Die Klinik der Syphilis kann grundsätzlich in unterschiedlichen Stadien verlaufen, die als Primärsyphilis, Sekundärsyphilis und Tertiärsyphilis bezeichnet werden.

Ein direkter Erregernachweis ist lediglich im Primärstadium eine gute Diagnosemöglich- keit. Der Nachweis erfolgt hierbei direkt aus der Gewebeprobe und kann durch Dunkel- feldmikroskopie, direkte Immunfluoreszenz oder eine Treponema pallidum spezifische PCR durchgeführt werden.

Serologische Verfahren zum Antikörpernachweis sind in allen Krankheitsstadien gut möglich. Sie geben Aufschluß über charakteristische Antikörperkonstellationen, die In- formationen über die Behandlungsbedürftigkeit geben.

Im wesentlichen spielen dabei anti-Treponema pallidum-spezifische Antikörper und Anti- körper gegen Cardiolipin eine Rolle.

Anti-Cardiolipin-Antikörper vom IgG-oder IgM-Typ können bei Patienten mit Treponema Infektionen vorkommen und können mit dem CMT-Test (Cardiolipin-Mikroflockungs- Test, englisch VDRL Test : Veneral Disease Research Laboratories Test) oder dem RPR - Test (Rapid Plasma Reagin-Test) oder dem Cardiolipin Komplement-bindungs- reaktions-Test nachgewiesen werden. Bei diesen Analyseverfahren werden positive Si- gnale beim Vorhandensein von anti-lipoidalen Antikörpern in der Probe beobachtet. Der VDRL Test kann bei entsprechenden Probenverdünnungen quantitativ durchgeführt werden, so dass ein Titer, bei dem eine deutliche Flockung gerade noch auftritt, als posi- tiv gewertet wird. Der Test eignet sich gut zur Verlaufskontrolle und Therapiekontrolle, kann aber auch unspezifisch reagieren. Kreuzreaktionen treten unter anderem bei Au- toimmunerkrankungen auf, wie zum Beispiel beim Anti-Phospholipid-Syndrom oder beim Systemischen Lupus Erythematodes.

Anti-Treponema-pallidum-spezifische Antikörper können gegen Proteine aus Treponema pallidum gebildet werden. Der Nachweis dieser Antikörper kann als Suchtest, als TPHA (Treponema Pallidum Hämagglutionations Test), TPPA (Treponema Pallidum Partikel Agglutionations Test) oder TPLA (Treponema Pallidum Latex Agglutinations Test) durchgeführt werden.

Die diagnostisch relevanten Proteine aus Treponema pallidum umfassen unter anderem die Proteine mit Molekulargewichten von 47 kD, 44,5 kD, 37 kD, 17kD und 15 kD (Labor und Diagnose, Herausgeber : Lothar Thomas, Seiten 1234 ff., TH-Books Verlagsgesell- schaft mbH, Frankfurt/Main, 2000 ; DE19536166 ; W08802403 ; Sambri et al., Clin. Diagn.

Lab. Immunol. 2001 May ; 8 (3) : 534-9). In unterschiedlichen marktgängigen Testen (Inno- lia Syphilis, lnnogenetics, Belgien ; Treponema Marblot, MarDx, USA ; Treponema Re- comblot, Mikrogen, Deutschland) werden Kombinationen aus diesen Proteinen auf fest- phasigen Trägermaterialien immobilisiert. Während der Inkubation der Probe mit dem beschichteten Trägermaterial können Treponema pallidum spezifische Antikörper an die Antigene binden und nachfolgend durch eine immunochemische Reaktion nachgewiesen werden. Der Nachweis dieser Treponema pallidum spezifischen Antikörper kann im Format eines ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) zum Beispiel als Suchtest für Syphilis eingesetzt werden oder im Format von Immunoblots als Bestäigungstest für Syphilis.

Immunoblots werden daher bei unklaren Befunden aus den Suchreaktionen, als Bestäti- gungstests und zur Verlaufskontrolle eingesetzt.

