зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом опухолей, и противоопухолевая вакцина на их основе

область техники, к которой относится изобретение

настоящее изобретение относится к областям медицины и ветеринарии, в частности — онкологии, и может быть использовано с целью профилактики онкологических заболеваний, в частности у «гpyпп pиcкa» и при «ceмeйныx формах)) рака, а также предупреждения рецидива злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, после проведенного противоопухолевого лечения.

уровень техники

в последние годы исследователи различных специальностей уделяют большое внимание изучению противоопухолевого действия вакцин на основе дендритных клеток (дк). природа этого феномена связана со способностью дк презентировать опухолевые антигены цитотоксическим т-лимфоцитам. к настоящему времени изучены отдельные виды биологической активности дк. вместе с тем многие способы получения и противоопухолевые свойства вакцин на основе дк остаются не до конца исследованными.

зрелые дк для противоопухолевых вакцин чаще всего получают из CD 14+ моноцитов по 2-cтaдийнoй методике. на первой стадии моноциты развиваются в незрелые дк в присутствии гранулоцит/макрофаг колониестимулирующего фактора (гм-ксф) и интepлeйкинa-4 (ил-4). незрелые дк обладают высокой способностью захватывать антигены путем макропиноцитоза и фагоцитоза (кеllеr, R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). в морфологическом и фенотипическом плане незрелые дк представляют собой крупные, неправильной формы слабо или не прилипающие к пластику клетки, значительно экспрессирующие костимулятор CD86 (B7-2), слабо экспрессирующие маркер моноцитов/макрофагов CD 14 и маркер зрелых дк CD83 (наsеbе, H., Nаgауаmа, H., Sаtо, к., бпоmоtо, M., таkеdа, Y., таkаhаshi T. а., наsшпi к., еriguсhi M. Dуsfuпсtiопаl rеgulаtiоп оf thе dеvеlорmепt оf mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls iп сапсеr раtiепts. - вiоmеd.&рhаrmасоthеr. 2000.- vоl. 54.- р. 291-298; моrsе M. а., Vrеdеriburgh J. J., Lуеrlу H. к. а соmраrаtivе studу оf thе gепеrаtiоп оf dепdritiс сеlls frоm mоbilizеd реriрhеrаl blооd рrоgепitоr сеlls оf раtiепts uпdеrgоiпg high dоsе сhеmоthеrару. - J. неmаtоthеr. Stеm CeIl Rеs. 1999.- vоl. 8.- р. 577-584). в

подавляющем большинстве экспериментов другой костимулятор CD80 (B7-1) экспрессируется много слабее, чем CD86, причем, уровень его экспрессии по данным разных авторов варьирует в значительных пределах 2-87%.

на второй стадии инициируется созревание дк. по мере созревания дк в значительной степени теряют способность эндоцитировать и процессировать антигены. однако зрелые дк сохраняют способность презентировать иммуногенные пептиды, не требующие предварительного процессинга внутри клетки (Sаllustо F., Niсоlо с, De маriа R., Corinti S., теsti R. сеrашidе iпhibits апtigеп uрtаkе апd рrеsепtаtiоп bу dепdritiс сеlls. - X ехр. меd. 1996.- vоl. 184.- N б.- р. 2411-2416). зрелые дк стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) с пептидами (сеllа M., Engering A., Pinet V., рiеtrаs т., Lапzаvессhiа а. Iпflашmаtоrу stimuli induce accumulation of MHC сlаss II соmрlехеs on dепdritiс сеlls. -Nаturе. 1997.- vоl. 388.- р. 782-787). от незрелых дк они отличаются также экспрессией характерных маркеров зрелых дк - CD83 и DC-LAMP - члена семейства мембранных гликопротеинов, ассоциированных с лизосомами, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. на поверхности зрелых дк увеличивается количество адгезивных молекул CD54 и CD58, способствующих взаимодействию с т-лимфопитами (кеllег R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113- 122). созревание в различных условиях может значительно повлиять на существенные функциональные характеристики дк, такие как секреция ил- 12 (еbпеr S., Rаtziпgеr G., кrоsbасhеr в., Sсhmuth M., Wеiss а., Rеidеr D., кrосzеk R. а., неrоld M., неuflеr с, Fritsсh р., Romani N. рrоduсtiоп оf IL-12 bу humап mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls is орtimаl whеп thе stimulus is givеп аt thе опsеt оf mаturаtiоп апd is furthеr епhапсеd bу IL-4. - J. Immuпоl. 2001. - vоl. 166 - р. 633-641) и способность мигрировать (Luft т., Jеffоrd M., Luеtjепs р., тоу т., Hochrein H., Masterman K. -а, маliszеwski с, Shоrtmап к., Cebon J., маrаskоvskу E. Fuпсtiопаllу distiпсt dепdritiс сеll (DC) рорulаtiопs iпduсеd bу рhуsiоlоgiс stimuli: рrоstаglапdiп E2 rеgulаtеs thе migrаtоrу сарасitу оf sресifiс DC subsеts. - вlооd. 2002 - vоl. 100. - р. 1362-1372). как CD40L, так и убитые бактерии в значительной степени стимулируют образование ил-12, причем максимальное количество питокина продуцируется в начальные моменты созревания. в то же время среда, кондиционированная моноцитами, ведет к созреванию дк, не синтезирующих функциональный ил-12 (еbпеr S., Rаtziпgеr G., кrоsbасhеr в.,

Schmuth M., Wеiss а., Rеidеr D., кrосzек R. а., неrоld M., неuflеr с, Fritsсh р.,

Romani N. рrоduсtiоп оf IL- 12 bу humап mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls is орtimаl whеп thе stimulus is givеп аt thе опsеt оf mаturаtiоп апd is furthеr епhапсеd bу IL-4. - J. Immuпоl. 2001. - vоl. 166 - р. 633-641).

в настоящее время считается, что для изготовления оптимальной противоопухолевой вакцины следует инкубировать незрелые дк с опухолевыми антигенами (опухолевый лизат, специфичные для опухоли пептиды или белки, опухолевая рек и т.д.) в присутствие стимулов, ведущих к созреванию дк (Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе imгаuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Imшuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). исследование на мышах показало, что лишь иммунизация полностью зрелыми дк, нагруженными опухолевым антигеном, эффективно защищает при заражении низкоиммуногенной опухолью (выжило 8 из 8 мышей) (сhеп Z., Dеhm S., вопhаm к., Kamencic H., Juurliпk в., Zhang X., Gordon J. R., Xiang J. S. DNA аrrау апd biоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf thе imрасt оf thе mаturаtiоп stаtus оf mоusе dепdritiс сеlls оп thеir рhепоtуре апd апtitumоr vассiпаtiоп еffiсасу. - CeIl Immшiоl. 2001.- vоl. 214.- р. 60-71). в то же время в тех же условиях незрелые дк не давали ни малейшей защиты (не выжило ни одной мыши из 8). некоторыми авторами было показано, что введение мышам незрелых дк, нагруженных антигеном, не только не вызывает эффективного иммунного ответа, а наоборот способствует подавлению или препятствует развитию иммунного ответа (вlапkепstеiп T. & Sсhulеr T. сrоss-рrimiпg vеrsus сrоss-tоlеrапсе: аrе twо sigпаls епоugh? - тrепds iп Immuпоlоgу. 2002.- vоl. 23.- р. 171-173, Enk A. H. & Jоmιlеit H. ноw dо dепdritiс сеlls рrеvепt аutоimmuпitу: whаt is а mаturе dепdritiс сеll iп thе mоusе? - тrепds iп Immuпоlоgу. 2001.- vоl. 22.- р. 547, Enk A. H. & Jопulеit H. ноw dо dепdritiс сеlls рrеvепt аutоimmuпitу: whаt is а mаturе dепdritiс сеll iп thе mоusе? - тrепds iп Immuпоlоgу. 2001.- vоl. 22.- р. 547).

