本发明涉及一种用于细胞三维培养的基质支架 及其构建方法和应用。 该支架起着 替代细胞外基质或组织、 器官的基质的作用， 进一步可用于细胞体外分化扩增、 组织 器官再造和肿瘤药物筛选。

背景技术

近年来，随着大量的生物靶向性药物的临床应 用，陆续出现的毒副作用也越来越受到关 注。为何这些药物的毒副作用不能在临床前的 研究结果中发现，主要的根源就是前期研究模 型与体内环境存在一定差距，成功构建接近人 体真实环境的研究模型也许就是解决上述问题 的关键途径之一。

细胞是我们常用的研究对象，我们所从事的细 胞学水平的研究也基本上是在二维培养状 态下进行，由于体内细胞（不论是贴壁还是非 贴壁生长的细胞）均是在一定基质支撑下生长 ， 因此体外的二维培养环境不能真实反应细胞的 体内环境。

近年来，三维培养技术逐渐成为细胞培养领域 研究的热点，其利用各种材料与方法， 使 细胞附着在立体空间内生长，其生长更接近于 细胞的体内生长模式，形成类似体内的组织结 构， 发挥其生理功能。根据培养方式的不同， 目前常用的三维培养技术主要包括动力性培养 和静止性培养两类。动力性培养主要包括旋转 烧瓶培养和旋转细胞培养系统，这类培养技术 虽然通过力学刺激使细胞更好地发挥功能，但 由于条件要求较高不易推广使用。静止性培养 是把细胞直接接种于三维载体上，在不施加任 何物理方法下培养，常见的技术包括自发性细 胞聚集、基质覆盖培养、预置基质培养和微载 体培养等。期中， 预置基质培养提供了与细胞 体内生长类似的支架环境， 且操作相对简单， 但关键取决于基质材料选择。

目前常用的基质来源于胶原蛋白 I、 明胶或提取的细胞外基质等动物性凝胶， 但动物性 凝胶价格昂贵且含有很多不确定成分。

CN101445971A, CN103418029A公幵了由丝素蛋白、 壳聚糖制成的一种仿生细胞外基质 丝素蛋白 /壳聚糖复合纳米纤维， 为细胞生长和组织再生提供最佳的仿生生理环 境。 其缺点 在于该发明所制备的丝素蛋白溶液， 稳定性相对低， 难于工业化应用。 CN102010601A, CN101624472A和 CN101624473A公开了由丝素蛋白、半乳糖基化壳聚 糖 在交联剂的作用下制得一种肝细胞特异性大孔 微载体支架材料， 适合于大规模培养肝细胞。 其缺点在于制作工艺繁琐 （壳聚糖经过糖基化后交联， 后再用网筛过滤）， 且所制备的支架 材料属大孔径支架， 应用范围有限。

CN102942660A公开了一种天然生物交联的纳米复合 三维凝胶支架， 由丙烯酰胺类单体、 无机纳米粘土、生物高分子和生物交联剂京尼 平溶于水原位自由基聚合而成，可用于医用移 植、药物释放和细胞培养。其缺点在于所使用 的主要材料丙烯酰胺类受高热分解易释放出刺 激性气体； 且在酸碱环境下转变成的丙烯酸对细胞有较强 的毒性作用。

CN103418029A公开了由丝素蛋白、壳聚糖制成的一 种丝素 /壳聚糖复合多孔支架。其缺 点在于该复合物的稳定性较差， 不适于工业化生产和广泛应用。

中国专利 CN102952279A公布了用甲基乙烯基醚 /马来酸共聚物和交联剂反应制备水凝 胶的方法及其在肿瘤组织培养中运用，但由于 该基质胶中含有大量细胞生长因子（如表皮生 长因子、 成纤维细胞生长因子及组织纤维酶原活化因子 ）， 这些细胞因子对培养细胞作用的 不确定性。

发明内容

为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一 种用于细胞三维培养的基质支架材料，所 述的基质支架材料类似细胞体内环境的支架， 可用于难培养细胞的体外扩增、组织器官再造 和肿瘤药物筛选。

