capable de produire un signal détectable tels que les composés fluorescents, les composés bioluminescents, les radio-isotopes et les colorants .

Selon un mode de réalisation préféré de la composition selon l'invention, la composition peut comprendre des acides

aminés modifiés et des acides aminés non modifiés associés à une capsule, lesdits acides aminés pouvant être identifiés par des techniques de chromatographie liquide à haute performance .

Un deuxième objet de l'invention correspond à un procédé de marquage d'un produit comprenant la fourniture à un produit d'une composition selon l'invention.

à titre d'exemples de produits, on peut citer les flacons de parfums, les bouteilles telles que les bouteilles de vin, les emballages, les billets de banque, les vêtements, les montres, les produits électriques, les livres, les passeports, les œuvres d'art, les médicaments, les formulations chimiques, les produits alimentaires tels que les viandes, les parfums, les vins, les articles à base de toile, de papier, de plastique, d'encres, de peinture.

On entend par fourniture, la livraison à un produit d'une composition selon l'invention. La fourniture à un produit d'une composition selon l'invention peut se faire de toute manière appropriée qui ne provoque pas de modification des caractéristiques desdits matériaux biologiques telles que les caractéristiques morphologiques.

à titre d'exemple, la fourniture à un produit peut se faire par collage ou vernissage si le support de la composition utilisé est respectivement une colle ou un vernis .

Lorsque le support de la composition est une capsule et que le produit est un fluide, la composition selon l'invention peut être fournie au produit par une opération de mélange. Lorsque le support de la composition est une capsule et que le produit est une pâte ou un solide, la composition selon l'invention peut être fournie au produit lors de la fabrication de la pâte ou du solide.

à titre d'exemples, lorsque le support de la composition est une capsule, la fourniture à un produit d'une composition selon l'invention peut être réalisée par :

- le mélange d'une composition selon l'invention avec une encre ou une composition de véhicule d'encre ou avec de l'eau ou une combinaison d'eau et de solvant organique et l'impression directement sur un produit, ou

- l'immersion d'au moins une partie de la surface d'un produit dans une solution comprenant une composition selon l'invention pour fixer, par exemple adsorber ladite composition sur le produit, ou

- le mélange d'au moins une composition selon l ' invention avec une matière colorante ou une peinture destinée à être utilisée avec un produit, ou - l'addition d'une composition selon l'invention directement à des solutions ou formulations de produits chimiques tels que des médicaments ou des produits alimentaires .

Avantageusement, la composition selon l'invention peut être fournie au produit par pulvérisation. La pulvérisation peut se faire par exemple à l'aide d'un appareil à buse pour le marquage de nombreux produits ou à l'aide d'un appareil de type « aérosol » .

Un troisième objet de l'invention correspond à un produit marqué susceptible d'être obtenu par la fourniture audit produit d'une composition selon l'invention.

Un quatrième objet de l'invention correspond à un procédé d'identification d'un produit marqué selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

(i) l'extraction d'une composition selon l'invention dudit produit marqué, et

(iii) l'identification desdits matériaux biologiques de ladite composition.

On entend par extraction d'une composition selon 1 ' invention dudit produit marqué , la récupération de la composition selon l'invention dudit produit marqué. L'extraction de la composition selon l'invention du produit marqué peut être effectuée selon toute manière appropriée qui ne provoque pas de modification des caractéristiques desdits matériaux biologiques telles que les caractéristiques morphologiques.

Par exemple, lorsque la composition est extraite d'un produit sous une forme liquide, le liquide peut être évaporé à l'aide d'un appareil tel qu'une centrifugeuse sous vide ou filtré afin de récupérer la composition sous forme de résidus de filtration et de permettre l'identification des matériaux biologiques de ladite composition. La filtration dudit produit peut se faire par exemple à l'aide d'unité d'ultrafiltration de type Amicon (Millipore) avec des filtres de type « cellulose YM 1 Dia 44,5 μm » (Millipore).