использование дк для лечения онкологических заболеваний стало особо привлекательным после обнаружения ряда опухоль ассоциированных антигенов (OAA) (Jеffоrd M., маrаskоvskу E., Cebon J., Dаvis I. D. Thе usе оf dепdritiс сеlls iп сапсеr thеrару. - Lапсеt опсоl. 2001.- vоl. 2.- р. 343-353, раrmiапi G., саstеlli с, Dаlеrbа р., моrtаriпi R., Rivоltiпi L., маriпсоlа F. M., апiсhiпi а. сапсеr immuпоthеrару with рерtidе-bаsеd vассiпеs: whаt hаvе wе асhiеvеd? Whеrе аrе wе gоiпg? - J. Nаtl. сапсеr Iпst. 2002.- vоl. 94.- р. 805-818). к OAA следует отнести, во-первых, антигены онкогенных

вирусов (карцинома печени - вирусы гепатита в и с, рак шейки матки - вирус папилломы, лимфома беркитта - вирус эпштейна-барр и т. д.), во-вторых, измененные белки, возникшие в результате соматических мутаций, в-третьих, не экспрессируемые в соматических тканях взрослого организма антигены (α- фетопротеин, теломераза), в-четвертых, нормальные антигены, гиперэкспессируемые опухолью (антигены меланомы и рака простаты). в настоящее время считается, что многие опухоли экспрессируют антигены, в той или иной степени распознаваемые иммунной системой (Fоss F. M. Immшюlоgiс mесhапisms оf апtitumоr асtivitу. - Sеmiп. опсоl. 2002.- vоl. 29.- р. 5-11). однако в большинстве случаев не развивается адекватный иммунный ответ, так как у опухолей и онкогенных вирусов существует целый спектр уловок, позволяющих ускользнуть от эффекторов иммунной системы. большинство опухолевых антигенов, за исключением вирусных, сами по себе слабо иммуногенны.

кроме типа используемых дк, очевидно, важную роль также играют источник опухолевого антигена и способ введения дк. в клинической практике до сих пор использовались главным образом белки и пептиды, а также, в несколько меньшей степени, опухолевые лизаты (Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20,- р. 167-173; кеllеr, R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immшюl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). недостаток вакцин на основе конкретных пептидов или белков заключается, во-первых, в том, что не все OAA уже идентифицированы. кроме того, популяция клеток опухоли гетерогенна и часть клеток может не экспрессировать отдельный антиген (Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе immшiizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Iшmuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). опухолевый лизат, очевидно, содержит широкий спектр различных антигенов, в том числе и неизвестные OAA. недавно появилось предварительное сообщение о применении дк, трансфецированных тотальной опухолевой рнк, для лечения распространенных форм рака толстой кишки и легких (Nаir S. к., моrsе M., восzkоwski D., Curnming R. L, Vаsоviс L., Gilbоа E., Lуеrlу H. к. Iпduсtiоп оf tumоr-sресifiс суtоtохiс T lуmрhосуtеs iп сапсеr раtiепts ъу аutоlоgоus tumоr RNа-trапsfесtеd dепdritiс сеlls. - апп. Surg. 2002.- vоl. 235.- р. 540-549). дк индуцировали развитие цтл, способных специфически лизировать опухоль.

способ введения дк может влиять на их миграцию в лимфоидную ткань и их иммуногенность. сравнительное исследование на мышах позволяет предположить, что дк, введенные внутривенно, менее иммуногенны, чем те, что были введены подкожно (Lаррiп M. в., Wеiss J. M., Dеlаttrе V., маi в., Dittmаr H., маiеr с, мапkе к., Gгаbbе S., Martin S., Simon J. с. апаlуsis оf mоusе dепdritiс сеll migrаtiоп iп vivо uроп subсutапеоus апd iпtrаvепоus iпjесtiоп. - Immшюlоgу. 1999.- vоl. 98.- р. 181-188).

к данному моменту времени был проведен ряд клинических испытаний противоопухолевых вакцин на основе дк. нsu еt аl. (нsu F. J., Benike C, Fagnoni F., Lilеs T. M., сzеrwiпski D., таidi в., Englemann E. G., Lеуу R. Vассiпаtiоп оf раtiепts with в-сеll lуmрhоmа usiпg аutоlоgоus апtigеп-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаturе. 1996.- vоl. 392.- р. 245-252) вводили 4 пациентам с фолликулярной лимфомой дк крови, нагруженные специфичным для опухоли идиотипическим белком. регрессия лимфомы наблюдалась у 3 пациентов. Nеstlе еt аl. использовали для лечения пациентов с распространенной формой меланомы дк (Nеstlе F. о., аlijаgiс S., Gilliеt M., Sшi Y., Gгаbbе S., Dшшαеr R., вurg G., Schadendorf D. Vассiпаtiоп оf mеlапоmа раtiепts with рерtidе- от tumог lуsаtе-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаtur. меd. 1996. - vоl. 2. - р. 328-332). в качестве опухолевого антигена были использованы либо определенные меланомные пептиды, либо опухолевый лизат. дк были введены 16 пациентам в здоровые лимфатические узлы. у 11 пациентов наблюдалась реакция гиперчувствительности замедленного типа (гзт) в ответ на дк, нагруженные пептидами, а у 5 пациентов наблюдалась объективная регрессия опухоли. в другом исследовании участвовало 11 пациентов с распространенной формой меланомы на гV стадии (тhurпеr в., Haendle L, Rоdеr с, Dieckmann D., кеikаvоussi р., Jопulеit H., Bender A., маszеk с, Schreiner D., vоп dеп Driеsh р., вrосkеr E.B., Stеiпmап R.M., епk A., Kampgen E., Sсhulеr G., Vассiпаtiоп with mаgе-заl рерtidе-рulsеd mаturе, mопосуtе dеrivеd dепdritiс сеll ехрапds sресifiс суtоtохiс T сеlls апd iпduсеs rеgrеssiоп оf sоmе mеtаstаsеs iп аdvапсеd stаgе гV mеlапоmа. - J. ехр. меd. 1999. -vоl. 190. -р. 1669- 1678). использовались зрелые дк, полученные из моноцитов, нагруженные меланомным пептидом MAGE-зA1. дк вводили 5 дозами: 3 - подкожно и 2 - внутривенно. наблюдались развитие иммунных реакций на антиген и экспансия цитотоксических лимфоцитов (цт JI), специфичных к MAGE-зA1. у 6 из 11 пациентов происходила регрессия отдельных метастазов. имеются также сходные данные о перспективности применения дк для лечения распространенных форм рака

простаты, почек, щитовидной железы, молочной железы, толстой кишки, шейки матки, миеломы (Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Irшпuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173; Jеffоrd M., маrаskоvskу в., Cebon J., Dаvis I. D. тhе usе оf dепdritiс сеlls iп сапсеr thеrару. - Lапсеt опсоl. 2001.- vоl. 2.- р. 343-353; кеllеr R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122;).

в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения может рассматриваться вакцина на основе дк, полученная в результате пульсации зрелых дк лизатом опухоли (Nоuri-Shirаzi M., Banchereau J., Fау J., раluсkа к., Dепdritiс сеll bаsеd tumоr vассiпеs. - Irшпuпоl. Lеttеrs. 2000,- vоl. 74.- р. 5-10). недостатком этого метода является необходимость получения опухолевого материала от конкретного больного для получения лизата, что не всегда является возможным. в частности, опухолевый материал может быть недоступен из-за особенностей локализации опухоли или при полной регрессией опухоли после успешно проведенного противоопухолевого лечения, например химио- или лучевой терапии. кроме того, существующие методы не позволяют использовать дк-вакцины, нагруженные опухолевым лизатом, для профилактики злокачественных новообразований, т.к. требуют наличия опухолевого материла пациента. синтетические и генноинженерные опухоль-ассоциированные антигены могут быть специфичны лишь для ограниченного количества новообразований (меланома, рак печени и некоторые другие), что не может решить проблемы профилактики даже основных видов злокачественных новообразований. кроме того, как отмечалось выше, гетерогенный пул злокачественно трансформированных клеток даже в пределах одного опухолевого узла может экспрессировать различные антигены. наконец, известно, что у онкологических больных нарушена функция иммунной системы, а опухоль способна выделять ряд иммуносупрессивных факторов, что в значительной степени снижает эффективность иммунотерапии и иммунопрофилактики рака.

в то же время существует обширный контингент людей, относящихся к «гpyппe pиcкa» или предрасположенных к так называемым: «ceмeйным фopмaм» рака. способы профилактики онкологических заболеваний у этой категории практически отсутствуют. предлагаемые варианты профилактической химио- или гормонотерапии, а также хирургического лечения (в частности двусторонняя

мастэктомия с удалением матки и придатков) у здоровых людей даже с высоким риском заболевания вряд ли можно считать адекватными.