本发明技术方案如下：

一种用于细胞三维培养的基质支架， 由丝素蛋白类物质、壳聚糖和交联剂经交联反 应而 制得， 其特征在于所述的丝素蛋白类物质是由蚕茧壳 或蚕丝经过脱胶、溶解、透析、干燥制 得丝素粉， 丝素粉再经如下方法制得所述的丝素蛋白类物 质：

( 1 )将丝素粉溶解于溴化锂溶液中；

( 2 )将步骤（1 ) 的溶解后的丝素溶液用截流分子量为 3500Da的透析袋进行透析， 制得透 析后的丝素溶液；

( 3 )将装有步骤 （2 )所制得的透析后的丝素溶液的透析袋放入聚� �二醇 6000粉中进行浓 缩， 所得浓缩液离心后取上清液， 即得所述的丝素蛋白类物质。

上述所述的用于细胞三维培养的基质支架， 其中所述的交联剂， 优选为 1-乙基- 3- [3 - 二甲氨基丙基]碳化二亚胺 （EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS)。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质 支架，其中将所述的丝素蛋白类物质、壳 聚糖和交联剂交联反应后所得反应产物经梯度 冷冻得到所述的基质支架，所述的梯度冷冻过 程如下-

( 1 )将反应产物先放入- 20°C冰箱中预冷冻 12〜48 h， 再放入 -80'C低温冰箱中冷冻 12〜 48h， 最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 24〜72 h, 得到初制的三维支架材料；

(2)将步骤（1 )制得的初制的三维支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠 (体积比 1 ： 1) 溶液浸泡 12〜48 h， 用去离子水冲洗后，置于冷冻干燥机内干燥 24〜72h后取出即得。

上述所述的用于细胞三维培养的基质支架， 其中通过改变丝素蛋白类物质、 壳聚糖和 / 或交联剂的用量以制得不同孔径和构象的用于 细胞三维培养的基质支架。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质 支架，其特征在于是通过包含如下步骤的 方法制得-

( 1 )制备丝素蛋白类物质的溶液

1 )将蚕茧壳剪成碎片后加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液煮沸 2— 3遍， 再用去离子水洗 后进行烘干；

2)将步骤 1 ) 制得的干燥丝素加入煮沸的 50%氯化钙溶液搅拌溶解， 冷却后过滤；

3)将滤液装入透析袋中用去离子水透析制得� ��素蛋白溶液， 用保鲜袋封装， 依次放入 -20度冰箱、 -80度冰箱， 最后放入冷冻干燥器中进行干燥制得丝素粉；

4)称取步骤 3)制得的丝素粉 10g,溶解于 9M溴化锂水溶液中， 室温下进行搅拌溶解；

5)将步骤 4)所制得的溶解后的丝素溶液冷却至常温后，� ��入截流分子量为 3500Da的 透析袋中透析 2— 4天，以去除丝素溶液中的小分子物质；

6)将步骤 5)制得的透析后的丝素溶液存放于透析袋,放入 聚乙二醇 6000粉剂中，干 燥浓缩,收集液体，离心取上清液即得；

(2) 制备壳聚糖溶液

1 )将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸， 将 pH调至 4. 6；

2)称取壳聚糖（脱乙酰度〉 90%)加入上述冰醋酸， 配制成壳聚糖溶液；

(3)制备交联支架

1 )将步骤（1 )所制备的丝素蛋白类物质的溶液和步骤（2)所 制备的壳聚糖溶液混合；

2 )浸入含 50匪 ol/l的 ED (：、 18醒 ol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h;

3)将步骤 2) 的交联反应产物放入 -20Ό冰箱中预冷冻 24 h， 再放入 _80°C低温冰箱中 冷冻 24 h, 最后放入冷冻干燥机冷冻干燥 48 h， 得到初制的三维支架材料；

4)将步骤 3) 所制的支架材料浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠 (体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h， 用去离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出， 即得所述的用于 细胞三维培养的基质支架。

