KIM SOOK-KYUNG (KR)
LEE SUN YOUNG (KR)
| US20120303083A1 | 2012-11-29 | |||
| US20070077548A1 | 2007-04-05 | |||
| JP2010526305A | 2010-07-29 | |||
| KR20090034980A | 2009-04-08 | |||
| JP2009536726A | 2009-10-15 |
None
특허법인 플러스 (KR)
| 청구범위 a)뇌성나트륨이뇨펩타이드，트로포닌 I또는트로포닌 T 단백질에단백질환원제를첨가하여반웅시키는단계; b) a)단계의단백질흔합물을각각요오드아세트아미드와 요오드아세트아미드의동위원소와반웅시키는단계;및 c) b)단계에서얻은두종류의단백질에대하여질량분석기를 이용한질량스펙트럼을얻는단계; 를포함하는질량분석법. 제 1항에있어서, 상기 a)단계에서단백질환원제는디티오트레이를， 디티오에리트리를，트리스 2-카르복시에틸포스핀또는트리부틸 포스핀인질량분석법. 제 1항에있어서, 상기 b)단계에서반웅은시스테인-시스테인재결합을막기위하여 시스테인의티올기의반웅성을비가역적형태로변경하는 질량분석법. 제 1항에있어서, 상기 b)단계에서요오드아세트아미드의동위원소는 요오드아세트아미드 -i3C2, D2인질량분석법. 제 4항에있어서， 상기요오드아세트아미드와요오드아세트아미드의동위원소는 3 내지 5 Da의분자량차이를가지는질량분석법 . 제 1항에있어서, 상기 c)단계의질량분석기는 LC-ESI-MS/MS인질량분석법. 제 1항에추가로 d)상기 c)단계에서얻은질량스펙트럼으로부터 상기단백질및단백질동위원소가심혈관질환진단또는예후 평가를위한물질로의적합성을판단하는단계를포함하는 심혈관질환진단및예후평가방법. |
발명의명칭:화학적동위원소치환법을이용한 액내뇌성 나트륨이뇨펩타이드질량분석법 기술분야
[1] 본발명은화학적동위원소치환법을이용한심혈 관질환진단바이오마커인 뇌성나트륨이뇨펩타이드특이적질량분석법에 관한것이며，상기
질량분석법을통해얻은실험결과를통해심혈관 질환여부를판단하고그 예후를평가하는방법에관한것이다.
배경기술
[2] 최근국내 .외적으로텐덤질량분석장치 (tandem mass spectrometry, MS/MS)와 융합된분석기술의발전에기인하여,세포내존 하는다양한단백질에대한 특성연구및정성 ·정량적분석이가능한프로테오믹스 (proteomics)분야의 연구가활발히이루어지고있다.특히인간의삶 질향상과연관된질환들에 대한원인을단백질수준에서규명하는데에목적 을두고있다.특히세포,조직, 혈청등의생체시료에대한단백질특이적안정동 위원소표지기술 (stable isotope-labeling method)의개발을통하여정상인과환자간단백질 료의 정량적비교가가능하게되었으며,이는다양한 환조기진단용바이오마커의 발굴및임상진단분야에기여하였다.그러나， 기안정동위원소표지기술을 이용한단백질의정량분석을위해서는 SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture), MeCAT(metal-coded affinity tags), TMT(tandem mass tags) 등과같은세포관련숙련자또는고가의동위원소 가치환된아미노산과복잡한 전처리기술이필요하다는문제점이있다.
[3] 상기문제점으로인해대부분의임상진단평가에 는단백질마커특이적
항체를이용한면역분석법 (immunoassay)이가장널리사용되고있다.특히 심혈관관련질환에대한진단및예후평가를위해 뇌성나트륨이뇨
펩타이드 (brain natriuretic peptide, BNP)단백질마커의정량적추이변화를 면역분석법을통해진단하고있으나，면역분석 법의항원 -항체비특이적반웅및 형광표지 (fluorescein labeling)기술의낮은재현성으로인해뇌성나트륨 이뇨 펩타이드의정량적측정불확실성이크다는단점 을가지고있으며，가격이비싼 효소의활용과오랜반웅시간소요등의문제로인 해효과적으로상기진단및 예후평가를수행하기에는비효율적인점이많아 다른대안이필요한실정이다.
[4] 따라서，상기심혈관질환에대한조기진단및검 증을위해보다정확하고
용이한시료전처리기술및정량분석법개발이필 요한점을인식하여，화학적 동위원소치환법을이용한혈액내뇌성나트륨이 뇨펩타이드질량분석법을 개발하게되어본발명을완성하였다.
