Markierungsvorläufer mit Quadratsäure-Kopplung

Die vorliegende Erfindung betrifft Markierungsvorläufer, umfassend einen Chelator oder eine Fluorierungsgruppe und einen oder zwei, jeweils über Linker und gegebenenfalls Spacer mit dem Chelator oder der Fluorierungsgruppe gekoppelte Targetingvektoren. Die erfindungsgemäßen Markierungsvorläufer sind vorgesehen für die bildgebende nuklear medizinische, radiologische Diagnose und Behandlung (Theranostik) von Krebserkrankungen, bei denen Tumorzellen prostataspezifisches Membranantigen (PSMA), Fibroblasten- Aktivierungs-Protein (FAP) oder Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS) exprimieren.

In der klinischen Behandlung werden seit etwa 15 Jahren in zunehmendem Umfang bildgebende radiologische Diagnoseverfahren, wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und

Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (single photon emission computed tomography, SPECT) eingesetzt. Jüngst gewinnen auch theranostische Verfahren zunehmend an Bedeutung.

In der radiologischen Diagnostik und Theranostik werden Tumorzellen mit einem radioaktiven Isotop, wie beispielsweise ⁶⁸ Ga oder ¹⁷⁷ Lu markiert bzw. bestrahlt. Hierbei werden

Markierungsvorläufer eingesetzt, die das jeweilige Radioisotop kovalent ( ¹⁸ F) oder koordinativ ( ⁶⁸ Ga, ^99m Tc, ¹⁷⁷ LU) binden. Die Markierungsvorläufer umfassen im Fall von metallischen Radioisotopen als wesentliche chemische Komponente einen Chelator für die effektive und stabile Komplexierung des Radioisotops sowie als funktionelle Komponente einen biologischen Targetingvektor, der an Zielstrukturen im Tumorgewebe bindet. In der Regel weist der biologische Targetingvektor eine hohe Affinität zu zellmembranständigen Rezeptoren, Proteinen oder Enzymen von Tumorzellen auf.

Nach intravenöser Injektion in den Blutkreislauf reichert sich der mit einem Radioisotop markierte Markierungsvorläufer auf bzw. in Tumorzellen an. Um die Strahlendosis bei diagnostischen Untersuchungen im gesundem Gewebe zu minimieren, wird eine geringe Menge eines Radioisotops mit kurzer Halbwertszeit von wenigen Stunden bis Tagen verwendet.

Durch den Chelator oder die Fluorierungsgruppe werden die Konfiguration und chemischen Eigenschaften des Targetingvektors modifiziert und in der Regel dessen Affinität zu

Tumorzellen stark beeinflusst. Dementsprechend wird die Kopplung zwischen dem Chelator oder der Fluorierungsgruppe und dem mindestens einen Targetingvektor in aufwendigen Trial- and-Error Versuchen bzw. sogenannten biochemischen Screenings maßgeschneidert. Hierbei wird eine große Zahl von, den Chelator oder eine Fluorierungsgruppe und den mindestens einen Targetingvektor umfassenden Markierungsvorläufern synthetisiert und insbesondere die Affinität zu Tumorzellen quantifiziert. Der Chelator oder die Fluorierungsgruppe und die chemische Kopplung mit dem Targetingvektor sind maßgeblich für die biologische und radiologische Potenz des jeweiligen Markierungsvorläufers. Zusätzlich zu einer hohen Affinität muss der Markierungsvorläufer weitere Anforderungen erfüllen, wie

- schnelle und effektive Komplexierung oder kovalente Bindung des jeweiligen Radioisotops;

- hohe Selektivität für Tumorzellen relativ zu gesundem Gewebe;

- in vivo Stabilität, d. h. biochemische Beständigkeit in Blutserum unter physiologischen Bedingungen.

Prostatakrebs

Für Männer in den Industrieländern ist Prostatakrebs die häufigste Krebsart und die dritt- häufigste tödliche Krebserkrankung. Das Tumorwachstum schreitet bei dieser Erkrankung nur langsam voran und bei einer Diagnose im frühen Stadium liegt die 5-Jahre Überlebensrate bei nahezu 100%. Wird die Krankheit erst entdeckt, wenn der Tumor metastasiert hat, sinkt die Überlebensrate dramatisch. Ein zu frühes und zu aggressives Vorgehen gegen den Tumor kann wiederum die Lebensqualität des Patienten unnötig beeinträchtigen. So kann z. B. die operative Entfernung der Prostata zu Inkontinenz und Impotenz führen. Eine sichere Diagnose und

Informationen über das Stadium der Krankheit sind essentiell für eine erfolgreiche Behandlung mit hoher Lebensqualität des Patienten. Ein weitverbreitetes Diagnosemittel neben dem Abtasten der Prostata durch einen Arzt ist die Bestimmung von Tumormarkern im Blut des Patienten. Der prominenteste Marker für ein Prostatakarzinom ist die Konzentration des prostataspezifischen Antigens (PSA) im Blut. Allerdings ist die Aussagekraft der PSA-Konzentration umstritten, da Patienten mit leicht erhöhten Werten oft kein Prostatakarzinom haben, jedoch 15% der Patienten mit Prostatakarzinom keine erhöhte PSA-Konzentration im Blut zeigen. Eine weitere

Zielstruktur für die Diagnose von Prostatatumoren ist das prostataspezifische Membranantigen (PSMA). Im Gegensatz zu PSA kann PSMA im Blut nicht nachgewiesen werden. Es ist ein membrangebundenes Glykoprotein mit enzymatischer Aktivität. Seine Aufgabe ist die

Abspaltung von C-terminalem Glutamat von N-Acetyl-Aspartyl-Glutamat (NAAG) und

Folsäure-(poly)-Y-Glutamat. PSMA tritt in normalem Gewebe kaum auf, wird aber von Prostata- karzinomzellen stark überexprimiert, wobei die Expression mit dem Stadium der Tumor erkrankung eng korreliert. Auch Lymphknoten- und Knochenmetastasen von Prostata karzinomen zeigen zu 40% eine Expression von PSMA.

Eine Strategie des molekularen Targetings von PSMA besteht darin, mit Antikörpern an die Proteinstruktur des PSMA zu binden. Eine weitere Herangehens weise ist die enzymatische Aktivität von PSMA, die gut verstanden ist, zu nutzen. In der enzymatischen Bindungstasche von PSMA befinden sich zwei Zn ²⁺ -Ionen, die Glutamat binden. Vor dem Zentrum mit den beiden Zn ²⁺ -Ionen befindet sich eine aromatische Bindungstasche. Das Protein ist in der Lage sich aufzuweiten und an die Bindungspartner anzupassen (induced fit), so dass es neben NAAG auch Folsäure binden kann, wobei die Pteroinsäuregruppe in der aromatischen Bindungstasche andockt. Die Nutzung der enzymatischen Affinität von PSMA ermöglicht die Aufnahme des Substrates in die Zelle (Endozytose) unabhängig von einer enzymatischen Spaltung des

Substrates.