Zur Bewertung der Behandlungsbedürftigkeit sind vor allem Testverfahren zur Bestim- mung von anti-Treponema-pallidum-spezifischen IgM-Antikörpern von Bedeutung. Typi- scherweise ist dieser Nachweis mit einem Tp- ! gM-FTA Test (Fluoreszenz Treponema Antikörper-Absorptions-Test) oder einem Tp-lgM-Elisa oder einem Treponema pallidum 1gM Immunobiot möglich.

Zur serologischen Verlaufskontrolle und Therapiekontrolle sind vornehmlich Verfahren indiziert, die eine zumindest semiquantitative Bestimmung von anti Cardiolipin Antikör- pern beinhalten.

Die aus dem Stand der Technik bekannten zur serologischen Bestätigung geeigneten Nachweisverfahren erlauben keine quantitave Bestimmung der Antikörper in der Patien- tenprobe. Ferner haben sie den Nachteil, dass sie es praktisch nicht ermöglichen, zu bestimmen, ob eine Treponemainfektion noch akut oder bereits abgeklungen ist. Dies beruht unter anderem darauf, dass Antikörper gegen Treponemaantigen noch sehr lange nachweisbar sind, selbst wenn die eigentliche Infektion-das heißt das Vorliegen von Erregem-bereits abgeklungen ist. Ferner sind die Tests aus dem Stand der Technik teilweise umständlich von der Verfahrensführung und somit für den Routinebereich und Hochdurchsatztechnologien ungeeignet.

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren anzugeben, die einerseits möglichst einfach zu handhaben sind und ferner eine serologi- sche Verlaufskontrolle des tatsächlichen Infektionsgrads ermöglichen.

Das vorliegende Problem wird gelöst durch einen Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, der mindestens ein immobilisiertes Cardioli- pin und mindestens ein immobilisiertes Treponema-spezifisches Antigen enthält.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Cardiolipin zusammen mit Lecithin und Cholesterin eingesetzt. Diese Kombination aus Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin wird im Folgenden auch als VDRL-Antigen bezeichnet.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das VDRL-Antigen die ge- nannten Bestandteile in folgenden Massenverhältnissen Cardiolipin : Lecithin : Choleste- rin in den Verhältnissen 0,1 bis 4,0 : 1 bis 5,0 : 1 bis 10,0. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Massenverhältnisse 1 bis 3,0 für Cardiolipin : 1 bis 3 für Lecit- hin : 5 bis 10 für Cholesterin.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger mehrere Positionen mit Cardiolipin, mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier Positionen, an denen das Cardiolipin in verschiedenen Konzentrationen vorliegt. Diese Konzentrationen sind für die einzelnen Positionen vorzugsweise wie folgt : 0,10 bis 1,00 mg/ml (Position 1), 0,05-0, 50 mg/ml (Position 2), 0,02 bis 0,2 mg/ml (Po- sition 3), 0,01 bis 0,1 mg/ml (Position 4).

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier verschiedene Tre- ponema-spezifische Antigene, wobei jedes Antigen in einer unterschiedlichen Position auf dem Träger immobilisiert ist.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Treponema-spezifischen Antigene ausgewählt aus Antigenen von Treponema pallidum, vorzugsweise handelt es sich hierbei um die 15 kD, 17 kD, 44,5 kD und 47 kD Antigene.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger weitere Kontrollen, die geeignet sind, die sachgemäße Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anzuzeigen. Zu diesen Kontrollen zählt bspw. eine Serumkontrolle. Diese Kontrolle zeigt an, dass der Teststreifen in der Tat beim Durchführen des Verfahren mit Serum in Kon- takt gebracht worden ist.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Kontrolle eine sog. Cut-Off- Kontrolle dar, welche bspw. eine Verdünnung von gereinigtem humanen Immunglobulin enthält. Diese Kontrolle dient der Auswertung, indem ein schwächeres Signal als die Cutoff-Kontrolle einem negativen Testergebnis entspricht, während ein stärkeres Signal einem positiven Testergebnis entspricht. Als Trägermaterialien kommen Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidendifluorid), Nylon, Celluloseacetat, Polystyrol in Betracht, wobei Ni- trocellulose besonders bevorzugt ist. Es hat sich gezeigt, dass beim Einsatz von Ni- trocellulose ein besonders gutes Signal-Hintergrundverhältnis, insbesondere für das VDRL-Signal erhalten wird.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger als Teststreifen ausge- staltet, insbesondere in einem Format, das den Einsatz in herkömmlichen Verfahren der tmmundiagnostik erlaubt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger als Westernblot ausge- staltet. Dabei enthält der Träger die diversen Reagenzien in immobilisierter Form.