à titre d'exemple encore, lorsqu'une composition est extraite d'un produit sous une forme solide, le produit peut être dissous ou traité de manière appropriée avec par exemple un solvant. On peut citer comme solvants les hydrocarbures halogènes tels que le dichlorométhane et ces dérivés, le cyclohexane, l'éthylènebenzène, les esters d'acides dicarboxyliques tels que l'adipate de diméthyle, le glutarate de diméthyle, le triéthylamine , l'acétonitril, le diméthylsulfoxide et des mélanges de ceux-ci.

On entend par identification la caractérisation des matériaux biologiques de ladite composition. Plusieurs techniques peuvent être utilisées selon l'invention pour

permettre l'identification des matériaux biologiques d'origine végétale. à titre d'exemples, on peut citer, les techniques de microscopie permettant l'identification des grains de pollen et des spores, les techniques immunologiques de type ELISA permettant l'identification des allergènes des grains de pollen et des spores ainsi que l'identification des substances contenues dans les grains d'aleurone et les techniques de chromatographie liquide à haute performance permettant l'identification des métabolites secondaires.

à titre d'exemple de technique de microscopie permettant l'identification des grains de pollen et des spores d'une composition selon l'invention, on peut citer la technique suivante :

Les grains de pollen et les spores végétales après avoir été fixés sur des lames et traités avec un colorant de type safranine formolées de Sémichon ou phloxine B alcoolique ou rouge congo SDS ou vert d'iode, peuvent être photographiés et numérisés sous microscope optique (avec un grossissement pouvant être compris entre 6Ox et 100Ox en immersion), en des séquences de 100 à 1000 images (avec un pas pouvant être compris entre 0,5 et 1 μm, de préférence 0,5 μm) prises à différentes distances focales pour représenter les grains en trois dimensions. Des mesures sur la coupe centrale des grains de pollen ou des spores végétales peuvent alors être effectuées afin d'analyser certaines de leurs caractéristiques comme la couleur, la taille, la forme, les pores, la nucléation du cytoplasme, la convexité du grain de pollen. Les caractéristiques, notamment morphologiques des grains de pollen ou des spores végétales peuvent également être analysées à partir de leur représentation en trois dimensions. Les différentes mesures et caractéristiques des grains de pollen ou des spores

végétales peuvent ensuite être comparées avec des banques de données regroupant les différentes caractéristiques des grains de pollen et des spores végétales connus. Ces banques de données sont notamment disponibles sur les sites http ; //perso .wanadoo . fr/pollens/biblioth/recherch. htm et http; //apimo.dk/pollen.htm. Par cette comparaison, les grains de pollen et les spores végétales d'une composition selon l'invention peuvent ainsi être facilement identifiés.

L'identification des grains de pollen et des spores d'une composition selon l'invention peut également être effectuée par l'analyse des mesures effectuées selon un seul plan focal (avec un grossissement pouvant être 10Ox en immersion) .

Les métabolites secondaires de la composition selon l'invention peuvent être facilement identifiés par des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que par l'analyse de leur profil d'élution après migration sur une colonne préférentiellement de type C8 ou C18 (phase inverse) par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Chaque métabolite secondaire présente un profil d'élution particulier de par son poids moléculaire, ses propriétés d'hydrophobicité et sa charge.

Selon un mode de réalisation préféré du procédé d'identification d'un produit marqué selon l'invention, le procédé comprend en outre une étape d'extraction (ii) desdits matériaux biologiques dudit support. On entend par l'extraction desdits matériaux biologiques dudit support, la libération et la récupération desdits matériaux biologiques dudit support. L'extraction de la composition selon l'invention du support peut être effectuée selon toute manière appropriée qui ne provoque pas de modification des

caractéristiques desdits matériaux biologiques telles que les caractéristiques morphologiques .

Lorsque le support est une colle, un vernis ou une capsule, l'extraction desdits matériaux biologiques dudit support peut être réalisée à l'aide de solvants comme par exemple les hydrocarbures halogènes tels que le dichlorométhane et ces dérivés, le cyclohexane, l'éthylènebenzène, les esters d'acides dicarboxyliques tels que l'adipate de diméthyle, le glutarate de diméthyle, le triéthylamine , l'acétonitril, le diméthylsulfoxide et des mélanges de ceux-ci.