другим важным аспектом является предотвращение рецидивов после проведения противоопухолевой терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию или радикальное хирургическое удаление первичного очага опухоли, когда опухолевая масса значительно уменьшается. к настоящему времени в экспериментах на мышах показана эффективность данного способа вакцинации для предотвращения рецидива карциномы печени после удаления первичного очага (ноmmа S., тоdа G., Gong X, кufе D., Ohno T. рrеvепtivе апtitumоr асtivitу аgаiпst hераtосеllulаr саrсiпоmа (HCC) iпduсеd bу immuпizаtiоп with шsiопs оf dendritic cells and HCC сеlls iп miсе. - J. Gаstrоепtеrоl. 2001.- vоl. 36.- р. 764-771).

таким образом, существует острая потребность в разработке новых эффективных средств и подходов, предназначенных для лечения и профилактики развития злокачественных новообразований у индивидов, нуждающихся в этом, например людей, в частности относящихся к группе лиц, предрасположенных к «ceмeйным фopмaм» рака, а также у других млекопитающих, например домашних животных, и для предотвращения рецидивов после проведенного противоопухолевого лечения.

раскрытие изобретения

в результате проведения обширных научных изысканий с использованием известных в данной области и хорошо охарактеризованных модельных систем и различных штаммов опухолей авторы неожиданно обнаружили, что зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом, полученным из опухолей по меньшей мере двух различных типов, и вакцины на их основе обеспечивают средства и подходы, позволяющие преодолеть указанные выше недостатки.

в своем первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает зрелые дендритные клетки, характеризующиеся тем, что они получены из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагружены полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. в альтернативном воплощении

млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.

в одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

в своем следующем аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения зрелых дендритных клеток из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, предусматривающий следующие стадии: а) выделение мононуклеарных лимфоцитов из индивида; б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов с ростовыми факторами для получения из них незрелых дендритных клеток; в) получение полилизата опухолей; г) обработку полученных незрелых дендритных клеток полилизатом опухолей; д) индукцию созревания незрелых дендритных клеток, обработанных полилизатом опухолей, в зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом опухолей.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. в альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.

в одном из воплощений мононуклеарные лейкоциты выделяют из периферической крови индивида.

в следующем воплощении в качестве ростовых факторов используют гранулоцит/макрофаг-колониестим улирующий фактор (гм-ксф) и интepлeйкин-4 (ил-4).

в еще одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

в следующем воплощении полилизаты получают путем трехкратного повторения замораживания и размораживания измельченной опухоли в дистиллированной воде и последующего фильтрования через стерилизующий фильтр.

в одном из воплощений индукцию созревания осуществляют при помощи

фно-α.

в своем следующем аспекте данное изобретение обеспечивает противоопухолевую вакцину, характеризующуюся тем, что она содержит в эффективном количестве зрелые дендритные клетки, полученные из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженные полилизатом опухолей различного происхождения, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, и физиологически приемлемые носители, наполнители или другие добавки.

в одном из воплощений противоопухолевая вакцина дополнительно содержит по меньшей мере один иммуномодулятор. в частном воплощении таким иммуномодулятором является полиоксидоний.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. в альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.

в одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

в одном из воплощений изобретения противоопухолевая вакцина применяется для профилактики злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.

в альтернативном воплощении противоопухолевая вакцина применяется для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.

в следующем альтернативном воплощении противоопухолевая вакцина применяется для профилактики злокачественного новообразования у индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака,

причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.

следующим аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата. должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу профилактики злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. в альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.

в одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

еще одним аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у указанного

индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относятся к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата. должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу предупреждения рецидива злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относятся к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. в альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.

в одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

наконец, еще одним аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата. должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу профилактики злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных

лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.

в одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком.

в одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.

преимуществом зрелых дк настоящего изобретения и противоопухолевой вакцины (поливакцины) на их основе по сравнению с существующими вариантами моновакцин является возможность их использования в профилактических режимах у млекопитающих с высоким риском заболевания злокачественными новообразованиями. другое преимущество настоящего изобретения состоит в возможности индивидуального подбора состава полилизата опухолевых клеток для конкретных пациентов в зависимости от вероятности возникновения того или иного вида онкологического заболевания. еще одним преимуществом дк, нагруженных полилизатом, а таюке вакцины на их основе является одновременное протективное действие против нескольких видов опухолей, что позволяет применять данный метод для профилактики онкологических заболеваний.

краткий перечень фигур

далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на фигуры, которые предназначены исключительно для иллюстрации и целей лучшего понимания сущности заявленного изобретения.

фиг. 1. гистограммы, отражающие уровни экспрессии поверхностных маркеров дк мыши. ось абсцисс - интенсивность сигнала для данного параметра. ось ординат отражает количество событий. фиг. IA —уровень экспрессии MHC I. фиг. IB - уровень экспрессии MHC II. фиг. 1с - уровень экспрессии CD80. фиг. ID - уровень экспрессии CD86. фиг. IE - уровень экспрессии CD34.

фиг. 2. гистограммы, отражающие уровни экспрессии поверхностных маркеров дк человека. ось абсцисс - интенсивность сигнала для данного параметра.

ось ординат отражает количество событий. фиг. 2A - распределение дк в Dоt рlоt.

фиг. 2в - уровень экспрессии CDIa. фиг. 2C - уровень экспрессии CD83. фиг. 2D - уровень экспрессии CD40. фиг. 2E - уровень экспрессии CD80. фиг. 2F - уровень экспрессии CD86. фиг. 2G - уровень экспрессии MHC I. фиг. 2H - уровень экспрессии MHC II.

фиг. 3. дендритные клетки, окраска гематоксилин-эозином, увеличение 900.

фиг. 4. электронная микрофотография дендритных клеток, увеличение 9000.

осуществление изобретения

определения

в контексте настоящей заявки под «зpeлыми дендритными клeткaми» понимаются дк, которые способны к активной презентации иммуногенных пептидов и не обладают выраженной фагоцитарной активностью (Sаllustо F., Niсоlо с, De маriа R., соriпti S., теsti R. сеrашidе iпhibits апtigеп uрtаkе апd рrеsепtаtiоп bу dепdгitiс сеlls. - J. ехр. меd. 1996.- vоl. 184.- N 6.- р. 2411-2416). зрелые дк стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) с пептидами (сеllа M., Engering A., Pinet V., рiеtrаs т., Lапzаvессhiа а. Iпflаmmаtоrу stiгаuli iпduсе ассumulаtiоп оf MHC сlаss II соmрlехеs on dепdгitiс сеlls. - Nаturе. 1997.- vоl. 388.- р. 782-787). от незрелых дк они отличаются также экспрессией характерных маркеров зрелых дк - CD83, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. на поверхности зрелых дк увеличивается количество адгезивных молекул CD54 и CD58, способствующих взаимодействию с т-лимфоцитами (кеllеr R. Dепdгitiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122).

в контексте данной заявки под термином «нaгpyжaть» или «пyльcиpoвaть» понимается такое контактирование незрелых дендритных клеток с лизатом опухолей, при котором они после превращения в зрелые дендритные клетки в результате индуцированного созревания становятся способными эффективно презентировать на своей поверхности опухолевые антигены и индуцировать развитие т-клеточного ответа на них.

в контексте данной заявки под «эффeктивным количеством)) понимается такое количество дендритных клеток или вакцины настоящего изобретения, которое является достаточным для оказания желаемого эффекта в отношении состояния, в

связи с которым они вводятся индивиду. точное количество будет зависеть от конкретных обстоятельств и может быть оценено специалистом в данной области с использованием известных методик. обычно, количество должно быть способно оказывать профилактическое действие в отношении развития злокачественного новообразования или предупреждать развитие рецидива злокачественного новообразования после противоопухолевого лечения. специалисту будет понятно, что эффективное количество будет iпtеr аliа зависеть от типа рака, режима введения, вводятся ли дендритные клетки или вакцина сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, общего состояния здоровья индивида.

под «фapмaцeвтичecки приемлемым)) или «физиoлoгичecки приемлемым)) в контексте настоящего описания понимается такой носитель, растворитель, эксципиент, иммуномодулятор, адъювант или любая иная целевая добавка, которые не вызывают никаких нежелательных побочных эффектов у индивида, которому они вводятся, а также не сказываются отрицательно на жизнеспособности дендритных клеток настоящего изобретения и не препятствуют осуществлению ими целевой биологической функции — презентации опухолевых антигенов иммунной системе при введении в организм индивида. такие фармацевтически и физиологически приемлемые средства хорошо известны в данной области (см., например, Rеmiпgtоп's рhаrmасеutiсаl Sсiепсеs, 18 ^й еditiоп, A.R. Gеппаrо, Ed., масk рublishiпg соmрапу - 1990; напdbооk оf рhаrmасеutiсаl ехсiрiепts, з ^гd еditiоп, а. кibbе, Ed., рhаrmасеutiсаl Press - 2000).