Daher eignen sich insbesondere PSMA-Inhibitoren gut als Targetingvektoren für bildgebende diagnostische und theranostische Radiopharmazeutika bzw. Radiotracer. Die radioaktiv markierten Inhibitoren binden an das aktive Zentrum des Enzyms, werden dort jedoch nicht umgesetzt. Die Bindung zwischen dem Inhibitor und dem radioaktiven Label wird also nicht gelöst. Begünstigt durch Endozytose wird der Inhibitor mit dem radioaktiven Label in die Zelle aufgenommen und in den Tumorzellen angereichert. Inhibitoren mit hoher Affinität zu PSMA enthalten in der Regel ein Glutamat-Motiv und eine enzymatisch nicht spaltbare Struktur. Ein hoch effektiver PSMA-Inhibitor ist 2-Phosphono- methyl-Glutar säure bzw. 2-Phosphonomethyl-Pentandisäure (2-PMPA), in der das Glutamat- Motiv an eine durch PSMA nicht spaltbare Phosphonatgruppe gebunden ist. Eine weitere Gruppe von PSMA-Inhibitoren, die in den klinisch relevanten Radiopharmaka PSMA- 11 und PSMA-617 genutzt wird, bilden Harnstoff-basierte Inhibitoren.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zusätzlich zu der Bindungstasche für das Glutamat-Motiv die aromatische Bindungstasche von PSMA zu adressieren. Beispielsweise ist in dem hoch wirksamen Radiopharmakon PSMA- 11 das Bindungsmotiv L-Lysin-Eirea-L-Glutamat (KuE) über Hexyl (Hexyl-Linker) an einen aromatischen HBED-Chelator (N,N'-Bis(2-hydroxy-5- (ethylen-beta-carboxy)benzyl)ethylendiamin N,N'-diacetat) gebunden. Wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) hingegen an den nicht-aromatischen Chelator DOTA (1,4,7, lO-Tetraazacyclododecan-l,4,7,lO-tetraacetat) gebunden, so ist eine verminderte Affinität und Anreicherung in Tumorgewebe zu konstatieren. Um dennoch den DOTA-Chelator für ein PSMA-affines Radiopharmakon mit therapeutischen Radioisotopen, wie ¹⁷⁷ Lu oder ²²⁵ Ac nutzen zu können, muss der Linker angepasst werden. Mittels gezielter Substitution von Hexyl durch verschiedene aromatische Strukturen wurde das hoch wirksame Radiopharmakon PSMA-617, der derzeitige Goldstandard, gefunden (Fig. 1 : PSMA-Inhibitoren; Fig. 2: Markierungsvorläufer PSMA-l l; Fig. 3: Markierungsvorläufer PSMA-617).

Tumor stroma

Viele Tumore umfassen maligne Epithelzellen und sind von mehreren nicht-kanzerogenen Zellpopulationen umgeben, einschließlich aktivierten Fibroblasten, Endothelzellen, Perizyten, Immunregulationszellen und Zytokinen in der extrazellulären Matrix. Diese sogenannten Stromazellen, die den Tumor umgeben, spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Metastasierung von Karzinomen. Ein großer Teil der Stromazellen sind aktivierte Fibroblasten, die als krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) bezeichnet werden. Im

Laufe der Tumorprogression verändern CAFs ihre Morphologie und biologische Funktion. Diese Veränderungen werden durch interzelluläre Kommunikation zwischen Krebszellen und CAFs induziert. Hierbei bilden CAFs eine Mikroumgebung, die das Wachstum der Krebszellen begünstigt. Es hat sich gezeigt, dass allein auf Krebszellen zielende Therapien unzulänglich sind. Effektive Therapien müssen die Tumor-Mikroumgebung, d. h. CAFs einbeziehen. Bei mehr als 90 % aller menschlichen Karzinome wird von CAFs das Fibroblasten- Aktivierungs-Protein (FAP) überexprimiert. Daher repräsentiert FAP einen erfolgversprechenen Angriffspunkt für die radiologische Diagnostik und Theranostik. Als affine biologische Targetingvektoren für FAP- Markierungsvorläufer eignen sich - analog zu PSMA - insbesondere FAP-Inhibitoren (FAPI oder FAPi). FAP weist bimodale, durch dasselbe aktive Zentrum katalysierte Aktivität von

Dipeptidylpeptidasen (DPP) und Prolyloligopeptidasen (PREP) auf. Dementsprechend kommen zwei Arten von Inhibitoren in Betracht, welche die DPP- und/oder die PREP-Aktivität von FAP hemmen. Bekannte Inhibitoren für die PREP-Aktivität von FAP weisen eine niedrige Selektivität für FAP auf. Bei Krebsarten, bei denen sowohl FAP als auch PREP überexprimiert wird, können jedoch auch PREP-Inhibitoren trotz ihrer geringen FAP-Selektivität als Targetingvektoren geeignet sein.

Fig. 4 zeigt einen DOTA-konjugierten FAP -Markierungsvorläufer, bei dem der Chelator an die pharmakophore Einheit ((S)-N-(2-(2-Cyano-4,4-difluoropyrolidin- 1 -yl)-2-oxoethyl)-6-(4- aminobutyloxy)-quinolin-4-carboxamid über die 4-aminobutoxy-Funktionalität an das Quinolin gekoppelt ist (Fig. 4: DOTA-konjugierter FAP -Markierungsvorläufer).

Knochenmetastasen

Knochenmetastasen exprimieren Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS), ein Enzym im HMG- CoA-Reduktase-(Mevalonat)-Weg. Durch die Hemmung von FPPS wird die Produktion von Farnesyl, einem wichtigen Molekül für das Docking von Signalproteinen an der Zellmembran unterdrückt. Als Folge wird die Apoptose von kanzerogenen Knochenzellen induziert. FPPS wird durch Bisphosphonate, wie Alendronat, Pamidronat und Zoledronat inhibiert. Beispielweise wird der Tracer BP AMD mit dem Targetingvektor Pamindronat regelmäßig bei der Behandlung von Knochenmetastasen eingesetzt.

Als besonders effektiver Tracer für die Theranostik von Knochenmetastasen hat sich Zoledronat (ZOL), ein Hydroxy-Bisphosphonat mit einer heteroaromatischen N-Einheit erwiesen. Mit den Chelatoren NODAGA- und DOTA-konjugiertes Zolendronat (Fig. 5) sind die derzeit potentesten Radio-Theranostika für Knochenmetastasen (Fig. 5: Tracer DOTA-Zoledronat (links) und NODAGA-Zoledronat (rechts)).

Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Markierungsvorläufern für Diagnose und Theranostik von Krebserkrankungen mit radioaktiven Isotopen bekannt.

WO 2015055318 Al offenbart Radiotracer für die Diagnose und Theranostik von Prostata- oder epithelialen Karzinomen, wie unter anderem, die in Fig. 3 gezeigte Verbindung PSMA-617. Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, für Diagnose und Theranostik von Prostata- und

Stromakarzinomen effiziente Markierung svorläufer für Radiotracer mit hoher Tumor Selektivität und -dosis bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Markierungsvorläufer der Struktur (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K) oder (L) mit

(A) = Ch-Li-QS-TVi

(B) = Ch-Li-QS-Si-TVi

(C) = Ch-Li-QS-Si-QS-TVi

(D) = Ch-Li-Q S-S _2- Q S-S I-T V i

(E) = TV2-QS-L2-O1-L1-QS-TV1

(F) = TV _2- S _3- QS-L _2- Ch-Li-QS-Si-TVi (G) = TV2-QS-S4-QS-L2-CI1-L1-QS-S2-QS-TV1

(H) = TV2-S3-QS-S4-QS-L2-CI1-L1-QS-S2-QS-S1-TV1

(I) = Fg-Li-QS-TVi

(J) = Fg-Li-QS-Si-TVi

(K) = F g-Li-Q S-S2-Q S-T V 1

(L) = Fg-Li-QS-S _2- QS-Si-TVi ;

umfassend

- einen Chelator Ch, gewählt aus der Gruppe, umfassend EDTA (Ethylendiamintetraacetat), EDTMP (Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure)), DTPA (Diethylentriaminpenta- acetat) und dessen Derivate, DOTA (Dodeca-l,4,7,l0-tetraamin-tetraacetat), DOT AGA

(2-(l,4,7,lO-Tetraazacyclododecan-4,7,lO)-pentandisäure) und anderen DOTA-Derivaten, TRITA (Trideca-l,4,7,l0-tetraamin-tetraacetat), TETA (Tetradeca-l,4,8,l l-tetraamin-tetra- acetat) und dessen Derivate, NOTA (Nona-l,4,7-triamin-triacetat) und dessen Derivate wie beispielsweise NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,l-glutarsäure,4,7-acetat), NOPO (1,4,7- triazacyclononan-l,4-bis[methylen(hydroxymethyl)phosphinsäu re]-7-[methylen(2- carboxyethyl)phosphinsäure]), PEPA (Pentadeca-l,4,7,l0,l3-pentaaminpentaacetat), HEHA (Hexadeca-l,4,7,l0,l3,l6-hexaamin-hexaacetat) und dessen Derivate, HBED