优选地，上述所述的用于细胞三维培养的基质 支架，其中所述的丝素蛋白类物质溶液的 浓度为 1 %— 5%， 所述的壳聚糖溶液的浓度为 1 %— 5%。

作为本发明另一目的，还提供上述所述的基质 支架的应用，其特征在于用于细胞的体外 扩增、 组织器官再造或者药物筛选。

优选地， 上述所述的应用， 其中用于干细胞培养、肿瘤微环境构建、肿瘤 药物筛选或者 组织器官重建工程。

优选地，上述所述的应用，其中用于胚胎组织 分离成肌细胞体外分化、肿瘤组织分离肿 瘤相关巨噬细胞（TAMs ) 或者肿瘤相关纤维母细胞（TAFs) 的体外扩增。

作为本发明另一目的，还提供一种细胞体外扩 增的方法，包括使用上述所述的基质支架 作为细胞三维培养的支架材料。

本发明所述的基质构架，采用所述方法制得的 丝素蛋白类物质与壳聚糖和交联剂进行交 联反应，通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例， 以得到不同孔径和 / 或构象的三维基质支架。

本发明还提供了上述所述的用于细胞三维培养 的基质支架的制备方法。作为具体实施方 式之一， 所述方法包括如下步骤-

1、 制备 1%〜5%丝素蛋白液

( 1 ) 将蚕茧壳（或蚕丝）剪成碎片后加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液煮沸 3-2遍， 再用去离子水洗两次再烘干。

(2) 将干燥的丝素加入煮沸的 50%氯化钙溶液搅拌， 冷却后过滤。

(3) 将滤液装入透析袋中用去离子水透析制得丝素 蛋白溶液， 用保鲜袋封装， 依次放入 -20度冰箱、 -80度冰箱， 最后放入冷冻干燥器中。

(4) 称取丝素粉 10g，溶解于 9M溴化锂水溶液中， 室温下搅拌 2小时进行溶解。

( 5) 将以上溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入 截流分子量为 3500Da的透析 袋中透析三天，以去除丝素溶液中的小分子物 质。

(6) 将制得的丝素蛋白液体存放透析袋，放入聚乙 二醇 6000粉剂中，干燥浓缩， 收集液体,离心取上清液。

(7) 取 3个称量瓶编号洗净后放入 60° C恒温烘箱中烘干，充分冷却,称量三者 重量，记为 Ml。 各取 10 ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为 M2。 放入 60° C 供箱中 12h取出，冷却后称重记为 M3,按公式丝素蛋白溶液浓度 %= (M3-M1)

/ (M2— Μ1) χ100%。

2、 制备 1%〜5%壳聚糖溶液

( 1 ) 将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸， 将 pH调至 4. 6。

(2) 称取 3〜5g壳聚糖 （脱乙酰度〉90%)加入上述冰醋酸。

3、 制备交联支架

( 1 ) 将步骤 1所制备的丝素蛋白溶液和步骤 2所制备的壳聚糖溶液混合。

(2) 浸入含 50ramol/l的 EDC；、 18mmol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h。

(3) 放入 -20°C冰箱中预冷冻 24 h， 再放入 -80 °C低温冰箱中冷冻 24 h， 最后放入冷 冻干燥机冷冻干燥 48 h， 得到初制 S F/C S支架材料。

(4) 将所制支架浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠（体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h， 用去 离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出镜检。

另一方面，本发明所述的基质支架的应用，优 选应用于在胚胎组织分离成肌细胞体外分 化、肿瘤组织分类肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)和� ��瘤相关纤维母细胞（TAFs)体外扩增中的 应用。

有益效果

本发明以蚕茧壳或蚕丝为原料，经过特定的提 取工艺制得了天然丝素蛋白类物质， 以其 作为原料， 与天然的壳聚糖 （chitosan, CS) 原料， 运用无毒性交联剂 1-乙基 _3_ [3-二甲 氨基丙基]碳化二亚胺 （EDC)和 N羟基琥珀酰亚胺 （NHS)进行交联反应， 所制得的三维基 质支架的构象接近细胞体内的空间构象，细胞 种植后能尽快形成细胞生长微环境，有利于细 胞尽快适应新的生长环境并发挥正常生理功能 。 本发明的主要优点：