발명의상세한설명 기술적과제
[5] 본발명에서는상기면역분석법의항원 -항체비특이적반웅및형광
표지 (fluorescein labeling)기술의낮은재현성과동위원소표지기술 의복잡한 시료전처리과정을동시에극복할수있는 iCCM(isotope-coded
carbamidomethylation)동위원소표지및이를이용한질 량분석기기반뇌성 나트륨이뇨펩타이드특이적정량분석법을제공 하고자한다.
과제해결수단
[6] 본발명은 a)뇌성나트륨이뇨펩타이드，트로포닌 I또는트로포닌 T단백질에 단백질환원제를첨가하여반웅시키는단계; b) a)단계의단백질흔합물올각각 요오드아세트아미드 (IAA)와요오드아세트아미드의동위원소와반응 키는 단계;및 c) b)단계에서얻은두종류의단백질에대하여질량 석기를이용한 질량스펙트럼을얻는단계;를포함하는질량분 법에관한것이다.
[7] 트로포닌 I는일반골격근에서는발견이되지않고，성인 심근에만
존재하므로심근손상이외에크레아틴키나아제 동질효소 (CK-MB)가증가되어 있을상황에서는혈중에서검출되지않아심근손 상에매우특이하며，심근경색 크기와도연관성을나타낸다.또한급성심혈관 환시에그발현량이급격히 증가하는것으로알려져있어서,이러한단백질 검출은급성심혈관질환의 초기진단에매우중요하다.한편,트로포닌 T는심근손상이있을때지속적으로 혈중으로유리되어그농도가증가된다.심장질 후 24시간이내에최고값을 보이고， 9일이상계속하여최고값이상으로존재하기때 에크레아틴 키나아제，크레아틴키나아제동질효소보다진 단시간대가넓어높은예민도및 특이도를가지므로심근경색증의초기및이후진 단에유용하고경색크기의 추정에도유리하다.
[8] 상기 a)단계에서단백질환원제는제한되지는않지만, 예를들면
디티오트레이를，디티오에리트리톨,트리스 2-카르복시에틸포스핀또는 트리부틸포스핀을사용할수있으며,바람직하 는디티오트레이톨을사용할 수있다.상기 b)단계에서반웅은시스테인-시스테인재결합을 막기위하여 시스테인의티올기의반응성을비가역적형태로 변경하는역할을한다.상기 효소처리과정에서단백질에대한효소처리향상 을위해，우선단백질의 시스테인-시스테인 (cystein-cystein)결합에의해형성된이황결합 (disulfide bond)을디티오트레이를 (DTT)와같은환원제를이용하여단백질
변성 (denaturation)시킨후,시스테인-시스테인재결합 (refolding)을막기위해 시스테인의티올기 (thiol group, -SH)에대하여알킬화제 (alkylating agent)인 요오드아세트아미드를첨가하여시스테인의티 올기반응성을비가역적형태로 변경한다.상기요오드아세트아미드에의한화 적수식 (chemical
modification)을통해최종적으로단백질시료에대 효소처리효율향상및 재현성을확보할수있다.상기요오드아세트아 드에의한시스테인특이적 CM(carbamidomethylation)과정을통해시스테인기에 57.05 Da의증가가 발생하게되며，본발명은상기 CM기반화학적수식방법을이용한 BNP 정량분석용동위원소표지방법을특징으로한다 .
[9] 상기 b)단계에서요오드아세트아미드의동위원소는 한되지는않지만,
요오드아세트아미드 -"C 2 , D 2 를사용할수있다. BNP정량분석용동위원소 표지를위하여,요오드아세트아미드와그동위 소인요오드아세트아미드 -i 3 C 2 , ^를 97%이상의순도를가진두개의표준 BNP단백질용액에각각
반웅시킴으로써，두개의시스테인기를가지고 있는 BNP는두곳의 CM반웅에 의해분자량이증가하며，최종적으로는요오드 아세트아미드와그동위원소인 요오드아세트아미드 -i 3 C 2 , D 2 에의해생성된 BNP-CM 2 과 BNP-iCCM 2 의분자량은 각각 3578.12, 3586.12 Da을갖게되어，두 BNP단백질시료간 8 Da의분자량 차이가발생할수있다.따라서，상기요오드아 트아미드와
요오드아세트아미드의동위원소는바람직하게 는 3내지 5 Da의분자량차이를 가질수있다.