под термином «πoлилизaт» в контексте настоящей заявки понимается лизат, полученный по меньшей мере из двух образцов опухолей, принадлежащих к различным типам. в качестве иллюстрации полилизат может включать в себя, например, лизат, полученный из опухолевой ткани рака яичника, и лизат, полученный из опухолевой ткани молочной железы. в состав полилизата могут входить лизаты, полученные из 3, 4, 5 и более различных типов опухолей без ограничения.

стандартным способом получения дендритных клеток, пригодным для использования в рамках данного изобретения, является двухстадийный способ получения из CD 14+ моноцитов, выделяемых из периферической крови (Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). на первой стадии моноциты развиваются в

незрелые дк в присутствии гранулоцит/макрофаг колониестиму-лирующего фактора

(гм-ксф) и интepлeйкинa-4 (ил-4). на второй стадии инициируется созревание дк.

выделение MH лейкоцитов из периферической крови может быть осуществлено различными способами, например, центрифугированием в градиенте сахарозы, центрифугированием в одноступенчатом градиенте фиколла. для предотвращения свертывания кровь стабилизируют обычно применяемыми для этих целей консервантами, такими как, например, гепарин, цитрат натрия, эдта.

культивирование MH лейкоцитов проводят в стандартной культуральной среде, известной специалисту в данной области, например в RPMI или DMEM с 10% человеческой сыворотки пациента (или AB сыворотки донора) в одноразовых пластиковых флаконах, например, объемом 250 мл фирмы «Costaг», или аналогичных флаконах других фирм. для получения незрелых дк могут быть использованы различные цитокины, например, комбинация интерферонов 1-го типа (ифн-I) и гм- ксф (дк-ифн) или комбинация гранулоцит/макрофаг колониестимулирующего фактора (гм-ксф) и интepлeйкинa-4 (ил-4). предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является использование комбинации гм-ксф и ил-4.

способ получения дк из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови является наиболее предпочтительным, поскольку позволяет получать достаточное количество дк из 50-100 мл периферической крови, что значительно упрощает процедуру забора предшественников дк посредством пункции костного мозга или проведения аппаратной сепарации крови.

также дендритные клетки млекопитающих, в частности человека могут быть получены напрямую из крови при помощи градиентного центрифугирования (нsu F. X, вепikе с, Fagnoni F., Lilеs T. M., сzеrwiпski D., таidi в., Englemann E. G., Lеvу R. Vассiпаtiоп оf раtiепts with в-сеll lуmрhоmа usiпg аutоlоgоus апtigеп-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаturе. 1996.- vоl. 392.- р. 245-252).

дк могут быть также получены из CD34+ предшественников костного мозга или крови. дифференцировка дк из предшественников происходит при довольно длительной (около 2 недель) инкубации в присутствии гм-ксф и фно-α (саuх с.,. маssасriеr с, Dеzuttеr-Dаmbuуапt с, Vапbеrvilеt в., Jаquеt с, Sсhmitt D., вапсhеrеаu J. нumап dепdritiс Lапgеrhапs сеlls gепеrаtеd iп vitrо ёrоm CD34+ рrоgепitоrs сап рrimе паivе CD4+ T сеlls апd рrосеss sоlublе апtigеп. - J. Imшιmоl. 1995.- vоl. 155.- р. 5427- 5435). выход дк может быть увеличен путем добавления фактора стволовых клеток

(фск) или Flt-зL (саuх с, Vапbеrvilеt в., маssасriеr с, Dеzuttеr-Dаmъuуапt с, dе

Sаiпt-Vis в., Jаquеt с, Yoneda K., Imаmurа S., Sсhmitt D., Banchereau J. CD34+ hеmаtороiеtiс рrоgепitоrs frоm humап соrd blооd diffеrепtiаtе аlопg twо independent dепdritiс сеll раthwауs iп rеsропsе tо Gм-сSF+жFα. - J. ехр. меd. 1996.- vоl. 184.- р. 695-706).

дк могут быть получены из мононуклеарных лейкоцитов селезенки, посредством ее механического измельчения и последующего центрифугирования в градиенте плотности фиколла.

получение полилизата опухолей может быть осуществлено различными способами. наиболее предпочтительным является получение лизата путем трехкратного повторения цикла замораживания-оттаивания в дистиллированной воде в соотношении взвесь опухолевых клеток и вода около 1: 10 и последующего фильтрования через стерилизующий фильтр. замораживание предпочтительно проводят при температуре от около минус 50°C до около минус 96 ⁰ C. размораживание предпочтительно проводят при температуре около 20-25°C. в качестве фильтра могут быть использованы нитроцеллюлозные, поливинилендифторидные, из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,22 мкм. возможна гомогенизация в физиологическом растворе (0,9% NaCl), обработка ультразвуком. соотношение опухоль - физиологический раствор составляет около 1:5. в качестве образца опухоли может использоваться, в частности, операционный материал, пунктат, биоптат, злокачественные выпоты, культивируемые в условиях iп vitrо штаммы опухолевых клеток. материал до получения лизата предпочтительно хранят при температуре от около минус 5O ⁰ C до около минус 96 ⁰ C. полилизат получают путем смешивания лизатов, полученных из различных индивидуальных типов опухолей. предпочтительно, чтобы в состав полилизата входили по меньшей мере два типа различных гистологических вариантов опухолей, выбранных из группы включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого. подготовленный полилизат хранят при температуре от около минус 50°C до около минус 96 ⁰ C. полилизат может также храниться в лиофильно высушенном состоянии, что обеспечивает большее удобство в хранении и транспортировке на большие расстояния, а также более продолжительный срок хранения. лиофильно высушенный полилизат непосредственно перед применением восстанавливают путем добавления подходящего растворителя,

например стерильной воды, физиологического раствора, PBS или TBS. полилизат может также готовиться ех tеmроrе из лизатов, полученных из индивидуальных опухолей, путем их смешивания. для пульсирования дк используется полилизат из расчета 0.1 см ³ на lмлн. дк. инкубацию дк с полилизатом проводят в CO ₂ - инкубаторе при 37°C и 4,5% CO ₂ в течение около 24 ч.

созревание дк может быть индуцировано под воздействием целого ряда факторов: бактерий (живых или мертвых), бактериальных продуктов (лпс), вирусов, двунитевой рнк или ее аналога пoли-I:C, белка теплового шока gp9б, провоспалительных факторов и их комбинаций (иJI-lβ, фно-α, ил-б, пpocтaглaндинa-E2 (пгE-2)) и лиганда CD40 (CD40L) (Dhоdарkаr M. V., Steinman R. M., Sарр M., Dеsаi H., Fоssеllа с, кrаsоvskу I, Donahoe S. M., Dunbar P. R., сегапdоlо V., Niхоп D. F., вhаrdwаj N. Rарid gепеrаtiоп оf brоаd т-сеll immuпitу iп humапs аftеr а siпglе iпjесtiоп оf mаturе dепdritiс сеlls. - J. сliп. Iпvеst. 1999.- vоl. 104.- р. 173-180; кеllеr R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Iшгаuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). дк, обработанные опухолевым антигеном в присутствие факторов, повышающих его иммуногенность (фно-α; иJI-lβ; CD40L; лпс; среда, кондиционированная моноцитами; аналог вирусной рнк - полиинозиновая- цитидиловая кислота), способны эффективно презентировать антиген и вызывать развитие т-клеточного иммунного ответа на него, что было показано в ряде исследований iп vitrо, в экспериментах на животных и в опытах на здоровых добровольцах (сhеп Z., Dеhm S., Bonham K., Kamencic H., Juuгliпk в., Zhang X., Gordon J. R., Xiang J. S. DNA аrrау апd biоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf thе imрасt оf thе mаturаtiоп stаtus оf mоusе dепdritiс сеlls оп thеir рhепоtуре апd апtitumоr vассiпаtiоп еffiсасу. - CeIl Immuпоl. 2001.- vоl. 214.- р. 60-71; Dhоdарkаr, M. V., вhаrdwаj, N. асtivе immuшzаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173; Nоuri-Shirаzi M., вапсhеrеаu J., Fау J., раluсkа к., Dепdritiс сеll bаsеd tumоr vассiпеs. - Immuпоl. Lеttеrs. 2000.- vоl. 74.- р. 5-10; Sаllustо F., Lапzаvессhiа а. еffiсiепt рrеsепtаtiоп оf sоlublе апtigеп bу сulturеd humап dепdritiс сеlls is mаiпtаiпеd bу grапulосуtе/mасrорhаgе соlопу-stimulаtiпg fасtоr рlus iпterleukiп-4 апd dоwпrеgulаtеd bу tumоr песrоsis fасtоr аlрhа. - J. ехр. меd. 1994.- vоl. 179.- р. 1109-1118).