1. 本发明从蚕茧壳或蚕丝中制得的丝素蛋白类物 质和壳聚糖均被证明具有良好生物相 容性和无毒性， 与动物性凝胶相比， 具有操作简单、 成本低廉等优点。

2. 大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于 一定的支架而生长， 本发明所制得的 所述的三维基质构架既适合于贴壁细胞也适合 非贴壁细胞的培养。 细胞在此三维环 境中排除了二维培养中的接触性抑制效应， 在此系统中进行的细胞体外研究结果， 更能客观反映细胞生理状态的生命活动， 提高研究结果的可靠性。

3. 通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例，可得到� �同孔径和构 象的三维基质支架， 根据培养目的细胞所在体内的组织结构特点， 可选用不同孔径 和不同基质构象的三维培养系统， 满足于不同组织来源的细胞的原代体外培养， 应 用范围及其广泛， 可适用于难培养细胞体的体外扩增、 组织器官再造和肿瘤药物筛 选。

4. 本发明的细胞三维培养基质构架材料的构象类 似于细胞体内微环境中的纤维组织构 象， 原代分离的细胞能尽快适应体外生长环境， 立足于此三维 （3D)培养过程中的 细胞生物学行为与体内接近， 减少体内外实验结果的误差， 具有重大的社会效益。

5. 为细胞三维培养研究提供了一个新的研究途径 ，这一研究的应用，将在干细胞培养、 肿瘤微环境构建、 肿瘤药物筛选、 组织器官重建工程等方面起着重要推动作用。 附图说明

图 1. 本发明实施例 1制备的基质构架材料在光学显微镜和扫描电� �显微镜下的图像 图 2. 原代成肌细胞在本发明实施例 1制得的三维基质构架培养中的分化 （肌管融合率） 情况

图 3. 原代成肌细胞在本发明实施例 1制得的三维基质培养中的增殖 （细胞周期）情况 图 4. 肿瘤相关巨噬细胞 （TAMs )在实施例 1制得三维基质培养中的生长（MTT) 情况 图 5. 肿瘤相关纤维母细胞 （TAFs )在实施例 1制得的三维基质培养中的生长 （MTT) 情 况

图 6. 本发明的基质支架材料与现有的丝素蛋白制得 的支架材料降解性的影响对比情况 图 7. 本发明的基质支架材料与现有的丝素蛋白制得 的支架材料对细胞增殖能力的影响 对比情况

其中- 图 1中： 经过冷冻干燥后的三维基质构架材料， 光学显微镜 （日本 Olympus CX21 )观察 通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例， 得到不同孔径的三维基质支 架， 图 1A-B (放大倍数 X 400); 扫描电子显微镜（荷兰， Philips XL20) 电镜观察基质结构 (见图 1C)。

图 2中： 从图中看出， 随着培养时间的延长， 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率开始逐 渐上升， 而 3D培养的成肌细胞的肌管形成率从培养的第 6天开始直到第 12天均保持一个平台 期。 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率在第 12天分别为 17%和 33%。

图 3中： 从图中看出， 成肌细胞在 2D培养基中 1天、 3天和 6天时合成期（S期）细胞分别 为 33%、 28%和 23%， 而 3D培养基中 1天、 3天和 6天时 S期细胞分别为 32%、 39%和 41%。

图 4: 从图中看出， 从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 而 3D 培养的 TAMs的 0D值从培养的第 6天开始直到第 15天均保持一个较高的平台期。 3D和 2D培养的 TAMs的 OD值在第 15天分别为 0. 63和 0. 43。

图 5中： 从图中看出， 从培养的第 2天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 2D 培养的 TAMs的 0D值至第 10天开始下降； 而 3D培养的 TAMs的 0D值持续升高到第 15天才开始下 降。

图 6中： 从图中看出， 用现有技术所制备的丝素蛋白液所制备的三维 支架 7W后的降解率 高达 21. 2%， 而使用本发明方法制 _备的丝素蛋白类物质为原料制备的三维支架� �着时间的延 长， 其降解率并不明显增加， 7W后仅为 9. 4%。