[10] 상기 c)단계의질량분석기는제한되지는않지만，예 들면
액체크로마토그래피-전기분무이은화 -텐덤질량분석법 (LC-ESI-MS/MS)올 사용할수있다.
[11] 또한본발명은상기 c)단계에추가로 d)상기 c)단계에서얻은질량
스펙트럼으로부터상기단백질및단백질동위원 소가심혈관질환진단또는 예후평가를위한물질로의적합성을판단하는단 계를포함하는심혈관질환 진단및예후평가방법에관한것이다.
발명의효과
[12] 본발명의뇌성나트륨이뇨펩타이드정량분석법 을통해고가의동위원소치환 펩타이드또는복잡한단백질동위원소표지전처 리방법에의한정량분석에서 야기되는시간및경제적손실을최소화할수있으 며，정량측정불확실성 감소와단백질동위원소표지전처리과정에서야 기되는부반웅을줄일수있는 효과가있다.본발명의 iCCM을이용한뇌성나트륨이뇨펩타이드
동위원소 -표지기반정량분석법은저렴한요오드아세트 미드와
요오드아세트아미드 -i 3 C 2 , D 2 를이용함으로써,뇌성나트륨이뇨펩타이 단백질 정량분석을위한동위원소표지전처리과정이 30분이내에이루어지며，이는 상기일반적정량분석법에비해보다정확한심혈 관질환진단에큰웅용성이 있다할수있다.
도면의간단한설명
[13] 도 1은 IAA를이용한 BNP단백질의 CM반웅에대한개요및 LC-ESI-FT
orbitrap-MS분석결과이며，
[14] 도 2는 CM기반 IAA와동위원소 IAA- 13 C 2 , D 2 를이용한 BNP-CM 2 와 BNP-iCCM 2에대한구조적차이및질량분석을통한분자량 정결과이며， [15] 도 3은 BNP-CM 2 과 BNP-iCCM 2 의흔합물에대한 LC-ESI-FT orbritrap-MS 분석을통해검출된 BPC및질량스펙트럼이며，
[16] 도 4는 400 pg BNP-iCCM 2 가첨가된혈청시료에대한 BPC및 BNP-CM 2 과
BNP-iCCM 2 특이적질량스펙트럼이며,
[17] 도 5는 400 pg BNP-iCCM 2 가첨가된혈청시료에대한 BNP-CM 2 과 BNP-iCCM 2 특이적 XIC분석결과이다.
발명의실시를위한최선의형태
[18] 이하본발명을실시예와첨부된도면을참조하여 상세히설명한다.그러나 이들은본발명을보다상세하게설명하기위한것 으로,본발명의권리범위가 하기의실시예에의해한정되는것은아니다.
[19]
[20] (실시예 1)요오드아세트아미드 (IAA)를이용한뇌성나트륨이뇨
펩타이드 (BNP)특이적카르바미드메틸화 (CM)및질량분석기 (MS)스펙트럼
[21] BNP (분자량: 3464.02 Da), DTT, IAA,동위원소 IAA- 13 C 2 , D 2 는
Sigma-AldrichsE에서구매하였다.표준 BNP단백질에대한 CM반응성및표지의 효율검증을위해 BNP단백질 1 mg을， 50 mM NH 4 CO 3 1 mL용액에용해시킨후, 1 mg DTT를추가하여 37°C에서 2시간동안가볍게흔들어주면서반웅시켰다. 상기 NH 4 C0 3 용액에 40 mM IAA용액을 20 nL첨가하고실온암실에서 30분 동안반웅시켰다.상기 IAA에의한시스테인특이적 CM과정을통해얻은 BNP-CM 2 단백질에대하여 FT orbitrap-MS를이용한질량스펙트럼을조사하여 도 1에도식화하였다.
[22]
[23] 도 1은상기 CM전처리된표준 BNP단백질 1 ng을 C8(5 μπι, 200 Α)이충진된 모세관 (75 μηι내부직경， 360 μιη외부직경)을이용하여분리한후， FT
orbitrap-MS를이용하여얻은 BPC(base peak chromatogram)와 19.2분에검출된 질량스펙트럼을나타낸다 BNP단백질의고유분자량인 3464.02 Da에서두개의 CM반웅에의해 114.10 Da가증가된형태인 3578.12 Da의 BNP-CM 2 가 99%이상 검출됨을확인하였다.특히， [M+4H + ] 4+ , [M+5H + , [M+6H + ] 6+ 및 [Μ+7Η+Γ+둥의 다중수소이은 (multiply hydride ion)을확인할수있었다.