(Hydroxybenzyl-ethylen-diamin) und dessen Derivate, DEDPA und dessen Derivate, wie H2DEDPA (l,2-[[6-(carboxylat-)pyridin-2-yl]methylamin]ethan), DFO (Deferoxamin) und dessen Derivate, Trishydroxypyridinon (THP) und dessen Derivate wie YM103, TRAP

(Triazacyclononan-phosphinsäure), TEAP (Tetraazycyclodecan-phosphinsäure) und dessen Derivate, AAZTA (6-Amino-6-methylperhydro-l,4-diazepin-N,N,N',N'-tetraacetat ) und Derivate wie DATA ((6-Pentansäure)-6-(amino)methyl-l,4-diazepin triacetat); SarAr (l-N- (4-aminobenzyl)-3 ,6, 10, 13 , 16, 19-hexaazabicyclo[6.6.6]-eicosan- 1 , 8-diamin) und Salze davon, Aminothiole und deren Derivate des Typs

q = 1 , 2, 3, 4 oder 5

Z = S oder NH

fV ^: H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl fV

FV

V

V

V

V H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder

- eine Fluorierungsgruppe Fg gewählt aus der Gruppe umfassend

R ₁ = Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Methyl, 2-Ethyl, 3-Propyl, 2-, 3-, 4-Phenyl,

2-, 3-, 4-Phenylmethyl oder 2-, 3-, 4-Phenylpropyl

R ₂ = Alkyl, Arylgruppe oder 3-Methylisopropylether einen oder zwei Linker Li und L ₂ , die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharn- stoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH ₂ ) _m- , -(CH2CH20) _m- und -(CH2) _m NH- mit m = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10;

einen oder mehrere Quadratsäurereste QS gegebenenfalls einen, zwei, drei oder vier Spacer S _j mit l <j < 4 , die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH ₂ ) _n- , -(CH ₂ ) -CH(COOH)-NH- , -(CH ₂ CH ₂ 0)„- und -(CH ₂ ) _n NH- mit

n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; und

einen oder zwei Targetingvektoren TVi und TV ₂ , die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, umfassend Reste von Verbindungen der Struktur [1] bis [41] mit 10

wobei Y eine Schutzgruppe und C' = CI, Br oder I ist und die gestrichelte Bindung der Targetingvektoren [1]— [41] eine Kopplungsstelle mit einer Abgangsgruppe bezeichnet. Vorteilhafte Ausfuhrungsformen der erfindungsgemäßen Markierungsvorläufer sind dadurch gekennzeichnet, dass

- der Markierungsvorläufer genau einen Targetingvektor TVi enthält;

- der Markierungsvorläufer zwei voneinander verschiedene Targetingvektoren TVi und TV ₂ mit TVi TV ₂ enthält;

- der Markierungsvorläufer zwei gleiche Targetingvektoren TVi und TV ₂ mit TVi = TV ₂ enthält;

- die Schutzgruppe Y gewählt ist aus der Gruppe umfassend tert-Butyloxycarbonyl (tert- Butyl), Trialkylsilylgruppen, Trimethylsilyl ( -Si(CH ₃ ) ₃ ), Triethylsilyl ( -Si(CH ₂ CH3)3 ), iso-Propyldimethylsilyl ( -Si(CH ₃ ) ₂ C(CH ₃ ) ₂ ), tert-Butyldimethylsilyl ( -Si(CH ₃ ) ₂ C(CH ₃ ) ₃ ) und tert-Butoxydimethylsilyl ( -Si(CH ₃ ) ₂ OC(CH ₃ ) ₃ );

- die Linker Li und L ₂ gleich sind (Li = L ₂ );

- die Linker Li und L ₂ voneinander verschieden sind (Li F L ₂ );

- die Spacer Si und S ₃ gleich sind (Si = S ₃ ); - die Spacer Si und S ₃ voneinander verschieden sind (Si F S ₃ );

- die Spacer S ₂ und S ₄ gleich sind (S ₂ = S ₄ ); und/oder die Spacer S ₂ und S ₄ voneinander verschieden sind (S ₂ F S ₄ ).

Der erfindungsgemäße Markierungsvorläufer mit dem Chelator Ch oder der Fluorierungsgruppe Fg ist vorgesehen für die Markierung mit einem Radioisotop gewählt aus der Gruppe, umfassend

⁴⁴ Sc, ⁴⁷ Sc, ⁵⁵ Co, ⁶² Cu, ⁶⁴ Cu, ⁶⁷ Cu, ⁶⁶ Ga, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸ Ga, ⁸⁹ Zr, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁹⁰ Nb, ^99m Tc, ^U1 ln, ¹³⁵ Sm, ¹⁴⁰ Pr, ¹⁵⁹ Gd, ¹⁴⁹ Tb, ¹⁶⁰ Tb, ¹⁶¹ Tb, ¹⁶⁵ Er, ¹⁶⁶ Dy, ¹⁶⁶ HO, ¹⁷⁵ Yb, ¹⁷⁷ Lu, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ²¹³ Bi und ²²⁵ Ac beziehungsweise mit ¹⁸ F, ¹³¹ I oder ²¹¹ At.

Dementsprechend betrifft die Erfindung im Weiteren Radiotracer- Verbindungen, die einen der vorstehend beschriebenen Markierungsvorläufer mit - einem Chelator Ch und einem komplexierten Radioisotop, gewählt aus der Gruppe, umfassend ⁴⁴ Sc, ⁴⁷ Sc, ⁵⁵ Co, ⁶² Cu, ⁶⁴ Cu, ⁶⁷ Cu, ⁶⁶ Ga, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸ Ga, ⁸⁹ Zr, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁹⁰ Nb, ^99m Tc,

¹¹ Tn, ¹³⁵ Sm, ¹⁴⁰ Pr, ¹⁵⁹ Gd, ¹⁴⁹ Tb, ¹⁶⁰ Tb, ¹⁶¹ Tb, ¹⁶⁵ Er, ¹⁶⁶ Dy, ¹⁶⁶ HO, ¹⁷⁵ Yb, ¹⁷⁷ Lu, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, 2 ¹³ Bi und ²²⁵ Ac; oder

- einer Fluorierungsgruppe Fg und einem kovalent gebundenen Radioisotop ¹⁸ F, ¹³¹ I oder 2 ¹¹ At oder einer kovalent gebundenes ¹⁸ F, ¹³¹ I oder ²¹¹ At enthaltenden Gruppe, insbesondere -CF ₂ ¹⁸ F (Trifluormethyl); umfassen. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Markierungs- Vorläufer zur Herstellung eines Radiopharmakons.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Markierungs- Vorläufer verwendet für die Herstellung eines mit ⁴⁴ Sc, ⁴⁷ Sc, ⁵⁵ Co, ⁶² Cu, ⁶⁴ Cu, ⁶⁷ Cu, ⁶⁶ Ga, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸ Ga, ⁸⁹ Zr, ⁸⁶ Y, ⁹⁰ Y, ⁹⁰ Nb, ^99m Tc, ^U1 ln, ¹³⁵ Sm, ¹⁴⁰ Pr, ¹⁵⁹ Gd, ¹⁴⁹ Tb, ¹⁶⁰ Tb, ¹⁶¹ Tb, ¹⁶⁵ Er, ¹⁶⁶ Dy, ¹⁶⁶ HO, ¹⁷⁵ Yb, ¹⁷⁷ LU, ¹⁸⁶ Re, ¹⁸⁸ Re, ²¹³ Bi, ²²⁵ Ac, ¹⁸ F, ¹³ T oder ²¹¹ At markierten Radiopharmakons.

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Markierungs- Vorläufer verwendet für die Herstellung eines Radiopharmakons für die bildgebende Diagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET).

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Markierungs- Vorläufer verwendet für die Herstellung eines Radiopharmakons für die bildgebende Diagnostik mittels Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT).

