BACTÉRICIDE

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ET DESCRIPTION

[0001] La séquestration des agents infectieux aériens est une priorité pour la santé publique. La récente épidémie virale en Asie (Covid-19) qui s’est transformée en pandémie mondiale est un excellent exemple. La consommation des masques de type FFP2 en milieu hospitalier est passé très rapidement à plus de 1000 masques par service par jour. Cette explosion de la demande a mis à jour des lacunes chroniques dans la disponibilité des équipements de protection personnelle (EPP). Le recours à des EPP performants de source alternative et dotés de capacité virucide et/ou bactéricide devient donc une nécessité.

[0002] Les filtres de type HEPA (existant dans les masques chirurgicaux) sont efficaces pour retenir et bloquer les virus aérosols, mais ne sont pas efficaces comme barrière de protection contre les virus aériens qui ont une taille inférieure aux pores du filtre.

[0003] Les inventions couvertes par les brevets US 3,664,335 et US 4,195,629, malgré leur souplesse, ne présentent pas une barrière contre les particules de faible dimension.

[0004] La rétention des agents infectieux dans un masque de type HEPA empêche la contamination immédiate de son porteur. Cette rétention représente cependant un risque non négligeable de contamination future si le porteur effectue une mauvaise manipulation lors de l’ajustement ou de l’enlèvement du masque.

[0005] Le brevet US 5,888,527 concerne un masque antiviral utilisant du polyphénol de thé contenant des catéchines et des Théa-flavines pour désactiver les virus.

[0006] La demande de brevet international W00/051460 concerne un filtre multicouche dont une couche retient les particules et les bactéries, tandis qu’une couche additionnelle a pour but de tuer les bactéries et les virus dont la taille est trop petite.

[0007] Les travaux publiés dans le Carbohydrate Polymers, Volume 199, 1 November 2018, Pages 641-648, montre qu’en plus des propriétés antibactériennes de l’argent (Ag), il est possible d’obtenir un fort impact antimicrobien contre le E. coli et le S. aureus par revêtement de nanoparticules d'argent avec du chitosane.

[0008] Les nanoparticules ZnO fonctionnalisées avec l'acide glutamique (Glu) et le thiosemicarbazide (TSC) ont montré de propriétés antimicrobiennes beaucoup plus élevé que les nanoparticules seules (Journal of Cluster Science volume, 2019, 30, pages 329-336)

[0009] L’étude de l'activité antimicrobienne des nanoparticules a montré que la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules par le Glucosamine entraîne une augmentation de leurs impacts antimicrobiens. Le mécanisme d'action antimicrobienne efficace des nanoparticules fonctionnalisées peut être attribué à la génération d'espèces / radicaux actifs en surface à la surface des nanoparticules et à sa relation structurelle-activité dérivée (Chemical Engineering Journal, Volume 209, 15 October 2012, Pages 558-567). [0010] Malgré que la littérature est très riche en ce qui concerne le rôle des nanoparticules métalliques à base d’argent, de cuivre ou de zinc sur les propriétés antibactériennes, peu de travaux ont été réalisés pour divulguer l’impact sur les viras en particulier des nanoparticules et nanoparticules fonctionnalisées. De même, les résultats de plusieurs recherches n’ont pas pu mettre en évidence les bénéfices de l’utilisation de ces nanoparticules dans des masques, sachant le coût de réalisation relativement élevé et en considérant que la majorité de ces masques sont jetables. De même aucun travail ne s’est intéressé à des masques ayant des propriétés virucides et/ou bactéricides, d’où l’invention en cours.

[0011] La démocratisation des techniques de production permet désormais aux particuliers de produire rapidement des pièces en plastique de bonne qualité au moyen de la fabrication additive par filament fondu (FDM/FFF).

[0012] La combinaison de la fabrication additive aux chaînes de blocs (« Block-chain »), selon les concepts d’industrie 4.0, permet une diffusion maîtrisée et rapide des éléments de conception du produit.