[24]
[25] (실시예 2) IAA와동위원소 IAA- 13 C 2 , D 2 를이용한 BNP특이적 CM및 iCCM 동위원소 -표지효율비교
[26] BNP단백질에각각 IAA와 IAA- 13 C 2 , D 2 를이용한 CM반웅을통해,서로다른 분자량을갖는 BNP-CM 2 와 BNP-iCCM 2 를만들고이를질량분석기를통해 분석하여얻은질량스펙트럼을도 2에도시하였다.
[27] IAA에의해생성된 8 1 > -€1 2 와동위원소 IAA- 13 C 2 , £) 2 에의해생성된
BNP-iCCM 2 를중량비 1:1로흔합한후， LC-ESI-FT orbitrap-MS분석법을통해 BPC를측정하고 19분에용리된질량스펙트럼을확보하여도 3에도시하였다.
[28]
[29] 도 2에서와같이 IAA에의해생성된 BNP-CM 2 (3578.12 Da)와 BNP-iCCM 2 (3586.12 Da)에대한전구체이온 (precursor ion)증 [M+6H + ] 이온에대하여 질량 /전하량인 m/z값올비교한결과각각 59그 6393과 598.9790임을확인할수 있었으며，두단백질간차이가약 1.333 Da (+6)이나타남을확인하였다.이 결과를토대로두단백질간분자량차이가 8 Da이나타남을확인하였으며，이는 CM반웅에의한결과와동일한효율임을알수있었 .특히 IAA 3 C 2 , D 2 를 이용한 BNP-iCCM 2 의질량스펙트럼에서와같이 IAA에의해나타나는 m/z값이 597.6393을갖는 BNP-CM 2 생성물이발견되지않음은 BNP-iCCM 2 의동위원소 표지물질의생성효율이 100%에가깝게이루어졌음을의미한다.
[3이 도 3에서와같이, BNP-CM 2 와 BNP-iCCM 2 단백질이흔합된상태에서두단백질 간 m/z의차이가 1.333 Da를나타내었다.또한，서로다른화학반웅에의 해 생성된단백질의흔합전처리과정에서도두단백 질의정량적변화가발견되지 않은점은혈청이나뇨와같은다양한형태의매질 내에존재하는단백질흔합물 시료에도상호부반웅없이정량적비교연구에웅 용가능한동위원소표지 방법이라할수있다.
[31]
[32] (실시예 3) CM기반동위원소표지법을이용한혈청 BNP단백질정량분석 [33] 상기실시예 1및실시예 2의 BNP특이적동위원소표지전처리방법을토대로 실제혈청시료에포함된 BNP단백질올정량하였다.심혈관환자의혈청시 500 를 ΙΑΑ에의해 CM처리하고， 400 pg BNP-iCCM 2 를혼합한후 C18 SPE 카트리지를사용하여 ACN:H 2 0가 10:90 (v/v)비율로흔합된용액에의해용리된 시료를 LC-ESI-FT orbitrap-MS를사용해 BPC와질량스펙트럼을확보하였다.
[34]
[35] 도 4에다양한형태의단백질및펩타이드흔합물이 출되었음을
확인하였으며，특히 24분에검출된질량분석스펙트럼에서 m/z가 592내지 606의범위에서 BNP-CM 2 와 BNP-iCCM 2 에의해생성되는 m/z가 59그 6393과 598.9790인이은을확인하였다.
[36] 도 5는혈청에존재하는 BNP-CM 2 에의해검출되는 m/z값이 597.6393 (+6), 716.9556 (+5)인것과혈청에첨가된 400 pg BNP-iCCM 2 에의해나타나는 598.9790 (+6), 718.5556 (+5)인이온들에대한단일이은관측 (SIM)모드 (mode)를 통해얻은 XIC(extracted ion chromatogram)이다.도 5의결과를토대로동위원소 표지된 BNP-iCCM 2 단백질의정량적정보를통하여실제혈청에 존재하는 BNP 단백질에대한정량적평가가가능한질량분석법 임을확인하였다.또한최상위 정량분석법인동위원소희석질량분석법 (isotope-dilution mass spectrometry, ID-MS)에큰웅용성을가짐을확인하였다.
Next Patent: NIGHT-TIME FRONT VEHICLE DETECTION AND LOCATION MEASUREMENT SYSTEM USING SINGLE MULTI-EXPOSURE CAMER...