In einer vorteilhaften Ausführungsform werden die vorstehend beschriebenen Markierungs- Vorläufer verwendet für die Herstellung eines Radiopharmakons für die Behandung von

Krebstumoren. Im Weiteren hat die vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein einfaches und effizientes Verfahren für die Synthese von Markierungsvorläufern für die Diagnose und Theranostik von

Krebstumoren, die PSMA und/oder FAP exprimieren, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, umfassend die Schritte - Konjugation eines Chelators Ch oder einer Fluorierungsgruppe Fg mit einem Linker Li zu einem Precursor Pi = Ch-Li bzw. Pi = Fg-Li oder Konjugation eines Chelators Ch oder einer Fluorierungsgruppe Fg mit einem Linker Li und Quadratsäure QS zu einem Precursor P ₂ = Ch-Li-QS bzw. P ₂ = Fg-Li-QS oder Konjugation eines Chelators Ch mit Linkern Li und L ₂ ZU einem Precursor P ₃ = L _2- Ch-Li oder Konjugation eines Chelators Ch mit Linkern

Li , L ₂ und Quadratsäure QS zu einem Precursor

P ₄ = QS-L _2- Ch-Li-QS ;

- gegebenenfalls Konjugation eines Targetingvektors TVi mit Quadratsäure QS zu einem

Precursor P ₅ = TVi-QS oder Konjugation eines Targetingvektors TVi mit Quadratsäure QS und einem Spacer S ₂ zu einem Precursor P ₆ = TV _I -QS-S ₂ oder Konjugation eines

Targetingvektors TVi mit einem Spacer Si zu einem Precursor P ₇ = TVi-Si oder

Konjugation eines Targetingvektors TVi mit einem Spacer Si und Quadratsäure QS zu einem Precursor P ₈ = TVi-Si-QS oder Konjugation eines Targetingvektors TVi mit einem Spacer Si, Quadratsäure QS und einem Spacer S ₂ zu einem Precursor P ₉ = TV _I -S _I -QS-S ₂ ; - gegebenenfalls Konjugation eines Targetingvektors TV ₂ mit Quadratsäure QS zu einem

Precursor P _l0 = TV _2- QS oder Konjugation eines Targetingvektors TV ₂ mit Quadratsäure QS und einem Spacer S ₄ zu einem Precursor Pu = TV _2- QS-S ₄ oder Konjugation eines Targetingvektors TV ₂ mit einem Spacer S ₃ zu einem Precursor P _l2 = TV _2- S ₃ oder

Konjugation eines Targetingvektors TV ₂ mit einem Spacer S ₃ und Quadratsäure QS zu einem Precursor Pi ₃ = TV _2- S _3- QS oder Konjugation eines Targetingvektors TV ₂ mit einem

Spacer S ₃ , Quadratsäure QS und einem Spacer S ₄ zu einem Precursor P _l4 = TV _2- S _3- QS-S ₄ ;

- Konjugation eines Targetingvektors TVi mit dem Precursor P ₂ oder Konjugation der

Precursor Pi und P ₅ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur Ch-Li-QS-TVi bzw. Fg-Li-QS-TVi oder Konjugation der Precursor Pi und P ₈ oder P ₂ und P ₇ zu einem

Markierungsvorläufer der Struktur Ch-Li-QS-Si-TVi bzw. Fg-Li-QS-Si-TVi oder

Konjugation der Precursor P ₂ und P ₉ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur

Ch-Li-QS-S _2- QS-Si-TVi bzw. Fg-Li-QS-S _2- QS-Si-TVi ; oder

- Konjugation der Precursor P ₃ , P ₅ und P ₁₀ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur TV _2- QS-L^Ch-Li-QS-TV _! oder Konjugation der Precursor P ₃ , P ₈ und Pi ₃ oder P ₄ , P ₇ und Pi ₂ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur TV _2- S _3- QS-L _2- Ch-Li-QS-Si-TVi oder Konjugation der Precursor P ₄ , P ₆ und P ₁₁ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur TV _2- QS-S^QS-L^Ch-Li-QS-S^QS-TVf oder Konjugation der Precursor P ₄ , P ₉ und Pi ₄ zu einem Markierungsvorläufer der Struktur TV _2- S _3- QS-S _4- QS-L _2- CI1-L _1- QS-S _2- QS-S _1- TVi; wobei

- der Chelator Ch gewählt ist aus der Gruppe, umfassend EDTA (Ethylendiamintetraacetat), EDTMP (Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure)), DTPA (Diethylentriaminpenta- acetat) und dessen Derivate, DOTA (Dodeca-l,4,7,l0-tetraamin-tetraacetat), DOT AGA (2-(l,4,7,lO-Tetraazacyclododecan-4,7,lO)-pentandisäure) und anderen DOTA-Derivaten, TRITA (Trideca-l,4,7,l0-tetraamin-tetraacetat), TETA (Tetradeca-l,4,8,l l-tetraamin-tetra- acetat) und dessen Derivate, NOTA (Nona-l,4,7-triamin-triacetat) und dessen Derivate wie beispielsweise NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,l-glutarsäure,4,7-acetat), NOPO (1,4,7- triazacyclononan-l,4-bis[methylen(hydroxymethyl)phosphinsäu re]-7-[methylen(2- carboxyethyl)phosphinsäure]), PEPA (Pentadeca-l,4,7,l0,l3-pentaaminpentaacetat), HEHA (Hexadeca-l,4,7,l0,l3,l6-hexaamin-hexaacetat) und dessen Derivate, HBED

(Hydroxybenzyl-ethylen-diamin) und dessen Derivate, DEDPA und dessen Derivate, wie H2DEDPA (l,2-[[6-(carboxylat-)pyridin-2-yl]methylamin]ethan), DFO (Deferoxamin) und dessen Derivate, Trishydroxypyridinon (THP) und dessen Derivate wie YM103, TRAP (Triazacyclononan-phosphinsäure), TEAP (Tetraazycyclodecan-phosphinsäure) und dessen Derivate, AAZTA (6-Amino-6-methylperhydro-l,4-diazepin-N,N,N',N'-tetraacetat ) und Derivate wie DATA ((6-Pentansäure)-6-(amino)methyl-l,4-diazepin triacetat); SarAr (l-N- (4-aminobenzyl)-3,6,l0,l3,l6,l9-hexaazabicyclo[6.6.6]-eicosa n-l,8-diamin) und Salze davon, Aminothiole und deren Derivate des Typs

q = 1 , 2, 3, 4 oder 5

Z = S oder NH

R ₃ = H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl

R ₄ =

^R 6

R ₇ =

R ₈ =

R _g = H, unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl

die Fluorierungsgruppe Fg gewählt ist aus der Gruppe umfassend

R ₁ = Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Methyl, 2-Ethyl, 3-Propyl, 2-, 3-, 4-Phenyl,

2-, 3-, 4-Phenylmethyl oder 2-, 3-, 4-Phenylpropyl

R ₂ = Alkyl, Arylgruppe oder 3-Methylisopropylether

- die Linker Li und L 2 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH ₂ ) _m- , -(CH ₂ CH ₂ 0)m- und -(CH ₂ ) _m NH- mit

m = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10;

- die Spacer S _j mit l <j < 4 unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe,

umfassend Amid-, Carbonsäureamid-, Phosphinat-, Alkyl-, Triazol-, Thioharnstoff-, Ethylen-, Maleimid-Reste, -(CH ₂ )„- , -(CH ₂ )-CH(COOH)-NH- ,

-(CH ₂ CH ₂ 0)„- und -(CH ₂ )„NH- mit n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10; und die Targetingvektoren TVi und TV ₂ unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, umfassend Verbindungen der Struktur [1] bis [41] mit

21

wobei Y eine Schutzgruppe und C' = CI, Br oder I ist und die gestrichelte Bindung der Targetingvektoren [1]— [41] eine Kopplungsstelle mit einer Abgangsgruppe bezeichnet.

Vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dadurch gekenn zeichnet, dass - die Targetingvektoren TVi und TV ₂ voneinander verschieden sind (TVi F TV ₂ ); die Targetingvektoren TVi und TV ₂ gleich sind (TVi = TV ₂ ); - die Schutzgruppe Y gewählt ist aus der Gruppe umfassend tert-Butyloxycarbonyl (tert- Butyl), Trialkylsilylgruppen, Trimethylsilyl ( -Si(CFl ₃ ) ₃ ), Triethylsilyl ( -Si(CFl2CF[ ₃ ) ₃ ), iso-Propyldimethylsilyl ( -Si(CH ₃ )2C(CH ₃ )2 ), tert-Butyldimethylsilyl ( -Si(CH ₃ )2C(CH ₃ ) ₃ ) und tert-Butoxydimethylsilyl ( -Si(CH ₃ ) ₂ 0C(CH ₃ ) ₃ ); - die Linker Li und L2 gleich sind (Li = L2);

- die Linker Li und L2 voneinander verschieden sind (Li F L2);

- die Spacer Si und S ₃ gleich sind (Si = S ₃ );

- die Spacer Si und S ₃ voneinander verschieden sind (Si F S ₃ );

- die Spacer S2 und S ₄ gleich sind (S2 = S ₄ ); und/oder - die Spacer S2 und S ₄ voneinander verschieden sind (S2 F S ₄ ).

Die Fluorierungsgruppe Fg umfasst eine Abgangsgruppe X für die Markierung mit einem der Radioisotope ¹⁸ F, ¹³¹ I oder ²¹¹ At. Die Abgangsgruppe X ist gleich einem Rest von Brom (Br), Chlor (Cl), Iod (I), Tosyl (-SCh-CöFL-CFF; abgekürzt "Ts"), Nosylat bzw. Nitrobenzolsulfonat (-OSO2-C6FL-NO2; abgekürzt "Nos"), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (-S0 _3- (CH2)2- N(CH ₂ ) ₄ 0; abgekürzt "MES"), Triflat bzw. Trifluormethansulfonyl (-S0 ₂ CF ₃ ; abgekürzt "Tf') oder Nonaflat (-0S0 _2- C ₄ F ₉ ; abgekürzt "Non").

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden folgende Bezeichnungen bzw. Abkürzungen verwendet:

PSMA . prostataspezifisches Membranantigen; FAP . Fibroblasten- Aktivierungs-Protein;

FPPS . Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase;

2-PMPA . 2-Phosphonomethyl-Glutarsäure;

KuE . L-Lysin-Urea-L-Glutamat; DOTA.QS.PSMA . Markierungsvorläufer, insbesondere mit Strukturformel gemäß Fig. 8, umfassend DOTA (Dodeca-l,4,7,l0-tetraamin-tetraacetat) als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei PSMA-Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist;

NOTA.QS.PSMA . Markierungsvorläufer, insbesondere mit Strukturformel gemäß Fig. 9, umfassend NOTA (Nona-l,4,7-triamin-triacetat) als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit ein oder zwei PSMA-Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist;

AAZTA.QS.PSMA . Markierungsvorläufer, insbesondere mit Strukturformel gemäß Fig. 9, umfassend AAZTA als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit ein oder zwei PSMA- Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist;

DATA.QS.PSMA . Markierungsvorläufer, insbesondere mit Strukturformel gemäß Fig. 9, umfassend DATA als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei PSMA- Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist;

DOTAGA.QS.PSMA ... Markierungsvorläufer, umfassend DOTAGA (2-(l,4,7,l0-

Tetraazacyclododecan-4,7,l0)-pentandisäure) als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei PSMA-Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist;

NOTAGA.QS.PSMA ... Markierungsvorläufer, umfassend NOTAGA (l,4,7-triazacyclononan,l- glutarsäure,4,7-acetat) als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei PSMA- Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist; TRAP.QS.PSMA . Markierungsvorläufer, umfassend TRAP (Triazacyclononan- phosphinsäure) als Chelator, der über einen oder zwei Linker,

Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei PSMA- Targetingvektoren mit Strukturformel [1], [2], [3] und/oder [4] gekoppelt ist.

NOTA.QS.PAM . Markierungsvorläufer, umfassend NOTA als Chelator, der über einen oder zwei Linker, Quadratsäuregruppen und Spacer mit einem oder zwei Pamidronat-Targetingvektoren gemäß Strukturformel [40] gekoppelt ist. Weitere im Rahmen der Erfindung verwendete Abkürzungen korrespondieren zu den vorstehenden Abkürzungen, wobei ein anderer Chelator, eine andere Fluorierungsgruppe und/oder ein anderer Targetingvektor - insbesondere ein Targetingvektor für FAP gemäß den Strukturformeln [5] bis [41] - in analoger Weise durch seine jeweilige Abkürzung oder

Akronym bezeichnet ist. Beispielsweise werden analoge Derivate, die zum Targeting von Farnesyl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS) in Knochenmetastasen eingesetzt werden, je nach Art des Bisphosphonats mit "PAM" für Pamidronat und "ZOL" für Zoledronat abgekürzt.

Der erfindungsgemäße Markierungsvorläufer umfasst gegebenenfalls einen oder mehrere Spacer Sj mit 1 < j < 4 , d. h. einen Spacer Si, zwei Spacer Si und S ₂ , drei Spacer Si, S ₂ und S ₃ oder vier Spacer Si, S ₂ , S ₃ und S _4.

In den Strukturformeln [1]— [41] der Targetingvektoren sind die für die Konjugation mit einer Quadratsäuregruppe oder einem Spacer Si oder S ₂ des erfindungsgemäßen Markierungs- Vorläufers vorgesehenen Bindungen gestrichelt dargestellt. Die über die gestrichelte Bindung konjugierte Gruppe ist eine Abgangsgruppe, die bei der Kopplung des Targetingvektors mit der Quadratsäuregruppe oder dem Spacer Si oder S ₂ abgespalten wird.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert. Fig. 6 zeigt die Struktur einiger der erfindungsgemäß verwendeten Chelatoren Ch (Fig. 6: Erfindung sgemäß verwendete Chelatoren).

Beispiel 1 : Svnthesestrategie für PSMA-Markierungsvorläufer Bei der Synthese der erfindungsgemäßen Markierungsvorläufer werden vorzugsweise

Quadratsäure-Diester eingesetzt. Dadurch ist eine Vielzahl, zum Teil sehr komplexer Markierungsvorläufer mittels einfacher Reaktionsverfahren darstellbar. Quadratsäure-Diester zeichnen sich durch ihre selektive Reaktivität mit Aminen aus, so dass bei der Kopplung von Chelatoren, Linkern, Spacern und Targetingvektoren keine Schutzgruppen benötigt werden. Zudem ist die Kopplung über den pH-Wert steuerbar. Zunächst wird ein Targetingvektor für PSMA synthetisiert (siehe Fig. 7) und nach Aufreinigung in wässrigem Medium bei pH = 7 mit Quadratsäurediester umgesetzt zu einer pro stethi sehen Gruppe bzw. einem Precursor für die Kopplung mit einem Chelator (siehe Fig. 8)

(Fig. 7: Syntheseschema für QS-KuE Precursor).

Im Fall eines Targetingvektors für PSMA wird z. B. mittels eines bekannten Verfahrens der PSMA-Inhibitor L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) synthetisiert. Hierbei wird an eine Festphase, insbeondere ein Polymerharz gebundenes und mit tert-Butyloxycarbonyl (tert-Butyl) geschütztes Lysin mit zweifach tert-Butyl-geschützter Glutaminsäure umgesetzt. Nach Aktivierung der geschützten Glutaminsäure durch Triphosgen und der Kopplung an das festphasengebundene Lysin wird L-Lysin-Urea-L-Glutamat (KuE) mittels TFA abgespalten und zugleich vollständig entschützt. Das Produkt kann anschließend mittels semipräparativer HPLC von freiem Lysin getrennt werden. Die auf Lysin bezogene Ausbeute der vorstehenden Reaktion ist größer als 50% (Fig. 8: Kopplung eines QS-KuE Precursor an DOTA).