в качестве иллюстрации для стимуляции созревания незрелых дк в зрелые дк могут быть использованы, например, провоспалительные факторы (ил-lβ, фно-α, ил-6) в концентрации около 10 нг/мл и их комбинации, пpocтaглaндин-E2 (пгE-2) в

концентрации около 250 нг/мл. предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является созревание под действием фно-α, который используют в концентрации около 20 нг/мл.

дк, полученные из моноцитов/макрофагов периферической крови или клеток костного мозга млекопитающих при инкубации с ростовыми факторами, имеют характерные особенности морфологической структуры и ультраструктуры. дк обладают высокой антигенпрезентирующей способностью и на их основе могут быть получены противоопухолевые вакцины. для этих целей полученные в экстракорпоральных условиях незрелые дендритные клетки, среди которых не более 30% экспрессируют маркеры терминальной дифференцировки и костимулирующие молекулы (CD83, CD86, CD80) инкубируют с лизатом опухоли и факторами индукции созревания дк в течение около 1 сут. и получают зрелые пульсированные опухолевыми антигенами дк, среди которых не менее 30% экспрессируют маркеры CD83, CD86,CD80.

зрелые дендритные клетки настоящего изобретения могут быть получены ех tеmроrе, т.е. перед тем, как планируется их введение индивиду, нуждающемуся в этом. в то же время, дк настоящего изобретения могут быть получены заранее и храниться до момента их применения в замороженном виде при температуре от около минус 50°C до около минус 96°C. для продолжительного хранения в замороженном состоянии к суспензии клеток могут быть добавлены дополнительные агенты, например криопротекторы. в качестве криопротекторов предпочтительно использовать такие фармацевтически приемлемые агенты, как диметилсульфоксид, глицерин. хранят замороженные клетки в виде отдельных аликвот. хранение дк в замороженном состоянии позволяет получать одну партию клеток для каждого конкретного индивида и использовать ее многократно, например, когда требуется повторное введение дк при ревакцинации. на основе дендритных клеток настоящего изобретения могут быть получены вакцины посредством их разведения в физиологически приемлемых растворителях с добавлением консервантов и адъювантов.

млекопитающие, на которых распространяется настоящее изобретение, не ограничиваются какими-либо конкретными видами. для специалиста будет очевидно, что данное изобретение относится в первую очередь к людям, страдающим злокачественными образованиями или нуждающимися в профилактике раковых

заболеваний. в то же время настоящее изобретение предусматривает и разнообразные ветеринарные приложения. предполагается, что наиболее важными видами млекопитающих с точки зрения реализации данного изобретения будут, но не ограничиваясь только ими, такие домашние животные, как кошки, собаки, лошади.

помимо эффективного количества зрелых дендритных клеток, нагруженных полилизатом, полученным из по меньшей мере двух типов опухолей, противоопухолевые вакцины настоящего изобретения также могут содержать физиологически приемлемые растворители, эксципиенты, наполнители и другие целевые добавки. к таким агентам, в частности, относятся вещества для поддержания осмотического давления, буферы, консерванты, криопротекторы, хелатирующие агенты.

для поддержания осмотического давления вакцины могут содержать такие регулирующие тоничность агенты, как сахароза, глюкоза, хлорид натрия, полиглюкин, реополиглюкин, а также многоатомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит или маннит.

для поддержания физиологических значений рн вакцины настоящего изобретения могут содержать физиологически приемлемые буферные агенты, как, например, нереs, фосфатный, цитратный, сукцинатный, тартратный, фумаратный, глюконатный, оксалатный, лактатный, ацетатный или гистидиновый буферы, а также их комбинации.

для обеспечения высокой выживаемости дендритных клеток в составе вакцины при хранении ее в состоянии глубокой заморозки в состав вакцин могут входить криопротекторы, такие как диметилсульфоксид и глицерин.

в качестве хелатирующего агента может использоваться, например, эдта.

для предотвращения бактериального заражения в состав вакцин могут также входить консерванты, как, например, различные антибиотики или их смеси, такие как гентамицин, смесь пенициллина и стрептомицина.

для стимуляции иммунного ответа и усиления т-клеточной реакции в ответ на введение дентдритных клеток настоящего изобретения вакцина может также содержать различные адъюванты и иммуномодуляторы. наиболее предпочтительно вакцина настоящего изобретения содержит такой иммуномодулятор и адъювант, как полиоксидоний.

вакцины, предназначенные для введения iп vivо, должны находиться в стерильном состоянии. что касается таких компонентов, как растворители, наполнители, эксципиенты, прочие целевые добавки, то их стерилизацию можно проводить такими известными специалистам в данной области способами, как, например, автоклавирование при повышенной температуре, стерилизация фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. культивирование дендритных клеток и все манипуляции с ними проводят с соблюдением всех необходимых требований стерильности, как известно специалисту в данной области.

вакцина настоящего изобретения хорошо переносится.

в зависимости от предполагаемой локализации опухоли зрелые дендритные клетки или вакцина настоящего изобретения могут вводиться подкожно, внутривенно, внутрибрюшинно, в здоровые лимфатические узлы 3-5 раз с интервалом в 2 недели. наиболее предпочтительным в рамках настоящего изобретения является внутрикожное введение дк, при котором дк наиболее эффективно достигают лимфатических узлов (моrsе M. A., Coleman R. E., Akabani G., Niеhаus N., Coleman D., Lуеrlу H. к. мigrаtiоп оf humап dепdritiс сеlls аftеr iпjесtiоп iп раtiепts with mеtаstаtiс mаligпапсiеs. - сапсеr Rеs., 1999, vоl. 59, р. 56-58). разовая доза для человека составляет от около 5 до около 100 млн клеток. опыты на модельных животных (мышах) свидетельствуют о том, что эффективность защиты вакцины ослабевает через 3 мес, в связи с чем может потребоваться ревакцинация. с учетом разницы в продолжительности жизни мыши и человека можно рекомендовать для последнего повторные вакцинации с интервалом в приблизительно 3-5 лет. аналогичным образом в отношении других млекопитающих также может быть рассчитана частота ревакцинации, требующаяся для поддержания протективного эффекта.

вакцинация дендритными клетками, нагруженными полилизатом опухолей, или вакцинами, полученными на их основе, достоверно повышает киллерную активность лимфоцитов мышей против клеток тех опухолей, из которых был получен полилизат, и вызывает торможение опухолевого роста. максимальный протективный эффект, приближающийся к 100%, достигается только при минимальной опухолевой массе (после противоопухолевой терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое удаление опухолевого очага) или в профилактическом режиме. таким образом, наиболее целесообразным является профилактическое использование зрелых дендритных клеток или вакцин настоящего изобретения у индивидов,

нуждающихся в этом, после проведения радикальных операций удаления первичного очага с целью предупреждения рецидива и для профилактики развития злокачественных новообразований, в частности у индивидов, относящихся к группе риска и предрасположенных к «ceмeйным фopмaм» онкологического заболевания.

дк и вакцины настоящего изобретения могут быть использованы в профилактических целях у лиц с семейными формами рака, в регионах с повышенным радиационным: фоном и при иных неблагоприятных условиях внешней среды и профессиональных вредностях. в частности, при семейных формах рака чаще всего одновременно встречаются рак молочной железы и яичников, и для этой категории пациентов следует использовать бинарные вакцины на основе лизатов опухолей данной локализации.