图 7中： 从图中看出， 用现有技术所制备的丝素蛋白溶液不能很好地 保持丝素蛋白原有 的理化性质，导致所制备的三维支架的降解率 随丝素蛋白溶液放置时间的延长而增高。而本 发明方法制备的丝素蛋白类物质为原料所制备 的三维支架稳定性较好，因此有利于原代组织 细胞在新环境中的适应和增殖， 原代培养细胞在 2周仍能保持较高的增殖能力， 两组间有明 显差异 P=0. 031 ) 具体实施方式

本发明提供的细胞三维培养的基质是采用本发 明所述的丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与 交联剂进行交联反应， 通过调整丝素蛋白类物质 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例， 得到 不同孔径和构象的三维基质支架，根据培养目 的细胞所在体内的组织结构特点，配置不同孔 径的三维基质， 为接种后细胞提供了附着支架，排除了二维培 养中的接触性抑制效应， 使细 胞在类似体内微环境状态下生长。

实施例 1: 用于细胞三维培养的基质构架材料及其构建方 法

1 )制备 1%〜5%丝素蛋白液

( 1 ) 将蚕茧壳剪成 lcm ² 的碎片， 加入浓度为 0. 5%的碳酸钠溶液浸没蚕茧壳煮沸 2-3 遍， 每次至少 1个小时。

(2) 先用自然水洗 2- 3次， 再用去离子水洗两次再烘干。

(3) 用 50%的氯化钙溶液加热至沸腾 (或溶解于 9M的溴化锂溶液中）， 将干燥的丝素 加入搅拌， 使丝素充分溶解， 冷却至室温用布氏漏斗过滤。

(4) 将滤液装入透析袋中用去离子水透析 3-5天， 制得丝素蛋白溶液。

(5) 用保鲜袋封装， 放入 -20度冰箱 （12个小时）， 再放入 -80度冰箱 （6个小时）， 最后放入冷冻干燥器中至少 24个小时。

(6) 称取丝素粉 10g，溶解于 9M溴化锂水溶液中， 室温下搅拌 2 小时进行溶解。 (7) 将以上溶解后的丝素溶液冷却至常温后，倒入 截流分子量为 3500Da的透析袋中， 用去离子水 4° C冰箱里透析三天,每隔 3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小 分子物质。

(8) 将制得的丝素蛋白液体存放透析袋，放入聚乙 二醇 6000粉剂中，干燥浓缩，收集 液体,将其以 3500r/min离心 15min， 取上清液， 置于 4° C冰箱中可保存一周。

(9) 取 3个称量瓶编号洗净后放入 60° C恒温烘箱中烘干，充分冷却,称量三者重量， 记为 Ml。各取 10 ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为 M2。放入 60° C供箱中 12h 取出，冷却后称重记为 M3，按公式丝素蛋白溶液浓度 %= (M3-M1) / (M2— Μ1) χ100%

( 10) 本实施例得出的丝素蛋白浓度为约为 2%〜3%。

)制备 1%〜5%壳聚糖溶液

( 1 ) 将 lmL冰醋酸用去离子水加至 100ml 得到 1%冰醋酸， 将 pH调至 4. 6。

(2) 称取 3. lg壳聚糖 （脱乙酰度〉 90%)加入上述冰醋酸。

( 3) 本实施例得到的是 1%的壳聚糖溶液。

)制备交联支架

( 1 ) 将步骤 1所制备的丝素蛋白溶液和步骤 2所制备的壳聚糖溶液混合。

(2) 浸入含 50mmol/l的 EDC、 18腿 ol/lNHS的 95%乙醇水溶液中， 4° C下交联 24h。

(3) 放入 -20°C冰箱中预冷冻 24 h， 再放入 -80°C低温冰箱中冷冻 24 h， 最后放入冷 冻干燥机冷冻干燥 48 h， 得到初制 S F/C S支架材料。