Der QS-KuE Precursor wird in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 9 mit dem Chelator DOTA zu dem Markierungsvorläufer DOTA.QS.PSMA konjugiert. Für die Radiomarkierung der PSMA-Markierungsvorläufer wurde ⁶⁸ Ga mit 0,6 M HCl von einem iThemba Ge/Ga-Generator eluiert und mittels wässriger Ethanol-Elution über eine Kationentauschersäule aufbereitet. Die Radiomarkierung erfolgt je nach Chelator bei pH-Werten zwischen 3,5 und 5,5 und Temperaturen zwischen 25°C und 95°C. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC und IPTC aufgezeichnet, um die kinetischen Parameter der Reaktion zu ermitteln.

Beispiel 2: Markierungsvorläufer NOTA.OS.PSMA. AAZTA OS.PSMA und DATA.OS.PSMA

Mittels einer Synthese gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Strategie wurden unter

Verwendung der Chelatoren NOTA, AAZTA und DATA anstelle von DOTA die in Fig. 9 wiedergebenen Markierung svorläufer NOTA.QS.PSMA, AAZTA.QS.PSMAund DAT A.QS. PSMA dargestellt (Fig. 9: Markierungsvorläufer NOTA.QS. PSMA, AAZTA.QS.PSMA und DAT A.QS. PSMA).

Beispiel 3 : PSMA-Markierungsvorläufer für Radiohalogenide Mittels geringfügig abgewandelter Reaktionen nach dem Syntheseschema der Fig. 7 wurden die in Fig. 10 wiedergegebenen PSMA-Markierungsvorläufer für die Radiomarkierung mit Halogenidisotopen, wie ¹⁸ F und I dargestellt. Ein entsprechender mit ¹⁸ F markierter

Radiotracer ist in Fig. 11 wiedergegeben (Fig. 10: Quadratsäure-konjugierte PSMA- Markierungsvorläufer für Radiohalogenide; Fig. 11 : Quadratsäure-konjugierter ¹⁸ F -Radiotracer für PSMA vor Abspaltung der tert-Butyl Schutzgruppen).

Beispiel 4: PSMA-Markierungsvorläufer für ^99m Tc

Mittels einer Synthese gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Strategie wurden die in Fig. 12 wiedergebenen PSMA-Markierungsvorläufer für die Radiomarkierung mit dem Isotop ^99m Tc dargestellt (Fig. 12: Quadratsäure-konjugierte PSMA-Markierungsvorläufer für ^99m Tc mit auf Aminothiol basierenden Chelatoren des Typs "N ₃ S").

Beispiel 5: Svnthesestrategie für FAP -Markierungsvorläufer

(Fig. 13 : Synthesestrategie für FAP -Markierungsvorläufer) Fig. 14 zeigt zwei FAP-Markierungsvorläufer, die gemäß der in Fig. 13 gezeigten

Synthesestrategie dargestellt wurden (Fig. 14: FAP-Markierungsvorläufer mit

Quadratsäurekopplung).

Beispiel 6: OS als Komplexierungshelfer Für die klinische Anwendung ist es sehr wichtig, dass die Komplexierung bei niedriger

Temperatur effizient erfolgt. Quadratsäuren komplexieren freie Metalle und können somit das Chelatorzentrum vor unspezifischer Koordination schützen. Dieser Effekt konnte bei der Radio- markierung von TRAP.QS bei unterschiedlichen Temperaturen beobachtet werden. TRAP komlexiert bei Raumtemperatur quantitativ. Demgegenüber wurde unter gleichen Bedingungen bei TRAP.QS ein RCY-Wert von lediglich 50% gemessen. Wird die Temperatur erhöht, so steigt die Markierungsausbeute von TRAP.QS auf quantitative Werte an. Hieran zeigt sich der

Einfluss, den die Quadratsäure auf die Komplexierung hat. Dieser in Fig. 15 illustrierte Effekt ermöglicht die stabile Komplexierung von Metallen mit hoher Koordinationszahl, wie beispiels- weise Zirkonium mithilfe des Chelators AAZTA.QS (Fig. 15: Koordination mittels

AAZTA.QS).

Beispiel 7: Dimere Markierun svorläufer mit jeweils zwei KuE- und FAPI-Targetingvektoren

(Fig. 16: Dimere Markierungsvorläufer)

(i) Synthese der D02A-Einheit mit zwei Amin-Seitengruppen:

(Fig. 17: Synthese von DOA2 mit zwei Amingruppen)

(ii) Synthese des KuE-QS-Motifs:

(Fig. 18: Synthese von KuE-QS)

(iii) Synthese von FAPI-QS, Kopplung des 4,4-Difluoroprolin-quinolin-4-carbonsäure Motivs mit QS:

(Fig. 19: Synthese von FAPI-QS)

(iv) Kopplung der D02A-Einheit mit KuE-QS und respektive FAPI-QS:

(Fig. 20: Synthese der Dimere)

Beispiel 8: ⁶⁸ Ga-DOTA.OS.PSMA präklinische Untersuchung

Mittels PET wurden präklinische Vergleichsversuche mit Radiotracern des Typs

6 ⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA, ⁶⁸ Ga-PSMA-l 1 und ⁶⁸ Ga-PSMA-6l7 an NMRInu/nu Nacktmäusen mit einem LNCaP-Tumor am rechten Hinterlauf durchgefiihrt. Fig. 21 zeigt PET-Aufnahmen 60 min nach Injektion des erfindungsgemäßen Tracers ⁶⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA, wobei Teilbild (A) und (B) die PET-Aufnahmen einer ungeblockten und respektive einer mittels koinjiziertem 2-PMPA geblockten Tumormaus wiedergeben.

Tabelle 1 : Standardisierte Aufnahmewerte (SUV)

von PSMA-Tracern

Aus den in Fig. 22 wiedergegebenen PET-Aufnahmen ist ersichtlich, dass sich der Tracer im Tumor stark anreichert. Aus den PET-Daten wurde für ⁶⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA ein

standardisierter Aufnahmewert (standardized uptake value, SETV) von 0,73 im Tumor ermittelt. Durch Extraktion der Organe und Messung von Gewicht und Aktivität bestimmte biologische Verteilungsdaten zeigen für ⁶⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA eine geringfügig niedrigere bzw. gleiche Tumoraktivität wie ⁶⁸ Ga-PSMA-l l und ⁶⁸ Ga-PSMA-6l7. Demgegenüber ist die Off-Target- Aktivität in der Niere deutlich geringer als bei ⁶⁸ Ga-PSMA-l 1.

Im Vergleich zu anderen bekannten Radiotracern ist die Off-Target- Anreicherung von

6 ⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA in Niere und Leber deutlich reduziert. ⁶⁸ Ga-DOTA.QS.PSMA weist eine hohe Affinität zu Tumorgewebe auf und verbessert den Kontrast bzw. das Signal-Rausch-

Verhältnis in der bildgebenden PET-Diagnostik von PCa-Primärtumoren und insbesondere von PCa-befallenen Lymphknoten im Beckenbereich. Auch wird die Strahlenbelastung der Niere und benachbarter Organe gemindert, was für die theranostische Behandlung einen erheblichen Vorteil dar stellt. Analoge ETnter suchungen mit ⁶⁴ Cu-TRAP.QS.PSMA und ⁶⁸ Ga-NOTAGA.QS.PSMA lieferten vergleichbare Ergebnisse. Im Weiteren wurde DOTA.QS.PSMA mit ¹⁷⁷ Lu und ²²⁵ Ac markiert. Erste Resultate zur radiologischen und physiologischen Stabilität dieser Tracer indizieren deren Eignung für die Theranostik.

Aufgrund des Einflusses der aromatischen Bindungstasche von PSMA auf die Affinität von PSMA-Inhibitoren wird der Lipophilie von PSMA-Tracern einige Bedeutung beigemessen.