Avantageusement, lorsque le support selon l'invention est composé de polyméthacrylate de méthyle ou de Pluronic® ou d'un mélange de ceux-ci, l'extraction desdits matériaux biologiques dudit support peut être réalisée à l'aide d'acétone.

Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé d'identification d'un produit marqué selon l'invention, la composition comprend au moins un grain de pollen et l'étape

(iii) correspond à l'identification dudit grain de pollen par ses caractéristiques morphologiques.

Avantageusement, l'identification dudit grain de pollen et/ou dudit spore peut être effectuée directement dans le support sans aucune manipulation préalable.

Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé d'identification d'un produit marqué selon l'invention, l'étape d'identification (iii) desdits matériaux biologiques peut comprendre un procédé immunologique par exemple de type

ELISA.

Selon encore un autre mode de réalisation préféré du procédé d'identification d'un produit marqué selon l'invention, l'étape d'identification (iii) desdits matériaux biologiques peut comprendre un procédé de chromatographie liquide à haute performance par exemple en utilisant une colonne de type C8 ou cl8 (phase inverse).

Un cinquième objet de l'invention correspond à l'utilisation d'une composition selon l'invention comme agent de marquage d'un produit.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des figures et des exemples qui suivent.

La Figure 1 illustre les capsules de 50 μm de diamètres, obtenues selon le procédé de fabrication de l'exemple 1 en utilisant comme polymère le polyméthacrylate de méthyle. Il s'agit d'une photographie d'une vue en microscopie électronique à balayage (Hitachi S-2600) des capsules obtenues selon le procédé de fabrication de l'exemple 1. La flèche blanche indique les capsules de l'ordre de 50 nm de diamètre existant à la périphérie des capsules de 50 μm de diamètre. Le trait blanc indique la longueur de 20 μm.

La Figure 2 représente des Chromatogrammes d'une solution d'acides aminés isoleucine, avant (Figure 2A) et après (Figure 2B) encapsulation obtenu par le passage sur colonne Alltima C8. (Figure 2A) : 25 μL d'une solution contenant 150 μM d' isoleucine ont été mélangés avec 25 μL d'une solution de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic®P6100 à 50/50 en poids. Ce mélange a ensuite été

analysé en Chromatographie Liquide à Haute Performance sur une colonne C8. (Figure 2B) : Le contenu d'une capsule à base de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic®P6100, comprenant de l'isoleucine a été extrait et analysé en Chromatographie Liquide à Haute Performance sur une colonne C8.

La Figure 3 représente des Chromatogrammes d'une solution d'acides aminés, de glycine et de 4- hydroxyisoleucine, avant (Figure 3A) et après (Figure 3B) encapsulation obtenu par le passage sur colonne Alltima C8. 25 μL d'une solution contenant 150 μM de glycine et de 4- hydroxyisoleucine ont été mélangés avec 25 μL d'une solution de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic®P6100 à 50/50 en poids. Ce mélange a ensuite été analysé en Chromatographie Liquide à Haute Performance sur une colonne C8. (Figure 3B) : Le contenu d'une capsule à base de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic®P6100, comprenant de la glycine et du 4-hydroxyisoleucine a été extrait et analysé en Chromatographie Liquide à Haute Performance sur une colonne C8.

La Figure 4 représente des chromatogrammes obtenus par une analyse par Chromatographie Liquide à Haute Performance, d'une solution d'iridals (le 16-hydroxyiridal et le 10- deoxy-17-hydroxyiridal) (Figure 4A) avant inclusion dans un support à base de polyméthacrylate de méthyle, (Figure 4B) après extraction du support à base de polyméthacrylate de méthyle .