для целей профилактики различных форм рака настоящим изобретением предусматривается использование полилизата по меньшей мере двух опухолей различной локализации. в одном из предпочтительных воплощений содержание каждого из типов злокачественных новообразований должно составлять не менее 2 образцов. введение дк, нагруженных полилизатом, и вакцин на их основе может индуцировать противоопухолевый иммунитет у здоровых субъектов против основных видов опухолей. вакцинации могут подвергаться основные группы «pиcкa»: лица старше 50 лет, пациенты с хроническими воспалительными и предраковыми состояниями, подвергающиеся воздействию профессиональных вредностей и проживающие в неблагоприятных экологических условиях, лица с генетическими предрасположенностями к злокачественным новообразованиям и др. для данных целей может быть создан банк различных опухолей, включающий в себя не менее 80% основных вариантов злокачественных новообразований. при этом для отдельных категорий с высоким риском заболевания определенными формами рака могут быть созданы специализированные полилизаты (для профилактики опухолей женской репродуктивной сферы, желудочно- кишечного тракта и т.п.). дк, нагруженные полилизатом, полученным на основе банка основных типов опухолей, или вакцины на основе таких дк могут применяться в профилактическом режиме у лиц без признаков опухолевого процесса. повторные курсы введения с интервалом 3-5 лет могут поддерживать иммунный ответ в течение длительного времени.

дендритные клетки и вакцины настоящего изобретения могут быть использованы для профилактики рецидивов рака у млекопитающих после

проведенного противоопухолевого лечения, когда отсутствует возможность получения индивидуального опухолевого материала для пульсации дендритных клеток или приготовления вакцин.

дендритные клетки и вакцины настоящего изобретения могут также применять для профилактики рака у млекопитающих с различными формам предраковых состояний (хронических воспалительных заболеваний).

далее изобретение будет проиллюстрировано примерами. следует, однако, понимать, что приводимые примеры предназначены не для ограничения объема притязаний, а исключительно для целей лучшего понимания сущности заявленного изобретения.

примеры.

пример 1. выделение мононуклеарных лейкоцитов (MHJI) из периферической крови

MHJI выделяют из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла (плотностью 1.077 г/см ³ ), центрифугированием при 400 g в течение 30 минут. лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирают пипеткой и трехкратно отмывают в среде 199. после каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждают центрифугированием при 200 g.

пример 2. лабораторные животные и выделение опухолевых клеток, получение дендритных клеток

в работе использованы мыши, весом 20-23 г, содержащиеся в условиях вивария. для поддержания опухолевых клеток меланомы в- 16, клетки имплантируют подкожно в дозе 500 тыс./мышь. на десятые сутки определялись опухолевые узлы в месте введения; через неделю мышей забивают посредством внутривенного введения гексенала в апноэтической дозе. волосяной покров выщипывают, кожные покровы обрабатывают 70% этанолом и надрезают стерильным инструментом. опухолевый узел удаляют и помещают в стерильную чашку петри со средой хенкса. опухоль измельчают ножницами, а затем для получения клеточной взвеси тщательно пипетируют. клетки подсчитывают, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде RPMI 1640 с добавками (HEPES, L-глютамин, гентамицин) в концентрации 1 млн./мл. часть клеток перевивают мышам, а остальные помещают в

культуральные флаконы, с добавлением 10% фетальной сыворотки и инкубируют в

сог-инкубаторе. культуральную среду заменяют через каждые 2 дня. культивируемые клетки меланомы в 16 используют для тестирования цитотоксической активности лимфоцитов мышей и имплантации мышам. для этих целей культуральную среду из флаконов сливают, прилипшие к пластику клетки меланомы заливают раствором версена и помещают на 10-15 мин в CO ₂ инкубатор. отлипшие клетки дважды отмывают в среде RPMI 1640 и используют в цитотоксическом тесте или для введения мышам.

дендритные клетки генерируют из костного мозга и селезенки мышей. у мышей удаляют бедренные кости и селезенку (после введения гексенала). костномозговой канал кости промывают средой RPMI 1640, селезенку растирают в стерильных условиях. полученную клеточную взвесь наслаивают на градиент плотности фиколл-верогарфин (или фиколл-рак) 1,088 и центрифугируют при 1500 об./мин 30 мин. образовавшееся интерфазное кольцо клеток собирают, отмывают дважды центрифугированием и ресуспендируют в полной культуральной среде с 10% фетальной сыворотки в концентрации 1 млн./мл. к MHJI костного мозга сразу добавляют гм-ксф и ил-4, а MHK селезенки выдерживают в течение суток в сог- инкубаторе, затем не прилипшие лимфоциты сливают. к прилипшим моноцитам добавляют те же ростовые факторы. каждые 2 сут. среду заменяют, и добавляют ростовые факторы. на 6 сут. к дендритным клеткам добавляют лизат опухоли и фио- ос. лизат получают трехкратным замораживанием и размораживанием опухолевых клеток меланомы. лимфоциты селезенки используют для цитотоксического теста.

пример 3. оценка противоопухолевого действия на мышах с привитыми опухолями

опухолевые клетки вlб и опухоли эрлиха вводят мышам подкожно в дозе 50 тыс./мышь. опухолевые узлы удаляют и выделяют опухолевые клетки по описанной в примере 2 методике. часть клеток перевивают мышам, а остальные помещают в культуральные флаконы с питательной средой RPMI- 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки и инкубируют в CO ₂ -инкyбaтope. культуральную среду заменяют через каждые 2 дня. культивируемые клетки меланомы вlб и опухоли эрлиха используют для тестирования цитотоксической активности лимфоцитов мышей и имплантации мышам.

дендритные клетки генерируют из костного мозга и селезенки мышей описанным в примере 2 способом с использованием ростовых факторов и фно-α. лизат опухоли получают трехкратным замораживанием и размораживанием опухолевых клеток меланомы. лимфоциты селезенки используют для цитотоксического теста.

исследование проводят на мышах-самцах линии C57B 1 и CBA и весом 20-22 г. мышей трижды с интервалом в 2 недели иммунизируют вакциной. через 2 месяца после иммунизации дк-вакциной мышей заражают клетками меланомы B-16 и рака яичников CaO-I (подкожно), карциномы эрлиха (внутрибрюшинно) в дозе 50 и 100 тыс/мышь.

оценку действия препарата на рост опухоли проводят по регистрации различий в скорости роста опухоли. скорость роста опухоли оценивают по ее объему. расчет объема опухоли осуществляют по формуле:

V=aв ² (усл.ед), где а й в наибольшие диаметры опухоли в мм.

торможение роста опухоли (TPO) рассчитывают по формуле:

V контр " Vоп

TPO= х 100%,

V контр где V _K oнтp — это объем опухоли в контроле, V _0n — объем опухоли в опытной группе. объем опухоли измеряют на 14 и 30 сут. после перевивки.

фенотип дендритных клеток определяют методом проточной цитофлюорометрии на цитометре фирмы весtоп Diсkiпsоп, сша с использованием меченных фитц (флюоресцеинизотиоцианатом) и/или фэ (фикоэритрином) антител фирмы соltаg, сша.

схема вакцинации. дендритные клетки вводят внутрикожно в 200 мкл среды трижды каждые три дня, через неделю вводят опухолевые клетки. контрольной группе животных вводят внутрикожно лизат опухоли. каждая группа включает 8-10 животных.

пример 4. цитотоксический тест

нк-активность определяют на линии K-562. для определения противоопухолевой активности (цитотоксичности) MHK используют аутологические опухолевые клетки. опухолевые клетки (1x10 ⁴ в 1 мл) инкубируют в культуральной среде с MHK (в соотношении 1:5) в плоскодонных 96-лyнoчныx микропланшетах 18

часов. затем в лунки добавляют витальный краситель MTT и по оптической плотности, измеряемой на мiltisсап MCC-340, рассчитывают процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

пример 5. культивирование дк

дк получают в культуре из MHK периферической крови при их инкубации с гранулоцит-макрофаг-колониестим улирующим фактором (гм-ксф) и интepлeйкинoм-4 (ил-4) в RPMI 1640 в течение 6 дней. для культивирования дк добавляли 20 нг/мл ил-4 и 80 нг/мл гм-ксф. на 3 и 5 день отбирали 1 мл и добавляли свежей среды, содержащей цитокины. затем, клеточные культуры отмывают средой 199. после каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждают центрифугированием при 200 g.

пример 6. индукция созревания дк

на 7 день культивирования в условиях, описанных в примере 5, дк собирали с чашки петри и центрифугировали 10 минут 40Og. затем клетки возвращали в ту же чашку петри со свежей культуральной средой, содержащей 20 нг/мл фно-α и 250 нг/мл простагландина E ₂ и культивировали еще 2 дня.