Studien deuten daraufhin, dass eine erhöhte Lipophilie zudem die Aufnahme bzw. Endozytose des Tracers in Tumorzehen begünstigt. Dementsprechend wurde die Lipophilie der erfindungs- gemäßen Tracer TRAP.QS.PSMA und DOTA.QS.PSMA mittels der HPLC-Methode von Donovan und Pescatore (S. F. Donovan, M. C. Pescatore, J. Chromatogr. A 2002, 952, 47-61) bestimmt. Hierzu wurden die Retentionszeit von TRAP.QS.PSMA, DOTA.QS.PSMA sowie einiger Kalibrierstandards mit bekannter Lipophilie in einer ODP-HPLC-Säule mit einem

Methanol/Wasser-Gradienten bei einem pH-Wert von 7 gemessen. Die durch lineare Regression der Retentionszeiten ermittelten logD-Werte für TRAP.QS.PSMA und DOTA.QS.PSMA sind in Tabelle 2 zusammen mit Literaturwerten für PSMA-l 1 und PSMA-617 wiedergegeben.

Da DOTA.QS.PSMA auf der ODP-HPLC-Säule keine Retention aufweist, ist für logD lediglich ein maximaler Wert angegeben. TRAP.QS.PSMA, PSMA-l 1 und PSMA-617 haben

vergleichbare Lipophilie. Überraschenderweise ist die Aufnahme von TRAP.QS.PSMA in der Niere gegenüber PSMA-l 1 und PSMA-617 deutlich reduziert. Diese Beobachtung ist durch die geringfügigen Unterschiede der jeweiligen logD-Werte nicht erklärbar. Offenbar beinflusst nicht nur die Lipophilie die Affinität und Endozytose, sondern andere Wechselwirkungen wie p-p-Stapelung in der enzymatischen Bindungstasche spielen ebenfalls eine Rohe. Hierbei erscheint Quadratsäure wegen ihrer im Vergleich zu Phenyl geringen Größe vorteilhaft.

Demgegenüber zeigt DOTA.QS.PSMA eine beträchtlich höhere Lipophilie in Verbindung mit einer mit PSMA-617 vergleichbaren Aufnahme in der Niere.

Tabelle 2: Lipophilie von PSMA-Tracern Zudem wurden mittels PET wurde präklinische ex vivo Versuche mit den Radiotracer des Typs [ ⁶⁸ Ga]Ga-DOTA.QS.PSMA, [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-l l und [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-6l7 an NMRInu/nu Nacktmäusen mit eine LNCap Tumor durchgefiihrt. Fig. 23 zeigt die Organverteilungen der entsprechenden Verbindungen. Die erhaltenen Ergebnisse unterstreichen die bei den in vivo Versuchen erhaltenen. Durch Extraktion der Organe und Messung von Gewicht und Aktivität bestimmte biologische Verteilungsdaten zeigen für [ ⁶⁸ Ga]Ga-DOTA.QS.PSMA eine geringfügig niedrigere bzw. gleiche Tumoraktivität wie [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-l 1 und [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-6l7. Demgegenüber ist die Off-Target- Aktivität in der Niere deutlich geringer als bei

[ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-l 1. Beispiel 9: FPPS-Tracer

Bisphosphonate, wie Alendronat, Pamidronat und Zoledronat (Strukturformel [39], [40] und respektive [41]) inhibieren Farne syl-Pyrophosphat-Synthase (FPPS) und induzieren in

Knochenmetastasen Apoptose. Für die Markierung von Knochenmetastasen wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen

Synthesestrategie ein Quadratsäure-gekoppelter Tracer NOTA.QS.PAM mit Chelator NOTA und Targetingvektor Pamindronat (Strukturformel [40]) synthetisiert. Fig. 24 illustriert das angewendete Syntheseschema anhand des Chelators NODAGA (Fig. 24: Synthese von

NODAGA.QS.PAM). Der erfindungsgemäße Tracer NOTA.QS.PAM und der in der klinischen Anwendung etablierte Referenztracer DOTA ^Zo1 wurden mit ⁶⁸ Ga markiert, jungen gesunden Wistar-Ratten injiziert und PET-Scans aufgezeichnet, jeweils in Zeitabständen von 5 min, 60 min und 120 min nach Injektion.

Fig. 25 zeigt die entsprechenden PET-Aufnahmen für die Tracer ⁶⁸ Ga-NOTA.QS.PAM und ⁶⁸ Ga-DOTA ^Zo1 120 min nach Injektion. Beide Tracer zeigen eine spezifische Aufnahme in

Knochenbereichen mit erhöhter Remodellierungsrate, insbesondere in den Epiphysen, die sich bei jungen Ratten noch im Wachstum befinden. Neben dem Skelett weist die Blase erhöhte Aktivität auf und indiziert die präferentiell renale Ausscheidung. Demgegenüber ist die

Retention in Weichgewebe äußerst gering. Im Vergleich zu ⁶⁸ Ga-DOTA ^Zo1 ist die renale Ausscheidung von ⁶⁸ Ga-NOTA.QS.PAM geringfügig reduziert. Diese Beobachtung steht in Einklang mit der renalen Ausscheidung von PSMA-Tracern. Diese ist das Ergebnis einer erhöhten Anreicherung im Zielgewebe in

Verbindung mit beschleunigter renaler Ausscheidung von freiem, nicht spezifisch gebundenem Tracer. Hinsichtlich der pharmakologischen Kinetik weisen die erfindungsgemäßen,

Quadratsäure-gekoppleten Tracer Vorteile gegenüber bekannten Tracern auf.

In Fig. 26 sind die Aufnahmewerte (SETV) für ⁶⁸ Ga-NOTA.QS.PAM und ⁶⁸ Ga-DOTA ^Zo1 in verschiedenen Organen in Zeitabständen von 5 min und 60 min nach Injektion in Form eines Balkendiagramms wiedergegeben. Die Organverteilung der Aktivität zeigt, dass beide Tracer eine hohe Aufnahme und Retention in Knochen aufweisen, wobei ⁶⁸ Ga- NOTA.QS.PAM einen geringfügig höheren Femur-SETV hat (SETV Femur: ⁶⁸ Ga-DOTA ^Zo1 = 3,7 ± 0,4; ⁶⁸ Ga-NOTA. QS.PAM = 4,5 ± 0,2). Beide Tracer zeichnen sich durch renale Ausscheidung und geringe Retention im restlichen Gewebe aus.

Beispiel 10: OS.PSMA Um die Aktivität der QS zu verdeutlichen wurden vergleichbare Versuche wie bei

DOTA.QS.PSMA mit NODAGA.QS.PSMA durchgeführt. Fig. 27 und 28 zeigen die radioaktive Markierung der Verbindungen mit ⁶⁸ Ga jeweils gemessen mit radio-DC (Fig. 27) und radio- HPLC (Fig. 28). Es werden Ausbeute von mehr als 95% erreicht.

Entsprechende Stabilitätstests wurde durchgeführt in humanem Serum und in PBS-Puffer. Die Verbindungen zeigen Stabilitäten von mehr als 95% nach 2h in PBS und in HS. Fig. 29 zeigt die mittels HPLC gemessene Stabilität.

Im Weiteren wurden die drei Verbindungen DOTAGA.QS.PSMA, NODAGA.QS.PSMA und TRAP.QS.PSMA in vivo und ex vivo untersucht. Fig. 30 zeigt die ex vivo Resultate der drei jeweils mit ⁶⁸ Ga markierten Verbindungen. Aus Fig. 30 ist ersichtlich, dass alle drei

Verbindungen sich im Tumorgewebe anreichern, wobei NODAGA.QS.PSMA eine niedrige Anreicherung in den Nieren zeigt.