Das oben genannte technische Problem wird ebenfalls gelöst durch ein Verfahren zur Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, das dadurch gekenn- zeichnet ist, dass ein oben genannter Träger mit einer Patientenprobe in Kontakt ge- bracht wird und so das Vorliegen von Antikörpern gegen ein Treponema-Antigen und/oder Cardiolipin in der Patientenprobe bestimmt wird.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Patientenprobe um eine Blut-, Serum-, Plasma-, Liquor-oder Synovialflüssigkeitsprobe des zu untersuchenden Patienten. Der Verfah- rensablauf entspricht den üblichen Verfahren auf dem Gebiet der Immundiagnostik und ist dem Fachmann geläufig.

Das oben genannte technische Problem wird ferner gelöst durch einen Testkit zur Dia- gnose einer Treponemainfektion und/oder der Verlaufskontrolle einer Treponemainfekti- on, wobei der Testkit einen eingangs genannten Träger enthält sowie die weiteren Rea- genzien zur Durchführung des diagnostischen Verfahrens sowie eine Gebrauchsanlei- tung zur Durchführung des Assays.

Mit dem neuen Testverfahren bzw. Träger können in einem Ansatz sowohl Treponema pallidum spezifische Antikörper jeweils gegen das 47 kD-, das 44,5 kD-, das 17 kD und das 15 kD Protein als auch Antikörper gegen das VDRL Antigen (Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin), insbesondere Cardiolipin, nachgewiesen werden.

Durch die Kombination von Treponema pallidum spezifischen Antigenen (47 kD-, 44,5kD-, 17 kD-, 15 kD-Proteine) mit nicht-Treponema pallidum Antigenen (z. B. Cardio- lipin) in einem Testformat kann gewährleistet werden, dass eine sicherere, besser auto- matisierbare und aussagekräftigere Syphilis-Diagnostik efolgen kann.

Im Rahmen der Stufendiagnostik zur Diagnose der Syphilis ist es somit möglich, nach einem Screening Test (TPPA, TPHA, TPLA, Tp Elisa) anschließend mit dem erfindungs- gemäßen Träger bzw. Verfahren sowohl die serologische Bestätigungsreaktion, als auch die Analyse zur Feststellung der Behandlungsbedürftigkeit, als auch die serologische Verlaufskontrolle durchführen zu können.

Insbesondere die Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion wird mittels des erfin- dungsgemäßen Trägers zuverlässig und einfach möglich. Das mit VDRL-Antigen erhal- tene Meßsignal ist eine zuverlässige Größe für den Grad der Treponemainfektion. Wäh- rend die in der Patientenprobe vorliegende Reaktivität mit den Treponema-Antigenen relativ unabhängig ist von dem Grad der Infektion (d. h. der Schwere der Infektion) gibt des VDRL-Signal hierzu aussagekräftigere Werte. Dabei war es insbesondere überra- schend, dass es gelungen ist, die körpereigenen Lipide (Cardiolipin, Lecithin und Chole- sterin) derart auf einen festen Träger zu immobilisieren, dass deren Reaktivität mit den Antikörpern des Patientenmaterials erhalten bleibt. Dies war keineswegs zu erwarten, da es sich bei den Lipidstrukturen, insbesondere beim Cardiolipin, um relativ labile dreidi- mensionale Strukturen handelt, so dass das Aufbringen auf einen festen Träger ein ho- hes Risiko der Zerstörung der relevanten Epitope darstellte. Überraschenderweise blei- ben die diagnostisch relevanten Epitope jedoch auch nach Fixierung auf dem festen Träger erhalten und erlauben somit einen raschen, einfachen und dennoch sicheren Nachweis der gegen Cardiolipin gerichteten Antikörper.