пример 7. микроскопия

дк, отмытые от питательной среды, фиксируют в 2% растворе глютарового альдегида в течение 40 минут. затем центрифугируют при 400 g в течение 30-40 минут. полученный осадок после фиксации в четырёхокиси осмия заключают в смолы (эпOH-812). полутонкие и ультратонкие срезы готовят на ультрамикротоме лкб-ш (швеция), просматривают и фотографируют ультратонкие срезы после окраски толуидиновым синим в световом микроскопе «пoливap» (австрия). ультратонкие срезы после обработки уранил-ацетатом и цитратом свинца просматривают и фотографируют в электронном микроскопе джэOл-1200 CX II (япония) (фиг.4)

пример 8. проточная цитометрия (FасS-анализ) и характеристика антител, используемых при проточной цитометрии

определение экспрессии поверхностных маркеров мнл проводят при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (саltаg Lаbоrаtоriеs, сша), результаты учитывают методом проточной цитофлюорометрии на проточном питометре FасSсап (весtоп Diсkшsоп, сша). на мнл исследуют уровни экспрессии дифференцировочных антигенов сDз, CD4, CD8, CD 16; активационных антигенов

CD25, CD38, HLA-DR; молекул адгезии CD57, CD58. гейт (окно) популяции клеток устанавливают на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. при учете результатов подсчитывают 10000 событий в гейте. статистическую обработку результатов проводят при помощи программного пакета WINMDI 2.8. (фиг. 1 и 2).

пример 9. иммунофенотипическая и морфологическая характеристика дендритных клеток

через сутки инкубации MHJI крови определяется популяция прилипающих клеток (моноциты, макрофаги). при добавлении гм-ксф и иJI-4, как описано в примере 5, к 5-6 сут. генерируются крупные клетки с характерными отростками (незрелые дендритные клетки). эти дк содержат две субпопуляции, отличающиеся степенью адгезии к пластику и способные к активной пролиферации. при добавлении фно дк практически не изменяют своих морфологических свойств, однако теряют способность к пролиферации. проведенные морфологические исследования показывают, что дк человека представляют собой гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, заполненной вакуолями, с активированным аппаратом гольджи и значительным количеством митохондрий. дк имеют характерные выросты на цитоплазме — дендритные отростки. дк имеют характерный фенотип: низкий уровень экспрессии CD14, и высокий уровень экспрессии ко стимулирующих молекул CD40, CD80, CD86, а также характерную для дк экспрессию молекул CD83.

таблица 1. иммунофенотип зрелых дк человека

таблица 2. иммунофенотип зрелых дк мыши, генерированных из костного мозга

при световой микроскопии (фиг.з) в культуре обнаружены разрастания крупных округлых клеток со светлой или темной цитоплазмой, отростками и округлыми ядрами. рядом с крупными клетками видны отдельные мелкие клетки.

при электронномикроскопическом исследовании (фиг. 4) в крупных клетках имеются ядра округлой и неправильной формы с диффузным хроматином и мелкими единичными ядрышками. ядра расположены, преимущественно, эксцентрично. цитоплазма занимает основную часть клетки, содержит вакуоли, митохондрии, рибосомы, структуры шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума, в единичных клетках встречаются лизосомы. на поверхности клеток имеются чаще длинные, реже короткие, тонкие переплетающиеся отростки. иногда отростки образуют неправильной формы выпячивания цитоплазмы. рядом с некоторыми крупными клетками располагаются мелкие единичные клетки с гиперхромными ядрами и отростчатой плазматической мембраной (моноциты).

таким образом, большие размеры клеток, наличие развитой системы отростков, выраженная цитоплазма, характер ядер, отсутствие признаков фагоцитоза дают основание рассматривать крупные клетки как дендритные. из 50 мл периферической крови человека может быть получено значительное количество дк (5-12 млн.), достаточное для проведения профилактических курсов вакцинотерапии. рекомендуемая доза для внутрикожного введения вакцины составляет 1-5 млн. дк.

пример 10. оценка пролиферативной активности дк здоровых доноров и мышей

оценку пролиферативной активности дк, полученных, как описано в примере 5, из мононуклеарных клеток, проводят в колориметрическом тесте с использованием витального красителя аlаmаrвluе в стерильных условиях, используя ламинарный бокс с горизонтальным потоком воздуха (Juап VFS 906). среду с клеточной взвесью вносят в лунки 96-лyнoчнoгo плоскодонного планшета (соstаr) по 200 мкл на лунку.

затем добавляют Bп-4 в диапазоне концентраций от 3 до 20 мкг/мл и/или цисплатин в концентрации 1 мкг/мл. планшеты помещают в CO ₂ -инкyбaтop (37 ⁰ C, 5% CO ₂ ). клетки инкубируют в присутствии этих препаратов в течение 72 часов. по окончании инкубации в лунки вносят краситель аlаmаrвluе (10 %) (вiоsоurs, сша). оптическую плотность измеряют после четырехчасовой инкубации при 37° с, 5% CO ₂ на мультискане MS 340 (Lаbsуstеm, финляндия) при длине волны 530 нм и 590 нм и выражают в условных единицах (у.е.) оптической плотности. рассчитывают индекс стимуляции (ис), представляющий собой отношение пролиферативной активности дк к пролиферативной активности неактивированных макрофагов.

аналогичное исследование было проведено на дк мышей линии CBA. контролем служили интактные макрофаги животных.

спонтанная пролиферативная активность макрофагов человека составляла 0,838±0,180 у.е. (таблица 3, группа 1). при добавлении в среду культивирования ростовых факторов ил-4 и гм-ксф происходило повышение пролиферативной активности генерируемых дк клеток до 1,682 у.е. (группа 3). при добавлении к дк фно, в качестве фактора их созревания отмечалось снижение пролиферативного ответа.

таблица 3. пролиферативная активность макрофагов и дк (разной степени зрелости) здоровых доноров (п— 15) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами

концентрация клеток в пролиферативная пролиферативный

объект среде культивирования активность, у.е. индекс

макрофаги 10 ^b 0,838±0,180

незрелые дк 10° 1,682 ±0,230 * 2,0

зрелые дк 10° 0,325±0,052* 0,4

пролиферативную активность макрофагов и дк мышей линии CBA изучали в аналогичных условиях. через 6 сут после инкубации макрофагальных клеток мышей с ил-4 и гм-ксф их пролиферативная активность увеличивалась с 0,638±0,057 до 0,932±0,072 у.е. (таблица 4). внесение в среду культивирования фно оказывало выраженное угнетающее действие на пролиферацию зрелых дк, что проявлялось в снижении пролиферативной активности в 5,2 раза, то есть до 0,123±0,029 у.е.

таблица 4. пролиферативная активность макрофагов и дк (разной степени зрелости) мышей (n=10) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами

примечание: HC — индекс стимуляции - отношение пролиферативной активности дк к пролиферативной активности интактных макрофагов. достоверность разности между группами: * р <0,05.

полученные данные свидетельствуют о том, что дендритные клетки при коинкубации с ростовыми факторами активно пролиферируют, существенно превосходя по этому показателю интактные макрофаги (их предшественники), и теряют способность к пролиферации после созревания под воздействием фно. эти результаты подтверждают, что выбранные режимы культивирования дк являются оптимальными. они позволяют нарастить в течение 6-7 суток достаточное количество незрелых клеток, а после пульсации полилизатом добавление фно прекращает их рост, что подтверждает зрелость дк.

пример 11. способность дендритных клеток к продукции фно и ил-12

продукцию цитокинов определяют методом ифа на мultisсап MC-340 (финляндия) с использование тест-систем фирмы вiоsоurсе. уровень цитокинов определяют в среде культивирования интактных макрофагов, незрелых и зрелых дк человека и мышей.

полученные данные представлены в табл. 5 и 6, соответственно.

таблица 5. продукция цитокинов макрофагами и дк (разной степени зрелости) здо овых доноров n=15 п и коинк бации iп vitrо с остовыми акто ами

достоверность различия по сравнению с макрофагами: *p <0,05.

таблица б. продукция цитокинов макрофагами и дк (разной степени зрелости) мышей (n=10) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами

достоверность различия по сравнению с макрофагами: * р <0,05

представленные данные свидетельствуют о том, что дк являются активными продуцентами хемотаксического и регуляторного пептида ил-12, который способен рекрутировать в конкретную область лимфоциты, активировать их и запускать пролиферативный ответ.

проведенные исследования фенотипа дендритных клеток, генерированных из костного мозга, свидетельствует о том, что среди них отсутствуют клетки предшественники CD34+. высокий уровень костимулирующих молекул CD80 и CD86, а также экспрессия MHC I и II класса позволяет заключить, что данная популяция может быть отнесена к зрелым дендритным клеткам.