La Figure 5 illustre le principe du marquage d'une encre à l'aide d'une combinaison déterminée de matériaux biologiques d'origine végétale incorporée dans des capsules

et de l'identification de la combinaison déterminée par la technique de Chromatographie Liquide à Haute Performance.

La Figure 6 illustre des lames de verre recouvertes avec une couche de Polyméthacrylate de méthyle. 50 μl d'une solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane ont été déposés sur une lame de verre (Figure 6A) sous forme d'une couche épaisse, (Figure 6B) sous forme de goutte, (Figure 6C) sous forme de goutte étalée avec une spatule.

La Figure 7 illustre des lames de verre recouvertes avec une couche de grains de pollen incorporés dans un support à base de Polyméthacrylate de méthyle et de Dichlorométhane . Un mélange de grains de pollen d'althéa et d'éphémère a été incorporé dans une solution de Polyméthacrylate de méthyle et de Dichlorométhane, puis déposé sur une lame de verre.

La Figure 8 illustre l'observation au microscope optique de grains de pollen issus d'althéa (Hibiscus syriacus) et d'éphémère (Tradescantia flumineusis) colorés au vert de méthyle avant (Figure 8A et Figure 8B) et après

(Figure 8C) leur incorporation dans une fine couche de

Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane. Photographie de grains de pollen issus d'althéa (Figure 8A) et d'éphémère

(Figure 8B) colorés au vert de méthyle avant leur incorporation dans un support à base de Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane. Photographie de grains de pollen issus d'althéa (Figure 8C) après leur extraction d'un support à base de Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane .

EXEMPLE 1 : Procédé de fabrication de capsules comprenant un acide aminé modifié comme matériau biologique d'origine végétale associé à un acide aminé non modifié

1) Préparation de la solution de polymères constituant les capsules

Du polymethylmethacrylate (PMMA) ou un mélange de poudre de PMMA et de Pluronic®P6100 à 50/50 (poids/poids) a été versé dans une solution de solvant organique volatil, l'ethyl acétate ou du dichloromethane dans des proportions de 25 g pour 500 mL et a été solubilisé par agitation afin d'obtenir une solution A.

Cette solution A a été mélangée à une solution aqueuse B dont le protocole de préparation est le suivant : 0,002% (poids/volume) d'acide aminé, soit un acide aminé non modifié, l'isoleucine seule (PM = 131,17 g), soit un mélange d'acide aminé non modifié, la glycine (PM = 75,07 g) et un acide aminé modifié, la 4-hydroxyisoleucine (PM = 147,5 g), ce qui correspond à 0,1 mg d'acide aminé dissous dans 4,9 mL d'eau distillée, puis ajusté à 5 mL. La solution finale B comprend ainsi environ 200 à 270 μM de chaque acides aminés. Cette solution aqueuse B enrichie en matériaux biologiques d'origine végétale doit être non miscible aux solvants du polymère . Le mélange des 2 solutions non miscibles A et B a été traité durant 1 minute par un sonicateur à ultrasons (Ultrasonic processor de Bioblock Scientific) réglé à 100% en observant des impulsions de 5 secondes alternées par des poses de 5 secondes afin d'obtenir une fine émulsion C. Cette opération a permis d'obtenir des gouttelettes d'eau très fine dans le solvant.

L 'émulsion C ainsi obtenue a ensuite été mélangée à une solution de polyvinyle alcool (PVA) utilisé comme tensioactif, lequel permet d'empêcher toute agglomération du

polymère ou des capsules si celles-ci se sont formées. Ce procédé d'émulsion permet aux polymères du solvant de précipiter autour des gouttelettes de la solution aqueuse B au fur et à mesure de l'évaporation du solvant. Ce procédé d'émulsion a duré 13 heures (avec un minimum de 12 heures) sous agitation avec un mélangeur (Rayneri de VMI) réglé à une vitesse de 2500 tours/min afin d'obtenir une émulsion D.