(4) 将所制支架浸入无水甲醇及 10%氢氧化钠（体积比 1 ： 1)溶液浸泡 24 h， 用去 离子水冲洗 3遍后，置于冷冻干燥机内干燥 48 h后取出镜检。

(5) 镜下观察图像结构： 光学显微镜 （日本 Olympus CX21 )观察通过调整丝素蛋白 /壳聚糖溶液与交联剂的浓度和比例， 得到不同孔径的三维基质支架 （见图 1A-B); 扫描电子显微镜 （荷兰， Philips XL20) 电镜观察基质结构 （见图 1C) 实施例 2: 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养后的增殖与分 化情况

1) 原代成肌细胞的分离培养和鉴定

( 1 ) 用妊娠 15周自愿终止妊娠的健康妇女捐赠的引产胚胎� �� 无遗传病史。

(2) 无菌条件下， 取出骨骼肌组织， 除去筋膜和血管， 用胰蛋白酶、 胶原酶混合多步 消化法分离出成肌细胞， 差速贴壁纯化成肌细胞。

(3) 在含 10%小牛血清的 DMEM (生长培养基， GM) 培养 1天后， 置于含 3%小牛血 清的 DMEM (分化培养基， DM)中培养 6天后用相差倒置显微镜观察成肌细胞的肌 管形成； 用免疫组化鉴定肌球蛋白 （Myosin)表达。

) 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养的分化情况

( 1 ) 分别设立实验组和对照组 24孔培养板，前者含有实施例 1中制备的丝素蛋白三维 基质 （称为 3D培养， 下同）， 后者是普通的培养板 （称为 2D培养， 下同）。

(2) 分别将上述成肌细胞按照 5 X lOVml接种到两组 24孔培养板，用 GM培养 1天后， 改换成 DM培养， 于 1、 2、 4、 6、 8天时行 Giemsa染色， 观察成肌细胞融合成肌 管的现象。

(3) 肌管融合率为单位视野下肌管内细胞核数量与 所有细胞核数量的比值， 肌管形成 率反映出成肌细胞的分化状态。 肌管形成率高表明大量细胞退出细胞周期， 进入 分化状态。 实验重复三次， 统计学分析。

(4) 实验结果显示， 从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率开始 逐渐上升， 2D培养的成肌细胞的肌管形成率直到培养的第 12天均保持的持续增 高趋势， 而 3D培养的成肌细胞的肌管形成率从培养的第 6天开始直到第 12天均 保持一个平台期。 3D和 2D培养的成肌细胞肌管形成率在第 12天分别为 17%和 33%

(见图 2)。

(5) 实验结果表明， 三维基质状态下为成肌细胞提供了类似体内环 境的支架， 有利于 成肌细胞的增殖， 因而减缓成肌细胞的诱导分化进程。

) 成肌细胞进行丝素蛋白三维培养的细胞周期情 况

( 1 ) 同上 2) ( 1 )， 分别设立实验组和对照组 24孔培养板， 前者含有实施例 1中制备 的丝素蛋白三维基质， 后者是普通的培养板。

(2) 同上 2) (2)， 分别将上述成肌细胞按照 5 X 107ml接种到两组 24孔培养板，用含

10%小牛血清的 DMEM培养 1天后， 改换成含有含 3%小牛血清的 DMEM中培养。

( 3) 分别培养 6天时收集细胞， 用 PBS洗 5minX 2， 离心， 1， OOOrpm, 弃上清， 将细 胞重悬于 4Ό预冷的 PBS中， 缓慢加入冷乙醇， 使其终浓度为 70%， 4°C过夜。

(4) 离心后将等体积的细胞悬液和碘化丙啶（Propid ium, PI )染液混合， 4°C， 30min _; 流式细胞仪 （美国 C0ULTESR, Elite, ESP)进行检测， 实验重复三次， 统计学 分析。

(5) 实验结果显示， 成肌细胞在 2D培养基中 1天、 3天和 6天时合成期（S期）细胞 分别为 33%、 28%和 23%， 而 3D培养基中 1天、 3天和 6天时 S期细胞分别为 32 %、 39%和 41% (见图 3)。 (6) 实验结果表明， 经 2D培养的成肌细胞中，大部分细胞退出细胞周� ��， 向终末细胞 分化，而在 3D培养的细胞中， 处于合成期的细胞比例较高，大部分细胞处于 增殖 阶段， 提示 3D培养基可用于难培养细胞的体外扩增。