Beispiel 11 : TRAP.QS.PSMA

Fig. 3 la-b, 32-36 zeigen die Synthese sowie Messergebnisse zur Radiomarkierung, Stabilität und in vivo Untersuchungen des Radiotracer [ ⁶⁸ Ga]Ga-TRAP.QS.PSMA. Die Ergebnisse sind vergleichbar mit denen der Beispiele 8 und 10. Die in vivo Untersuchungen wurden mit ⁶⁸ Ga und ⁶⁴ Cu durchgefuhrt. Aus den Aufnahmen ist ersichtlich, dass im Vergleich zu den Beispielen 8 und 10 die Anreicherung in den Nieren für beide Radiotracer erhöht ist. Dies ist auf die abweichende, durch langkettige Linker verursachte Lipohilie der Radiotracer des Beispiels 11 zurückzuführen. Der ex vivo Vergleich zeigt, dass gegenüber [ ⁶⁸ Ga]Ga-PSMA-l 1 die

Anreicherung im Tumorgewebe erhöht und in den Nieren merklich erniedrigt ist. Beispiel 12: r ⁶⁸ GalGa-DATA OS.PSMA

Weitere erfmdungsgemäße Verbindungen sind jene des Typs DATA.QS.PSMA, deren Struktur den anderen aufgeführten Verbindungen entspricht, wobei der Chelator DATA eine einfachere und mildere Markierung ermöglicht. Bei der in Fig. 37 dargestellten Synthese wird eine

Ausbeute von etwa 70% erzielt. Bei der radioaktiven Markierung mit ⁶⁸ Ga wird eine Ausbeute von mehr als 95% erreicht (Fig. 38). Wie aus Fig. 39 ersichtlich, weisen die Verbindungen eine hohe Stabilität sowohl in Humanserum (HS) wie auch phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf. Bei vitro Untersuchungen der Verbindung mit LNCap-Zellen wird ein IC o-Wert von 51.5 nM erhalten, der mit PSMA-l 1 und PSMA-617 vergleichbar ist (Tabelle 3). Desweiteren wurden Verbindungen des Typs DATA.QS.PSMA in vivo im gleichen Tiermodell mit PSMA-l 1 verglichen. Die MIP-Abbildungen (Fig. 40) zeigen deutlich, dass auch für

[ ⁶⁸ Ga]Ga-DATA.QS.PSMA eine sehr gute Anreicherung in den Tumor zu sehen ist. Aus den in Fig 40 wiedergegebenen Zeit/ Aktivitätskurven ist zudem ersichtlich, dass die Ausscheidung über die Nieren für [ ⁶⁸ Ga]Ga-DATA.QS.PSMA in der ersten Stunde deutlich schneller erfolgt als bei [ ⁶⁸ Ga] -PSMA-l 1. Die Anreicherung im Tumorgewebe ist vergleichbar.

Tabelle 3 : ICso-Werte der nicht markierten Verbindungen.

Die Ergebnisse von ex vivo Untersuchungen (Fig. 41-43) stehen in Einklang mit den in vivo Beobachtungen. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, sind die %ID/g-Werte im Tumor der beiden mit ⁶⁸ Ga markierten Verbindungen vergleichbar, wohingegen bei [ ⁶⁸ Ga]Ga-DATA.QS.PSMA die Anreicherung in den Nieren und den Speicheldrüsen erheblich reduziert ist. Niedrige

Anreicherung in den Speicheldrüsen ist sehr vorteilhaft, da letztere bei bekannten Verfahren zur radiopharmazeutischen Behandlung von Prostatakrebs einer erhöhten Dosis ausgesetzt und in ihrer Funktion erheblich beeinträchtigt sind. Blocking-Studien mit 2-PMPA zeigen zudem, dass die erfmdungsgemäßen Verbindungen eine erhöhte Spezifizität für PSMA aufweisen.

Tabelle 4: Ex vivo Aktivitäten

Beispiel 13 : r ⁴⁴ Sc1Sc-AAZTA.OS.PSMA

Ähnlich wie DATA lässt sich auch der Chelator AAZTA bei milden Bedingungen mit Radio- nukliden, wie beispielsweise ⁴⁴ Sc und ⁶⁸ Ga markieren. In diesem Beispiel wurde für die

Markierung ⁴⁴ Sc eingesetzt und die Eigenschaften des Radiotracers [ ⁴⁴ Sc1Sc-AAZTA OS.PSMA untersucht. Die in Fig. 44 dargestellte Synthese konnte einfach und mit hohen Ausbeuten durchgeführt werden. Wie in Fig. 45 gezeigt, wird auch bei der Radiomarkierung eine hohe Ausbeute erhalten. Die Stabilität von [ ⁴⁴ Sc1Sc-AAZTA OS.PSMA beträgt mehr als 95% über einen Zeitraum von 24h (Fig. 46).

Der Radiotracer [ ⁴⁴ SclSc-AAZTA OS.PSMA wurde außerdem in vivo in drei, jeweils einen LNCap Tumor tragenden Mäusen untersucht. An einer der Mäuse wurden zudem Blocking- ETntersuchungen durchgeführt. Die in Tabelle 5 und Fig. 47 gezeigten ex vivo Ergebnisse zeigen, dass auch die mit ⁴⁴ Sc markierten AAZTA-Derivate im Tumorgewebe stark angereichert werden. Außerdem kann mit 2-PMPA ein Großteil der Aktivität im Tumor geblockt werden.

Gleiches gilt auch für die Nieren. Diese Resultate stehen in Einklang mit entsprechenden in vivo ETntersuchungen. Fig. 48 und 49 zeigen die Tumoraktivität lh nach Injektion ohne Blocking bzw. 40 nach Injektion (20 min statische Aufnahme) mit Blocking durch Koinjektion von 2- PMPA.

Tabelle 5: Ex vivo Aktivitäten

Beispiel 14: Verbindungen für ¹⁸ F -Markierung

Für die PET-Diagnostik mit ¹⁸ F wurden diverse Markierungsvorläufer synthetisiert und in vitro an LNCap Zellen untersucht. Hierbei wurden für mehrere der untersuchten Verbindungen niedrige, zu PSMA-l 1 und PSMA-617 korrespondierende ICko-Werte beobachtet. Drei derartige Verbindungen mit ihren ICko-Werten sind in Fig. 50 gezeigt (Fig. 50: Verbindungen für ¹⁸ F -Radiotracer).

Beispiel 15: DOTA FAPi und DATA FAPi

Die in Fig. 51 gezeigte Synthese von DOTA.QS.FAPi wird analog zu Beispiel 6 durchgefiihrt und umfasst die Schritte: (a) Paraformaldehyd, MeOH, Amberlyst A21 ; (b) Pd/C, CH3COOH, abs. EtOH, K2C03; (c) tert-Butylbromoacetat, MeCN, K2C03; (d) Formalin (37 wt%), CH3COOH, NaBH4, MeCN; (e) l M LiOH, l,4-Dioxan/H20 (2: 1); (f) N-boc-Ethylenediamin, HATU, HOBt, DIPEA, MeCN; (g) (i) 80 % TFA in DCM, (ii) 3,4-Diethoxycyclobut-3-ene-l,2- dion, Phosphat-Puffer pH 7, 1 M NaOH; (h) 3, Phosphate-Puffer pH 9, 1 M NaOH

(Fig. 51 : Synthese DAT A.QS.FAPi). Die Markierung mit ⁶⁸ Ga erfolgt schnell und mit hoher Ausbeute (Fig. 52 und 53). Die Stabilität in humanem Serum (HS) und NaCl-Lösung beträgt über einen Zeitraum von 2h mehr als 98% (Tabelle 6).

Tabelle 6: Stabilität in HS, EtOH und NaCl

Die Messung der FAP IC o-Werte wurde mit Z-Gly-Pro-7-amino-4-methylcoumarin (AMC) durchgeführt. Die Bestimmung der PREP IC o-Werte erfolgte mit N-succinyl-Gly-Pro-AMC. Die Selektivitätsindices sind vergleichbar mit Literaturwerten (Jansen et al. J Med Chem, 2014, 7, 3053). Die Messwerte sind in Tabelle 7 wiedergegeben.

Tabelle 7: IC50-Werte und Selektivitätsindices

In vivo sowie ex vivo ETnter suchungen mit [ ⁶⁸ Ga]Ga-DOTA.QS.FAPi an Darmkrebs (HT29) tragenden Mäusen zeigen eine hohe Anreicherung im Tumorgewebe (Fig. 54 und 55).