2) Purification des capsules Afin de purifier les capsules en éliminant les surplus d'acides aminés non encapsulés et de polymères, l'émulsion D contenant les capsules a été passée sur un filtre de 0,25 μm de porosité à l'aide d'une unité de filtration Millipore™. Le filtre sur lequel ont été retenues les capsules a été rincé par un tampon E (composé de 20OmM Tris HCl et 5mM EDTA) afin d'éliminer toutes traces de solution aqueuse. Cette opération a permis d'obtenir sur le filtre un grand nombre de capsules de diamètre 50 μm.

Ces capsules ont été reprises dans 5 mL de tampon E puis ont à nouveau été filtrées sur une membrane de 0,45 μm de porosité et le filtrat a été récupéré. Cette opération a permis d'obtenir une solution riche en capsules de diamètre 50 nm ; ces capsules existant à la périphérie des capsules de 50 μm de diamètre.

3) Tests de l'efficacité d'encapsulation des acides aminés

Les acides aminés ont été dosés selon le protocole décrit dans l'exemple 2 avant et après encapsulation. Par différence, un pourcentage d'encapsulation de la solution aqueuse B enrichie en acides aminés a été obtenue ; en faisant la moyenne des résultats de trois manipulations

indépendantes, un taux d'encapsulation de 70% à 75% a été obtenu.

Les capsules de 50 μm de diamètre obtenues avec le polyméthacrylate de méthyle sont montrées sur la Figure 1.

L'évaluation du niveau d'imperméabilité des capsules a été réalisée. Pour cela, ces dernières ont été laissées dans le tampon de récupération A sur filtre à température ambiante. Chaque jour un échantillon de 200 μL a été prélevé afin de doser les acides aminés. Cette expérience a été menée sur trois synthèses indépendantes de capsules. L'expérience la plus longue s'est étalée sur un mois. Aucune valeur significative en acides aminés dans les échantillons prélevés n'a été obtenue, ce qui montre que les capsules obtenues ne sécrètent pas ou très peu d'acides aminés.

EXEMPLE 2 : Analyse du contenu d 'une capsule

Le contenu des capsules obtenues par le procédé de fabrication illustré dans l'exemple 1 a été analysé par le procédé suivant :

1) Extraction du contenu des capsules Après estimation de la densité des capsules par microscopie électronique, les solutions F ont été diluées afin d'obtenir des solutions contenant une seule capsule dans lOOμl. Un échantillon de 100 μl a été soumis à une évaporation à l'aide d'une centrifugeuse à vide afin de récupérer une capsule. La capsule récupérée a ensuite été incubée pendant 2 minutes dans 5 μl d'acétone puis 20 μl d'un mélange eau/éthanol (1/70, volume/volume) a été ajouté.

2 ) Identification des acides aminés contenus dans les capsules

Les 25 μl de la solution contenant une capsule avec de l'eau et de l'éthanol ont été incubées pendant 1 minute à température ambiante avec 25 μl d'une solution à base d'ortho-phtaliadéhyde (OPA) préparée selon le protocole suivant :

Une solution OPA à 38,2 mM dans du méthanol a été mélangée à une solution de borate 0,2M (préparée dans du KCl à 0,2M et ajustée à pH 9,9 avec de la soude) et à une solution d'acide mercaptopropionique dans des proportions 5/20/0,05 (volume/volume/volume) ; Le pH de la solution ainsi obtenue a ensuite été ajusté à 9,1.

Les 50 μl ainsi obtenus ont ensuite été injectés sur une colonne de type Chromatographie Liquide à Haute Performance Alltima C8 (250 x 4,6 mm). L'appareil utilisé est un Varian 5000 Liquid Chromatograph couplé à un fluorimètre Shimadzu RF-530 (sensibilité : haute, gain : infini, longueur d'onde d'excitation et d'émission : 337/454). L'acquisition des données a été réalisée à l'aide du logiciel Millenium ³² ® Chromatography Manager.

Les éluants utilisés sont l'éluant G d'acétate de sodium 8OmM à pH 5,7 et l'éluant H composé d'un mélange méthanol/Tétrahydrofuranne (THF) (93,1/6,9 en volume/volume) . Le débit des éluants a été de 1,5 mL/min.