Abbildung 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Träger mit VDRL-Antigenen verschiedener Konzentration sowie vier verschiedenen Treponema pallidum Antigenen Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Herstellung des Treponema Testsstreifens Herstellung des VDRL Antigens VDRL Antigen wurde aus einer Mischung aus den Einzelkomponenten Cardiolipin, Lecit- hin und Cholesterin in Ethanol hergestellt. Cardiolipin wurde aus Rinderherz gereinigt (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA), Lecithin aus Hühnerei (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA) und Cholesterin aus Wollfett (Avanti Polar Lipids Inc., Alaba- ster, AL, USA). Die Einzelkomponenten wurden in Reinheitsstufen von mindestens 98 % eingesetzt. Die Einzelkomponenten lagen jeweils als Trockensubstanz vor und wurden in Ethanoi (100%) aufgenommen. Die Konzentration von Cardiolipin betrug 4 g/1 in Ethanol (100%), die Konzentration von Lecithin betrug 100 gut in Ethanof (100%) und die Kon- zentration von Cholesterin betrug 25g/l in Ethanol (100 %). In der Reihenfolge Cardioli- pin, Lecithin und Cholesterin wurden die Einzelkomponenten entsprechend dem ge- wünschten Mischungsverhältnis gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 12-24 Stunden im Dunkeln vor einer weiteren Verarbeitung aufbewahrt. In der VDRL Mischung lagen die Massenverhältnisse von Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin im Bereich von (0,1- 4,0) : (0,1-5, 0) : (0,1-10, 0). Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin mit einem Massenverhältniss von 2,0 : 1,4 : 9,0 erzielt.

Herstellung von VDRL-Verdünnungen VDRL Antigen wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH7, 2 stufenweise in 1,4- bis 1000-fachen Verdünnungen hergestellt.

Herstellung von Treponema spezifischen Antigenlösungen 47 kD Protein aus Treponema pallidum (Capricorn, USA), 44,5 kD Protein aus Trepone- ma pallidum (Lee Laboratories, USA), 17 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee La- boratories, USA) und 15 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA) wurden zur Herstellung der Treponema spezifischen Antigenlösungen verwendet. Die Verdünnungen der Antigene erfolgte in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH7,2. Es wurden Konzentrationen zwischen 1 pg/ml und 200 pg/ml pro Antigen verwendet. Gut geeignet haben sich beim 47 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 60 pg/ml, beim 44,5 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 5 pg/ml, beim 17 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 10 pg/ml und beim 15 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 20 pg/ml.

Immobilisierung der Antigene auf festphasigem Trägermaterial Als festphasiges Trägermaterial wurde Nitrocelluose (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) eingesetzt. Die entsprechend verdünnten Antigene (Konzentrationen : VDRL : 1, 40-fache, 28,6-fache, 55,6-fache und 111, 1-fache Verdünnung der VDRL Antigenlösung ; 47 kD-Protein : 60 ug/ml ; 44,5 kD-Protein : 5pg/mi ; 17 kD-Protein : 10 pg/ml ; 15 kD-Protein : 20 pg/ml) konnten durch passive Adsorption auf Nitrocellulose als festphasigem Trägermaterial gebunden werden. Die Antigen-Lösungen wurden mit einem Dispensierautomaten mit Tropfengrößen von 10,67 nl bis 85 nl und Flussraten von 0, 5 ul/cm bis 5,0 pI/cm aufgetragen.