пример 12. оценка антигенпрезентирующей активности дендритных клеток

для оценки антигенпрезентирующей активности дендритных клеток используют лимфоциты, полученные из селезенки мышей на различных этапах вакцинации пульсированными лизатом меланомы B16 дендритными клетками в дозах от 100 тыс. до lмлн. часть мышей забивают через 3 дня после каждой пульсации и перед имплантацией опухоли. лимфоциты выделяют из селезенки и инкубируют с опухолевыми клетками для определения цитотоксической активности.

как следует из представленных в таблице 7 данных, оптимальной дозой для вакцинации является 1 млн. пульсированных дендритных клеток, дальнейшее увеличение дозы не приводит к повышению цитотоксической активности лимфоцитов, максимальная киллерная активность лимфоцитов отмечается после 2-3 прививки.

таблица 7. цитотоксическая активность лимфоцитов после вакцинации мышей (%)

достоверность различия по сравнению с контролем: *p <0,05

пример 13. оценка эффективности прививочных доз клеток меланомы в 16 животным вводят различные прививочные дозы опухолевых клеток и определяют процент гибели животных в каждой группе для определения абсолютно- летальной дозы опухолевых клеток.

представленные в таблице 8 данные позволяют сделать заключение, что доза в 50 тыс. опухолевых клеток вызывает образование опухоли и гибель животных в 100% случаев.

таблица 8. гибель животных после имплантации опухолевых клеток (%)

пример 14. оценка активности дк-вакцины у мышей с привитой меланомой

B-16

в данном примере была использована доза вакцины, равная 1 млн. дендритных клеток/мышь, которая, как было продемонстрировано в примере 7, является оптимальной дозой, и различные прививочные дозы опухолевых клеток.

представленные в таблице 9 данные показывают, что полный защитный эффект от вакцинации наблюдается при прививочной дозе, не превышающей 50 тыс. опухолевых клеток. при более высоких прививочных дозах меланомы в 16 вакцина была менее эффективна, хотя при всех испытанных уровнях у провакцинированных

животных опухолевые узлы верифицировались позднее, а гибель животных также наступала в более поздние сроки по сравнению с контрольной группой.

таблица 9. процент гибели вакцинированных мышей при различных прививочных дозах опухолевых клеток

пример 15. оценка противоопухолевой активности бинарной вакцины на основе дендритных клеток, пулъсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток меланомы в 16 и опухоли эрлиха

мышам линии C57 Bl трехкратно вводят аутовакцину с интервалом 2 недели, затем через 2 нед. после последней вакцинации вводят опухолевые клетки в дозе 50 тыс/мышь (одной группе клетки опухоли эрлиха, второй — меланому B16 и контрольной группе — физиологический раствор). после вакцинации у части мышей удаляют селезенки, выделяют лимфоциты и определяют их цитотоксичность на опухолевых клетках меланомы и опухоли эрлиха. в качестве контроля используют лимфоциты интактных мышей.

как следует из данных, представленных в таблице 10, вакцина (бинарная вакцина) на основе дендритных клеток, пульсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток меланомы B16 и опухоли эрлиха, достоверно повышает противоопухолевую киллерную активность лимфоцитов, выделенных из селезенки вакцинированных мышей, в отношении клеток меланомы в 16 и опухоли эрлиха и практически не влияет на спонтанную цитотоксичность лимфоцитов по отношению к клеткам рака яичников. эти результаты свидетельствуют о специфическом усилении противоопухолевой активности лимфоцитов по отношению к тем видам опухолей, к которым проводилась иммунизации.

таблица 10. цитотоксическая активность лимфоцитов после вакцинации мышей (%)

*- достоверные изменения по сравнению с исходным уровнем (р <0,05).

для определения протективных свойств бинарных вакцин у мышей линии C57B1 оценивали торможение роста меланомы и опухоли эрлиха после введения дендритных клеток, пульсированных смесью антигенов указанных опухолевых клеток. представленные в таблице 11 данные свидетельствуют о том, что бинарная вакцина в дозе 50 тыс. клеток вызывает выраженное торможение роста опухоли меланомы в 16 и опухоли эрлиха и, следовательно, оказывает протективное действие.

таблица 11. торможение опухолевого роста на 30 сутки после перевивки опухоли (%)

пример 16. оценка противоопухолевой активности бинарной вакцины на основе дендритных клеток, пулъсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток опухоли эрлиха и рака яичников CaO-I

на мышах линии CBA исследовали эффективность профилактической бинарной вакцины, полученной в результате пульсации дендритных клеток полилизатом, содержащим смесь лизатов опухоли эрлиха и рака яичников CaO-I . как следует из данных, представленных в табл. 12, бинарная вакцина вызывает выраженное торможение роста опухоли эрлиха и CaO-I на 20 сут. после перевивки опухолей. таким образом, вакцины на основе дендритных клеток, пульсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов клеток опухоли эрлиха и рака яичников CaO-I, оказывают противоопухолевое профилактическое действие.

таблица 12. торможение опухолевого роста на 20 сутки после перевивки опухоли (%)

пример 17. оценка отсроченной эффективности бинарной вакцины отсроченную эффективность бинарной вакцины у мышей с привитыми опухолями меланомы B-16 и карциномы эрлиха оценивают через 1-3 мес. после последней вакцинации. процент торможения опухолевого роста определяют на 14 и 20 сутки после перевивки опухоли по сравнению с контролем, при различных сроках введения опухолевых клеток.

как следует из приведенных в таблице 13 данных, достоверных различий в эффективности вакцин по сравнению с приведенными выше результатами при трансплантации опухоли через 2 нед. после завершения вакцинации не отмечено. это свидетельствует о сохранении профилактического действия вакцины по меньшей мере в течение 1 мес.

таблица 13. процент торможения опухолевого роста после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 1 мес. после вакцинации бинарной вакциной

через 2 мес. после вакцинации защитное действие бинарной вакцины несколько ослабевало, однако эффект торможения превышал 50% (таблица 14), что позволяет рассматривать его как значимый.

таблица 14. процент торможения опухолевого роста после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 2 мес. после вакцинации бинарной вакциной

согласно данным, представленным в таблице 15, через 3 мес. после вакцинации торможение опухолевого роста более чем на 50% отмечается только в отношении меланомы в 16 на 14 сутки после имплантации опухоли. следовательно, защитный эффект бинарной вакцины длится в течение 3 мес.

таблица 15. процент торможения опухолевого роста на 14 и 20 сут после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 3 мес. после вакцинации бинарной вакциной

учитывая снижения защитного эффекта дк-вакцины в течение 3 мес. в специальной серии экспериментов 8 мышам спустя 3 мес. вакцинации дважды с интервалом в 2 недели проводят повторный курс вакцинации дк, пульсированными полилизатом, содержащим смесь лизатов меланомы и опухоли эрлиха. через две недели после перевивки опухоли оценивают величину образовавшихся узлов. полученные данные (таблица 16) свидетельствуют о том, что повторные вакцинации усиливают защитный эффект дк-вакцины, который ослабевает к 3 мес. после первого цикла вакцинации.

таблица 16. процент торможения опухолевого роста на 20 сут после перевивки опухоли по сравнению с контролем, при повторной вакцинации

таким образом, при использовании стандартных моделей для экспериментальной онкологии — мышей с привитыми опухолями, показано, что вакцины, содержащие дендритные клетки настоящего изобретения, пульсированные полилизатом, содержащим лизаты двух различных опухолей, оказывают профилактическое действие и защищают от развития опухоли при трансплантации животным опухолевых клеток в дозах, вызывающих 100% развитие опухоли. представленные экспериментальные данные о низкой эффективности дк-вакцин при

имплантации мышам больших доз опухолевых клеток (более 300 тыс. клеток на мышь), свидетельствуют о том, что предлагаемые для клинического применения лечебные режимы вакцинации дк будут мало эффективны. эти результаты в целом не противоречат материалам клинических испытаний дк-вакцин. поэтому, наиболее оптимальной областью применения дк-вакцин является профилактика злокачественных новообразований, в частности у групп риска, и профилактики рецидивов заболевания после противоопухолевого лечения. основной проблемой для получения профилактических вакцин является отсутствие или недоступность аутологичного опухолевого материала. для этих целей могут быть использованы полилизаты тех гистологических вариантов рака, возникновение/рецидив которых наиболее вероятен у данного пациента или животного.

следует понимать, что специалистом могут быть сделаны различные модификации или усовершенствования настоящего изобретения, однако все они будут охватываться притязаниями, объем которых определяется следующей далее формулой изобретения.