Le gradient qui a été appliqué sur la colonne est le suivant : 91 % d'éluant G d'acétate de sodium et 9% d'éluant H durant 10 minutes, 66 % d'éluant G et 34 % d'éluant H durant 5 minutes puis 38 % d'éluant G et 62 % d'éluant H durant 10 minutes et enfin 100% d'éluant H pendant 2 minutes. La collecte des données a été arrêtée 30 minutes après l'injection de l'échantillon sur la colonne.

Les résultats obtenus sont montrés sur les figures 2 et 3. La Figure 2 représente des Chromatogrammes d'une solution d'acides aminés isoleucine, avant (Figure 2A) et après (Figure 2B) encapsulation obtenu par le passage sur colonne Alltima C8. La Figure 3 représente des Chromatogrammes d'une solution d'acides aminés, de glycine et de 4-hydroxyisoleucine, avant (Figure 3A) et après (Figure 3B) encapsulation obtenu par le passage sur colonne Alltima C8. Un profil chromatographique identique dans chaque expérience avant (Figure 3A) encapsulation et après (Figure 3B) extraction des acides aminés de la capsule a été observé .

Ces expériences démontrent donc qu'il est possible d'identifier un produit marqué par une composition comprenant une combinaison déterminée d'acides aminés encapsulés par l'extraction d'une seule capsule dudit produit .

En théorie chaque capsule quelle que soit la taille contient les acides aminés à une concentration de 150 μM environ chacun. Les expériences ont été réalisées avec une capsule de 50 μm de diamètre ; son volume est donc de 65,5 pico litre. Nous pouvons donc conclure que la capsule de 50 μm de diamètre contient environ 10 pmoles. l/10 ^ème de la solution a été déposé sur la colonne chromatographique soit environ 1 pmoles de chaque acide aminé.

Au vu de ces résultats et sachant que la sensibilité de détection de cette méthode est d'une femtomole, nous pouvons donc envisager d'utiliser dans les compositions selon l'invention des capsules d'environ 50 nm de diamètre.

En encapsulant une solution d'acide aminé 10 fois plus concentrée, il est envisageable de diminuer jusqu'à 5 nm le diamètre des capsules.

4) Quantification des acides aminés contenus dans les capsules

à partir des chromatogrammes obtenus, l'aire du pic de l'acide aminé étalon est calculé à l'aide du logiciel Millenium ³² ® Chromatography Manager. L'aire du pic est directement corrélée à la quantité d'acide aminé déposé.

Exemple 3 : Marquage d'une plaque de verre à l'aide d'une pellicule de Polyméthacrylate de méthyle contenant une combinaison déterminée d'iridals.

1) Purification des iridals à partir de rhizomes d'iris

L'extraction et l'analyse des iridals à partir de rhizomes d'iris a été réalisée selon le protocole suivant:

Les rhizomes de divers génotypes et variétés d'iris ; Iris germanica L. var. Rococo, Iris tectorum Maxim., Iris pallida Lam. , ont été lavés à l'eau distillée puis coupés en très petits morceaux avant d'être broyés en fine poudre au broyeur (Janke & Kunkel, model AlO). Le jus a été déposé sur une cartouche de cellulose (whatman, 41 x 123 mm) puis cette dernière a été rincée 3 fois avec une solution EtOH — H ₂ O (7/3, v/v) à température ambiante dans un appareil de type Tecator. Les éluants ont été rassemblés et la solution a été filtrée au travers d'une membrane Analypore EC (0,45 μm, Nalgene filtration System) puis le solvant a été évaporé sous vide à l ' évaporateur rotatif (Rota Vapor, Bioblock) . De l'eau distillée (100 mL) a été ajoutée et la solution de resuspension a été lavée 4 fois (4 x 100 mL) avec de l'Et ₂ O.