DESCRIPTION

[0013] Deux facteurs ont motivé la réalisation de la présente invention, à savoir l’épidémie qui s’est transformé en pandémie et la pénurie des masques durant cette période qui en a résulté. La présente invention propose ainsi une solution alternative à ces deux points, à savoir le recours à un masque réutilisable ayant des propriétés virucides et/ou bactéricides. Le présent masque est composé de deux parties : une partie solide qui assure l’étanchéité avec le visage et un fdtre à couches multiples qui assure la respiration du porteur du masque. La Figure 1 présente une vue d’ensemble ((1) Porte filtre amovible (géométrie type, mais non limitée à) (2) Filtre remplaçable (3) Masque (géométrie type, mais non limitée à) (4) Joint d’étanchéité (géométrie type, mais non limitée à) (5) Points de fixation des bretelles). La partie coté visage peut être fabriquée par une variété de polymères tels que : l’acide polylactique, la famille des nylons, les polymères de haute performance (PEEK, PEKK, PPS, PEI et leurs mélanges), PET, PETG et ces dérivés, les polyoléfines et tous les mélanges des polymères issus de ces polymères.

[0014] Pour des raisons de sécurité, les masques réalisés couvrent en total le nez, la bouche et le menton (Figure 2 : Zone du visage couvert par le masque (géométrie type, mais non limitée à)) tout en assurant une très bonne étanchéité avec le visage du porteur. L’étanchéité est réalisée via le moulage d’une résine durcissable coulée sur la partie frontale du masque. Cette résine ne présente aucun danger à la peau du porteur.

[0015] Les molécules ayant des propriétés antibactériens et/ou antivirales utilisées dans la présente invention, dérivent des familles de nanoparticules d’argent, de zinc, de cuivre, de titane et de magnésium, les molécules intermétalliques issus de ces métaux, ainsi d’autres molécules organiques contenant des fonctions amine avec un degré de protonation élevé tel que le chitosane.

[0016] Les nanocomposites à base des polymères (ou mélange des polymères) et agents antibactériens et/ou antiviraux sont préparés à l’état fondu par extrusion dans une extrudeuse bi-vis. Les paramètres de test tels que la température et la vitesse de rotation des vis sont variés en fonction de chaque système considéré. Le filament extradé est granulé pour servir de matière première dans des systèmes de production de filament à diamètre calibré ou pour ré extrusion/injection. Les filaments sont destinés à être utilisé par des imprimantes 3D de type FDM/FFF pour la fabrication de masques.

[0017] La mise en forme des masques est réalisée par impression 3D ou par extrusion/injection sur des moules selon les caractéristiques techniques de chaque matériaux nanocomposites. L’impression 3D (ou la fabrication additive) des plastiques et une technologie d’ajout de matériau couche par couche jusqu’à l’obtention de la pièce finale

[0018] La partie frontale du masque constitue le filtre jetable. Ce filtre est conçu de plusieurs couches de tissu tissé et/ou non tissé (Figure 3 : Composition du filtre remplaçable : (1) Couche interne (2) Couches intermédiaires (3) Couche externe fonctionnelle). La partie extérieure du filtre (exposée à l’air atmosphérique) est fabriquée d’un tissue non tissé chargé des agents antibactériens/antiviraux précités. Les agents actifs sont mis en suspension dans une solution contenant déjà un polymère ou biopolymère polaire de préférence contenant un bon nombre de fonctions amine primaire. Le solvant utilisé a un caractère très volatil. Les mélanges ayant les viscosités souhaitées sont par la suite déposés sur le filtre par la technologie d’électro-filage, ce qui permet de conserver une texture fibreuse. L’épaisseur de la couche déposée n’excède guère quelques centaines de nanomètres à quelques microns. Ceci n’a aucun impact sur le bon fonctionnement du masque en termes de résistance respiratoire.

[0019] Pour l’utilisation des masques dans un milieu hostile tels que les hôpitaux, la désinfection des masques s’effectue selon les normes applicables NF EN 14885/DVA NF T 72- 281. La procédure consiste à l’utilisation d’un désinfectant répondant aux normes médicales (Bactéricide NF EN 13727, Virucide NF EN 14476). Pour une utilisation de masque en milieu non-hospitalier, la désinfection peut être réalisée avec des détergents recommandés à cette fin.