Blockierung freier Bindestellen Mit Antigen beschichtete Nitrocellulose wurde mit einem Puffer aus Trishydroxymethyla- minomethan (3,25 g/i), Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/I), Thimerosal (0,02 g/I), Milchpulver (40 g/I), pH 7,5, bei 37 °C 30 min inkubiert, anschließend in einem Puffer aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51 g/I), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/I), Milchpulver (5 gel), pH 7,5, bei 37 °C 30 min inkubiert und getrocknet.

Zur weiteren Verwendung wurde die blockierte Nitrocellulose in Streifen geschnitten (Teststreifen).

Entwicklung der Nitrocellulosestreifen mit Probenmaterial Als Probenflüssigkeit eignen sich Serum, Plasma, CSF (zerebrospinale Flüssigkeit) oder Synovialflüssigkeit.

Der mit Antigen beschichtete Nitrocellulosestreifen (=Teststreifen, zum Beispiel Darstel- lung 1)-wird in 1,5 mi Waschpuffer bestehend aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/I), Thimerosal (0,02 g/1), Milchpulver (5 g/l), pH 7,5, bei Raumtemperatur 5 min auf einem Wippschüttler in einer Wanne inku- biert. Anschließend wird der Puffer dekantiert. 20 ut Probenflüssigkeit werden zusammen mit 1,5 mi Waschpuffer auf den Teststreifen gegeben. Der Teststreifen wird 30 min auf dem Wippschüttler inkubiert. Nach der Inkubation mit Probenflüssikeit wird der Test- streifen dreimal mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer gewaschen und anschließend mit anti- human-egg oder anti-human-IgM oder anti-human-lgA-alkalische Phosphatase- Konjugat inkubiert. Anschließend wird mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer dreimal jeweils 5 min gewaschen. In einem weiteren Waschschritt wird mit destilliertem Wasser für 1 min nachgewaschen und anschließend mit Chromogen/Substrat Lösung (BCIP/NBT) entwik- kelt. Die Entwicklung wird entsprechend der Färbung einer Cut-Off Kontrolle durch De- kantieren der Entwicklungslösung und dreimaliges Waschen mit jeweils 1,5 ml destillier- tem Wasser gestoppt.

Interpretation der Färbungen auf den Teststreifen Auf den Teststreifen werden Färbeintensitäten der Antigenlinien mit der Färbeintensität der Cut-Off Kontrolle verglichen. Eine Färbeintensität kann durch Scannen (handelsübli- che Farbscanner ; Programm Virascan, Viramed, Planegg, Deutschland) der entwickelten Teststreifen quantifiziert werden. Aus den Messwerten der Färbeintensitäten werden Verhältnisse zur Cut-Off Kontrolle berechnet (Ratio). Ist das Ratio größer oder gleich eins, so wird eine entsprechend gefärbte Antigenlinie als positiv gewertet. Ist das Ratio kleiner als eins aber größer oder gleich 0,5 so wird die entsprechende Antigenlinie grenzwertig gewertet. Ist das Ratio kleiner als 0,5 so wird die entsprechende Antigenlinie negativ gewertet.

Eine oder mehrere positive Antigenlinien der Proteine 47 kD, 44,5 kD, 17 kD oder 15 kD weisen auf das Vorhandensein entsprechender Antikörper in der jeweiligen untersuchten Probe hin.

Eine oder mehrere positive Antigenlinien der aufgetragenen VDRL Verdünnungsstufen weisen auf das Vorhandensein von anti Cardiolipin Antikörpern eines entsprechenden Titers hin. Es besteht eine Korrelation zwischen dem VDRL-Titer, ermittelt nach dem herkömmlichen VDRL Testverfahren und der quantifizierbaren Färbeintensität der VDRL Antigenlinien auf dem Teststreifen. Somit ist das Trägergebundene VDRL ein geeignetes Mittel zum quantitativen, zumindest semi-quantitativen, Nachweis von Anti-Cardiolipin- Antikörpern und kann somit zur Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion herangezo- gen werden.