La solution organique a été concentrée à 40 ⁰ C sous vide à 1 ' évaporateur rotatif (Rota Vapor, Bioblock) . à la fin de ce traitement, il reste un résidu de 5g environ qui a été passé sur 2 colonnes CLHP ( Chromatographie Liquide à Haute Performance) successives selon le protocole suivant :

Protocole Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) : L'instrument CLHP est composé de deux pompes Gilson, une pompe 305 et une pompe 302 (tête 25 SC) , un détecteur UV-Vis 112 Gilson réglé à 254 nm. La première colonne semi-préparative est de type Hibar Lichrospher RP- 18, 100 â, 10 μm, 250 x 25 mm (Merck, Germany) . La deuxième colonne préparative est une analytical Kromasil, C18, 5 μm, 100 â, 250 x 4,6 mm (Touzart & Matignon, France). Durant 2 minutes, un mélange MeOH/H ₂ O (4/1, v/v) a été passé puis un gradient a été programmé afin de passer vers un solvant d'élution 100% MeOH en 20 min, puis le MeOH a encore été passé sur la colonne durant 30 min.

2) Incorporation d'iridals dans du Polyméthacrylate de méthyle puis dépôt sur une plaque de verre

Un mélange de deux iridals : le 16-hydroxyiridal et le 10-deoxy-17-hydroxyiridal, chacun à 500 μM a été réalisé. Cette solution a alors été mélangée à une solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane, (2,5 mg/50 mL). Le mélange fluide a été versé puis étalé sur une lame de verre afin de recouvrir la lame. La lame a été placée à 5O ⁰ C afin d'évaporer le solvant et générer une pellicule d'épaisseur homogène. En quelques minutes, le solvant très volatil a été éliminé et le Polymétharcylate de méthyle a formé une fine pellicule solide et transparente.

3) Analyse par CLHP des iridals avant et après leur inclusion dans le Polyméthacrylate de méthyle

Le lendemain, sur cette pellicule un volume de 500 μl d'acétone a été étalé puis un volume de 400 μL a été récupéré qui a ensuite été filtré sur un filtre de 0,25 μm (Millipore) adapté sur une seringue de 1 mL.

50 μL de cette solution ont alors été injectés sur la colonne analytique C18 pré-équilibrée. Les résultats sont montrés sur la figure 4. La Figure 4 représente des chromatogrammes obtenus par une analyse par Chromatographie Liquide à Haute Performance, d'une solution d' iridals (le 16-hydroxyiridal et le 10-deoxy-17-hydroxyiridal) (Figure 4A) avant inclusion dans un support à base de polyméthacrylate de méthyle, (Figure 4B) après extraction du support à base de polyméthacrylate de méthyle .

Cette expérience démontre la possibilité :

- d'incorporer une combinaison déterminée de matériaux biologiques d'origine végétale comme les iridals dans un support comme le polyméthacrylate de méthyle afin de marquer un produit tel qu'une plaque de verre.

- d'extraire la combinaison déterminée du support par solubilisation du polyméthacrylate de méthyle. - d'identifier la combinaison déterminée de matériaux biologiques préalablement fournis au produit par la technique de Chromatographie Liquide à Haute Performance.

Exemple 4 : Observation au microscope optique d'une combinaison déterminée de grains de pollen avant et après son extraction d'un support à base de polyméthacrylate de méthyle

1) Marquage d'une plaque de verre à l'aide de couches transparentes de Polyméthacrylate de méthyle contenant une combinaison déterminée de grains de pollen

Une solution de Polyméthacrylate de méthyle a été préparée en solubilisant 250mg de Polyméthacrylate de méthyle dans 5mL de dichlorométhane . Cette solution a été conservée à température ambiante dans un flacon parfaitement hermétique .

à l'aide d'une micropipette, 50 μL de la solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane ont été déposés au centre de la lame de verre sous la forme d'une grosse gouttelette. Cette goutte a soit été laissée séchée, soit été étalée en une couche très fine à l'aide d'une spatule en verre. En quelques minutes, un film rigide et résistant et parfaitement transparent, parfois légèrement opalescent a été obtenu comme illustré sur la Figure 6.