实施例 3: 肿瘤组织提取的肿瘤间质细胞在丝素蛋白三维 基质中的培养与扩增

1)肿瘤相关巨噬细胞 （TMAs) 的分离培养和鉴定

(1) 将新鲜结肠癌组织切成 2mm大小碎片，用含 0.3%胶原酶的 PBS在 37°C下消化成细 胞悬液， 用 70 ra不锈钢网过滤细胞悬液， 离心后用 PBS洗涤。

(2) 用不含血清的 RPMI-1640培养基重悬后加入培养瓶中培养 40分钟， 用 CD68荧光 标记鉴定贴壁的 TAMs。

2)肿瘤相关纤维母细胞 （TAFs) 的分离培养和鉴定

(1) 将新鲜结肠癌组织切成碎片， 接种含 15%FCS的 DMEM培养基， 5天后可见细胞从 团块中长出来， 胰酶消化传代。

(2) 根据 aSMA、 Vimentin、 Desmin表达和形态特点进行纯化。

)肿瘤间质细胞 TMAs和 TAFs在丝素蛋白三维基质培养中的扩增情况

(1) 同上实施例 2中的 2) (1)， 分别设立实验组和对照组 24孔培养板， 前者含有实 施例 1中制备的丝素蛋白三维基质， 后者是普通的培养板。

( 1 ) 分别将上述肿瘤组织分离并鉴定出的 TAMs和 TAFs按照 5 X lOVml接种到两组 24 孔培养板， 用含 10%小牛血清的 DMEM培养 1天后， 改换成含有含 5%小牛血清 的 DMEM中培养。

(2) 分别于上述培养的第 1、 2、 4、 8、 16天时弃去培养液， 加 500 μ 1/孔 MTT培养液

(100μ1ΜΤΤ+400μ 1培养基）， 置摇床震荡充分溶解结晶物。

(3) 用酶联免疫检测仪在 0D570nm处测各孔吸光值， 重复三次， 取平均值。

(6) 实验结果显示， TAMs从培养的第 4天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显 上升， 2D培养的 TAMs的 0D值直到培养的第 10天均保持的持续增高趋势， 之后 逐渐下降； 而 3D培养的 TAMs的 0D值从培养的第 6天开始直到第 15天均保持一 个较高的平台期。 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值在第 15天分别为 0.63和 0.43(见 图 4)。 TAFs从培养的第 2天开始， 3D和 2D培养的 TAMs的 0D值均明显上升， 2D 培养的 TAMs的 0D值至第 10天开始下降； 而 3D培养的 TAMs的 0D值持续升高到 第 15天才开始下降 （见图 5)。

(7) 实验结果表明， 三维基质为 TAMs和 TAFs提供了类似体内环境的支架， 有利于细 胞的增殖培养。

实施例 4 : 对比试验： 分别用本发明方法所制丝素蛋白类物质与按现 有技术 (CN103418029A)制得丝素蛋白为原料制得的基质支� ��材料降解性的影响对比

1 ) 按 CN103418029A的实施例五制得浓度 20%丝素蛋白溶液

2) 按本发明实施例 1之步骤 1 ) 制得 3%丝素蛋白溶液；

3) 制备 1%〜5%壳聚糖溶液， 同实施例 1之步骤 2);

4) 分别运用 1 )和 2)所制备的丝素蛋白液制备交联支架 A和 B， 同实施例 1之步骤 3)。

A支架是按现有技术制得的丝素蛋白为原料制� �的基质支架材料， B支架是按本发明 方法制得的丝素蛋白类物质为原料制得的基质 支架材料。

5) 降解性能检测

( 1 ) 将人工体液 （SBF溶液） 作为体外降解环境， 降解温度为恒温 37°C。

(2) 取配置好的无菌 SBF溶液 40ml放置体积为 50ml的塑料瓶内。

( 3) 将支架 A和 B分别称重 （记为 W。）， 置于 SBF中， 置 37 °C恒温保湿。

(4) 分别于 ld， 7d， 14d， 21d， 28d， 35d， 42d, 49d 时的重量变化。 计算重量时， 先用去离子水冲洗干净， 60Ό烘箱烘干， 称重记为 ， 公式为： 降解率 = (W„- W,) / W„ X 100%, 每个数据测 3各样本， 取均数士标准差。