[0020] Pour les tests antibactériens, les masques et les filtres témoins et chargés avec des molécules bioactives ont été préparés sous forme d'échantillons de forme carrée de 50 x 50 mm ² . Les échantillons ont été nettoyés et désinfectés avec de l'éthanol à 70% pour éviter toute contamination.

[0021] Deux souches bactériennes ont été utilisées dans ce travail : Escherichia coli et Staphylococcus aureus.

[0022] Pour la partie imprimée en 3D et/ou préparé par extrusion- injection, considérée comme plastique et surface non poreuse, les tests antibactériens ont été réalisés selon la norme ISO- 22196 (2007), alors que pour le filtre, les tests ont été effectués selon la norme ISO-20743.

[0023] Les bactéries ont été stockées dans le bouillon Brain-Heart Infusion (BHI) additionné de 30% (v/v) de glycérol et conservées à -80°C. Avant chaque utilisation expérimentale, les souches ont été pré-cultivées deux fois dans le bouillon BHI et incubées à 35°C pendant 18h.

[0024] Pour la préparation des suspensions bactériennes, les bactéries testées sont transférées à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile dans 9 ml de Bouillon Nutritif dilué (NB) (1/500) et incubées à 35°C pendant 24 h. La concentration finale de la suspension bactérienne (inoculum) pour chaque bactérie est ajustée à environ 105 UFC/ml à l'aide d'un spectrophotomètre (600 nm). Au cours de chaque expérience, le dernier repiquage est utilisé pour préparer la suspension bactérienne de test. [0025] Chaque échantillon d'essai a été placé dans une boîte de Pétri stérile séparée avec la surface d’essai en haut. Ensuite, 0,4 ml de l’inoculum d’essai préparé a été déposé sur la surface et recouvert d'un morceau de film (40 mm x 40 mm). Enfin, les boîtes ont été incubées à une température de 35 °C pendant 24 h. Après incubation, 10 ml de bouillon SCDLP ont été ajoutés dans chaque boite pour laver complètement les échantillons. Les bactéries viables récupérées ont été dénombrées en effectuant des dilutions dans une solution physiologique tamponnée au phosphate. Chaque dilution a été étalée en surface dans des boîtes à la gélose Plate Count Agar puis incubées. Le nombre de colonies et l'activité antibactérienne est ensuite calculée selon les normes ISO-22196 et ISO-20743.

[0026] Pour tester l’inhibition de la croissance bactérienne, les différents échantillons prélevés des masques ont été testés contre des bactéries à Gram positif (E. coli) et à Gram négatif (S. aureus).

[0027] Contre E. coli, l’activité bactéricide des dérivés plastiques peut être classée comme suit : Plastique-AgNP / Plastique -ZnNP / Plastique -CuNP / Plastique -TiNP / Plastique. La réduction des cellules bactériennes était d’environ 98.7; 92 ; 89 ; 63 et 0%, respectivement.

[0028] Contre S. aureus et selon l’activité bactéricide des dérivés plastiques, on trouve : Plastique-AgNP / Plastique CuNP/Plastique-ZnNP/Plastique -TiNP/ Plastique. La réduction des cellules bactériennes de S. aureus était d’environ 100 ; 97 ; 75 ; 50 et 2%, respectivement.

[0029] L’activité antibactérienne des filtres a été améliorée de 20% de réduction par rapport à l’échantillon control (sans membrane).

[0030] L’évaluation des propriétés antivirales des masques et des tissues ont été réalisées selon les normes ISO-21702 (2019) et ISO 18184 (2014), respectivement.

[0031] Plusieurs souches de virus dérivant de : Influenza virus (sensible), Coronavirus (exemple SARS, Covid-19) sont considérés. Des milieux de culture relativement à chaque type de virus ont été utilisées.

[0032] Les virus cryo-conservés ont été décongelés à une température de 37°C. Les solutions virales pour le test ont été préparées puis conservées au réfrigérateur à 4°C. Le test et la mesure d’ineffectivité des virus ont été réalisés selon les normes ISO 21702 (2019) et ISO 18184 (2014).