Un mélange de grains de pollen issus d'althéa et d'éphémère a ensuite été incorporé dans la solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane selon le protocole suivant :

Des grains de pollen issus d'althéa (Hibiscus syriacus) et d'éphémère (Tradescantia virginiana) ont été récoltés et stockés au sec et à l'obscurité. Ils se présentent sous la forme d'une fine poudre jaune.

Un volume de 50 μL de la solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane a été versé dans un tube eppendorf (spécifique PCR de 75 μL) et rapidement fermé afin d'éviter toute évaporation. à l'aide d'une spatule en plastique, un mélange de grains de pollen issus d'althéa et d'éphémère (les grains de pollen se fixent par effet électrostatique à la spatule) a été plongé quelques

secondes dans les 50 μL de la solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane

Le mélange a alors été déposé puis étalé sur une lame de verre à l'aide d'une micropipette. Une fois le solvant totalement évaporé (après 2 minutes), une fine couche transparente a été obtenue .

2 ) Marquage d'une plaque de verre à l'aide de couches transparentes de Polyméthacrylate de méthyle dans lesquelles sont incorporées des grains de pollen colorés au vert de méthyle

Des grains de pollen issus d'althéa (Hibiscus syriacus) et d'éphémère (Tradescantia virginiana) ont été récoltés et stockés au sec et à l'obscurité. Une coloration des grains de pollen au vert de méthyle a été réalisé selon le protocole suivant :

Une goutte d'eau a été déposée au milieu d'une la lame de verre. à l'aide d'une spatule en plastique, du pollen a été prélevé et dispersé dans la goutte d'eau. La lame a alors été placée à 70 ⁰ C afin d'évaporer toute l'eau. Une goutte d'éthanol a été déposée sur le résidu sec afin de déshydrater les tissus biologiques. Après quelques minutes, l'éthanol est éliminé. Ce traitement a été répété 2 fois). Une goutte de vert de méthyle à 5% a alors été déposée sur la lame et laissée durant 5 minutes avant d'être dispersée par de l'éthanol. Il est également possible d'éliminer l'excès de colorant à l'aide d'un papier absorbant en se plaçant sur le bord de. la goutte d'éthanol.

Le pollen coloré a alors été recouvert d'une fine couche de 50 μL de la solution de Polyméthacrylate de méthyle/Dichlorométhane. La fine couche transparente formée sur la lame a été photographiée (Figure 7) et observée en microcopie optique (Figures 8A et 8B).

Une infime partie du film transparent a été récupérée par resolubilisation à l'aide de dichlorométhane . La resolubilisation peut également être effectuée avec un mélange de chloroforme/Dichlorométhane/alcool isoamylique, 12/12/1, v/v/v) . Le produit récupéré a été déposé sur une lame de verre afin d'identifier par microscopie optique les grains de pollen (Figure 8C).

3) Observation des grains de pollen par microscopie optique

Les photographies des grains de pollen (Figure 8) ont été réalisées à l'aide d'un microscope Leitz-Diaver avec un grossissement 1000X sous huile à immersion. La Figure 8 illustre l'observation au microscope optique de grains de pollen issus d'althéa (Hibiscus syriacus) et d'éphémère (Tradescantia flumineusis ) colorés au vert de méthyle avant (A et B) et après (C) leur incorporation dans une fine couche de Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane. Photographie de grains de pollen issus d'althéa (A) et d'éphémère (B) colorés au vert de méthyle avant leur incorporation dans un support à base de Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane. Photographie de grains de pollen issus d'althéa (C) après leur extraction d'un support à base de Polyméthacrylate de méthyle/dichlorométhane.

Les grains de pollen issus d'althéa et d'éphémère ont été parfaitement identifiés grâce à leurs caractéristiques morphologiques. La coloration des grains de pollen par le vert de méthyle, leur incorporation dans un support à base de Polyméthacrylate de méthyle et de Dichlorométhane ainsi que leur libération par solubilisation du support n'a pas altéré la morphologie des grains de pollen, ce qui permet leur identification.