6) 结果分析： 如本实验结果如图 6所示， 用现有技术所制备的丝素蛋白液所制备 的多维支架 7W后的降解率高达 21. 2%, 而使用本法制备的丝素粉为原料制备的多维支 架随着时间的延长， 其降解率并不明显增加， 7W后仅为 9. 4%。 现有技术所制备的丝素 蛋白为原料制得的基质支架材料稳定性不好， 而本发明方法制备的基质支架材料的稳定 性显著提高。

实施例 5: 对比试验， 分别用本发明方法所制的丝素蛋白类物质与运 用现有技术制备的 丝素蛋白为原料制备的基质支架材料对细胞增 殖能力的影响对比

1 ) 用现有技术所制备的丝素蛋白溶液

同实施例 4之步骤 1 );

2) 本发明所制备的 1%〜5%丝素蛋白液， 同实施例 1之步骤 1 )。

3) 制备 1%〜5%壳聚糖溶液， 同实施例 1之步骤 2)。

4) 分别运用放置 2W后的 1 ) 所制备的丝素蛋白液和 2 )所制备的丝素蛋白液制备交联 支架 A和 B， 同实施例 1之步骤 3)。 A支架是按现有技术制得的丝素蛋白为原料制� � 的基质支架材料， B支架是按本发明方法制得的丝素蛋白类物质� �原料制得的基质支 架材料。

5) MTT法检测上述三维支架 A和 B对原代培养结肠癌组织细胞增殖能力的影响

( 1 ) 取术后或活检标本，除去坏死和溃疡组织，用 含双抗 PBS浸泡 10-20mi _n 后放置无 血清保存液 （DMEM/RPMI 1640+10%双抗） 中冰上保存。

(2) 将组织放入处理用 PBS (含 10%双抗和 1%FBS) 中剪碎组织 （冰上进行）

( 3) 组织与液体置于离心管， 1000r/min， 5min， 去除上清， 取沉淀， 用胰蛋白酶 +胶 原酶消化， 37°C培养箱培养 1小时左右， 每 10-15分钟摇晃一次。

(4) 离心， 去除消化液， 用 PBS低速离心洗 2-3次， 去除上清， 最后用培养基离心洗 1次， 用完全培养基悬浮， 并用吸管吹打分散制成细胞悬液， 接种在含 10%的 FBS 的 DMED (或 RPMI1640) 中， 37°C， 5%C02下分瓶 （皿） 培养。

(5) 分别于上述培养的第 1、 2、 4、 8、 16天时弃去培养液， 加 500 μ 1/孔 MTT培养液

( 100 μ 1ΜΤΤ+400 μ 1培养基）， 置摇床震荡充分溶解结晶物。

(6) 用酶联免疫检测仪在 OD570nm处测各孔吸光值， 重复三次， 取平均值。

6) 结果分析： 结果如图 7所示。 由于现有技术所制备的丝素蛋白溶液不能很好 地保持 丝素蛋白原有的理化性质， 导致所制备的基质支架材料的降解率随丝素蛋 白溶液放 置时间的延长而增高， 进而影响细胞增殖能力。 而本法制备的丝素蛋白类物质为原 料所制备的基质支架材料稳定性较好， 因此有利于原代组织细胞在新环境中的适应 和增殖，原代培养细胞在 2周仍能保持较高的增殖能力，两组间有明显� �异 031 ) 上述实施例只是为了说明本发明的技术构思， 目的是使一般技术人员了解本发明的 内容并据以实施， 但不能以此限制本发明的保护范围。 凡根据本发明的实质内容所做出 的等效变化及其不同领域的应用， 都涵盖在本发明的保护范围。