[0033] Des échantillons de 0,5 g et d'environ 20 mm par 20 mm par pièce pour les échantillons des filtres et 50 mm par 50 mm avec 10 mm d’épaisseur par pièce pour les échantillons Plastiques ont été préparés. 9 échantillons pour la référence (control négatil) et 6 échantillons pour le matériau traité ont été préparés pour chaque virus. Les échantillons ont été stérilisés dans un autoclave à 121°C et 103 kPa pendant 15 min.

[0034] L’évaluation d’activité antivirale pour les échantillons de filtres et de plastique ont été réalisées selon les normes ISO-21702 (2019) et IS018184 (2014).

[0035] Tous les échantillons ont été inoculés avec 0,2 ml de la suspension virale déjà préparée dans des flacons spécifiques. 3 échantillons de référence et 3 échantillons de test antiviraux ont été conservés sans inoculation pour le test témoin. Les flacons ont été incubés pendant 2 h à 25°C. Après 2h de contact, 20 ml de milieu SCDLP ont été ajoutés. Ensuite, les flacons ont été fermés et agités pour récupérer les virus des échantillons. Immédiatement après l'inoculation du virus, 3 échantillons de référence ont été récupérés sans incubation. Enfin, une série de dilutions de chaque échantillon a été préparée dans 1,8 ml du milieu d'entretien. La détermination de PFU et la mesure de G ineffectivité par la méthode de plaque ont été réalisés selon les normes ISO-21702 (2019) et IS018184 (2014).

[0036] Pour la partie filtre, sa partie extérieure (exposée à l’air atmosphérique- partie active) est fabriquée d’un tissue non tissé chargé des agents antibactériens/antiviraux.

[0037] La partie déposée par électro-filage est une couche constituée de biopolymères chargé avec des nanoparticules déjà précitées.

[0038] Pour le test de filtration contre les virus, les échantillons de filtres avec et sans couche active ont été testés contre la souche d’Influenza virus (sensible) comme virus test.

[0039] Le montage de filtration utilisé pour le test est constitué d'un générateur d'aérosol relié à un nébuliseur. Ces deux composantes sont séparées par un filtre de taille de pore de 0.22 pm afin d'éviter toute contamination bactérienne.

[0040] Le filtre est placé dans une cellule contenant une entrée et une sortie d'air. La sortie d'air est connectée à un piège liquide (un sérum physiologique) pour capter les souches virales sortantes. Le montage a été stérilisé par autoclavage.

[0041] Après croissance des cellules hôtes dans 150 ml de milieu de croissance, la solution virale a été préparée. L’incubation a été faite pendant 24h à 35°C. Le milieu a été ensuite centrifugé pour éliminer les cellules, les surnageant a été passé par un filtre de taille de pores de 0,45 pm. La solution récupérée sert de solution test à nébuliser.

[0042] La solution virale déjà préparée a été nébulisée pendant 1 heure. La filtration a été réalisée contre le montage seul pour déterminer le facteur de perte. Ensuite, Trois échantillons de filtres traités et non traités ont été préparés. Enfin, les différents échantillons ont été testés par filtration contre Influenza virus.

[0043] Des virus des différentes familles représentatives ont été choisis pour évaluer les activités antivirales des échantillons de plastique et de filtre.

[0044] Concernant les échantillons de plastiques et comme prévu, les témoins de Plastique indiquent une inactivation relativement faible (non significative), tandis que les plastiques modifiés permettent de capter les virus et de les neutraliser. La neutralisation est totale pour les échantillons Plastique -AgNP, Plastique-CuNP, et partielle pour Plastique -ZnNP et Plastique - TiNP, respectivement. Les mêmes remarques sont valables pour les autres virus considérés.

[0045] Concernant les filtres testés, une inactivation presque totale des virus en question a été observé pour les filtres couverts par des polymères chargés avec des dérivés Ag et Cu et Zn.

[0046] Un test préliminaire du montage de filtration a révélé que le facteur de perte avait une valeur de 2,1.

[0047] En tenant compte du facteur de perte du montage, le test de la filtration contre la souche de TInfluenza virus a démontré que les filtres traités par la couche intermédiaire du chitosane chargé (et les autres molécules constituants la partie active) avaient une rétention virale 17 fois supérieure aux filtres non traités.